PT97511B

PT97511B - Processo enzimatico para determinacao de antibioticos de nucleo beta-lactamo

Info

Publication number: PT97511B
Application number: PT97511A
Authority: PT
Inventors: Jacques Degelaen; Jean-Marie Frere
Original assignee: Ucb Bioproducts
Priority date: 1990-04-30
Filing date: 1991-04-29
Publication date: 1998-08-31
Also published as: CA2040180C; FI97151B; FI912054A; YU48050B; NO302664B1; CS9101246A2; HUT58825A; PL169360B1; BG61082B2; IE69037B1; GR3017235T3; DK0468946T3; NZ237950A; IE911433A1; DE69111149T2; NO911692D0; AU636482B2; CZ280282B6; EP0468946A1; US5246830A

Description

presente invento refere-se a um novo processo enzimático, rápido e sensível, para a determinação de antibióticos ds núcleo β-lactamo num liquido biológico. 0 presente invento refere-se também a um sistema de ensaio utilizável na colocação em prática deste processo.

Actualmente, os antibióticos são muito utilizados, não apenas como agentes terapêuticos para, o tratamento de doenças infecciosas provocadas por bactérias, mas também como agentes de conservação dos alimentos e como aditivos para a dieta dos animais, no sentido de estimular o seu crescimento. Há, por isso, cada vez mais necessidade de se determinar a presença de antibióticos, mesmo em concentrações muito baixas, nos líquidos biológicos complexos, como no leite, na. urina, no sangue, no soro, na saliva, nos extractos ds carne, nos líquidos de fermentação, ou nos meios aquosos tamponados.

caso da produção ds leite é um exemplo. É bem •conhecido o efeito da utilização de penicilinas no tratamento de determinadas doenças infecciosas do gado produtor de leite, como por exemplo a mastite. Portanto, por razões medicinais evidentes o leite destinado ao consumo por seres humanos deve, em pricípio, estar isento de quaisquer vestígios de antibióticos. Por outro lado, concentrações de penicilina de 0,005 U.I./ml ou mesmo inferiores podem ter efeitos nefastos quando da fabricação de produtos derivados do leite, como o queijo, o iogurte, etc. Por outro lado, em certos países, as normas legais impõem uma. concentração em antibióticos não superior a 0,004 U.I./ml.

Verifica-se por isso que ê necessário poder -se, rapidamente e de maneira precisa, a concentração linas no leite produzido pelo gado e isto, de directamente no local de exploração.

determinardes penicipreferênc ia,

Jà. existem há muito tempo processos microbiológicos gue permitem fazer a determinação de concentrações rslativamente pequenas de antibióticos β-lactamos em líquidos biológicos. Estes processos são baseados na medida da inibição do crescimento dos microorganismos sensíveis aos antibióticos, na presença de uma amostra de líquido biológico. No entanto, estes processos exigem muito tempo, bem como uma grande técnica; no melhor caso, a duração necessária para se obter um resultado é de cerca de 2 a 3 horas, o que não é admissível na prática.

J

Mais recentemente, foi proposto um processo microbiológico rápido para detectar a presença de antibióticos num líquido biológico, em especial no leite (ver patente americana n.2 4.233.8525.

De acordo com este método, a amostra do líquido a examinar é incubada, por um lado com células ou partes de células de um microorganísmo muito sensível aos antibióticos, em especial Bacillus stearothermophilus, e por outro, com um antibiótico marcado por um elemento radioactivo ou por um enzima. Durante a incubação, o antibiótico que etá eventualmente presente na amostra e o antibiótico marcado entram em competição para se fixarem nos locais receptores das células ou de partes de células. Em seguida, determina-se a quantidade de antibiótico marcado que se fixou sobre as células ou parte de células; isto fornece uma indicacão da presença (ou não) de antibióticos, estando definido que a quantidade de antibiótico marcado e que se encontra fixado é inversamente proporcional á concentração de antibiótico na amostra.

De acordo com o autor desta patente, este processo permite detectar concentrações de antibióticos tão pequenas

quanto 0,01 U.I./ml, inclusive de 0,001 U.I./ml no leite, am pouco menos que 15 minutos.

No entanto, maior inconveniente deste processo reside no facto de, para se atingir este resultado, e preciso ter-se 1 -4 acesso a um antibiótico marcado por um elemento radioactivo ( C j ?5 ou 1.5, cujo doseamento tem que ser feito com um aparelho especial, por exemplo um contador de cintilação. Além disso, a manipulação de produtos radioactivos, mesmo em quantidades muito pequenas, não estã totaimente isenta de perigo para a pessoa que faz a análise.

.é verdade que no exemplo 2 desta patente se descreve uma variante deste processo de acordo com a. qual se utiliza um antibiótico marcado por um enzima, e no qual se determina a quantidade de antibiótico marcado por um método calorimétrico visual. No entanto, esta variante não permite detectar se há. mais (ou menos? do que 0,05 U. X ./ml de penicilina na amostra, oe leite. Este processo é portanto nitidamente menos sensível e por 3,sso mu3. to menos interessante .

