SK279176B6

SK279176B6 - Spôsob enzymatického stanovenia antibiotík s beta-

Info

Publication number: SK279176B6
Application number: SK1246-91A
Authority: SK
Inventors: Jaques Degelaen; Jean-Marie Frere
Original assignee: Ucb-Bioproducts S.A.
Priority date: 1990-04-30
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1998-07-08
Also published as: PT97511A; HU911441D0; DE69111149T2; DE69111149D1; AU7622691A; IE911433A1; ES2075414T3; JP2823382B2; GB9009692D0; HUT58825A; YU48050B; PT97511B; EP0468946B1; DK0468946T3; CA2040180C; CS9101246A2; FI912054A; ATE124998T1; NO911692D0; FI912054A0

Description

V súčasnosti sa antibiotiká vo veľmi širokej miere používajú nielen ako terapeuticky účinné látky pri liečení infekčných ochorení, vyvolaných baktériami, ale tiež ako konzervačné prostriedky v potravinách a ako prísady v kŕmnych zmesiach na výživu zvierat, stimulujúce ich rast. Čím ďalej, tým viac sa javí potreba detekovať prítomnosť antibiotík, a najmä veľmi nízku koncentráciu antibiotík, v komplexných biologických tekutinách, akými sú napríklad mlieko, moč, krv, sérum, sliny, mäsové extrakty alebo fermentačné tekutiny, alebo vo vodných pufrovaných prostriedkoch.

Výroba mlieka je toho typickým príkladom. Je veľmi dobre známe, že sa na liečenie niektorých infekčných ochorení dobytka, produkujúceho mlieko, napríklad pri liečení mastitídy, používajú penicilíny. Ale z evidentných lekárskych dôvodov musí byť mlieko, určené na konzumáciu ľuďmi, principiálne bez stôp antibiotík. Ostatne koncentrácie penicilínu 0,005 U.I./ml alebo menej môžu mať za následok určité problémy pri výrobe produktov, odvodených z mlieka, napríklad pri výrobe syrov alebo jogurtov. Okrem toho nariaďujú zákonné normy niektorých zemí koncentráciu antibiotík, nepresahujúcu hodnotu 0,004 U.I./ml.

Ukazuje sa teda nevyhnutným môcť rýchlo a presne stanoviť koncentráciu penicilínu v mlieku, produkovanom dobytkom, a to výhodne už priamo na ľarme.

Už dlho existujú mikrobiologické postupy, ktoré umožňujú stanoviť relatívne nízke koncentrácie antibiotík s B-laktámovým jadrom v biologických tekutinách. Tieto postupy sú založené na odmeraní inhibície rastu mikroorganizmov, citlivých na antibiotiká, v prítomnosti vzorky testovanej biologickej tekutiny. Ale tieto postupy vyžadujú mnoho času a relatívne značné technické vybavenie. V najlepšom prípade sa čas, potrebný na získanie výsledkov, pohybuje od asi 2 do 3 hodín, čo je v praxi neprijateľné.

Bol navrhnutý rýchly mikrobiologický postup detekcie prítomnosti antibiotík v biologickej tekutine, najmä v mlieku, ktorý je opísaný v americkom pat. spise 4 239 852.

Podľa tejto metódy sa vzorka biologickej tekutiny, v ktorej má byť stanovená prípadná prítomnosť antibiotika, inkubuj e jednak s bunkami alebo časťami buniek mikroorganizmu, veľmi citlivého na antibiotiká, napríklad mikroorganizmu Bacillus stearothermophilus, a jednak s antibiotikom, označeným rádioaktívnym izotopom alebo enzýmom. V priebehu inkubácie súperí antibiotikum, prípadne obsiahnuté vo vzorke, a označené antibiotikum pri obsadzovaní receptorových miest uvedených buniek alebo častí buniek. Potom sa stanoví množstvo označeného antibiotika, fixovaného na uvedených bunkách alebo častiach buniek; to potom ukáže na prítomnosť (alebo neprítomnosť) antibiotika vo vzorke, pričom platí, že množstvo fixovaného označeného antibiotika je nepriamo úmerné koncentrácii antibiotika vo vzorke.

Podľa autora patentu umožňuje tento spôsob detekovať koncentráciu antibiotika v mlieku 0,01 U.I./ml alebo dokonca 0,001 U.I./ml a to v čase málo kratšom ako 15 minút.

Hlavný nedostatok postupu však spočíva v tom, že na dosiahnutie výsledku je nevyhnutné použiť antibiotikum značené rádioaktívnym izotopom (¹⁴C alebo ¹²⁵J), ktoré je treba dávkovať pomocou špeciálneho dávkovacieho zariadenia, ktorým je napríklad scintilačný počítač. Okrem toho manipulácia s rádioaktívnym materiálom, aj keď ide iba o veľmi malé množstvá, vždy predstavuje pre personál, ktorý stanovenie uskutočňuje, určité riziko.

Je síce pravda, že v príklade 2 uskutočnenia tohto patentu je opísaný variant uvedeného rádioaktívneho stanovenia, pri ktorom sa používa antibiotikum, značené enzýmom, a pri ktorej sa množstvo značeného antibiotika stanovuje vizuálnou colorimetrickou metódou, ale tento variant umožňuje iba stanoviť, či je vo vzorke mlieka prítomné viac (alebo menej) ako 0,05 U.I./ml penicilínu. Tento variant je teda výrazne menej citlivejší a teda aj omnoho menej zaujímavý.

Komerčne sú takisto dostupné testy, založené na použití monoklonálnych alebo polyklonálnych protilátok. V skutočnosti je známe, že tieto testy môžu byť vykonané pri použití klasických imunologických diagnostických techník (ELISA, aglutinácia v latexe, radioimunologická metóda atď.). Ako príklad testov tohto typu je možné uviesť SPOT-test, ktorý je komerčne dostupný v firme ANGENICS (US).

Nevýhody testov tohto typu spočívajú v skutočnosti, že sú všeobecne veľmi zložité a že umožňujú detekovať iba veľmi obmedzený počet antibiotík. Vysoká špecifickosť použitých protilátok umožňuje určiť iba tých členov skupiny antibiotík, ktoré sú špecifické pre proti látky, použité na imunizáciu. Je to chúlostivý problém hlavne v prípade skupiny B-laktámov.

Takisto je známy enzymatický spôsob, umožňujúci stanoviť nízke koncentrácie antibiotík s B-laktámovým jadrom v ľudskom sére a v mlieku (J.-M. Frere a kol., Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 18 (1980, č. 4), 506-510).

Tento spôsob (ďalej nazývaný ako spôsob J-M. Frerea) je zaujímavejší, pretože pri jeho uskutočňovaní nie je treba použiť rádioaktívne látky, vyžadujúce relatívne nákladné technické vybavenie, a vzhľadom na skutočnosť, že ide o veľmi rýchle a pozoruhodne presné stanovenie. Tento spôsob je založený na použití špecifického enzýmu, ktorým je v danom prípade exoceluláma rozpustná D-alanyl-D-alanin-karboxypeptidáza, ktorá je produkovaná mikroorganizmom Actinomadura R 39 (predtým Streptomyces R 39). V nasledujúcom opise bude tento enzým označovaný ako enzým R39. Tento enzým má špecifickú aktivitu hydrolyzovať koncové skupiny D-alanyl-D-alanín rôznych peptidov, čo je sprevádzané uvoľnením koncového D-alanínu.

Ďalšia dôležitá charakteristika enzýmu R39 spočíva v tom, že reaguje s antibiotikami s B-laktámovým jadrom pri veľmi rýchlom vzniku inaktívneho a v podstate ireverzibilného ekvimolekulámeho komplexu enzým-antibiotikum.

Pri spôsobe J-M. Frera sa využívajú uvedené vlastnosti enzýmu R39 na stanovenie veľmi nízkych koncentrácií antibiotík s B-laktámovým jadrom. Tento spôsob má tri základné stupne.

V prvom stupni je stanovený objem vzorky tekutiny, v ktorej sa má stanoviť prípadný obsah antibiotika, inkubuje sa stanoveným množstvom enzýmu R39. Táto inkubácia sa uskutočňuje pri podmienkach, umožňujúcich reakciu prípadne prítomného antibiotika vo vzorke s uvedeným enzýmom pri vzniku inaktívneho a v podstate ireverzibilného ekvimolekulámeho komplexu enzým-antibiotikum.

V druhom stupni sa spoločne s produktom, získaným v prvom stupni, inkubuje stanovené množstvo substrátu, kto rým je napríklad N^alft, N^epsilon-diacetyl-L-lyzil-D-alanyl-D-alanín, pri podmienkach umožňujúcich hydrolýzu substrátu enzýmom pri vzniku takého množstva D-alanínu, ktoré zodpovedá zvyškovej aktivite enzýmu R39, ktorý nebol viazaný do komplexu s antibiotikom v prvom stupni.

V treťom stupni sa potom stanoví takto vytvorené množstvo D-alanínu. Je ľahko pochopiteľné, že množstvo D-alanínu, vytvorené v uvedenom druhom stupni, závisí od zvyškovej aktivity uvedeného enzýmu, pričom toto množstvo je nepriamo úmerné množstvu antibiotika, prítomného v meranom roztoku.

Pri spôsobe J-M. Frera sa toto množstvo D-alanínu stanovuje enzymatickou metódou. Toto stanovenie spočíva v dvoch združených enzymatických reakciách. Pri prvej reakcii sa D-alanín oxiduje na kyselinu pyrohroznovú pomocou D-aminoacid-oxydázy (v prítomnosti jej koenzýmu, ktorým je flavín-adenín-dinukleotíd); súčasne sa vytvorí zodpovedajúce množstvo peroxidu vodíka zo vzdušného kyslíka. Pri druhej reakcii sa takto vytvorený peroxid vodíka použije na oxidáciu o-dianizidínu pomocou peroxydázy. Vytvorí sa hnedé zafarbenie, jeho intenzita zodpovedá množstvu D-alanínu.

