JPS6156098A - 抗微生物活性物質の検出用試薬および検出方法 - Google Patents

抗微生物活性物質の検出用試薬および検出方法

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JPS6156098A
JPS6156098A JP60177775A JP17777585A JPS6156098A JP S6156098 A JPS6156098 A JP S6156098A JP 60177775 A JP60177775 A JP 60177775A JP 17777585 A JP17777585 A JP 17777585A JP S6156098 A JPS6156098 A JP S6156098A
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    • C12Q2334/00O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/10O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明tま液状試料または適当な液体に懸濁した固体試
料中の抗微生物活性物質を簡単K、しかも迅速に検出す
るための試薬および方法に関する。
動物および植物を原料とする食品中の残留抗生物質は、
これらが工業的加工処理中に経済的損害を生じさせるか
、または消費者の健康にとって潜在的危険性を有するこ
とから重大である。
抗生物質を含有する食品の加工、たとえば、醗酵孔、ヨ
ーグルトまたはチーズの生産あるいは未加熱ノーセージ
の生産における損害は、醗酵製品の製造に必須の微生物
の活性が阻害され、生産に失敗するか、ま−たけ著しい
品質上の欠陥を有する製品が生成されるという事実てよ
る。
抗生物質を含有する食品の正常の消化はヒトの健康に対
して多くの危険を含んであり、たとえば毒性障害、アレ
ルギーおよび病原性および非病原性の腸内細菌に対する
耐性発現の危@を含んでいる。
医学的診断に対して、尿、髄液または血液のような体液
中の抗生物質の水準は信頼できる診断の確立およびψ療
管理にとって極めて重要である。化学療法を行なってい
る場合には、尿中の活性抗生物質の水準が組織中の水準
に比較して多くの場合に非常;て高くなる。従って、尿
中の微生物の量を抗微生物活性用試験により微生物学的
に検査する処置を追加することが絶対的に必要である。
抗微生物性物質は多くの物理的、化学的、生化学的およ
び微生物学的方法により検出できる。
成る種の微生物阻害物質の化学的および物理的検出は、
たとえばストレプトマイシン中のグアニジノ基またはク
ロラムフェニコール中の塩素のような特徴的成分の固定
により、あるいは成る吸収極大を測定することにより行
なわれる。
免疫学的方法(放射免疫検定法、酵素免疫検定法)もま
た成る群の抗生物質の特異的検出に適している。しかし
ながら、試料の抗微生物活性物質の一連の検査では、化
学的、物理的および免疫学的方法は大部分の場合に不適
である。これはこれらの方法では一つの検査工程では化
学的に明確にさり、ている化合物あるいは化学的に明確
にされている成る基の検出だけが可能であるためである
これに対して、微生物学的試験方法は被験生物の阻害物
質に対する感受性に応じてかなりの抗微生物性物質の検
出が可能である。しかしながら、β−ラクタマーゼに対
して感受性のβ−ラクタム系抗生物貰の場合を除いて、
抗微生物性物質を簡単にしかも迅速に同定することは従
来、不可能であった。
微生物学的阻害物質に対する試験の緊理は阻害物質に対
して感受性の微生物を、阻害物質を含有しない栄養培地
中および阻害物質を潜在的に含有する栄養培地中で平行
培養する方法にもとづいており、生物の生命の顕示を測