Existem igualmente no comercio* testes basea.do*s na utilização de anti-corpos monoclonais ou policlonais. Com ©feito, e sabido que os testes podem ser* elaborados a pai^tií¹ de técnicas clássicas de diagnóstico imunológico* (ELISA, aglutinação* do látex, método radio-imunológico, etc.?. A titulo de exemplo relatívamente a. este tipo de testes, podem-se cita?·' o SFOT TEST, comercializado pela firma ANGENICS (Estados Unidos).

As desvantagens deste tipo de testes residem de el.es serem geralmente muito complexos e, sobretudo, permitirem determinar senão um número muito limitado de ticos. Com efeito, a. elevada especif icidade dos anti no facto* eles não* antibiócorpos só

β ~· lhes permite reconhecer os membros de uma família estruturalmente ligada àquela que foi escolhida para a. imunização. Isto ê espec i a. .1 men te de I i c ado para a f am i 1 i a dos β - 3 a c t amos.

Conhece-se igualmente um processo permite determinar concentrações pequenas de núcleo β-lactamo no soro humano e no leite Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia, •50ò—510) enzimãtico que an t i fo i óticos de ÍJ-M. FRERE et al., 18, <1380, n£ 4),

Este processo (designado a seguir por processo de ·.!

.M

FRERE) é mais interessante porque não necessita de recorrer a produtos radioactivos que exijam aparelhos de medida sofisticados, ao mesmo tempe* que apresenta uma grande rapidez e uma precisão notíãvsl. Este processo baseia-se na utilização de um enzima específico, neste caso a D-alanil-O-alanina-carfooxipepfidase exocelular solúvel, que é produzida pela Actinomadura R33 (precedentemente designada por enzima R39) actividade específica de hidrólise do D-alani1-D-alanina de diversos péptidos

Este enzima, possui uma s agrupamentos terminais com libertação do terminal D-alanina.

Uma outra reside no facto dele mo para formar muito característica importante do enzima R33 reagir com os antibióticos de núcleo β-lactarapidamente um complexo enzima-antibiótico equ i mo1 ec u I a r, i nac t i vo e sens i ve1men te i r r eve r s í ve1.

Mo processo de J—M. FRERE, tira—se partido destas propriedades do enzima R33 para se determinar as concentrações muito baixas dos antibióticos de núcleo β-lactamo. Este processo compreende três fases essenciais

Na primeira fase, um volume determinado de uma amostra do liquido a examinar é incubada com uma quantidade determinada do enzima R39. A incubação é conduzida a condições que permitem que o antibiótico β-lactamo que está eventualmente presente na amostra reaja com o enzima para formar um complexo enzima-antibió tico equi.molecu.lat', ,'í.nacfi vo e sensível.men te irreversível.

Na segunda fase, uma. quantidade determinada de substrato, por exemplo, a Ν³·*· , ^^un-diaceti X-L-l isi 1-D-alani l-D-ala nina, é incubada com o produto obtido na primeira fase em condições que permitam a hidrólise do formar uma quantidade de D-alanina residual do enzima R39 que não foi n a p rxme i ra fase.

substrato pelo enzima para c o r r espondert te á.

:omplexado com o ac tividade antibiótico

Na terceira fase, determina-se a quantidade de D-alanina formada deste .modo. Compreender-se-á facilmente que a quantidade de D-alanina formada na segunda fase depende da actividade residual do enzima e é portanto inversamente proporcional à quantidade de antibiótico que está presente na amostra.

No processo de J-M. FRERE, determina-se esta quantidade de D-alanina. por um método enzimático.

ito reside em duas reacções enzimáticas associadas. Na primeira reacção, a D-alanina è oxidada em ácido pirúvico com o auxílio de uma D-aminoácido-oxi dase Cna presença do seu co-enzima, a flavina-adenina-dinucleotido).; forma—se ao mesmo tempo uma quantidade correspondente de peróxido de hidrogénio a partir do oxigénio do ar. Na segunda reacção, o peróxido de hidrogénio formado é utilizado para oxidar a o-dianisidina com o auxilio de uma peroxi.da.se. Produz-se uma coloração escura, cuja intensidade é função da quantidade de D-alanina.

Isto permite por isso determinar a quantidade de D-alanina por um método calorimétrico, quer visual.men te, quer por medida da densidade óptica no espectrofotómetro (lambda max — 460 nm 3 .

Por preparação de uma série de amostras com uma determinada concentração conhecida de antibiótico e por aplicação deste processo, pode-se estabelecer deste modo uma curva, de aferição que liga a percentagem de aetividade enzimática residual do enzima R39 á concentração de antibiótico.

Para se obter uma indicação quantitativa da concentração de antibiótico de uma amostra, procede-se então exactamente da mesma maneira e determina-se a concentração de antibiótico por ut i1i za ção da c u rva de a f e r i ç ão.