To umožňuje stanoviť množstvo D-alanínu colorimetrickou metódou, a to buď vizuálne, alebo meraním optickej hustoty spektrofotometrom (lambda max. = 460 nm).

Ak sa pripraví séria vzoriek známej koncentrácie a ak sa tieto vzorky použijú pri uvedenom spôsobe, potom je možné vyniesť kalibračnú krivku, znázorňujúcu závislosť percentuálnej zvyškovej enzymatickej aktivity enzýmu R39 od koncentrácie antibiotika v testovanej vzorke.

S cieľom získať kvantitatívny údaj koncentrácie antibiotika v meranej vzorke sa pri stanovení tejto koncentrácie v meranej vzorke postupuje presne rovnakým spôsobom a hľadaná koncentrácia sa potom ľahko odpočíta z uvedenej kalibračnej krivky.

Toto kvantitatívne stanovenie koncentrácie antibiotika vo vzorke však jednoznačne vyžaduje použitie spektrofotometra.

Aj tak však pri stanovení, pri ktorom ide o zistenie, či koncentrácia antibiotika vo vzorke presahuje alebo nepresahuje určitú kritickú hodnotu, nie je nevyhnutné používať uvedený spektrofotometer alebo iný podobný merací prístroj.

V tomto prípade stačí predbežne poznať, pri ktorej kritickej koncentrácii antibiotika je aktivita enzýmu R39 úplne potlačená, alebo inak povedané, pri ktorej koncentrácii antibiotika sa už netvorí D-alanín a teda už nedochádza k uvedenému hnedému zafarbeniu. Ak teda poznáme uvedenú kritickú koncentráciu, potom je zrejmé, že je možné napríklad jednoduchým vizuálnym posúdením výsledku stanovenia posúdiť, či daná vzorka obsahuje koncentráciu antibiotika vyššiu alebo nižšiu, ako je uvedená kritická koncentrácia. Je teda zrejmé, že týmto spôsobom je možné aj bez zvláštneho prístrojového vybavenia rýchlo a presne stanoviť, či mlieko obsahuje prípustnú alebo neprípustnú koncentráciu antibiotika.

Okrem toho tento spôsob umožňuje stanoviť relatívne nízke koncentrácie antibiotík s B-laktámovým jadrom v mlieku a v ľudskom sére. Tak napríklad, ak sa vychádza zo vzorky mlieka s objemom asi 20 μΐ a ak sa tieto vzorky inkubujú s 3 pikomólmi enzýmu R39, potom je možné stanoviť kvantitatívne (s použitím spektrofotometra) koncentrácie penicilínu v mlieku, rovné až 0,02 U.I./ml; kvantitatívne je tiež možné stanoviť s použitím opísanej vizuálnej metódy koncentráciu penicilínu v mlieku vyššiu ako 0,09

U.I./ml. Výsledky obidvoch stanovení sú k dispozícii v čase kratšom ako je jedna hodina.

Aj tak uvedený spôsob J-M. Frera má niektoré výrazné nedostatky.

Predovšetkým citlivosť spôsobu J-M. Frera je hlavne v prípade stanovenia antibiotík v biologických tekutinách (mlieko, sliny, sérum a podobne) nedostatočná. Je síce pravda, že túto citlivosť je možné zvýšiť buď znížením použitého množstva enzýmu R39, čo má ale za následok predĺženie reakčného času tak v prvom, ako aj v druhom stupni uvedeného spôsobu, alebo zväčšenie objemu vzorky', ktorú je treba inkubovať uvedeným enzýmom R39, pričom v tomto prípade je treba predĺžiť reakčný čas v prvom stupni uvedeného stanovenia.

Nie je možné zvyšovať citlivosť spôsobu J-M. Frera týmto spôsobom najmä v prípade komplexných tekutín biologického pôvodu. V skutočnosti bolo konštatované, že je nemožné vykonať vhodné stanovenie v prípade, ak objem vzorky biologickej tekutiny prestúpil určitý kritický objem, ktorý je závislý od charakteru uvedenej biologickej tekutiny. V prípade mlieka a séra je možné v prípade, keď objem vzorky, určenej na inkubáciu, prekračuje objem ± 50 μΐ, pozorovať, že množstvo vytvoreného oxidovaného o-dianizidínu je silne znížené.

Nakoniec v prípade moču sa nedetekuje žiadna enzymatická aktivita a to dokonca ani v prípade, keď sa použijú také malé vzorky ako 10 μΐ. Je preto nemožné použiť tento spôsob na stanovenie antibiotík v moči.

Predpokladá sa, že biologické tekutiny obsahujú látky, ktoré inhibujú účinok enzýmov, použitých pri tomto spôsobe stanovenia. Prakticky to znamená, že použitie veľkých objemov vzoriek ide v najlepších prípadoch na úkor zvýšenia množstva reagencií, ktoré je prinajmenej úmerné zväčšenému objemu.

Preto takéto zväčšovanie objemu vzoriek nie je možné odporučiť najmä vzhľadom na to, že použité enzýmy, najmä D-aminoacid-oxydáza a jej kofaktor flavín-adeni-dinukleotid, sú veľmi drahé.

Komerčne dostupná je tiež zlepšená verzia spôsobu J-M. Frera; táto verzia má formu testu, nesúceho označenie Penzym. Tento test je používaný hlavne ako triediaci vstupný test na mlieko, ktoré je privážané do mliekarní.

Tento test sa uskutočňuje v dvoch stupňoch. V prvom stupni sa 50 μΐ mlieka inkubuje s 1,5 pikomólu enzýmu R39 počas 5 minút pri teplote 47 °C. V druhom stupni sa potom do inkubačného prostredia pridajú všetky reakčné zložky, umožňujúce stanoviť zvyškovú enzymatickú aktivitu, t. j. v danom prípade substrát N^llft, N^eľ''^l ^r-diacetyl-L· -lyzyl-D-alanyl-D-alanín, D-aminoacid-oxydáza, flavínadenín-dinukleotid, peroxydáza a chromogénna reakčná zložka, následne sa takto získaná zmes inkubuje počas 15 minút pri teplote 47 °C. Po ukončení inkubácie sa zafarbenie porovná s farebnou vzorkovnicou, pričom žlté zafarbenie bez stôp ružovej znamená prítomnosť antibiotík s Blaktámovým jadrom v koncentrácii vyššej ako 0,17 U.I./ml mlieka. Naopak ružové zafarbenie znamená buď neprítomnosť antibiotík (intenzívne ružové zafarbenie), alebo prítomnosť antibiotík v koncentrácii nanajvýš sa rovnajúcej 0,017 U.I./ml pričom intenzita ružového zafarbenia je nepriamo úmerná koncentrácii antibiotika, prítomného vo vzorke mlieka.

Vďaka tomuto testu je možné vizuálne stanoviť koncentráciu antibiotík v mlieku pri tak nízkych hodnotách ako je koncentrácia 0,017 U.I./ml, a to počas 20 minút.

Ani táto optimalizovaná verzia spôsobu J-M. Frera však nemá rýchlosť a citlivosť, ktoré by umožňovali jej po užitie buď v zemiach, v ktorých zákonné normy povoľujú iba extrémne nízke koncentrácie antibiotík, napríklad koncentrácie 0,004 U.I./ml, alebo ako ultrarýchlu metódu stanovenia, ktorá by producentom mlieka umožňovala vykonať test mlieka na stanovenie prítomnosti antibiotík ešte na farme v čase kratšom ako 5 minút.

Zvýšenie citlivosti a skrátenie času odozvy sú spojené s nedostatkami, ktoré už boli diskutované v predchádzajúcej časti opisu v súvislosti s opisom spôsobu J-M. Frera. Okrem toho tento test je vykonávaný s veľmi malými objemami vzoriek a vyžaduje teda určitú skúsenosť s mikrodávkovacou technikou, lebo presnosť dávkovania je tu zárukou presných výsledkov.

S cieľom vyvarovať sa všetkých týchto problémov, spojených s použitím kvapalnej formy enzýmu, bol takisto navrhnutý' spôsob, pri ktorom je enzým R39 imobilizovaný na nosič nerozpustný vo vode, najmä na poly/N,N-dimetylakrylamidovej/živici. Tento spôsob je predmetom amerického patentu 4 546 076 a pozostáva z troch nasledujúcich stupňov:

1. enzým imobilizovaný na nosiči sa inkubuje v prítomnosti biologickej tekutiny;

2. imobilizovaný enzým sa potom oddelí od biologickej tekutiny a premyje sa;

3. stanoví sa zvyšková aktivita enzýmu R39 kolorimetrickým stanovením D-alanínu, vytvoreného z peptidového substrátu pomocou reakčného systému, obsahujúceho D-aminoacid-oxydázu a jej kofaktor, peroxydázu a chromogénnu reakčnú zložku, pričom sa výsledok vizuálne odpočíta pomocou spektrofotometra.

Tento spôsob stanovenia má niekoľko výhod: nedochádza tu k žiadnej interferencii biologickej tekutiny s enzýmami, použitými na stanovenie D-alanínu, lebo biologická tekutina sa odstráni už v druhom stupni stanovenia;

- je možné dosiahnuť znamenité výsledky aj pri použití veľkých objemov vzoriek, napríklad objemov dosahujúcich až 5 ml a

- dosahuje sa tu značne vyššia citlivosť stanovenia vzhľadom na to, že tento spôsob umožňuje vizuálne stanoviť koncentrácie penicilínu G až 0,002 U.I./ml mlieka.

Aj tento spôsob má však niektoré nevýhody: ako pri všetkých spôsoboch, ktoré vyžadujú separačný stupeň, je dosahovaná nižšia reprodukovateľnosť výsledkov ako v prípade spôsobov, uskutočňovaných v homogénnej fáze;

nech sa použije akákoľvek separačná metóda, vždy to má nevyhnutne za následok predĺženie času, nevyhnutného na stanovenie a zvýšenie zložitosti stanovenia;

aj keď tento spôsob umožňuje dosiahnuť vizuálnym odpočítaním výsledky vysokej citlivosti, dosahujúcej až 0,002 U.L/ml penicilínu G, je čas nevyhnutý na získanie tohto výsledku ešte príliš dlhý na to (aspoň 30 minút), aby sa mohol tento spôsob použiť na rýchle ohodnotenie mlieka pri jeho zbere hneď na farme a

- navyše je cena tohto stanovenia výrazne vyššia ako cena testu, vykonávaného v homogénnej fáze.

