JPS6054698A - 細菌の感受性の試験方法および試験薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ムレイン生合成において主たる作用を、有す
る抗生物質に対する細菌の感受性を試験するための方法
および薬剤に関する。

抗生物質療法を開始する前に、各種抗生物質に対する病
原体の感受性を可能な限シ測定すべきである。感受性の
試験に今日用いられている試験方法は、大抵、抗生物質
の存在下における微生物の純培養物の増殖抑制の検出に
基づいている。

試験管内感受性試験においては、抗生物質の作用は多く
の要因、例えば微生物の増殖相、栄養培地、および菌集
団密度などによって左右される。抗生物質に対する微生
物の感受性を試験するための標準的方法番ま寒天また＆
まプロスでの希釈試験および寒天拡散試験である。

それらの試験は、実際に（ま、希釈夕１ｊ試験で（・ま
濁度の測定により、あるい＆ま寒天拡散試験で（ま、阻
止円直径の測定により例え＆了２４時間インキュベーシ
ョンした後、試験］ｚラッチ微生物増殖に関し目視検査
することによって評価される。

希釈列試験における分析時間なま現在の鋭敏な分析法、
例えばインピータｒンス濱１ｊ定また＆まレーザーネフ
エロ計などにより通常４〜８時間まで短縮できる。しか
しながら、相当する分析装置カー概して高価であり、そ
のために、それらの使用をま多数の試料を扱う検査室の
場合に正当イヒされるにすぎず、また平均分析時間力″
−４〜８時間なので、その結果はしばしば業務時間後に
得られるにすぎず、その結果、この情報提供の遅延によ
って分析時間の短縮という利点力；相殺されてしまう。

それ故、実際に、極めて迅速に結果を与えしかも装置に
余り多大な支出を伴うことなく比較的小さな検査室で行
なうこともできるという感受佃試験手段が切望されてい
る。化学療法剤に対する微生物の感受性を確認するため
の迅速な試験は、抗生物質のより調節された使用を可能
とし、そして、その結果、例えば患者の治療時間が短縮
し、また、多重耐性細菌株選抜のチェックができるよう
になる。

主な作用部位がムレイン生合成である抗生物質としては
、例えば治療上極めて有用なＲニジリン類およびセファ
ロスポリン類のほかに、サイクロセリン、パイコマイシ
ンおよびバシトラシンなどが挙げられる。Ｒニジリン類
およびセファロスポリン類はβ−ラクタム環が存在する
という化学的特徴を有している。β−ラクタム系抗生物
質に対するグラム陰性細菌の耐性はグジノ、陽性生物の
それとは異なる。大部分のグラム陽性細菌はそのβ−ラ
クタム環を開裂しそれによってβ−ラクタム系抗１生１
物Ｉ質を失活させる比較的多量の細胞外β−ラクタマー
ゼを産出する。β−ラクタム系抗生物質に対するグラム
陰性細菌の感受性については、β−ラクタマーゼに起因
する耐性よりも貫入耐性の方が可成大きな主要性を有す
ることが多い。グラム陰性細菌の細胞結合β−ラクタマ
ーゼは、グラム陽性細菌の細胞外β−ラクタマーゼより
も実質的に低濃度で形成される。グラム陰性細菌の場合
には、しばしば、β−ラクタム系抗生物質の最／ＪＸ阻
止濃度とβ−ラクタマーゼ活性との間に相関が存在しな
い。β−ラクタマーゼ陽性細菌（まβ−ラクタム系抗生
物質感受性およびβ−ラクタム系抗生物質非感受性のい
ずれ）のグラム陰性細胞にも認められる二従って、既知
の迅速β−ラクタマーゼ試験はそれだけでは、例え（ｆ
腸内細菌科のβ−ラクタム系抗生物質に対する感受性を
試験するには意義をもたない。

本発明の目的は、主な作用部位をムレイン生合成に有す
る抗生物質に対する細菌の感受性を４時間よりも相当に
短い分析時間で試験するための簡便な方法および迅速な
試験系を開発することにある。