Eísta determinação quantitativa necessita evidentemente de recorrer a um espectofotómetro.

Além disso, para se determinar se a concentração de antibiótico ultrapassa ou não um determinado valor critico, não é necessário recorrer-se a um espectrofotómetro ou a um outro aparelho similar de medição.

Basta ter conhecimento previamente a que concentração critica, de antibiótico a aetividade do enzima R33 é to tal men te suprimida ou, de outro modo, a que concentração de antibiótico não se forma a D-alanina e, por consequência, não se produz coloração. Tendo-se conhecimento desta concentração critica, é evidente que se pode, por meio de uma simples inspecção visual do resultado da determinação, julgar se uma determinada amostra contém ou não uma concentração em antibiótico menor ou maior que a referida concentração critica. Constata-se, portanto, que por este processo se pede, sem dispor de um aparelho especial, obter rapidamente e de maneira precisa, uma indicação da concentração de an t i b i ά t i c o no Ie i te.

Por outro lado, este processo permite determinar concentrações reiati vamente pequenas do antibiótico β-lactamo no leite e no soro humano. Deste modo, por exemplo, partindo-se de amostras de leite com um volume de cerca de 20 ql e procedendo-se ã sua. incubação com 3 picomoles do enzima R39, é possível determinar-se, quantitativamente (por utilização de um espectrofotómede 1 e i te, e qua I i ta t i vamen te, pe 1 : riormente, concentrações superiores menos de uma hora.

tro?, concentrações de penicilina tão pequenas como 0,02 U.I./mx método visual descrito antea 0,0’3 U. .1. /'.mi de leite em?

No entanto, o processo de ..J—M. FRERE apresenta diversos inc onveni en tes i mpo rtan tes.

Coro efeito, a sensibi1 idade do processo de J-M. FRERE, em especial no caso de líquidos biológicos (leite, saliva, soro, etc.?, e xnsuficiente. é verdade que ê possível aumentar—se esta sensibilidade, quer por diminuição da quantidade de enzima R39 posto á disposição do processo, mas donde resultaria um aumento da duração da reacção tanto na primeira, comia na segunda fase do processo, quer por aumento do volume da amostra necessário para incubação com o enzima R33, e neste caso, seria necessário aumentar o tempo de reacção da primeira, fase do processo.

Infelizmente, não é possível aumentar desta maneira, a sensibi 1 idade do processo de .J-M. FRERE, em especial no caso dos líquidos complexos de origem biológica. Constatou-se com efeito que é impossível realizar uma determinação conveniente quando o volume da amostra de líquido biológico ultrapassa um determinado volume crítico, que varia ern função da natureza do mesmo. Deste modo, no caso do leite e do soro, quando o volume da amostra que se submete a incubação ultrapassa um volume ds ± SO /.il, observa-sa que a quantidade de o—dianisidina oxidada formada é fortemente reduzida.

Final.mente, no caso da urina, não se detecta nenhuma actividade enzimãtica, mesmo utilizando-se volumes de amostra tão pequenos como 10 jul. é por isso impossível empregar—se este processo para determinação de antibióticos na urina.

Supõe-se que os .liquidos biológicos compreendem substâncias que inibem a acção dos enzimas utilizados no processo. Na prática, isto significa que a utilização de grandes volumes de amostras não pode ser feita nos melhores casos, senão ã custa de um aumento da quantidade dos reagentes, peio· menos numa quantidade proporcional ao aumento do volume.

Isto não é no entanto aconselhável, face ao elevado dos enzimas necessários, em especial da D-aminoãcido dase e o seu co—factor, a flavina-adenina-dinucleotido.

custo

Uma versão aperfeiçoada do processo de J-M. FRERE é comercializada sob a forma de um teste com a marca Penzym. Este teste á utilizado principalmente como um teste de separação para o leite proveniente das leitarias.

Este teste é realizado em duas fases,’ na primeira fase, 50 ,ul de leite são incubados com 1,5 picomoles do enzima R39 durante 5 minutos a 47^SC. C<e seguida, na segunda fase, todos os reagentes que permitem efectuar a determinação da actividade enzimãtica residual, no caso do substrato n®·^®, N^SPteJ ^'^On-diaceti 1-L-l isi 1-D-alani l-D-alartina, a D-aminoác ido-oxidase, a flavina-adenina-dinucleotido, a peroxidase e o cromogénio reactivo, são adicionados ao meio ds incubação e o t-odo é incubado durante 15 minutos a 47°C. No final da incubação, por comparação com uma caria de cores, uma cor amarela sem rosa indica a presença de antibióticos de nó G-lactamo com uma concentração superior a 0,017 U.I./ml de leite. Por contrário, a presença de uma cor rosa indica quer a ausência ds antibióticos (cor rosa intensa), quer a presença de antibióticos em concentrações que podem ir até 0,017 U.I./ml, em que a intensidade da cor rosa obtida é inversa— ante proporcional â concentração de antibiótico.