Výrazným technickým a hospodárskym pokrokom by teda bolo, keby bol k dispozícii spôsob stanovenia antibiotík v biologických tekutinách, ktorý by nemal nedostatky doteraz známych stanovení antibiotík v biologických tekutinách, najmä nedostatky uvedeného spôsobu J-M. Frera a spôsobov, ktoré sú od tohto spôsobu odvodené, najmä spôsobu stanovenia Penzym a spôsobu stanovenia, ktorý je opísaný v americkom patente 4 546 076. Bolo by vhodné vyvinúť spôsob stanovenia antibiotík v biologických tekutinách, ktorý by mal súhrn výhodných vlastností, čo znamená, že

- by bolo možné získať výsledok stanovenia veľmi rýchlo, napríklad v priebehu 5 minút alebo v čase ešte kratšom;

by sa dosahovala vysoká citlivosť stanovenia, čo by umožnilo použitie tohto spôsobu stanovenia aj v zemiach, v ktorých zákonné normy nepripúšťajú koncentrácie antibiotík, presahujúce koncentráciu 0,004 U.I./ml alebo koncentráciu ešte nižšiu;

- by bolo možné vykonávať stanovenie s objemami vzoriek 1 ml alebo s vyššími objemami, čo by umožňovalo vykonávať toto stanovenie nešpecializovaným personálom;

- by bol spôsob stanovenia nenákladný a veľmi jednoduchý.

Podstata vynálezu

Tieto ciele sa dajú dosiahnuť spôsobom podľa vynálezu, ktorý sa vyznačuje hlavne:

1. použitím špeciálneho substrátu tioesterového typu pre enzým R39, ktorý umožňuje to, že sa hydrolýzou vytvorí zlúčenina, obsahujúca voľnú skupinu SH, ktorá môže byť stanovená jednoduchou a nenákladnou kolorimetrickou metódou bez toho, aby bolo potrebné použiť enzými, ktorých účinok je rušený zložkami biologickej tekutiny a

2. uskutočňovaním hydrolýzy substrátu enzýmom v prítomnosti aminokyseliny konfigurácie D alebo glycínu, ktoré aktivujú uvedenú hydrolýzu.

Predmetom vynálezu je enzymatický spôsob stanovenia antibiotík s betalaktámovým jadrom v biologickej tekutine, zahŕňajúci nasledujúce stupne:

1. inkubáciu uvedenej biologickej tekutiny s rozpustnosťou D-alanyl-D-alanín-karboxypeptidázou, produkovanou mikroorganizmom Actinomadura R39, pričom sa táto inkubácia uskutočňuje pri podmienkach, umožňujúcich reakciu antibiotika s β-laktámovým kruhom, prípadne prítomného v uvedenej biologickej tekutine, s enzýmom pri vzniku inaktívneho a v podstate ireverzibilného ekvimolekulámeho komplexu enzým-antibiotikum;

2. inkubáciu zmesi, získanej v prvom stupni, s roztokom substrátu pri podmienkach, umožňujúcich hydrolýzu uvedeného substrátu enzýmom pri vzniku zlúčeniny, ktorej množstvo je úmerné zvyškovej enzymatickej účinnosti;

3. stanovenie množstva zlúčeniny, vytvorenej v stupni 2 a

4. porovnanie hodnoty, stanovenej v treťom stupni, s etalónom s cieľom zistiť koncentráciu antibiotika v biologickej tekutine, ktorého podstata spočíva v tom, že sa inkubácia v druhom stupni uskutočňuje so substrátom, ktorým je tioester všeobecného vzorca

R‘-R²-S-CH-COOH,

I R³ v ktorom

R¹ znamená benzoylový zvyšok, fenylacetylový radikál alebo N^ilfa-acetyl-L-lyzylový radikál,

R² znamená glycylový radikál alebo D-alanylový radikál a R³ znamená atóm vodíka alebo metylový radikál, tak, že hydrolýzou vznikne kyselina 2-merkaptoalkánová všeobecného vzorca

HS-CII-COOH,

I

R³ v ktorom R³ má uvedený význam, pričom sa inkubácia uskutočňuje v prítomnosti aminokyseliny, ktorá aktivuje hydrolýzu substrátu enzýmom, pričom uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej aminokyseliny s konfiguráciou D a glycín.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že substrátom je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tiojoctová.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že aminokyselina je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej D-alanin, D-metionín, D-arginín, D-fenylalanín, D-serín, D-histidín, D-valin, D-tryptofan a kyselina D-2-aminomaslová.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že aminokyselinou je D-alanín.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že stupne 2 a 3 sa uskutočňujú súčasne.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že biologická tekutina sa zvolí zo skupiny, zahŕňajúcej mlieko, sérum, moč, sliny, mäsové extrakty, fermentačné tekutiny a pufrované vodné roztoky.

Spôsob podľa vynálezu jc výhodne charakterizovaný tým, že antibiotikum, ktoré má byť stanovené, sa zvolí zo skupiny, zahŕňajúcej benzylpenicilin, ampicilín, fenoxymetylpenicilín, karbenicilín, meticilín, oxacilín, cloxacilín, cefalosporin C, cefaloglycín, cefalotín, cefalexín a cefapirín.

Spôsob podľa vynálezu je výhodne charakterizovaný tým, že množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca

HS-CH-COOH

I

R³ sa stanoví inkubáciou zmesi, získanej v stupni 2, s kyselinou 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoovej/ pri vzniku zafarbenia, ktorého intenzita je funkciou množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej.

Predmetom vynálezu je takisto súprava na stanovenie antibiotík s β-laktámovým jadrom v biologickej tekutine, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje:

1. stanovené množstvo rozpustnej D-alanyl-D-alanínkarboxypeptidázy, produkované mikroorganizmom Actinomadura R39;

2. stanovené množstvo substrátu, ktorým je tioester všeobecného vzorca

R'-R²-S-CH-COOH,

I

R³ v ktorom

R¹ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál alebo N^alíi-acetyl-L-lyzylový radikál,

R² znamená glycylový radikál alebo D-alanylový radikál a R³ znamená atóm vodíka alebo metylový radikál;

3. stanovené množstvo aminokyseliny s konfiguráciou D alebo glycín;

4. reakčnú zložku, umožňujúcu stanoviť kyselinu 2-merkaptoalkánovú všeobecného vzorca

HS-CH-COOH,

I

R³ v ktorom R³ má uvedený význam a

5. prípadne etalón, s ktorým môžu byť porovnané výsledky testov, uskutočnené so zložkami 1, 2, 3 a 4.

Súprava podľa vynálezu je výhodne charakterizovaná tým, že substrátom je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tiojoctová.

Súprava podľa vynálezu je výhodne charakterizovaná tým, že aminokyselina s konfiguráciou D je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej D-alanín, D-metionín, D-arginín, D-fenylalanín, D-setín, D-histidín, D-valín, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomaslovú.

Súprava podľa vynálezu je výhodne charakterizovaná tým, že aminokyselinou s konfiguráciou D je D-alanín.

Súprava podľa vynálezu je výhodne charakterizovaná tým, že reakčnou zložkou 4 je kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová/.

Súprava podľa vynálezu je výhodne charakterizovaná tým, že substrát a reakčná zložka 4 sú združené vo forme tablety.

V priebehu výskumných prác v tejto oblasti bolo novo zistené, že enzým R39 má špecifickú aktivitu hydrolyzovať tioesterové väzby niektorých zlúčenín, majúcich koncovú tioesterovú skupinu, a najmä špecifickú aktivitu hydrolyzovať tioestery uvedeného všeobecného vzorca (I). Tento objav je prekvapujúci, lebo podľa súčasných znalosti nebol doteraz známy ani jeden príklad D-alanyl-D-alanínkarboxypeptidázy, fungujúci tiež ako tioesteráza. Na zistení tejto neočakávanej vlastnosti enzýmu R39 je založený nový zdokonalený enzymatický spôsob stanovenia antibiotík s βlaktámovým kruhom v biologických tekutinách.

Na rozdiel od spôsobu stanovenia podľa J-M.Frerea a analogických opísaných stanovení sa pri spôsobe podľa vynálezu ako substrát pre enzým R39 používa tioester všeobecného vzorca (I), z ktorého hydrolýzou vzniká kyselina 2-merkaptoalkánová uvedeného všeobecného vzorca (II). Tento nový substrát prináša viac výhod tak z technologického, ako aj ekonomického hľadiska. Kyselina 2-merkaptoalkánová všeobecného vzorca (II), vytvorená z uvedeného substrátu (a ktorej množstvo je úmerné zvyškovej aktivite enzýmu R39), môže byť stanovená jednoduchou kolorimetrickou metódou, ktorá nevyžaduje enzýmy ako D-aminoacid-oxydáza a jej koenzým. Okrem výrazného zníženia nákladov sa taktiež dosiahne potlačenie jedného z hlavných nedostatkov spôsobu podľa Frerea tým, že tu už nedochádza k žiadnej interferencii medzi zložkami biologickej tekutiny a činidlami, používanými pri kolorimetrickom stanovení, pričom tieto činidlá sú tvorené jednoduchými chemickými zlúčeninami bez enzýmov.

Spôsobom podľa vynálezu je teda možné uskutočniť priame stanovenie antibiotík v samotnej biologickej tekutine; nie je už teda nevyhnutné predbežne odstraňovať zo vzoriek, určených na stanovenie, látky, ktoré by mohli rušiť kolorimctrické stanovenie.

Ďalej vzhľadom na to, že stanovená zvyšková aktivita už nie je ovplyvňovaná faktormi, prítomnými v biologických tekutinách, je možné pracovať s objemami vzoriek biologických tekutín až do 10 ml. Spôsob podľa vynálezu teda umožňuje uskutočňovať stanovenie antibiotík s použitím podstatne väčších objemov vzoriek, čo robí vlastné stanovenie jednoduchším, pričom toto stanovenie môže byť uskutočnené aj personálom, ktorý nebol na toto stanovenie špeciálne školený.