定する。
2種の試料間に生じる差が阻害物質の存在を示す。実用
される最も重要な試験微生物はバフルス、サブチリス(
Bacillus 5ubtilis )、パフルス・
ステアロテルモフィルス(Bacillusetear
othermophilus )、バフルス、ステアロ
テルモフィルスカリドラクチス変種(Bacillus
stearothermophilus var、ca
lidolactis )、サルシナ幸ルテア(5ar
cina 1utea )およびストレプトコッカス・
テルモフィルス(5treptoco−ccus th
ermophilus )である。
抗微生物作用を有する物質の全部を一種の試験生物、た
とえばバシルス・サブチリスを使用して同じ容易さで検
出できるものではない。これは試験生物の種々の抗生物
質に対する感受性が異なるからである。前記のバシルス
種を使用すると、治療的に重要な抗生物質の主要部分を
容易に検出できる。特定の抗生物質を検出する:・ζは
、最4勺の′;:!:、験生物を抗生物質(て対する感
受性(′C応じて選択、嗜ねばならない。醗酵プロセス
の原材料中の抗生物質の検出のような特別の問題が存在
する場合には、誤った仕込みを避けるために、生産菌種
(たとえばヨーグルト生産用のヨーグルト細菌)に対す
る残留試験全直接に行なうと有利である。
それらの内生胞子形成・上方により、および前記・ζ/
ルス種訓菌の発芽相まだは成長相期間中の抗微生物活性
物質に対する高い感受性により、これらの細菌は好適な
試験生物である。
慣用の微生物学的試験方法の列には、寒天波数試検法、
濁度測定法、pH変化測定法、電位変化測定法または放
射能測定法がある。寒天拡散法では、阻害物質を含有す
るものと見做れる物質の試料を、試験微生物を接種した
固形寒天培地に適用する。もし阻害物質が存在すればこ
れは固形のもとの試料(たとえば肉の小片)から、また
は液体試料(たとえば乳、尿)で含浸した戸紙の一片か
ら寒天中に拡赦し、イ/キュベー/ヨ/後に微生物が濃
密に生育する培地上に、微生物が存在しない「阻害咄」
が生じる。基2倹生物トしてツマ/シス・ステアロテル
モフィルス・力IJ heラクチス変種を使用する最適
の寒天波数試験は2〜4時間の検出時間を要するだゆで
ある。しかしながら、すぐに使用できる試験板の貯蔵寿
命は最適貯蔵条件下でさえも2〜3週間にすぎない。さ
らに、この試験用板の製造には長時間がかかり、従って
経費が止がることになる。
濁度測定法では、阻害物質を含有しない培地および潜在
的に阻害物質を含有する培地における試験生物の生育を
試験生物の生育により生じた濁度の変化により測定する
。放射能測定による阻害物質試験方法は14c−標識性
はグルツースで培地中の試砿生物の生育を試験すること
にもとづいている。
試料中のβ−ラクタム抗生物質を検出するための迅速な
試験方法は、たとえばβ−ラクタム抗生物質と化学量論
的複合体を形成する結果として、D−アラニル−D−ア
ラニンカルボキシ被ゾチダーゼの酵素活性の阻害を検知
することKもとづいている(ヨーロッパ公開特許出願第
85.667号明細書参照)。
微生物の酵素活性を抗生物質に対して感受性の発色性捷
たは発・2光性の試験基質を用いて直接検出する方、去
は、たとえばヨーロノ・e公開時“許出願第91,83
7号明細:薯?よび同第54,001号明細書並び(て
米国特許第3,509,026号から既知である。西ド
イツ国公開特許出願i 2,930,394号明細書は
゛また、抗生物質が試験生物の細胞内ATP濃度を成る
インキュベー7ヨ/期間の後に測定することにより検出
できることを開示している。
本発明の目的は下記の要件に適合する抗微生物活性物質
の試験方法2よび試験系を提供することにある: (イ) 数時間以内に信頼できる検定結果が得られるこ
と; 10) 及生物含有凌が低い試料の場合でさえも試料を