Graças a. este teste, podem-se determinar visualmente concentrações de antibiótico no leite tão pequenas como 0,017 U.I./ml, no espaço de 20 minutos.

Contudo, esta mesma versão optimizada do processo ds •J-N. FRERE apresenta, caracter isticas de sensibilidade e de rapidez que não permitem a sua utilização quer nos países onde a legislação impõe concentrações de antibiótico extremamente pequenas, por exemplo de 0,004 U.I./ml, quer como teste ultra-rápido que permita ao recolhedor de leite efectuar os ensaios na herdade num periode de tempo inferior a 5 minutos.

J aumento da sensabi1 idade e a redução do tempo de resposta estão submetidos aos mesmos condicxonalismos que aqueles já assinalados anteriormente quando da análise do processo de J—M. FRERE. Por outro lado, este teste é efectuado com volumes muito reduzidos de amostra e requer por isso um certa experiência na técnica de microdosagem para poder ser efectuado correctamente

Para se evitar todos os problemas ligados á utilização de um teste que tem que sei¹ efectuado totalmente na presença do liquido biológico, foi proposto também um processo no qual o

enzima R39 é imobilizado sobre um suporte .insolúvel em água, em especial sobre uma resina ds poli(N,N“dimetilacrilamida>. Este processo, que é objecto da patente americana n2 4.546.076, compreende as três fases seguintes;

<í) o enzima imobilizado sobre o seu suporte é incubado· na presença do líquido biológico;

<2> o enzima imobilizado é de seguida separado do liquido biológico e é lavado;

<3> a actividade residual do enzima R39 é determinada por doseamento calorimétrico da D-alanina formada a partir do substrato peptidico, graças ao sistema de reagentes constituído por uma D-aminoácido-oxidase e pelo seu co-factor, uma peroxidase e um cromogeno reactivo, com leitura visual do resultado ou com o auxilio de um espectrofotómetro.

Este processo apresenta várias vantagens; não há qualquer interferência do liquido biológico com os enzimas utilizados no doseamento da .D-alanina, uma vez que o liquido biológico já. foi eliminado na fase <2> do processo; podem-se fazer determinações excelentes com volumes de amostra mais importantes que podem ir até -5 ml; e a sensibilidade é muito maior, visto que este processo permite determinar visualmente concentrações de penicilina Q superiores a 0,002 U.I.Zml de leite.

No entanto, este processo apresenta também alguns i nconven ien tes;

— como todos os processos que precisam de u.ma etapa de separação, a reprodutibi1 idade dos resultados é pior que num processo de fase homogénea;

- qualquer que seja o método de separação considerado, este resulta inevitavelmente num aumento da duração e da complexidade do processo;

- Í8 mesmo que este processo permita obter por leitura visual uma sensibilidade elevada que poderá ir até 0,002 U.I./ml de penicilina G, o tempo necessário para se obter este resultado é demasiado prolongado (pelo menos trinta minutos) para que o processo possa ser utilizado na despistagsm rápida, no momento da recolha do leite na herdade,' e

- além disso, o seu custo é nitidamente mais elevado do que o de um teste prático em fase homogénea.

Um progresso técnico e económico importante consistiria portanto em poder-se dispor de um processo que não apresentasse os diversos inconvenientes dos processos do estado da técnica e em especial do processo de J-M. FRERE ou dos processos derivados do mesmo, tais como o teste de penzym ou o processo descrito na. patente .Norte Americana n.2 4.546.076. Por outras palavras, ê necessário podei—se proporcionar um processo que apresente um conjunto de propriedades vantajosas, ou seja que permita a obtenção muito rapidamente do resultado, por exemplo ao fim de 5 minutos ou menos.:

que apresente uma sensibilidade muito elevada que permita, o seu emprego mesmo nos paises onde a legislação é muito severa e impõe concentrações em antibiótico não superiores a 0,004 U.I/ml ou menoresque permita efectuar determinações com volumes de amostra importantes de i ml ou mais, o que possibiIitaria a sua colocação em prática de um modo bastante fácil por pessoal não sspe cia1i zado que apresente um custo reduzido e uma grianda simplicidade relativamente â sua colocação em prática.