Navyše vzhľadom na to, že je možné pracovať s väčšími objemami, má spôsob stanovenia podľa vynálezu omnoho vyššiu citlivosť. Ako bude ukázané ďalej v príkladoch uskutočnenia, umožňuje spôsob podľa vynálezu ľahko vizuálne stanoviť množstvo asi 0,004 U.I.penicilínu G v mi lilitri mlieka v priebehu 15 minút; takisto je možné porovnaním s farebnou škálou dosiahnuť stanovenie koncentrácie antibiotika až 0,002 U.I./ml.

Okrem toho sa zistilo, že prídavok aminokyseliny konfigurácie D alebo glycínu má za následok výrazné zvýšenie rýchlosti hydrolýzy substrátu, tvoreného tioestcrom všeobecného vzorca (I) vplyvom uvedeného enzýmu. Výskumné práce v tejto oblasti ukázali, že niekoľko aminokyselín konfigurácie D, takisto ako glycín môžu hrať úlohu aktivátora hydrolýzy uvedeného tioesteru. Medzi najlepších aktivátorov tohto typuje možné uviesť: D-alanín,

D-metionín, D-arginín, D-fenylalanín, D-serin, D-histidín, D-valín, D-tryprofán a kyselina D-2-aminomaslová,

Ak sa teda napríklad aktivita enzýmu R39 vyjadrí v jednotkách na miligram enzýmu, pričom táto enzýmová jednotka hydrolyzuje pri teplote 47 °C 1 mikromól substrátu za minútu, potom sa zistilo, že aktivita enzýmu R39 proti kyseline [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octovej, použitej ako substrát, sa rovná 8 jednotkám v neprítomnosti D-alaninu a 320 jednotkám v prítomnosti D-alanínu. Inými slovami, v prítomnosti tohto aktivátora sa rýchlosť hydrolýzy substrátu pôsobením enzýmu R39 zvýši 40-krát.

Naproti tomu sa zistilo, že žiadne z aminokyselín, majúcich konfiguráciu L, nie sú schopné aktivovať uvedenú hydrolýzu substrátu.

Preto je pri spôsobe podľa vynálezu dôležité, aby hydrolýza substrátu tioesterového typu v stupni 2/ bola uskutočnená v prítomnosti aminokyseliny konfigurácie D, ktorá aktivuje hydrolýzu uvedeného substrátu enzýmom R39. Toto opatrenie umožňuje dosiahnuť pri stanovení značnú časovú úsporu. Takto je možné spôsobom podľa vynálezu ľahko stanoviť koncentráciu penicilínu G 0,016 U.I. v mililitri mlieka v priebehu 5 minút. Na porovnanie je možné pripomenúť, že test Penzým vyžaduje na získanie rovnakého výsledku čas asi 15 minút. Na rozdiel od doteraz známych spôsobov je spôsob stanovenia podľa vynálezu teda zvlášť príťažlivý pre rýchle stanovenie antibiotík v mlieku priamo na farme v okamihu, keď sa toto mlieko získava dojením, a to tým skôr, že ide o jednoduché stanovenie, ktoré nevyžaduje žiadne dokonalejšie prístrojové vybavenie.

Okrem toho sa zistilo, že spôsob podľa vynálezu môže byť s úspechom aplikovaný nielen na stanovenie antibiotík v mlieku, ale tiež aj v iných biologických tekutinách, akými sú napríklad sérum, moč, sliny, mäsové extrakty, fermentačné tekutiny a vodné pufrované roztoky.

Prvoradou výhodou spôsobu podľa vynálezu je teda to, že umožňuje buď stanoviť vo veľmi krátkom čase (5 minút) koncentráciu antibiotika s β-laktámovým jadrom asi 0,016 U.I./ml, alebo stanoviť v čase trocha dlhšom (15 minút) veľmi nízku koncentráciu antibiotika s β-laktámovým jadrom asi 0, 004 U.I./ml alebo koncentráciu ešte nižšiu a to bez použitia zvláštneho analytického prístrojového vybavenia a komplexnej technológie.

Antibiotiká, ktorých koncentrácia môže byť stanovená spôsobom podľa vynálezu, patria ku skupine antibiotík, ktoré sú charakterizované prítomnosťou B-laktámového jadra v ich molekule, čo v podstate zahŕňa všetky penicilíny a cefalosporíny. Ako príklady týchto penicilínov je možné uviesť:

benzylpenicilín (penicilín G), ampicilín, fenoxymetylpenicilín, karbenicilín, meticilín, oxacilín a cloxacilín.

Ako príklady uvedených cefalosporínov je možné uviesť:

cefalosporín C, cefaloglycín, cefalotín, cefalexín a cefapirín.

Zvlášť priaznivé výsledky sa dosiahnu pri stanovení penicilínu G.

V stupni 1/ spôsobu podľa vynálezu sa stanovený objem vzorky biologickej tekutiny inkubuje so stanoveným množstvom enzýmu R39.

Ako už bolo vysvetlené, je možné pracovať s veľkými objemami vzoriek. Pri danom množstve enzýmu R39 sa zdvojnásobením objemu vzorky zdvojnásobí aj citlivosť spôsobu stanovenia. Tak napríklad zdvojnásobením objemu vzorky sa zdvojnásobí aj citlivosť stanovenia; strojnásobením objemu vzorky sa strojnásobí aj citlivosť stanovenia atď. Objem vzorky môže teda byť zvolený v závislosti od požadovanej citlivosti stanovenia. Tak napríklad v prípade mlieka je možné citlivosť stanovenia upraviť podľa noriem, udávajúcich prípustnú koncentráciu antibiotika v mlieku v konkrétnej zemi alebo podľa požiadaviek mliekarenského priemyslu.

Rovnaký účinok je možné takisto dosiahnuť v prípade, keď sa pri danom objeme vzorky biologickej tekutiny zmenší množstvo enzýmu R39 (pozri uvedený príklad 2). Ale v tomto prípade je nevyhnutné úmerne predĺžiť aj čas trvania nielen stupňa 1/, ale aj stupňa 2/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu.

V praxi budú zvolené množstvá enzýmu R39 a biologickej tekutiny závisieť jednak od spôsobu, akým bude stanovenie uskutočnené, a jednak od požadovanej citlivosti alebo požadovanej rýchlosti stanovenia.

Tak napríklad, ak má byť spôsob stanovenia podľa vynálezu použitý na stanovenie kontaminácie mlieka antibiotikom priamo na farme, potom sa dáva prednosť práci s veľkými objemami vzorky, aby bola pri stanovení dosiahnutá ľahšia manipulácia so vzorkami a činidlami. Výhodne sa volia objemy vzoriek medzi 1 a 10 milimetrami. Pri uskutočňovaní spôsobu stanovenia podľa vynálezu v laboratóriu, vybavenom pomôckami na mikrodávkovanie, dokonale vyhovujú objemy vzoriek v rozsahu medzi 50 mikrolitrami a 1 mililitrom.

Inak zvolené množstvá enzýmu a biologickej tekutiny budú v podstate závisieť od požadovanej citlivosti stanovenia. Tak napríklad, ak je stanovenie uskutočnené v laboratóriu, kde môže byť manipulované s malými objemami, a ak je žiaduce, aby bola dosiahnutá citlivosť stanovenia 0,01 U.I./ml, potom sa enzým použije v množstve asi 1 pikomólu a objem biologickej tekutiny predstavuje asi 50 mikrolitrov. Ak je žiaduce získať citlivosť stanovenia 0,005 a 0,0025 U.I./ml, potom sa použije objem biologickej tekutiny 100 mikrolitrov, resp. 200 mikrolitrov, bez toho, aby sa pritom menilo množstvo použitého enzýmu.

Vynikajúca citlivosť, rýchlosť a presnosť spôsobu stanovenia antibiotík v biologických tekutinách podľa vynále

SK 279176 Β6 zu je dôsledkom mimoriadnych vlastností uvedeného enzýmu R39 a metódy, použitej na stanovenie zvyškovej aktivity tohto enzýmu R39.

V skutočnosti je tento enzým R39 charakterizovaný:

- extrémne rýchlou tvorbou ekvimolekulámeho komplexu enzým- antibiotikum, mimoriadnou stabilitou tohto komplexu, pričom, sotva sa tento komplex vytvorí, rozkladá sa len veľmi pomaly; pre ilustráciu je možné uviesť, že polčas rozpadu komplexu, vytvoreného zlúčením enzýmu R39 a penicilínu G, predstavuje pri teplote 37 °C asi 70 hodín, vynikajúcou enzymatickou aktivitou, prejavujúcou sa rýchlou hydrolýzou koncovej skupiny substrátu tioesterového typu všeobecného vzorca (I) za pôsobenia špecifického aktivátora tejto hydrolýzy.

Vďaka týmto trom vlastnostiam zaujíma uvedený enzým privilegovanú pozíciu vzhľadom na až doteraz identifikované D-alanyl-D-alanín-karboxypeptidázy. Vzhľadom na to, že čas rozkladu komplexu enzým-antibiotikum je nekonečne dlhší, ako celkový čas, ktorý je potrebný na vytvorenie tohto komplexu a na odmeranie jeho zvyškovej enzymatickej aktivity, nie je potrebné sa obávať, že výsledky stanovení budú skreslené spätným uvoľnením enzýmu z komplexu v dôsledku predčasného rozkladu komplexu enzým-antibiotikum.

Ak sa teda skúmajú D-alanyl-D-alanín-karboxypeptidázy, ktoré sú až doteraz známe a ktoré nezahŕňajú uvedený enzým R39, potom sa dochádza k záveru, že žiadny z týchto enzýmov nemá uvedené vlastnosti; v skutočnosti majú tieto enzýmy desaťkrát menšiu rýchlosť tvorby komplexu enzým-antibiotikum, ich stabilita komplexu enzýmantibiotikum je nedostatočná a rýchlosť, s akou hydrolyzujú substrát, je veľmi malá (to je najmä prípad všetkých endocelulámych karboxypeptidáz, viazaných na bakteriálnu membránu).