本発明は、ムレイン生合成に主作用を有する抗生物質に
対する細菌の感受性の試験方法に関するものであり、こ
の方法は前記抗生物質と酵素基質の存在下に、前記の細
菌から放出される細胞質酵素活性を直接測定することを
特徴とする。

本発明は更にムレイン生合成に主作用を有する抗生物質
に対する細菌の感受性を試験するための薬剤に関するも
のであシ、この薬剤は種々の抗生物質濃度の緩衝された
栄養培地ならびに、少なくとも１種の酵素基質および所
望により少なくとも１種の補酵素および所望によシ少な
（とも１種の酸化還元指示薬を本質的に含有する。

本発明による方法および薬剤により、細胞質酵素活性の
簡易かつ迅速々測定によって、当該細菌の１世代サイク
ル内でムレイン生合成に対する抗生物質の影響を直接確
認することが可能と攻シ、例えば細菌のβ−ラクタム系
抗生物質に対する感受性試験を３０〜６０分間内に行な
うことができる。本発明によれば、通常抗生物質の存在
下での細菌の増殖速度を監視する既知の方法よりも迅速
に細菌の抗生物質に対する感受性を検出することかでき
る。これら既知の方法においては、細菌の数世代サイク
ルに相当するインキュベーション時間が必要である。

本発明による方法においては、固体栄養培地からの約１
１１ＩＩＩ＋の大きさの単一細菌コロニーは感受性試験
を行なうための接種物として十分である。抗生物質に対
する細菌の感受性を確認するための本発明による試験の
原理は、ムレイン生合成に主作用を有する抗生物質の存
在下での細菌増殖障害の直接検出である。ムレイン生合
成が阻−害されると不完全な、すなわち断片的なムレイ
ン骨格が生じる。このムレイン骨格が低張媒質中での細
菌の浸透圧に対し適切な逆圧を与えることができない場
合には、菌体は破裂しそして菌体内酵素が放出される。

様々な抗生物質濃度の存在下に放出される細胞質酵素活
性はその抗生物質に対する細菌の感受性の信頼できる目
安である。ムレイン骨格の損傷程度がほんのわずかにす
ぎない場合の菌体の破裂は低濃度の洗剤によって促進す
るこζができる。通常、抗生物質のいわゆる最小阻止濃
度よりも低い選択試験条件の下では細胞質酵素活性は全
く検出されないかまたは極めて低い細胞質酵素活性が検
出できるにすぎない。その最小阻止濃度に等しいかまた
はそれよりも高い抗生物質濃度では、例えば菌体の超音
波処理により放出できる細胞質酵素活性に相当する細胞
質酵素活性が検出できる。

細胞のβ−ラクタム系抗生物質に対する感受性を試験す
るために用いられる細胞質酵素は細菌に広汎に分布する
酵素、あるいは個々の細菌科、細菌属あるいは細菌株に
いたるまでの特異的な酵素であることができる。

選択栄養培地としてのマツコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅ
ｙ）寒天を用いて単離された医療上重要なグラム陰性細
菌の場合には陽性β−ガラクトシダーゼ活性は例えば、
エシェリヒア（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ’）属、ントロ
バクター（Ｃｊ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　）属、クレブシ
ェラ（Ｋｌｅｂｓｊ、ｅｌ、］、ａ　）属、エンテロツ
ク゛クター（Ｅｎｔｅｒｏ−ｂａｃｔｅｒ）属、ノ・フ
ニア（Ｈａｆｎｉａ　）属、セラシア（Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ）属、またはアリソゝす（Ａｒｉｚｏｎａ）属の代表
菌の存在を示している。

１細菌種に対し特異的な細胞質酵素の調査においては、
相当する細菌種の感受性を他の細菌種を含む混合培養物
中で試験することができる。

このように、純培養物の単離に起因する推定病原体に対
する感受性試験の実施の遅滞はない。

例えば、他の大腸菌類とは対照的に、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊ、ａ、　ｃｏｌｉ　）　＆’
！、通常強力な細胞質β−Ｄ−グルクロニダーゼ活性を
示す。