Estes ofojectivos são alcançados pelo processo que é objecto do presente invento, o qual destingue-se pelas caracterís ticas essenciais seguintes;

Cl) utilização de um substrato especial do tipo tioéster para o enzima R39, de maneira a formar por hidrólise um composto que contenha um grupo SH livre que possa ser doseado por um método calorimétrico* simples e barato, sem necessitar de enzimas cuja acção é perturbada por compostos do liquido biológico,' (2) condução da hidrólise do substrato pelo enzima na presença de um ãcido aminado de configuração D ou de glicina que activa sensivelmente esta hidrólise.

presente invento tem por isso por objecto um novo processo enzimático para a determinação de antibióticos de núcleo β-lactamo num liquido biológico* que compreende as fases seguintes* C1) a incubação do referido* liquido biológico com a. u—alani.1 D -&1an i na-car box i pep t i dase so1úve1 p r oduz i da pe1a

Actinomadura fi esta incubação do referido liquido b i ο I óque permitam gico é conduzida em condiçdes tais antibiótico de β-lactamo eventualmente presente no referido liquido reaja com o enzima para formar um complexo enzima-antibiótico* equimolecular, ínactivo e sensivelmente irreversível 5 (2) a incubação da mistura obtida no fim da fase Cl) com uma solução de substrato em condições que permitam a hidrólise do referido substrato pelo enzima, para formar um composto, cuja quantidade seja proporcional ã. actividade enzimática residual;

<3) a determinação* da quantidade do* composto formado* na fase <4) a comparação* do valor determinado na fase 03) com um padrão, de modo a se obter a concentração do antibiótico* no liquido* biológico, *o qual é carac ter izado por a incubação da fase (2) ser efectuada com um substrato que é um tioéster d'e fórmula geral

R -R„,-8-CH-C00H 1 x na qual R,

-alfa representa o radical benzoilo, fenilacetilo ou N -a ε e t i .1 -L, - .1 i s i 1 o,

R._, representa o radical glicilo ou D-alani Io, e R._, é um átomo de hidrogénio ou um radical metilo, de maneira a formar por hidrólise um ácido 2-mercaptoalcanóico ds •F Λ òrmula

HS-CH-COOH (II) na qual R.-, tem o significado dado anteriormente, e na presença de um ácido aminado que activa a hidrólise do substrato pelo enzima, em que o referido ácido aminado é escolhido entre um ácido aminado de configuração D e a glicina.

de determinados te r m i na 1 e ma i s

Durante os trabalhos de pesquisa neste domínio, o requerente descobriu que o enzima R39 possui uma actividade espec íf Xca de hxdrólxse das 1igaçt.-.* compostos que possuem um agrupamento tioéstey espeeialmente uma actividade de hxdrólxse em comparação com os tioésteres correspondentes á fórmula geral I mencionada anteriormente. Esta descoberta è surpreendente só por si, uma vez que não é conhecido, ou pelo menos não é do conhecimento do requerente, na técnica um exemplo de uma D-alanil-O-alanina-carboxipepticomo uma txoesterase.

requerente tirou partido das vantagens que determinam esta propriedade inesperada do enzima R39 para proporcionar um novo processo enzxmático mais perfeito para a determinação de antibióticos de nó β -1 a c tam o em 1 í qu i dos b i o .1 óg icos.

Ao contrário do procssso de -J-M, FRERE e dos processos análogos descritos anteriormente,. emprega-se por isso, de acordo com o presente invento, como substrato para o enzima R33, um tioéster de fórmula geral I que forma, por hidrólise, um ácido .2-mercaptoal canôi co que corresponde à formula IJ. dada anteriormen te. Este novo substrato porporeiona numerosas vantagens, tanto do ponto de vista tecnológico, como do ponto de vista económico. Com efeito, o ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula IJ. formado a partir deste substrato Ce cuja quantidade é proporcional á actividade residual do enzima R39? pode ser doseado por um método calorimétrico simples que não requer a utilização ds ensiísas t-ais como a b amxnoácxoo-oxxdase e o seu co—enzxma. Além de uma redução substancial do preço de revenda, suprime-se em consequência um dos maiores inconvenientes do processo J-M. FRERE, ficando estabelecido que não há nenhuma interferência, possível entre os compostos do líquido biológico e os reagentes do doseamento calorimétrico, sendo estes últimos constituídos por simples reagentes químicos isentos de enzimas.

Pelo processo de acordo como invento, pode-se portanto efectuar uma determinação directamente no líquido biológico, tal qual na forma em que se encontra.,' não é necessário retirar, previamente às amostras sujeitas a determinação, as substâncias que podem perturbar o doseamento calorimétrico.

Por outro lado, uma vez que a determinação da actividade residual do enzima deixa de ser inf .luenc iada pelos factores presentes nos líquidos biológicos, é também possível trabalhar com volumes de amostra de líquido biológico que podem ir até 10 ml. 0 processo de acordo com invento permite por trabalhar com volumes mais importantes, uma vez que aplicação do mesmo, mais fácil de executar por espec ia1izadas.

consequênc ia o torna, por pessoas não

Além disso, visto que é possível trabalhar com maiores volumes, o processo do invento permite obter uma sensibilidade bastante maior. Como se mostrará a seguir nos exemplos de realização, o processo do presente invento permite determinar, visualmente e com fac.ilidade, quantidades da. ordem de 0,004 0.1. de penicilina G por mililitro de leite em 15 minutos; pode-se mesmo, por referência a uma carta de cores, conseguir detectar-se concentrações tão pequenas como 0,002 U.I./ml.

requerente constatou por outro lado, cor» surpresa, que a adição de um ácido aminado de configuração D ou de glicína tem o efeito de aumentar consideravelmente a velocidade da reacção de hidrólise do substrato do tipo tioéster de fórmula I sob influência do isnzifsa. Os seus trabalhos de pesquisa neste domínio mostraram que vários ácidos aminados de configuração D, bem como a glicina, podem desempenhar um papel importante como activadores da reacção de hidrólise do tioéster. Entre os melhores activadores, pode-se citar a. D-alanina, a. D-metionina, a D-arginina, a D-fenilalanina, a D-serina, a D-histidina, a D-valina, o D-triptofano e o ácido D-2-aminobutírico.