予め殺菌することなく安全に使用できるとと; (ハ)試料中の抗微生物活性と示さない物質に対して試
験系が不感受性であること; に)実用されている抗生物質の大°部分に対して良好な
検出感度を有すること; (ホ)作業および材料の点で労苦を必要とせずに試験を
実施できること; (へ)連続的検査に適応できること; (ト)  すぐに使用できる試験系の貯w1.寿命が数
ケ月であること; (男 安価に商業的規模で製造できること;および (1刀 安易な自動化が実施できること。
驚くべきことK、本発明による抗微生物活性物質の検出
用試薬および検出方法が既知の方法に比較して前記の要
件の全部に適合することが見い出された。
従って、本発明の主題は微生物の胞子、栄養培地、指示
薬、緩衝系および場合により洗剤よりなり、指示薬がヒ
ドロラーゼ(加水分:’+’l酵素)の発色性または発
螢光性の酵素基質であることを特徴とする、試料中の抗
微生物活性物質の検出用帽1ζある。
本発明のさらに別の主題は試料中の抗微生物活性物質の
検出方法にあり、この方法は微生物の胞子、栄養培地、
ヒドロラーゼの発色性捷たは発螢光性の酵素基質、緩衝
系および1合により洗剤よりなる試験系を試料と一緒に
し、次いでインキュベートし、生じる発色団〕tたはA
 螢光団を視覚的に、または光度測定によりdlll定
することを′¥Nakとする、抗微生物活性物質の検出
方法である。
本発明による試薬および方法は、阻害物質感受性試験生
物の発色性または発蟹光性の酵素基質に対する成る種の
ヒドロラーゼ活性を直接にしかも特異的に検出すること
Kより、試験生物の性質によって多くて6時間以内に試
料中の抗微生物活性物質の検出を可能にする。
ヒドロラーゼに対する発色性または発螢光性の酵素基質
:はグリコ/−類、カルボッ敏エステル類および滅プチ
ド誘導体項であることができ、これらはその分子内(て
、本発明による方法の条件下に脱離できる発色団または
発・孟凭団全含有する。従来技術から既矧の好適な発着
先回の例には4−メチル−ウンベリフェロン、7−アミ
/−4−メチル−クマリン、フルオレセイン、α−およ
びβ−ナフトール並グメにα−およびβ−ナフチルアは
ンの誘導体がある。好適な発色団の例にはニトロアニリ
ノ、ニトロフェノールおよびジアゾ化ナフトールの誘導
体またはナフチルアミンおよびインノボの誘導体がある
発色性または9@螢光性つ酵素基質はインキュベートョ
/・パッチにおける道終濃1.′戴について、10−1
〜10−5M、好”ましくけ10−2〜10−3Mの濃
度で使用する。
発色口重たは発着先回の酵素てよる脱離:で有効であり
、および試験生物の代謝活性の検出に用いられるヒドロ
ラーゼは脂肪族カルボン酸エステル(02〜C26)の
ためのエステラーゼ;α−D−グルコンダービ、β−D
−グルコシダーゼ、α−D−ガラクトシダーゼ、β−D
−キシロシダーゼのようなグリコシダーぜ;D−アラニ
ン−アミノ被ブチダーゼ、L−ピログルタミン酸アミノ
滅ブチダーゼ、グリシン−アミノ被ブチダーゼまたはL
−アルギニン−アミノペプチダーゼのようなアミノ被ブ
チダーゼである。
阻害物質試験に使用すると好ましいバフル2種細菌は、
たとえば発微光団として4−メチルウンベリフェリルを
用いて、脂肪族カルボン酸エステルに対して非常に高い
エステラーゼ活性を有する点が特長である。
たとえば、バシルス・サブチリスは次の発電光性基質に
対して優れたエステラーゼ活性を示f:4−1チルウン
ベリフェリルアセテート、フルオレセインジアセテート
、4−メチルウノベリ7エリルデロピオネート、4−メ
チルウンベリフェリルブチレート、4−メチルウンベリ
フェリルニーブチレート、4−メチルウンベリフェリル
バレレート、4−メチルウンベリフェリル1−バレレー
ト、4−メチルウンベリフェリルトリメチルアセテート