従ってエシェリヒア・コリのβ−ラクタム系抗生物質に
対する感受性は各種大腸菌類の混合培養物中で簡単かつ
迅速に測定することができる。

本発明の試験系は次の組成を有する。すなわち、様々な
抗生物質濃度を有する緩衝された栄養培地、１種または
それ以上の酵素基質、好ましくは、けい光源または発色
源基質、および所望によ９１種またはそれ以上の補酵素
（補因子）、および所望により少なくとも１種の酸化還
元指示薬である。試験系は好ましくは洗剤も含有する。

抗生物質に対する細菌の感受性を試験するには、その試
験系に供試細菌の懸濁液を接種する。

使用できる緩衝された栄養培地としては例えば、ミュラ
ー・ヒントン（Ｍｉｉｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）ブロス
、脳−心臓ブロスおよびカゼインはプトンー大豆粉はプ
トンブロスなどを適当な緩衝剤、例えばホスフェート緩
衝剤、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ト
リス緩衝剤）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピはラ
ジンーＮ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＢＳ緩衝剤）
またはその他の通常の緩衝系に混合したものが挙げられ
る。好ましい緩衝剤はｐＨ値７の０．１Ｍホスフェート
緩衝剤である。緩衝剤およびｐＨ値の選択は検出すべき
酵素の至適試験条件にも、またその細菌に適した生理学
的条件にも依存する。

当業者であれば慣用の方法によシ適切な条件を測定する
ことができる。

ムレイン生合成に主な作用部位を有する抗生物質として
は例えばＲニジリン類、例えばはニジリン０１Ｒニジリ
ン■およびアンピシリン、セファロスポリン類、例えば
セファロスポリンＣ１セフアロリジン、セファロチン、
７９ンコマイシン、サイクロセリンおよびノく′シトラ
ジンなどが挙げられる。インキュベーション・、＜フチ
中の抗生物質の最終濃度は０〜６４μｒ／ｍｅの範囲、
好ましくは８μ２汐までの範囲で増加させるｔ（きであ
る。

抗生物質の存在下に細菌から放出され極めて容易に検出
できる細胞質酵素活性は好ましくは、加水分解酵素（ヒ
トロラー七）、例えばグリコシダーゼ類、例えばβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、およびβ−Ｄ−グルクロニダーゼ
、または酸化還元酵素類、例えばサクシネートデヒドロ
ゲナーゼ、およびマレートデヒドロゲナーゼである。

グリコシダーゼ類の酵素活性は、例えばけい光源または
発色源の基質を用いて測定される。

このような基質としては、例えば、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼについてはα−またはβ−ナフチルβ−Ｄ−ガラ
クトピ−ラノシド、０−またはｐ−ニトロフェニルβ−
福−ガラクトピラノンドおよび４−メチル−ラムベリフ
ェニリルβ−〇−ガラクトピラノシド；β−Ｄ−グルク
ロニダーゼについてはα−またはβ−ナフチルβ−Ｄ−
グルクロニド、　ｏ　−マｆｔハｐ−二トロフェニルβ
−Ｄ−グルクロニドおよび４−メチルウムベリフエリル
β−Ｄ−グルクロニドである。

酸化還元酵素類の細胞質酵素活性は、相当する酵素基質
および補酵素を用いて常法により測定されるが、けい光
源または発色源の酸化還元反応をひき続き行々わせるこ
とも可能である。適当な補酵素の例としてはＮＡＤ、　
ＮＡＩ）Ｐおよび還元型のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨで
ある。適当な酸化還元指示薬はその酸化型および還元型
を目視により、光度計によりあるいは電気化学的方法に
より、明確に区別できるものであシ、例えばテトラゾリ
ウム塩類、例えば３−（４−ヨードフェニル）、２．’
（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラ
ゾリウムクロリドおよび３７　（４，５−シメチルーチ
アゾール−２−イル）　−２，５−ジフェニル−２Ｈ−
テトラゾリウムプロミドなどである。酸化還元指示薬の
タイプに応じて、電子移動を直接に、あるいはいわゆる
電子移動剤を用いて行なうことができる。可能な電子移
動剤としては例えばフェナジンメトサルフェート、フェ
ナジンエトサルフェート、メルトラブル−およびジアフ
ォラーゼなどが挙げられる。