Deste modo, por exemplo, posto que a actividade do enzima R33 é expressa em unidades por miligrama de enzima, uma unidade de enzima que hidrolisa 1 micromole de substrato por minuto, a 47°C, descobriu-se que a actividade do enzima R3S em comparação com o ácido CCN-benzoi1-D-alani1)tiolacético utilizado como substrato, é igual a 8 unidades na ausência da D-alanina e a 320 unidades na presença da D-alanina. Por outras palavras, na ubstrato

presença deste activador, a velocidade de hidrólise do pelo enzima RSS é 40 vezes mais elevada.

Pelo contrãrii também se constata que nennum ácido aminado com a configuração L é capaz de activar a hidrólise do substrato.

é por isso que, de acordo com invento, é essencial que a hidrólise do substrato do tipo tioéster, no estado <2>, seja efectuada na presença de um ácido aminado de configuração D que activa a hidrólise do referido substrato pelo enzima RSS. Esta medida permite com efeito um ganho ds tempo considerável para realizar o processo. é, deste modo, graças ao processo· de acordo com o presente invento, possível determinar-se com facilidade uma concentração em penicilina Q de 0,016 U.I. por mililitro de leite num prazo· de 5 minutos. A título· de comparação, recorde -se que o teste Penzym requer cerca de 15 minutos para se obter o· mesmo resultado. Contrariamente aos processos do· estado· da técnica, o· processo de acordo com o invento é por isso particular mente atraente para a despistagem rápida no momento· da recolha do leite na herdade, tanto mais que a sua colocação em prática é simples e não· necessita, de uma aparelhagem sosf isticada.

Por outro lado, constata-se que o processo· de acordo· com o· presente invento· pode ser aplicado· com sucesso, não· apenas para a determinação· de antibióticos no leite, mas também noutros líquidos biológicos, tais co<mo o soro, a urina, a saliva, os extractos de carne, os líquidos de fermentação, as soluçSes aquosas tamponadas, etc.

A vantagem primordial do processo do presente invento consiste no facto de ele permitir, quer de detectar num período muito curto (de 5 minutos) concentrações em antibióticos de ·- Í9 β-lactamo de derca de 0,016 U.I./ml, quer de detectar num período de tempo um pouco mais prolongado (de 15 minutos) concentrações muito reduzidas de antibiótico β-lactamo da ordem de 0,004 U.I./ml ou menores, sem ser necessário recorrer-se a um aparelho especial de análise e a uma tecnologia complexa que necessite de um processo de separação.

Os antibióticos, dos quais se possa determinar a concentração por utilização do processo de acordo com o invento, pertencem ao grupo de antibióticos que são caracterizados pela presença de um núcleo β-lactamo na sua. molécula, ou seja em princípio todas as penicilinas e cefalosporinas. A título de exemplo de penicilinas, podem-se citar a benzi lpenxc.il ina (penicilina G), a ampicilina, a fenoximetilpenicilina, a carbenici1ina a meticilina, a òxacilina, a cloxacilina, etc. A titulo de exemplo de cefalosporinas podem-se citar a cefalosporina C, a c e f a 1og1i c i na, a c ef a1ot i na, a c ef a1ex i na, a c e f ap i r i na, etc.

Obtiveram-se resultados especialmente favoráveis com a penicilina G.

Na fase (í) do processo de acordo com o invento, um volume determinado de uma amostra do liquido biológico é incubado com uma quantidade determinada do enzima R33.

Como foi explicado anteriormente, é possível trabalhar com volumes muito grandes de amostras. Para uma quantidade dada do enzima R39, se se aumentar o volume da amostra, aumenta-se paralelamente a sensibilidade do processo. Por exemplo, se se duplicar o volume da amostra, a sensibilidade é também duplicada; se se triplicar o volume da amostra, a sensibilidade é também triplicada, etc. Pode-se por isso escolher o volume da amostra em função da sensibilidade desejada. No caso do leite por

exemplo, pode se adaptar a sensxbx3.ida.de do processo ás normas fixadas pela legislação do pais onde ele é utilizado, ou ainda às exigências da indústria leiteira.