、4−メチルウンベリフェリルカプロエート、4−メチ
ルウンベリフェリルへブタノエート、4−メチルウンベ
リフェリルカプリレート、4−メチルウンベリフェリル
カプレ−ト、4−メチルウンベリフェリルカプレート、
4−メチルウンベリフェリルラウレート、4−メチルウ
ンベリフェリルミリステート、4−メチルウンベリフェ
リル・♀ルミテート、4−メチルウノベリ7エリルオ7
エート、4−メチルウンベリフェリルラウレート、4−
メチルウンベリフェリルステアレートおよび4−メチル
ウンベリフェリルカプリレート。
種々の基質についてのエステラーゼ・古注の大部分は前
記・ミシルス種試験微生物(これらの試験生物は特に高
い酵素活性を有する点でだけ特異である)においてだけ
ではなく生じるけ?1ども、ある種のグリコシダーゼ、
中でもα−D−グルコシダーゼはバシルス・サブチリス
、ハ/ルス・ステアロテルモフィルスおヨヒハ/ルス・
ステアロテルモフィルスカリ1゛ラクチス変種:テ対し
高度の特異性を有する。大部分のダラム陰性およびダラ
ム鴛注細菌では、試験条件下)て僅かにだけα−D−グ
ルコ/ダーゼ活性を検出できるか、または全く検出でき
ない。従って、α−D−グルコ7ダーゼは阻害′物質耐
性細菌を含有する試料においてさえも、バシルス・サブ
チリス、バシルス・ステアロテルモフイルスマタはバシ
ルス、ステアロテルモフィルス・カリドラクチス変fm
の代謝活性を検出するための阻害物質試論に匝めて好適
である。バシルス・サブチリスidまた良好なβ−D−
グルコ/ダービ2よびα−D−ガラクト7ダーゼ活性を
有する。
バシルス・ステアロテルモフイルスは同mK、良好なα
−D−ガラクトシダーゼ活性を示す。
本発明による試−炙がバシルス・サブチリスの胞子を含
有する場合に、グリコシダーゼ用の発色性または発螢光
性の基質としてβ−D−ゲルコンドまたはα−D−グル
コシドを用いると好1しく、そしてアミノペプチダーゼ
用にはD−アラニンー(発色団/発着先回)化合物また
にD−アラニン(発色団/発電シを団)と含有する啄プ
チドを使用すると好ましい。本発明による試薬がバシル
ス・ステアロテルモフィルスの胞子を含有する場合には
、発色性または発螢光性の基質としてα−D−グルコ/
ドまたはα−D−がラクトシトを使用すると好ましい。
たとえば、p−ニトロフェニルα−D−グルコシド、4
−メチルウンベリフェリルα−D−グルコシド、フルオ
レツセンα−D−グルコシド、α−4たはβ−ナフチル
α−D−グルコ/ト、インドキシルα−クーグルコシl
−”、5−7’ロモー3−インドキンルα−D−グルコ
シド、5−7’ロモー4−クロル−3−インドキフルα
−D−グルコシドおよびインドキンルα−D−グルコシ
ド−インタアセテートをα−D−グルコシダーゼに対す
る基質として使用できる。
試験条件下に、パンルス・サブチリスは発電光性基質と
してのD−アラニン−7−アミド−4−メチルクマリン
に対して、または発色性基質としてのD−アラニン−p
−ニトロアニリンに対して格別の、しかも微生物特異性
のD−アラニア−アミノ滅ブチダーゼ活性を示す。もう
一種の適当な、居室はグリシン、アラニン、ノζリン、
ロインノ、イノロイノン、アスノQラギン駿、グルタミ
ン酸等のようなアミノ酸をD−アラニン(発色団/発着
−et団)化合シ吻のN末端にさらに含有する啄プチド
誘導体、たとえばグリシル−D−アラニニノー7−アミ
ドー4−メチルクマリンである。
バンルス・サブチリス、バフルス、ステアロテルモフィ
ルスまたはバシルス・ステアロテルモフィルス力リドラ
クチス変種をインキュベーション・バッチ1個当り10
′〜10°胞子濃度で抗微生物活1生物質用の試験生物
として使用すると好ましい。抗微生物活性物質検出に、
細菌胞子の代りに使用できるものとして、カビ胞子も抗
A繭物質の検出eこ使用できる。抗真菌性物質に幻して