Enzým R39 je špecifická rozpustná exoceluláma D-alanyl-D-alanín-karboxypeptidáza, ktorá je vylučovaná mikroorganizmom Actinomadura R39 v prípade, že je tento mikroorganizmus kultivovaný vo vhodnom živnom prostredí. Tento mikroorganizmus bol uložený lO.júla 1981 v zbierke Pasteurovho ústavu (inštitút Pasteur) v Paríži pod číslom 1-127.

Na použitie pri spôsobe stanovenia antibiotík podľa vynálezu musí byť tento enzým evidentne v podstate čistý. Jeho príprava a čistenie môžu byť uskutočnené metódami, ktoré sú opísané v odbornej literatúre (tejto témy sa týka článok J-M. Frerea a kol., Biochem. J. 143 (1974), 233 až 240, uvedený pod titulom Molecular Weight, Aminoacid Composition and Physico-chemical Properties of the Exocellular DD-Carboxypeptidase-Transpeptidase of Streptomyces R39). Okrem toho je tento enzým v čistom stave teraz komerčne dostupný; je možné ho získať vo firme UCB-Bioproducts S.A. (Belgicko).

Enzým R39 má vynikajúcu stabilitu; znáša teploty až do 60 °C. Vzhľadom na to môže byť inkubácia biologickej tekutiny s enzýmom R39 uskutočňovaná bez ťažkosti v teplotnom intervale od 20 do 50 °C. Výhodne sa používa inkubačná teplota blízka 47 °C. Za týchto podmienok je inkubačný čas, ktorý je úzko spojený s časom, nevyhnutným na vytvorenie ekvimolekulámeho inaktívneho komplexu enzým-antibiotikum, veľmi krátky. Zvýšenie uvedenej inkubačnej teploty bude mať za následok skrátenie inkubačného času. Čas stanovenia j c teda možné skrátiť zvýšením uvedenej inkubačnej teploty.

V stupni 2/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu sa zmes, získaná v stupni 1/, inkubuje so stanoveným množ stvom substrátu tioesterového typu všeobecného vzorca (I) v roztoku v prítomnosti glycínu alebo aminokyseliny konfigurácie D, ktorý, resp. ktorá aktivuje hydrolýzu uvedeného substrátu enzýmom. V priebehu tohto stupňa je frakcia enzýmu, ktorá nebola spotrebovaná na vytvorenie komplexu enzým-antibiotikum v stupni 1/, využitá na uskutočnenie hydrolýzy substrátu tioesterového typu všeobecného vzorca (I) . Touto hydrolyzačnou reakciou sa vytvorí určité množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II) , pričom toto množstvo je úmerné zvyškovej enzymatickej aktivite enzýmu R39.

Uvedené tioestery všeobecného vzorca (I) sú novými zlúčeninami s výnimkou kyseliny [/N-benzoyl-glycyl/tiojoctovej, ktorá je známou zlúčeninou (pozri patent US 2 824 863).

Tioestery všeobecného vzorca (I) sa môžu pripraviť konvenčným spôsobom, ktorý zahŕňa iba známe reakcie. Spravidla sa v inertnom rozpúšťadle, akým je chloroform, dichlórmetán, octan etylnatý alebo dimetylformamid, kondenzuje kyselina všeobecného vzorca (III), ktorá bola predbežne aktivovaná a nachádza sa napríklad vo forme zmesového anhydridu alebo aktívneho esteru, s kyselinou 2-merkaptoalkánovou všeobecného vzorca (II) podľa nasledujúcej schémy:

R'R²OH + HS-CH-COOH-------> (I),

I

R³ (III) (II) v ktorom R¹, R² a R³ majú uvedený význam.

Ako príklady tioesterov všeobecného vzorca (I), použiteľných pri stanovení podľa vynálezu ako substrát, je možné uviesť: kyselinu [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octovú, kyselinu 2-[/N-benzoyl-D-alanyl/tio]propiónovú, kyselinu [/N-fenylacetyl-D-alanyl/tio]octovú, kyselinu [/N^alfa-acetyl-L-lyzyl-D-alanyl/tio]octovú.

Ale najlepšie výsledky sa dosiahnu pomocou kyseliny [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octovej.

Ako neobmedzujúce príklady aminokyselín konfigurácie D, ktoré môžu byť pridané k uvedeným substrátom ako aktivátory hydrolýzy týchto substrátov, je možné uviesť: D-alanín, D-metionín, D-arginín, D-fenylalanin, D-serín, D-histidín, D-valín, D-tryptofán a kyselinu 2-aminomaslovú.

Podľa výhodného uskutočnenia spôsobu stanovenia podľa vynálezu sa ku kyseline [/N-benzoyl-D-alanyl/tiojoctovej, použitej ako substrát, pridá ako aktivátor D-alanín.

Použité množstvá substrátu a aktivátora nie sú kritickými parametrami spôsobu stanovenia podľa vynálezu v prípade, že sa pracuje pri podmienkach nasýtenia enzýmu uvedeným substrátom.

Pracovné podmienky, ktoré je potrebné dodržať v priebehu tohto stupňa, sú v podstate rovnaké ako podmienky, ktoré už boli uvedené uskutočňovanie stupňa 1/ stanovenia podľa vynálezu. Inkubácia sa môže uskutočniť v teplotnom intervale od 20 do 50 °C, výhodne pri teplote blízkej 47 °C. Inkubačný čas, v priebehu ktorého sa substrát inkubuje s enzýmom R39, resp. s jeho časťou, ktorá nebola deaktivovaná vstupom do komplexu enzým-antibiotikum, musí byť aspoň dostatočná na vytvorenie merateľného množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II). Pre inkubačnú teplotu 47 °C sa tento inkubačný čas môže pohybovať v intervale medzi niekoľkými sekundami a 10 minútami, a to podľa množstva prítomného enzýmu a objemu vzorky biologickej tekutiny. Tento inkubačný čas môže byť skrátený zvýšením inkubačnej teploty, alebo naopak predĺžený znížením inkubačnej teploty. Takisto je snaha zvýšiť inkubačnú teplotu vo všetkých prípadoch, kedy je rozhodujúcim faktorom rýchlosť stanovenia antibiotika v biologickej tekutine.

S cieľom zachovať optimálnu enzymatickú aktivitu použitého enzýmu by inkubačné prostredie malo mať výhodne hodnotu pH medzi 7 a 8,5. Obyčajne sa udržiava hodnota pH blízka hodnote 8,0 tým, že sa inkubácia uskutočňuje v prostredí, ktoré je vhodným spôsobom pufrované.

V stupni 3/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu sa určí množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II), vytvorenej v priebehu stupňa 2/.

Stanovenie kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II) môže byť vykonané ľubovoľnou vhodnou známou metódou. Je iba dôležité, aby táto metóda bola rýchla a málo nákladná a aby umožňovala špecificky stanoviť kyselinu 2-merkaptoalkánovú všeobecného vzorca (II) s vylúčením všetkých ostatných produktov, ktoré sú prítomné v biologickej tekutine, určenej na stanovenie obsahu antibiotika. Výhodne sa preto používa kolorimetrické stanovenie, uskutočňované pomocou činidla, ktoré reakciou s voľnou skupinou SH kyseliny 2-merkaptoalkánovej produkuje charakteristické zafarbenie.

Toto chromogénne činidlo môže byť zvolené zo skupiny, zahŕňajúcej chemické činidlá, ktoré sa obyčajne používajú pre tento typ reakcie; patrí sem napríklad kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová), kondenzačné produkty 4,4'-ditiobis/fenylamínu s benzaldehydmi a systém fenantrolín-Fe⁺⁺⁺.

Výhodným chromogénnym činidlom je kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová/, ktorá jc takisto nazývaná Ellmanovým činidlom a ktorá produkuje žlté zafarbenie, tvorené kyselinou 2-nitro-5-merkaptobenzoovou, vytvorenou výmennou reakciou so skupinou SH kyseliny 2-merkaptoalkánovej; intenzita tohto zafarbenia je priamo funkciou množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej.

Ale pri niektorých aplikáciách môže byť výhodné použiť červené zafarbenie, ktoré je produkované reakciou fenantrolínu s voľnými skupinami SH v prítomnosti katiónov Fe⁴’¹“¹'.

Množstvo použitého chromogénneho činidla bude funkciou množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej. Výhodne sa pracuje pri podmienkach, kedy moláme množstvo chromogénneho činidla je v miernom prebytku vzhľadom na maximálne moláme množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej, ktoré môže byť vytvorené v stupni 2/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu.

Je potrebné zdôrazniť, že enzým R39 musí byť nevyhnutne prítomný od samého začiatku stupňa 1/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu; rovnako tak substrát a aktivátor hydrolýzy musia byť nevyhnutne prítomné na začiatku stupňa 2/. Ale je možné pridávať aktivátor už na začiatku stupňa 1/ a rovnako tak je možné pridať chromogénne činidlo už na začiatku stupňa 1/, alebo na začiatku stupňa 2/ a alebo na konci stupňa 2/. Podľa výhodného uskutočnenia spôsobu stanovenia podľa vynálezu sa na začiatku stupňa 1/ a v priebehu tohto stupňa inkubuje roztok enzýmu R39 so vzorkou mlieka v prítomnosti aktivátora a v stupni 2/ sa pridá substrát a chromogénne činidlo, pričom stupeň 2/ a stupeň 3/ sa vykonajú súčasne za podmienok, ktoré sú v podstate rovnaké ako podmienky, ktoré boli uvedené pre stupeň 2/.

V stupni 4/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu sa hodnota, stanovená v stupni 3/, porovná s etalónom s cieľom stanoviť koncentrácie antibiotika v biologickej tekutine.

Kvantitatívne stanovenie koncentrácie antibiotika môže byť uskutočnené nasledujúcou metódou.