Pode-se igualmente obter o .mesmo efeito para um volume dado de liquido biológico por diminuição da quantidade do enzima R33 (ver o exemplo 2 seguinte). Todavia, neste caso, é preciso aumentar proporcionalmente não apenas a duração da fase Cl), mas também a duração da fase C23 do processo.

Na prática, a escolha das quantidades do enzima R33 e do liquido biológico a. utilizar dependerá, por um lado, da forma como o processo será posto em prática e, por outro, da sensibilidade ou da rapidez que se pretende obter.

Deste modo, por exemplo, se se pretender utilizar o

-se ão oe preferência volumes compreendidos entre

COfi	taminação
_f
'nos	s vo ,í umes
1 .	Escolher·
1 e	10 ml.
com	mater xa1
ios	ent«^ee 50

jul e 1 ml são perfeitamente convenientes.

Por outro lado, a escolha das quantidades de enzima e de liquido biológico dependerão essencialrnente da sensibi.1 idade requer ida.

Deste modo, por exemplo, em laboratório, onde se podem utilizar pequenos volumes e onde se pretende obter uma. sensibilidade de 0,01 U.I./ml, escolher-se-á uma quantidade de enzima da ordem de 1 picomole e um volume de liquido biológico da ordem de -50 aiI . Se se pretender obter uma sensibi 1 idade respec ti varnente

2Í de Ο,ΟΟδ e de 0,0025 U.I/ml, levar-se-á o volume de liquido biológico respectivamente a 100 ;j! e a 200 ,ul, sem se alterar a quant i dade de enz i ma.

A excelente sensibilidade, a rapidez e a precisão do processo de acordo com o invento resultam das características particulares do enzima R33 por um lado, e por outro, do método utilizado para a determinação da actividade residual deste enzima R39.

Com efeito, o enzima R3'3 é caracterizado por;

formação extremamente rápida de um complexo enzima-antibióti c o equ i mo1ec u1ar i na ct i vo, estabilidade extraordinária do referido complexo porque, uma vez formado, ele apenas se decompõe muito lentamente. A titulo de exemplo, o tempo de semi-vida do complexo formado entre o enzima R33 e a penicilina C ê de cerca de 70 horas a 37°C.

uma actividade enzimática excelente que se traduz por uma hidrólise muito rápida do agrupamento terminal do substrato do tipo tioéster de fórmula I, sob a influência de um a c t i va.do r es pe c í f i c o.

Sraças a estas três características, o enzima R33 ocupa uma posição priveiigiada em relação âs D-alanil-D-alanina-carboxipeptidases identífiçadas até á data. Com efeito, estando definido que o tempo de decomposição do complexo enzima-antibiótico é infiniiamente maior que a duração de tempo total que ê necessária respectivamente para a. formação do complexo e para, a medição da actividade enzimática residual, não é de recear que os resultados da determinação sejam falsos devido a colocação em liberdade do enzima activo, na sequência de uma decomposição prematura do complexo enzima-antibiótico.

Portanto, quando se examinam as D-alanil-D-carboxipeptidase que se conhecem actualmente, para além do enzima R33 não existe mais nenhum que responda perfeitamente a estas condições; com efeito, ou é a velocidade de formação do complexo que é uma dezena de vezes menor, ou é a estabilidade do complexo antibiótico-enzima que é absolutamente insuficiente, ou é ainda a velocidade de hidrólise do substrato que é demasiado lenta (é partieularmente o caso de todas as carboxipeptidases endocelulares ligadas â membrana bacteriana).

enzima R3‘3 é a D-alanil-D-alanina-carboxipeptidase exocelular solúvel especifica que é excretada pela Actinomadura R39, quando se cultiva este microorganismo (depositado em 10 de •Julho de 13S1 no Instuto Pasteur de Paris, sob o n£ 1-127) num meio de cultura apropriado.

Para a colocação em prática do processo do invento, este enzima deve evidentemente ser substancialmente puro. A sua preparação e a sua purificação podem ser efectuadas segundo os métodos descritos na literatura (ver relativamente a este assunto, o artigo de J-M. FRERE & al., Biochem.J.143, (1374), 223-240, intitulado Peso Molecular, Composição de Aminoácido e Propriedades E i s i c o-Quím i cas da DD~Ca rboxi pept i dase-Transpept i dase Exoc e™ lular de Streptomyces R33). Por outro lado, este enzima, no estado puro, está agora disponível, no comércio; pode ser adquirido na firma UCB-BIOPRODUCTS S.A. (Bélgica).

enzima R33 possui uma excelente suporta temperaturas elevadas que podem ir até razão que a incubação do liquido biológico com estabiI idade; SO°C. s por o enzima R33 ele essa pode ssr efectuada sem inconvenientes, num intervalo de temperatura compreendido entre 20 e 50°C. De preferência, esta temperatura está próxima dos 47°C. Com efeito, nestas condições, a duração da incubação, que está estreitamente .ligada ao tempo necessário para a formação do complexo enzima-antibiótico equimolecular inactivo, é muito reduzida. Um aumento da temperatura de incubação terá por efeito uma diminuição da sua duração e inversamente. .é portanto possivel reduzir-se a duração do processo por aumento da temperatura.