適当な試験生物には、たとえばデルモトフイチスの場合
にはトリコフィトン・ルブルム(Trichophyt
□n rubrum )およびトリコフィトン・スコエ
ンライニイ(TriChOph7tOn 5choen
−1eini工)があり、そして病原性酵母菌の場合に
はカンジグ・アルビカンス(Candida albi
cans)およびトルロプシス・グラブラータ(Tor
ulo−psis glabrat& )がある。アス
滅ルギルス(A8−pergilus )またVi啄ユ
ニシリウム Penicilli−um)種も抗真菌性
物質の一般的検出に使用できる。
使用できる栄養培地の例には適当な暖衝液、たとえばリ
ン酸塩緩im、トリス/ HCI緩衝液またはその他の
慣用の緩衝剤系中のミューラーーヒントン(MtyFJ
LLzR−H工NToN)ブロス、脳/心臓ブロスおよ
びカゼイン・ペプトン/大豆粉ベプト/ブロスがちる。
好適な緩衝剤は0.1Mリン酸カリウム緩衝剤である。
緩衝剤およびりI(値の選択は検出しようとする酵素の
最適試験条件および試験生物のための最適生理学的条件
によって変わる。当業者ならばJ′&適条件を慣用の方
法により決定できる。
それらの第1作用部位がミュレイノの生合成にある抗生
′物質の場合には、検出感度は細菌の生育に対して負の
作用と有しない濃度で洗剤と試験混合・物に加えること
により改善できる。ミュレイン生合成が損われた細砲は
洗剤の存在で崩壊され、酵素活性の測定において試験生
物の正常な阻害されていない生育を擬装する大型な形状
を取らない。洗剤は意図する最終濃度について10−′
〜10−’Mの濃度で1吏用すると好ましい。
好ましくは、本発明による試薬はカチオノ性、アニオン
注、しよび(′または)非イオン性洗剤、たとえば、1
リオキ7エチレンンルビタンモノラウレート、ソルビタ
ンモノ/9ルミテートおよびソルビタンモノオレエート
のようなソルビタンエステルの:Pリオキシエチレン誘
導体を含有する。
試験混合物16当り19より多いグルコース濃度は時に
はグリコシダーゼを抑制することがある。この「グルコ
ース作用」ハグルコースの酸化によシ補償することがで
きる。
本発明てよる試薬および方、去により検出できる多くの
抗微生物活性物質試験としては下記・つ物質をあげるこ
とができる:ストレゾトマイ/ン、ネオマイ7)、カナ
マイ7ノ、ダ/タマイシンおよびス被クチネオマイ・/
ンのようなアミノグルコノド抗生′物質;チアムフエニ
コールのようなりロラムフエニコールおよびその誘導体
;エリスロマイ/ン、ロイコマ・r/ノ、オレア/ドマ
インン、スピラマイシンおよびカルボマイシンのような
マクロライド抗生物質;クリンダマイシンおよびり/コ
マイン/のようなりノコマイシン類;フェノキンメチル
滅二/リン、アムぜシリン、滅ニシリ/G 、  O二
/リンv1 ノクロキサンリンナトリウム、フロキサ/
リンおよびメ/リナムのようなイニ7リン類;セファロ
チ/、セフアマ/r−ル、セファゾリン、セホキ7チ/
およびセフロキ/ムのようなセファロスポリン類;バフ
トラシン、グラミノジノおよびポリミキシンのようなペ
プチド抗生物質;リファムピ//およびリファマイ7ノ
のようなリファマイシン類;7ノデイツク駿のようなス
テロイド抗生物質;ドキシサイクリン、ミノサイクリン
、クロルテトラサイクリンおよびオキシテトラサイクリ
ンのようなテトラサイクリン類;並び(その他の抗生物
質、たとえば7クロセリン、ホスホマイシン、パンコマ
・rシン、スルホンアミド類、ニトロフラントインおよ
びナリデイクス殴。
種々の抗微生・吻活性物質の検出A8度は1吏用する試
験生物の阻害物質感受性、インキュベーション・バッチ
中の試験生物の数および栄養培地の組成に応じて変わシ
、既知の阻害物質試験の感度に少なくとも相当する。抗
微生物活性物質試験を実施するに要求される労苦は本発