Najskôr sa pripraví séria vzoriek biologickej tekutiny, ktoré obsahujú známe koncentrácie antibiotika s fl-laktámovým kruhom. Táto séria vzoriek okrem určitého počtu vzoriek, obsahujúcich rastúcu koncentráciu antibiotika, bude obsahovať tiež dve vzorky biologickej tekutiny, ktoré antibiotikum neobsahujú. Potom sa tieto vzorky spracujú celkom identickým spôsobom v stupňoch 1/, 2/ a 3/ spôsobu podľa vynálezu.

V prípade jednej zo vzoriek biologickej tekutiny, neobsahujúcej antibiotikum, sa použitý roztok enzýmu nahradí v stupni 1/ identickým objemom vody. V tomto špecifickom prípade sa teda na konci stupňa 3/ získa roztok, ktorý obsahuje všetky reakčné zložky s výnimkou enzýmu R39. Vzhľadom na to, že enzým tu chýba, nedôjde ku tvorbe kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II) v stupni a v dôsledku toho ani chromogénne činidlo, ktorým je v danom prípade kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová/, neposkytne zafarbenie. Táto vzorka bude ďalej označovaná ako slepá vzorka.

Druhá zo vzoriek biologickej tekutiny naopak vytvorí uvedené žlté zafarbenie. V prípade, že je vzorka biologickej tekutiny bez antibiotika, nie je enzým R39 deaktivovaný v stupni 1/ a dôjde teda k vytvoreniu maximálneho množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II) (toto množstvo zodpovedá celkovej enzymatickej aktivite enzýmu R39, ktorý bol na stanovenie použitý), a teda aj k tvorbe maximálneho množstva kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoovej a v dôsledku toho aj k vytvoreniu maximálneho žltého zafarbenia. Táto vzorka bude ďalej označovaná ako referenčná vzorka.

Takisto je zrejmé, že ak vzorky biologickej tekutiny obsahujú moláme množstvo antibiotika, ktoré je nižšie, ako moláme množstvo použitého enzýmu R39, potom bude len časť tohto enzýmu inaktivovaná antibiotikom v stupni 1/; v týchto prípadoch sa teda vytvorí určité množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II), ktoré bude zodpovedať zvyškovej enzymatickej aktivite tej časti enzýmu, ktorá nebola inaktivovaná antibiotikom, a teda aj zodpovedajúce množstvo kyseliny 5-merkapto-2-nitrobenzoovej. V týchto prípadoch teda dôjde ku vzniku žltého zafarbenia, ktoré má však menšiu sýtosť ako zafarbenie, vytvorené v referenčnej vzorke.

Konečne v prípadoch, kedy vzorky biologickej tekutiny obsahujú moláme množstvo antibiotika, ktoré je rovné alebo vyššie ako moláme množstvo použitého enzýmu R39, bude enzým celkom inaktivovaný antibiotikom v priebehu stupňa 1/; nedôjde teda k vytvoreniu kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca (II) a chromogénne činidlo teda zostane nezmenené. V týchto prípadoch sa získa zafarbenie, zodpovedajúce zafarbeniu slepej vzorky.

S cieľom dosiahnuť presné stanovenie sa odmeria spektrofotometrom optická hustota zafarbenia všetkých vzoriek, vrátane slepej a referenčnej vzorky.

Vzhľadom na to, že aj v prípade slepej vzorky sa získa určitá hodnota optickej hustoty, je potrebné túto hodnotu odpočítať od hodnôt, získaných pre referenčnú vzorku a pre ostatné vzorky.

Z takto získaných hodnôt optickej hustoty sa potom vypočíta percentuálna zvyšková aktivita (enzýmu R39) pre každú vzorku biologickej tekutiny. Táto percentuálna zvyšková aktivita sa rovná pomeru optickej hustoty danej vzorky k optickej hustote referenčnej vzorky, násobenému stom. Získané hodnoty sa potom vynesú do grafu, v ktorom sú na zvislej osi vynesené koncentrácie antibiotika, a na vodorovnej osi sú vynesené percentuálne zvyškové aktivity enzýmu R39. Získa sa priamka, ktorá pretína zvislú os v bode, zodpovedajúcom referenčnej vzorke (100 % zvyšková enzymatická aktivita) a vodorovnú os v bode, zodpovedajúcom vzorke, ktorá obsahuje molárne množstvo antibiotika, rovnajúce sa molámemu množstvu použitého enzýmu R39 (0 % zvyšková enzymatická aktivita).

Takto získaný graf tvorí etalón, ktorý umožňuje stanoviť neznámu koncentráciu antibiotika s β-laktámovým jadrom vo vzorke biologickej tekutiny, ktorá sa použila na získanie tohto etalónu. S týmto cieľom je potrebné vzorku s neznámou koncentráciou antibiotika spracovať presne rovnakým spôsobom v stupňoch 1/, 2/ a 3/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu; potom sa spektrofotometrom odmeria optická hustota rezultujúceho zafarbenia; od tejto optickej hustoty sa odpočíta optická hustota, nájdená pre slepú vzorku; vypočíta sa percentuálna zvyšková aktivita enzýmu spôsobom, ktorý bol opísaný, a koncentrácia antibiotika vo vzorke sa stanoví podľa uvedeného etalónu.

Týmto spôsobom je možné kvantitatívne stanoviť v priebehu 15 minút tak nízke koncentrácie antibiotika ako 0,002 U.I./ml biologickej tekutiny.

Ale táto metóda v niektorých prípadoch vyžaduje predbežné vyčerenie biologickej tekutiny, aby bolo možné použiť spektrofotometer, čo vedie k tomu, že stanovenie musí byť v podstate uskutočnené v laboratóriu. Ak je potrebné iba stanoviť, či koncentrácia antibiotika v biologickej tekutine presahuje alebo nepresahuje určitú prahovú hodnotu (napríklad v prípade mlieka maximálne prípustnú hodnotu, stanovenú zákonom tej alebo onej krajiny), potom nie je nevyhnutné používať spektrofotometer. To však vyžaduje niekoľko predbežných vysvetlení.

Ako už bolo uvedené, pretína kalibračná krivka vodorovnú os v bode, zodpovedajúcom vzorke, obsahujúcemu molárne množstvo antibiotika, rovné molámemu množstvu použitého enzýmu R39. Pri tejto kritickej koncentrácii antibiotika sa percentuálna zvyšková aktivita rovná 0 %, pretože sa na konci stupňa 3/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu získa rovnaké zafarbenie ako zafarbenie, získané v prípade slepej vzorky.

Pri koncentrácii vyššej, ako je táto kritická koncentrácia antibiotika v biologickej tekutine, sa takisto získa zafarbenie, ktoré je rovnaké ako zafarbenie, získané pre slepú vzorku, lebo zvyšková percentuálna aktivita sa stále rovná 0 %. Naopak pri koncentrácii antibiotika v biologickej tekutine nižšej, ako je uvedená kritická koncentrácia antibiotika, sa získa žlté zafarbenie, lebo tu zostala ešte určitá zvyšková enzymatická aktivita.

Ak sa teda výsledok stanovenia zakladá iba na zistení, či na konci stupňa 3/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu vznikne alebo nevznikne uvedené žlté zafarbenie, potom je možné na základe tohto zistenia priamo určiť, či koncentrácia antibiotika v biologickej tekutine presahuje alebo nepresahuje uvedenú koncentráciu.

Stačí teda vopred poznať kritickú koncentráciu, aby sa potom mohlo stanoviť bez použitia spektrofotometra a veľmi rýchlo, či vzorka biologickej tekutiny obsahuje koncentráciu antibiotika s β-laktámovým jadrom, ktorá presahuje alebo nepresahuje túto kritickú koncentráciu. S tým cieľom sa taká vzorka biologickej tekutiny spracuje presne rovnakým spôsobom v stupňoch 1/, 2/ a 3/ spôsobu stanovenia podľa vynálezu, potom sa jednoducho pozoruje, či vznikne uvedené zafarbenie; ak toto zafarbenie zodpovedá zafarbeniu slepej vzorky, potom koncentrácia antibiotika vo vzorke sa aspoň rovná uvedenej kritickej koncentrácii; ak vznikne žlté zafarbenie, potom je koncentrácia antibiotika vo vzorke biologickej tekutiny nižšia ako uvedená kritická koncentrácia antibiotika.

Takto je možné vizuálne a s istotou stanoviť, či vzorky biologickej tekutiny obsahujú viac alebo menej ako 0,004 U.I. antibiotika v jednom mililitri biologickej tekutiny a to v priebehu 15 minút. Okrem toho použitím farebnej škály, reprodukujúcej zmenu intenzity žltého zafarbenia v závislosti od koncentrácie antibiotika v biologickej tekutine bude možné semikvantitatívne stanoviť koncentráciu antibiotika v koncentračnom rozsahu, vymedzenom nulovou koncentráciou antibiotika a kritickú koncentráciu antibiotika. V prípade, kedy uvedená kritická koncentrácia predstavuje 0,004 U.I./ml, bude možné stanoviť bez zvláštnych ťažkostí koncentráciu 0,002 U.I./ml.

Táto metóda, ako s použitím farebnej škály, alebo bez použitia farebnej škály, teda dokonale vyhovuje sériovým testom vzoriek mlieka, a to dokonca aj mimo laboratórium, napríklad uskutočňované priamo na farme nešpecializovaným personálom.

Spôsob kvantitatívneho a kvalitatívneho stanovenia koncentrácie antibiotika podľa vynálezu bol v predchádzajúcom texte detailne vysvetlený s použitím farebnej zmeny, produkovanej kyselinou 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoovou/. Ale je ľahko pochopiteľné, že pri uvedenom stanovení je možné použiť aj ďalšie chromogénne činidlá, pričom výsledné zafarbenie bude samozrejme odlišné.