個々の酵素に適した基質および試験条件は文献で知られ
ているか、あるいは標準的方法により測定することがで
きる。

酵素基質は通常１０−１〜１０−５Ｍの濃度で用いられ
る。

抗生物質に対する感受性を試験しようとする細菌は、例
えば血液寒天、カゼインＲプトンー大豆粉Ｒゾトン寒天
、ブロラシン寒天または同様の栄養培地から得られた純
培養物として用いられる。試験パッチ中の細菌懸濁液は
１０５〜１０８菌数／ｒｎｌの菌数を有するべきである
。

本発明による薬剤は、好ましくは、陽イオン性、陰イオ
ン性および／または非イオン性の界面活性剤を含有する
。これらは、そのタイプは特定されない。そしてそれら
は、通常用いられる界面活性剤から選択することができ
る。例えばンルビタンエステルのポリオキシエチレン誘
導体、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート、ポリオキシエチレンソルビタンモノノミルミテー
トおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
などが適している。これらは１０−４〜１０−６Ｍの濃
度で用いられ、またこれらの界面活性剤濃度では、ムレ
イン骨格の害われていない菌体から有意量の細胞質酵素
が放出されることはない。

試験系は好ましくは、約１００μｔのサイズの多くの空
洞を有する深絞りコンポーネント、商業的に入手可能な
微量滴定板または特別なセルレールから成り、また試験
系の試薬は凍結乾燥した形にしてお（のが有利である。

本発明を次の実施例によってさらに詳細に説明する。

実施例　１ ブロラシン寒天でのエンテロバクタ−・クロアカニ（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ　）の１２〜
１８時間経過培養物（−夜培俗物、）の約１ｍＷのサイ
ズのコロニーを１−の０．１Ｍホスフェ−）緩衝剤（ｐ
Ｈ７，０）に懸濁する。微量滴定板の空洞中にある各種
濃度のアンピシリン〔Ｄ（ハ）−α−アミンベンジルに
ニジリン〕の１００μを供試溶液にそれぞれ１００μｔ
の前記細菌懸濁液を添加する。このインキュベーション
パッチにおけるアン上０シリンの最終濃度はＣ１−０，
５−１，０−２，［ｌ−４，０−８，０μ？／−である
。

試験溶液は０．１Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７，０）
中の２回濃縮ミュラー・ヒントンブロスより成り、かつ
２Ｘ１０−５Ｍの４−メチルウムベリフエリルβ−Ｄ−
ガラクトピラノシドおよび２Ｘ１０−Ｍのオクチルフェ
ノールポリエチレングリコールエーテルを含みそして前
述のアンピシリン濃間インキュベーションした後、その
微量滴定板を３６６　ｎｍにおいてＵＶランプで照射す
る。アンピシリンによるムレイン生合成阻害は、抗生物
質を有しないコントローフレ（対照）ま＊　＆’！、　
ｆｉｌ　小阻止濃度よりも低い抗生物質濃度を有するパ
ッチに比較して有意なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の
結果、試験パッチのけい光として認識することができる
。４０および８．　Ｄ　１１９７ｍ１のアンピシリンを
含有する試験パッチは有意なけい光を示す。すなわち、
これらのアンピシリン濃度では選択された試験条件下に
おいてエンテロバクタ−・クロアカニのムレイン生合成
が阻害される。

実施例　２ 血液寒天を用いたエシェリヒア・コリの一夜培養物から
０．１Ｍホスフェ−）　緩ｉ剤（ｐＨ７，ｏ　）中に約
１０７菌数／ゴを含む細菌懸濁液を調製する。微量滴定
板の空洞中にある各種濃度のサイクロセリンを含有する
１００μｔの試験溶液にそれぞれ１００μｔの前記細菌
懸濁液を添加する。この試験パッチにおけるサイクロセ
リンの最終濃度はＯ−０，５−１，０−２，０−４，０
−８，０μ？鷹である。