明による方法で最小限にすることができる。すぐに使用
できる試験混合′匈の構成成分は乾燥杉であるので、少
なくとも数ケ月の充分な貯蔵寿命が保証笹れる。
本発明?こよる抗微生物活性物質の試験方法は非常に簡
単である。すなわち、液状、試料または適当な液体に懸
濁した試、科をすぐに使用できる配列形試験用具の反応
液中に入れ、この試験系を試験生物の最適生育温度でイ
ンキュベートする。試験生物としてバンルス・サブチリ
ス胞子を使用した場合には、たとえば試料中の抗微生物
活性物質の存在についての信頼できる情報を試験生物の
最適生育温度における4時間のインキュベーション期間
の後に、色素産生性〜または発・談光性の酵素基質の加
水分解的分解部分の濃度を胞子の発芽tJ If K応
じてo+ 2すること)でより得ることができる。この
試験の信顆でさる評価は試験用具における発色団の呈色
強度または発着先回の螢光強度を標準と比較することに
より裸眼で実施できる。抗微生物活性物質の濃度が最低
抑止濃度より大であるかまたは等しい場合には、酵素基
質は阻害物質を含有しない試料と比較して最低両度でだ
け加水分解的に分解されるか、または全く加水分解的に
分解さnない。
乾燥形態であるすぐに使用できる試験混合物は次の組成
を有する。試験生物の胚(好ましくは胞子)、栄養培地
、ヒドロラーゼのための色素12′r生性または発螢光
性酵素基質、適当な緩′衝系および場合により洗剤。し
かしなから、試験混合物に1−iた干渉性物質を排除す
るための成分、たとえばグルコース酸化用の酵素を含有
できる。
試験系は、所望により、0゜5〜l a6寸法の多数の
凹部を有する深穴部品種たは注入成型部品、あるいは市
販の微滴定板よりなる。イ/キュベーノヨ/中の液体の
損失を口締するために、試験系の凹部は妾着性フィルム
または結合性ンートにより、あるいはフタにより閉鎖す
ることができる。乾燥形態であるすぐに1更用できる試
験混合物の構成成分は凹部内で液体に対し高い吸着能力
を有する担体(たとえば戸紙小片)に適用しておくこと
ができる。別法として、すぐに使用できる試験混合物の
構成成分はまた液体に対して高い吸音能力を有する試験
棒状体の反応帯域に適用することもできる。試料は液体
に対して明確な吸着能力を有する試験ストリップの1個
または数個の反応帯域に浸出方法により適用できるか、
または一定寸の試料をピ梗ノド:てより反応帯域に適用
する。すぐVC使用できる試験混合物の構成成分は各反
応帯域、Iこついて変えることができる。たとえばpH
!、!E 、緩衝系、酵素基質、試験生物、栄養培地並
びに洗剤の種頃および濃度を変えることができる。
試験ストリップ上の反応帯域は、たとえば特別の戸紙お
よび(または)たとえばカルボキンメチルセルロース、
アルギニン酸カルシウム、ポリビニルアルコールまたは
ポリビニルピロリドンの重合体系マトリックスよりなる
ことができる。試験生物はまた担体江固定することがで
きる。インキュベーション中の乾固を防止するために、
試験ストリップは適当な形状の、適度に堅く封鎖できる
インキュベー7ヨ/容器に貯蔵する。
本発明を次側によりさらにμ則に説明する。
例  1 パシルス・ステアミテルモフィルスのα−り一グルコシ
ダーゼ検出用の阻害物質試験すぐに使用できる試験系の
製造: pH7,5の0.1MIJン酸カリウム緩衝液中の10
倍濃縮ミューラーーヒントンプロス父μl、p−二トロ
フエニ、ルα−D−グルコ7)’010−2M水溶液閣
μeおよびポリエチレングリコールモノ−p −(1,
1,3,3−テトラメチルブチル)−フェニルエーテル
の5X10−’M浴溶液0μgをl tn6ボリスチレ
ン製キュベツト中に入れる。溶液を次いで凍結乾燥させ
る。パシルス、ステアロテルモフィルス〔カントラット
(KUNDRAT ) )と5×107胞子/ 7It