Ďalším predmetom vynálezu je súprava na stanovenie antibiotík v biologických tekutinách spôsobom podľa vynálezu. Táto súprava obsahuje najmä:

1. stanovené množstvo rozpustnej D-alanyl-D-alanínkarboxypeptidázy, produkovanej mikroorganizmom Actinomadura R39;

2. stanovené množstvo substrátu, ktorým je tioester všeobecného vzorca

R'-R²-S-CH-COOH,

R³ v ktorom

R¹ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál alebo N-^alf“-acetyl-L-lyzylový radikál,

R² znamená glycylový radikál alebo D-alanylový radikál a R³ znamená atóm vodíka alebo metylový radikál,

3. stanovené množstvo aminokyseliny s konfiguráciou D alebo glycín,

HS-CH-COOH,

R³ v ktorom

R³ má uvedený význam a

5. prípadne graf, znázorňujúci zvyškovú percentuálnu aktivitu enzýmu, vyprodukovaného Actinomadura R39, ako funkciu koncentrácie antibiotika alebo farebnú škálu, v ktorej dochádza k zmene intenzity sfarbenia v závislosti od koncentrácie antibiotika, s ktorými je možné porovnať výsledky testov, uskutočnené so zložkami 1, 2, 3 a 4.

Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu je substrátom kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tiojoctová, aminokyselinou s konfiguráciou D je D-alanín a činidlom 4/ je kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová/.

Podľa zvlášť výhodného uskutočnenia vynálezu sú substrát a reakčná zložka, umožňujúca stanovenie kyseliny 2-merkaptoalkánovej, združené vo forme tablety spoločne s pomocnými látkami, ktoré sa obvykle používajú pri tabletovaní.

Do súpravy ako určitý' etalón môže byť teda zabudovaný graf, na ktorom je graficky vynesený vzťah medzi koncentráciami antibiotika a zvyškovými percentuálnymi aktivitami enzýmu R39. Takto je možné uskutočňovať kvantitatívne stanovenie antibiotík v biologických tekutinách spôsobom, ktorý bol vysvetlený v predchádzajúcom texte. Tento graf však nie je vždy nevyhnutný. V prípade, kedy táto súprava má slúžiť iba na zistenie, či koncentrácia antibiotika presahuje alebo nepresahuje určitú hranicu, potom stačí v návode uviesť, pri ktorej koncentrácii antibiotika je možné po spracovaní vzorky spôsobom podľa vynálezu pozorovať zmenu farby.

S cieľom bližšie objasniť vynález je v nasledujúcej časti opisu uvedených niekoľko konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, ktoré majú iba ilustratívny charakter a vlastný rozsah vynálezu, daný formuláciou patentových nárokov, nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Tento príklad uskutočnenia ukazuje, že spôsob podľa vynálezu umožňuje veľmi rýchle stanovenie nízkych koncentrácií penicilínu G v mlieku.

Pripraví sa séria vzoriek mlieka, majúcich objem 50 mikrolitrov a obsahujúcich známe koncentrácie penicilínu G, rovnako ako dve vzorky (slepá a referenčná) mlieka, majúce objem 50 mikrolitrov a neobsahujúce penicilín G.

Ku každej vzorke (referenčná vzorka + vzorky, obsahujúce penicilín G) sa pridá 1,5 pikomólu enzýmu R39, rozpusteného v 10 mikrolitroch 0,5 M Hepes-pufri (pH = 8,0), obsahujúceho 0,5 M koncentráciu chloridu sodného a 0,25 M koncentráciu chloridu horečnatého a 20 mikrolitrov vodného roztoku, obsahujúceho 50 mg/ml D-alanínu. V prípade slepej vzorky je enzým R39, rozpustený v Hepes-pufri, nahradený 10 mikrolitrami 0,5 M Hepes-pufra (pH = 8,0), obsahujúceho 0,5 M koncentráciu chloridu sodného a 0,25 M koncentráciu chloridu horečnatého (Hepes = kyselina 4-hydroxyetyl-l-piperazínetánsulfónová). Táto zmes sa potom inkubuje pri teplote 47 °C počas 4 minút.

Potom sa pridá 5 mikrolitrov vodného roztoku, obsahujúceho 5 mg/ml kyseliny [N-benzoyl-D-alanyl/tio]octovej a 10 mikrolitrov roztoku fosfátového pufra (pH = 8,0, KH₂PO₄ + K₂HPO₄), obsahujúceho 2 mg/ml kyseliny 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoovej) a takto získaná zmes sa potom inkubuje pri teplote 47 °C počas 1 minúty.

Potom sa pozoruje získané zafarbenie jednotlivých vzoriek. Získané výsledky sú reprodukované v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka I

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
1	0,004	intenzívna žltá
2	0,008	stredne žltá
3	0,012	bledožltá
4	0,016	biela
5	0,020	biela
6	0,025	biela
slepá	0	biela

Z uvedenej tabuľky I je zrejmé, že pri koncentrácii penicilínu G, rovnej alebo vyššej ako 0,016 U.I./ml, sa získa biele zafarbenie, ktoré je rovnaké ako zafarbenie slepej vzorky, zatiaľ čo pri nižších koncentráciách sa získa žlté zafarbenie, ktoré je čím ďalej tým intenzívnejšie s klesajúcou koncentráciou penicilínu G až po dosiahnutie veľmi intenzívneho žltého zafarbenia, zodpovedajúceho nulovej koncentrácii penicilínu G (referenčná vzorka).

Je teda zrejmé, že spôsob stanovenia podľa vynálezu umožňuje v priebehu piatich minút stanoviť vizuálne, či vzorka mlieka obsahuje koncentráciu penicilínu G, rovnú 0,016 U.I./ml alebo koncentráciu vyššiu, čo robí tento spôsob stanovenia príťažlivým pre rýchle roztriedenie mlieka buď v mliekarni, alebo priamo na farme.

Príklad 2

V tomto príklade bude ukázané, že spôsob stanovenia podľa vynálezu je veľmi citlivý.

Opakuje sa presne postup podľa príkladu 1 s výnimkou, že:

- ku vzorkám sa pridá 0,4 pikomólu enzýmu R39 (namiesto 1,5 pikomólu);

- prvá inkubácia trvá 10 minút (namiesto 4 minút) a druhá inkubácia trvá 5 minút (namiesto 1 minúty).

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II.

Tabuľka II

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
1	0,001	intenzívna žltá
2	0,002	stredne žltá
3	0,003	bledožltá
4	0,004	biela
5	0,005	biela
6	0,008	biela
7	0,010	biela
slepá	0	biela

Táto tabuľka ukazuje, že pri použití spôsobu podľa vynálezu je možné v mlieku vizuálne detekovať koncentrácie penicilínu G, aspoň rovné 0,004 U.I./ml mlieka, a to v priebehu 15 minút. Okrem toho pri použití farebnej škály je možné detekovať ešte nižšie koncentrácie, ako napríklad koncentráciu 0,002 U.I./ml. Tento spôsob teda umožňuje stanoviť, či mlieko obsahuje koncentráciu antibiotika, ktorá presahuje (alebo nie) zákonné normy dokonca v krajinách, kde sú tieto normy veľmi prísne.

Príklad 3

Tento príklad ukazuje, že spôsob podľa vynálezu môže byť použitý na stanovenie koncentrácie antibiotík vo veľkých objemoch vzoriek.

Opakuje sa presne postup podľa príkladu 1 s výnimkou, že:

- vzorky sú tvorené 3 mililitrami mlieka (namiesto 50 mikrolitrov);

- sa ku každej vzorke pridá 24 pikomólov enzýmu R39, rozpusteného v 150 mikrolitroch 0,5 M Hepes-pufra (pH = 8,0) (namiesto 1,5 pikomólu) a 600 mikrolitrov vodného roztoku D-alanínu, obsahujúceho 100 mg/ml D-alanínu;

- prvá inkubácia trvá 10 minút (namiesto 4 minút);

sa potom pridá 120 mikrolitrov vodného roztoku kyseliny [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octovej (namiesto 5 mikrolitrov), a 120 mikrolitrov roztoku fosfátového pufra (pH = 8,0), obsahujúceho 5 mg/ml kyseliny 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoovej/ a druhá inkubácia trvá 5 minút (namiesto 1 minúty). Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke III.

Tabuľka III

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
1	0	stredne žltá
2	0,003	bledožltá
3	0,004	biela
4	0,006	biela
slepá	0	biela

Táto tabuľka ukazuje, že spôsobom podľa vynálezu je možné vo veľkých objemoch vzoriek (3 ml) vizuálne detekovať prítomnosť 0,004 U.I. penicilínu G/ml mlieka, a to v priebehu 15 minút. Toto stanovenie teda môže byť veľmi ľahko uskutočnené aj nešpecializovaným personálom.

Rovnaké výsledky sa získajú aj v prípade, keď sa spôsob podľa vynálezu použije na stanovenie koncentrácií penicilínu G vo vzorkách, tvorených 1 ml mlieka.

Príklad 4

Tento príklad ukazuje, že spôsob podľa vynálezu môže byť použitý aj v spojitosti s inými substrátmi, ako je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octová.

Spôsob stanovenia sa uskutočňuje rovnako ako v príklade 3. Ale po prvej inkubácii sa pridá 120 mikrolitrov vodného roztoku, obsahujúceho 5 mg/ml kyseliny [/N-fenylacetyl-D-alanyl/tio] octovej.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke IV.

Tabuľka IV

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
1	0,003	bledožltá
2	0,006	biela
slepá	0	biela

Táto tabuľka ukazuje, že spôsob podľa vynálezu môže byť s úspechom použitý v spojitosti s kyselinou [/N-fenylacetyl-D-alanyl/tio]octovou, použitou ako substrát.

Príklad 5

Tento príklad ukazuje, že spôsob stanovenia antibiotík v biologických tekutinách môže byť úspešne použitý aj vtedy, keď sa ako aktivátory hydrolýzy substrátu enzýmom použijú rôzne aminokyseliny s konfiguráciou D alebo glycín.

Postup stanovenia je tu rovnaký, ako postup opísaný v príklade 3. Ale vodný roztok, obsahujúci 100 mg/ml D-alanínu (test I) je tu nahradený vodným roztokom, obsahujúcim 100 mg/ml D-fenylalanínu (test II), D-serínu (test III), D-histidínu (test IV), D-metionínu (test V), kyseliny D-2-aminomaslovej (test VI) alebo vodným roztokom, obsahujúcim 200 mg/ml glycínu (test VII).