試験溶液は［１，１Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７，［
］）中の２回濃縮ミュラー・ヒントンブロスであり、か
つ２　Ｘ　１０−５　Ｍの４−メチルウムヘリフエ１ノ
ルβ−Ｄ−グルクロニドおよび２　Ｘ　Ｉ　Ｑ−５Ｍの
オクチルフェノールホリエチレンｉ　ＩＪコールエーテ
ルを含有しそして前記サイクロセリン濃度を有する。

その試験パッチを６７℃で３０分間インキュベーション
した後その微量滴定板を３６６　ｎｍにおいてＵＶラン
プで照射する。４．０および８０μ２／コのサイクロセ
リンを含有する試験、＜ツチ（ま有意なβ−Ｄ−グルク
ロニダーゼ活性の結果として有意なけい光を示す。すな
わち、エシェリヒア・コリの場合、選択された試験条件
下で（まサイクロセリンの最小阻止濃度は４．０μ？／
ｍｅである。

実施例　６ 血液寒天でのントロノ２クター・フロインジ（Ｃ１ｔｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　）の１６〜２０時
間経過培養物の約１鰭のサイズのコロニー１０個を５−
の０．１　Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７，４）に懸濁
する。各種濃度のアンピシリンを含有する０５−の試験
溶液にそれぞれ０．　’５　ｍｌの前記細菌懸濁液を添
加する。そのインキュベーションパッチにおける最終濃
度はＯ−０，５−１，Ｄ　−２，０−４，０−８，０−
１６，０μ？鷹である。

試験溶液は２Ｘ１０−５Ｍのオキザロアセテート、４Ｘ
１０−”ＭのＮＡＤＨおよび２Ｘ１０−５Ｍのオクチル
フェノールポリエチレングリコールエーテルを含ム０．
１　Ｍホスフェート緩衝剤（ｐＨ７，４）中の２回濃縮
ミュラー・ヒントンブロスから成る。その試験パッチを
３７℃で４５分間インキュ（−シコン後、マレートデヒ
ドロゲナーゼ活性をＮＡＤＨ含量の測定（３４０ｎｍに
おける吸光測定）により測定する。

アンピシリンによるムレイン生合成阻害は、抗生物質を
含まないコントロールまたは最小阻止濃度よりも低い抗
生物質濃度を有するバッチに比較して有意に低い３４０
　ｒａｍにおける試験／シツチの吸光として認識できる
。８．０および１６０μｙ／ｍｅのアンピシリンを含む
試験バッチは３４０ｎｍにおいて有意に低い吸光を示す
。すなわち、これらの試験バッチにおいては有意なマレ
ートデヒドロゲ′ナーゼ活性を検出することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ムレイン生合成に主作用を有する抗生物質に対
   する細菌の感受性を試験する方法であって、前記抗生物
   質と酵素基質の存在下に前記細菌から放出される細胞質
   酵素活性を直接測定することを特徴とする、細菌の感受
   性の試験方法。 （２）加水分解酵素の細胞質活性をけい光源酵素基質ま
   たは発色源酵素基質を用いて測定する、特許請求の範囲
   第１項に記載の方法６ （６）酸化還元酵素の細胞質活性を酵素基質、補酵素お
   よび所望によりけい光源または発色源の酸化還元指示薬
   を用いて測定する、特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 （４）　ムレイン生合成に主作用を有する抗生物質に対
   する細菌の感受性を試験する薬剤であって、その薬剤が
   各種抗生物質濃度の緩衝された栄養培地ならびに少なく
   とも１種の酵素基質および所望により少な（とも１種の
   補酵素さらに所望により少なくとも１種の酸化還元指示
   薬を本質的に含むことを特徴とする、細菌の感受性を試
   験する薬剤。 （５）付加的に洗剤を含有する特許請求の範囲第４項に
   記載の細菌の感受性を試験する薬剤。