含有する水性胞子懸濁液10μノを凍結乾燥物に加え、
混合物を次いで再び真空凍結乾燥させる。真空凍結乾燥
後に、すぐに使用できる試験キュベツトに7メとして、
アルミニウム8It層したノリエチレンフィルムの袋中
に密封し、次いで使用時まで4〜6℃で冷却貯蔵する。
インキュベーター試験操作: フェノキンメチル被ニジリンOO/ 0.510.11
0.05 / 0.01 / 0.005 / 0.0
01 / 0.0005、α9 / mlを含有する試
料水溶液0.5〜lをそれぞれ一つのすぐに使用できる
試験キュベノ)K入れる。キュベツトを閉め、ω℃で4
時間インキ ・ユベーションする。IN水酸化ナトリウ
ム溶液刃μeを加えた後K、試験混合物の390nmで
の吸光値を測定する。
フェノキシメチルペニシリンを含有しない試料およびフ
ェノキンメチルベニ/リン0.001およびo、ooo
sμ!i/meを含有する試料はフェノキシメチル被ニ
ジリン濃度が0.005μ0/−またはそれより高い試
料の場合に比較して390nnで格別に高い吸光値を示
す。
従って、この選択された試験や注におけるフェノキシメ
チルペニシリンの検出限界はo、oosμ777〜lで
ある。
例  2 バフルス・サブチリスの、ターD−グルコシダーゼ検出
用阻害′物質試験 すぐに使用できる試験系の製造 複数の戸紙片(直径9電)を−7,5の0.1 Mリン
酸塩緩衝液中のカゼ・f7−2プトン/大豆粉認ゾトン
プaス50 tt eで処理する。試験紙片と次いで・
10°Cで乾燥さぜる。次いで、エタノール中のp−ニ
トロフェニくしβ−D−グルコシド、7)10−”M@
液刃μeを試験紙片上にピペットで分配し、40℃で乾
燥させる。107胞子/meを含有するバシルス・サブ
チリスの水性胞子懸濁1 toμjを次いで乾燥してい
る試験紙片に適用する。これらを次いで40℃で再び乾
燥させ、それぞれ2ratねじ栓付きジャーの中に包装
する。これらのすぐに使用でさる試験2紙片は使用時ま
で4〜6℃で貯蔵する。
阻害物質試験操1t: クロラムフェニコールを32/16/8/4/2/1 
/ 0.5 / 0.25μ9 / I+Ilの4度で
ミルク試料に加える。1枚のすぐに使用できる試′!A
紙片に各ミルク試料をそれぞh浸み込捷せ、次いで再び
ねじ栓付きジャー(て戻す。かたく密封したねじ栓付き
゛ジャー全37℃で4時間インキユベーショノした後K
、IN水酸化ナトリウム溶液美μgを各試験紙片eこそ
れぞれ適用する。
ミルク試料中にクロムフェニコールを含有しない試m紙
片およびクロラムフェニコール0.25督よび0.5μ
F 1rrr&を含有する試験紙片は、2μ9/ ml
およびそれより高いクロラムフェニコール濃度を有する
ミルク試料に浸した試験紙片に比較して、強い黄色を示
す。クロラムフェニコール1.0μI/ゴを含有する試
験紙片は淡黄色呈色を示す。
従って、このような試験条件(lこb・けるタコラムフ
ェニコールの検出)S艮界は1〜2μ9 /r、Ilで
ある。
例  3 パンルス・サブチリスのブチレートエステラーゼ検出阻
害物°霞試験 すぐに使用できる試験系の製造: 複数の戸紙片(直径9 ox )を;)Il3.sの0
.1 Mリン酸塩緩衝液中のミューラーーヒントンプコ
ス50μeおよびアセトン中の・をメチルウンベリフェ
リルブチレートの2X10−”M溶液3μeで処理する
。これらの試験紙片を温かい空気流中で40℃で乾燥さ
せる。10°′j泡子/コ全含有するバシルス・サブチ
リスの水性胞子懸濁液10μlを次いで乾燥している試
験紙片に適用する。次いで試験紙片を温かい空気流中で
40℃で再び乾燥させ、使用時まで2bxtねじ栓付き
ジャー中で4〜6℃で貯蔵する。
阻害物質試験操作。
試験紙片を種々の濃度(16/8/4/2/110.5
 / 0.25 / 0.1 / 0.05 / 0.