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke V.

Tabuľka V

Test	Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
	referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
I			veľmi intenzívna žltá
II			veľmi intenzívna žltá
III			veľmi intenzívna žltá
IV			veľmi intenzívna žltá
v			veľmi intenzívna žltá
VI			veľmi intenzívna žltá
VII			veľmi intenzívna žltá
	1	0,003
I			bledožltá
II			bledožltá
III			bledožltá
IV			bledožltá
v			bledožltá
VI			bledožltá
VII			bledožltá
	2	0,006
I			biela
II			biela
III			biela
IV			biela
v			biela
VI			biela
VII			biela
	slepá	0
I			biela
II			biela
III			biela
IV			biela
v			biela
VI			biela
VII			biela

Táto tabuľka ukazuje, že aminokyseliny s konfiguráciou D a glycín sú všeobecne vhodné na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu.

Príklad 6

Tento príklad ilustruje použitie spôsobu podľa vynálezu na stanovenie cefapirínu (antibiotikum skupiny cefalosporínov) v mlieku.

Postupuje sa rovnako ako v príklade 3, pričom však 3 ml vzorky mlieka obsahujú známe koncentrácie cefapirínu.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke VI.

Tabuľka VI

Vzorka	Koncentrácia cefapirínu (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	veľmi intenzívna žltá
1	0,002	stredne žltá
2	0,003	bledožltá
3	0,004	biela
4	0,006	biela
slepá	0	biela

Táto tabuľka ukazuje, že spôsob podľa vynálezu umožňuje detekovať vizuálne prítomnosť 0,004 pg/ml cefapirínu v mlieku v priebehu 15 minút.

Príklad 7

Tento príklad ilustruje použitie spôsobu podľa vynálezu na stanovenie nízkych koncentrácií penicilínu G v sére.

Postupuje sa rovnako ako v príklade 3, pričom sa však 3 ml vzorky mlieka nahradia 3 ml vzorkami séra, obsahujúcimi známe koncentrácie penicilínu G. Okrem toho sa po druhej inkubácii, trvajúcej 5 minút, vzorky odstredia a supematanty sa 10-krát zriedia vodou. Potom sa meria optická hustota spektrofotometrom pri 410 nm.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke VII. Hodnoty optickej hustoty, uvedené v tabuľke VII, sú získané po odpočítaní optickej hustoty slepej vzorky od optických hustôt referenčnej vzorky a ostatných vzoriek.

Tabuľka VII

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Optická hustota (pri 410 nm)
referenčná	0	435
1	0,002	226
2	0,003	175
3	0,004	49
4	0,006	15
slepá	0	0

Táto tabuľka ukazuje, že je možné s použitím spektrofotometra kvantitatívne stanoviť veľmi nízke koncentrácie penicilínu G (tak nízke ako 0,002 U.I./ml) vo vzorke séra.

Príklad 8

V tomto príklade sú substrát a reakčná zložka, umožňujúca stanovenie kyseliny 2-merkaptoalkánovej, združené vo forme tablety.

Spôsob stanovenia sa uskutočňuje rovnako ako v príklade 3. Ale pre prvú inkubáciu, trvajúcu 10 minút, sa pridá tableta, ktorá obsahuje 600 mikrogramov kyseliny [ŕN-benzoyl-D-alanyl/tio]octovej a 600 mikrogramov kyseliny 5,5'ditiobis/2-nitrobenzoovej/. Táto tableta má nasledujúce celkové zloženie (v hmotnostných percentách):

substrát + reakčná zložka	4	%
polyetylénglykol 6000	3	%
Avicel⁺	27	%
škrob	10	%
laktóza	55	%
Aerosil⁺⁺	0,5	%
stearát horečnatý	0,5	%

⁺⁾ mikrokryštalická celulóza koloidná silika.

Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke VIII.

Tabuľka VIII

Vzorka	Koncentrácia penicilínu G (v U.I./ml)	Zafarbenie
referenčná	0	intenzívne žltá
1	0,002	stredne žltá
2	0,003	bledožltá
3	0,004	biela
4	0,006	biela
slepá	0	biela

Táto tabuľka ukazuje, že je možné použiť spôsob podľa vynálezu pri podmienkach, kedy substrát a reakčná zložka sú združené vo forme tablety. Ide o reakčnú zložku, umožňujúcu stanovenie kyseliny 2-merkaptoalkánovej. Toto usporiadanie predstavuje výhodu tak po stránke manipulácie s reakčnými zložkami, ako aj po stránke stability reakčných zložiek.

Claims

1. Spôsob enzymatického stanovenia antibiotík s B-laktámovým jadrom v biologickej tekutine, zahŕňajúci nasledujúce stupne:

a) inkubáciu uvedenej biologickej tekutiny s rozpustnosťou D-alanyl-D-alanín-karboxypeptidázou, produkovanou mikroorganizmom Actinomadura R39, pričom sa táto inkubácia uskutočňuje pri podmienkach, umožňujúcich reakciu antibiotika s B-laktámovým kruhom, prípadne prítomného v uvedenej biologickej tekutine, s enzýmom pri vzniku inaktívneho a v podstate ireverzibilného ekvimolekulámeho komplexu enzýmantibiotikum;

b) inkubáciu zmesi, získanej na výstupe z prvého stupňa, s roztokom substrátu pri podmienkach, umožňujúcich hydrolýzu uvedeného substrátu enzýmom pri vzniku zlúčeniny, ktorej množstvo je úmerné zvyškovej enzymatickej účinnosti;

c) stanovenie množstva zlúčeniny, vytvorenej v stupni 2 a

d) porovnanie hodnoty, stanovenej v treťom stupni, s etalónom s cieľom zistiť koncentráciu antibiotika v biologickej tekutine, vyznačujúci sa tým, že sa inkubácia v druhom stupni uskutočňuje so substrátom, ktorým je tioester všeobecného vzorca

R'-R²-S-CH-COOH,

R³ v ktorom

R¹ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál alebo N^alfa-acetyl-L-lyzylový radikál,

HS-CH-COOH,

R³ v ktorom

SK 279176 Β6

R³ má uvedený význam, pričom sa inkubácia uskutočňuje v prítomnosti aminokyseliny, ktorá aktivuje hydrolýzu substrátu enzýmom, pričom uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej aminokyseliny s konfiguráciou D a glycín.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že substrátom je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tiojoctová.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že aminokyselina je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej D-alanín, D-metionín, D-arginín, D-fenylalanín, D-serín, D-histidín, D-valín, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomaslovú.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že aminokyselinou je D-alanín.

5. Spôsob podľa nároku laž4, vyznačujúci sa t ý m , že stupne 2 a 3 sa uskutočňujú súčasne.

6. Spôsob podľa nárokov laž5, vyznačujúci sa t ý m , že biologická tekutina sa zvolí zo skupiny, zahŕňajúcej mlieko, sérum, moč, sliny, mäsové extrakty, fermentačné tekutiny a pufrované vodné roztoky.

7. Spôsob podľa nárokov laž6, vyznačujúci sa t ý m , že antibiotikum, ktoré má byť stanovené, sa zvolí zo skupiny, zahŕňajúcej benzylpenicilín, ampicilín, fenoxymetylpenicilín, karbenicilín, meticilín, oxacilín, cloxacilín, cefalosporín C, cefaloglycín, cefalotín, cefalexín a cefapirín.

8. Spôsob podľa nárokov laž7, vyznačujúci sa t ý m , že množstvo kyseliny 2-merkaptoalkánovej všeobecného vzorca

HS-CH-COOH,

R³ v ktorom

R³ má uvedený význam, sa stanoví inkubáciou zmesi, získanej v stupni 2, s kyselinou 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoovou/ pri vzniku zafarbenia, ktorého intenzita je funkciou množstva kyseliny 2-merkaptoalkánovej.

9. Súprava na stanovenie antibiotík s B-laktámovým jadrom v biologickej tekutine, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje:

a) stanovené množstvo rozpustnej D-alanyl-D-alanínkarboxypeptidázy, produkovanej mikroorganizmom Actinomadura R39;

b) stanovené množstvo substrátu, ktorým je tioester všeobecného vzorca

R'-R²-S-CH-COOH,

I

R³ v ktorom

R¹ znamená benzoylový radikál, fenylacetylový radikál alebo N^alfa-acetyl-L-lvzylový radikál,

c) stanovené množstvo aminokyseliny s konfiguráciou D alebo glycín;

d) reakčnú zložku, umožňujúcu stanoviť kyselinu 2-merkaptoalkánovú všeobecného vzorca

HS-CH-COOH,

R³ v ktorom

R³ má uvedený význam a prípadne graf, znázorňujúci zvyškovú percentuálnu aktivitu enzýmu, vyprodukovaného Actinomadura R39, ako funkciu koncentrácie antibiotika alebo farebnú škálu, pri ktorej dochádza ku zmene intenzity zafarbenia v závislosti od koncentrácie antibiotika, s ktorým môžu byť porovnané výsledky testov, uskutočnené so zložkami 1, 2, 3 a 4.

10. Súprava podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že substrátom je kyselina [/N-benzoyl-D-alanyl/tio]octová.

11. Súprava podľa nárokov 9a 10, vyznačujúca sa tým, že aminokyselina s konfiguráciou D je zvolená zo skupiny, zahŕňajúcej D-alanín, D-metionín, D-arginín, D-fenylalanín, D-serín, D-histidín, D-valín, D-tryptofan a kyselinu D-2-aminomaslovú.

12. Súprava podľa nároku 11, vyznačujúca sa t ý m , že aminokyselinou s konfiguráciou D je D-alanin.

13. Súprava podľa nárokov 9ažl2, vyznačujúca sa tým, že reakčnou zložkou je kyselina 5,5'-ditiobis/2-nitrobenzoová/.

14. Súprava podľa nárokov 9ažl3, vyznačujúca sa tým, že substrát a reakčná zložka 4 sú združené vo forme tablety.