025 / 0.01μI/ me ) Dテトラサイ
クリンと含有するpH6,5の0.1MIJMリン酸塩
緩衝液中、次いでぬじ役付きジャー中に戻す。堅く俺を
したねじ栓付きジャーヲ37℃で4蒋間インキュベーシ
ョンした後K、試験紙片の螢光を366nm波長の照射
により検査する。
試料中ンこテトラサイクリンを含有しない試験片および
詞書中にテトラサイクリンを0.0110.02510
.05 Djl/me含有する試験紙片u 試料中K 
O、1ttjl 7m1−4たはそれより高い′a度で
テトラサイクリンが含有されていた試1倹1紙片に比較
して強い青色螢光を示す。従って、これらの試験条件に
おけるテトラサイクリンの検出限界は0.1 ttll
/mlcある。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)微生物の胞子、栄養培地、指示薬、緩衝系および
    場合により洗剤よりなる試料中の抗微生物活性物質の検
    出用試薬であつて、指示薬がヒドロラーゼの発色性また
    は発螢光性の酵素基質であることを特徴とする検出用試
    薬。
  2. (2)発色性または発螢光性の酵素基質がグリコシド、
    カルボン酸エステルまたはペプチド誘導体である、特許
    請求の範囲第1項記載の試薬。
  3. (3)バシルス・サブチリスの胞子およびグリコシダー
    ゼの発色性または発螢光性の基質と してβ−D−グルコシドまたはα−D−グルコシドを含
    有する特許請求の範囲第1項または第2項に記載の試薬
  4. (4)バシルス・ステアロテルモフイルスの胞子および
    グリコシダーゼの発色性または発螢光性の基質としてα
    −D−グルコシドまたはα−D−ガラクトシドを含有す
    る、特許請求の範囲第1項〜第3項のいづれか一項に記
    載の試薬。
  5. (5)バシルス・サブチリスの胞子およびアミノ−ペプ
    シダーゼの発色性または発螢光性の基質がD−アラニン
    (発色団/発螢光団)化合物またはD−アラニン(発色
    団/発螢光団)含有ペプチドを含有する、特許請求の範
    囲第1項〜第4項のいづれか一項に記載の試薬。
  6. (6)乾燥形または凍結乾燥形である特許請求の範囲第
    1項〜第5項のいづれか一項に記載の試薬。
  7. (7)重合体系マトリックス中に存在する特許請求の範
    囲第1項〜第6項のいづれか一項に記載の試薬。
  8. (8)試料中の抗微生物活性物質の検出方法であつて、
    微生物の胞子、栄養培地、ヒドロラーゼの発色性または
    発螢光性の酵素基質、緩衝系および場合により、洗剤よ
    りなる試験系を試料と一緒に合わせ、次いでインキユー
    ベーシヨンし、放出された発色団または発螢光団を視覚
    的にあるいは光度測定により測定することを特徴とする
    、抗微生物活性物質の検出方法。
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EP0174477A1 (de) 1986-03-19
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