i

Na fase (2.) do processo de acordo coro o presente invento, a mistura obtida no final da fase (!) é incubada com uma quantidade determinada do substrato do tipo tioéster de fórmula 1, em solução, na presença, de glicina ou de um ácido aminado de configuração D, que activa a. hidrólise deste substrato pelo enzima. Durante o desenrolar desta fase, a fracção do enzima que não foi consumida na formação: do complexo: enzima-antibiótico na. fase (!) do processo é utilizada para efectuar a hidrólise do substrato tioéster de fórmula I. Esta reacção de hidrólise produzirá uma quantidade de um ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula II que é proporcional á actividade residual do enzima R39.

Us tioésteres de fórmula I são compostos novos, com excepção para o ácido £<N-benzoi1-glici1)tiol-acético, que é um composto conhecido (ver patente americana nS 2.324.8S3).

Os tioésteres de fórmula. I podem ser preparados de acordo com um processo convencional que apenas faz intervir reacções conhecidas. Por regra, geral, um ácido de fórmula 111, previamente activado, por exemplo sob a forma de anidridos mistos ou ainda de ésteres activos, é condensado num solvente inerte tal como o clorofórmio, o diclorometano, o acetato de etilo ou a

dimetilformamida, com um ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula. II, de acordo com o esquema reaccional

R.R...OH + HS-CH-COOH X

-> (I) (III) na qual Rp R... e R.-_s têm o mesmo significado que anteriormente

I, que poderão N-benzo i1~D~a1at i o 3 - p r op i ό n i c o,

COh)O £?XS?R7p 103 d© t·! dC? f ÓPIttU I ser utilizados como substrato, citamos o ácido EC n i .1) t io3 --a c vá t i c ο, o ác í do 2- E (N-benzo i I -D-a I an i I o ac ido E C ÍM™ f en i 1 ac e t i 1 —L·—a 1 an i 1 ? t ι o 3 acético, o ácido ECN **' —acetiIL--.Iisil-D-aianiI)tio3-acético, etc. No entanto, o ácido E<N-benzoil-D-alani1)tio3acético é aquele que proporciona os melhores resultados.

Como exemplos não limitativos de ácidos aminados de conf iguração L/ que se pooem assoeiar na qualxdaoe oos substratos mencionados anteriormente, citar-se-ão a D-alanina, a D-metionina a D-arginina, a D-f eni lalanina, a E)~serina, a D-histidina, a D-valina, o D~triptofano e o ácido D-2-aminobutírico.

j. nverst o, -D~a1an i1

Oe acordo com uma forma especialmente preferida do s D-alanina encontra-se associada ao ácido ECN-benzoiltio3-acético, o qual é utilizado como substrato.

fts quantidades de substrato e de activador a utilizar não são criticas, desde que se opere nas condições de saturação do enzima pelo substrato.

- 25 As condições de operação a observar durante esta fase são sensivelmente as mesmas que as indicadas mais atrás para a fase (1). A incubação pode ser efectuada dentro de um intervalo de temperaturas compreendido entre 20 e SO°C_; de preferência a uma temperatura próxima de 47°C. A duração do período de incubação com a fracção do enzima R39 não activada deve ser pelo menos suficiente para formar uma quantidade mensurável do ácido 2-mer~ captoalcanóico de fórmula II. Para uma temperatura de incubação de 47°C, a duração deste período pode variar entre alguns segundos e 10 minutos, de acordo com a quantidade de enzima presente e o volume da amostra. A duração deste período pode ser diminuída por aumento da teniperafura de incubação ou, por aumentada por diminuição da temperatura de incubação, da. temperatura desta incubação é considerado interessante em todos os casos em que a rapidez da determinação seja um factor i mpo r ta π te.

contrarxo, 0 aumento

A fim de conservar uma actividade enziríi&ticãi óptima, o meio de incubação deverá, de preferência, apresentar um valor de ©H ompreendido entre 7 e

5. Normalmente, mantém-se um valor de pH vizinho de 8,0, efectuando-se a incubação no tampão apropriado.

• i o de um

Na fase (3) do processo ds acordo com o presente invento, determina-se a quantidade de ácido 2-mercaptoalcanôico de fórmula II que se formou na fase <2).

A dosagem do ácido 2-mecaptoalcanõico de fórmula II pode ser efectuada por qualquer método conhecido por si só. é apenas importante que o método seja rápido, pouco oneroso e que permita determinar especificamente o ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula II, com exclusão de todos os outros produtos que se encontram presentes no líquido a examinar.

é por isso que se utiliza calorimétrica com o auxílio de um c o1o ra çSo a través da 2-mercaptoalcanôi co.

de preferência uma dosagem reagente que produza uma reacção com o grupo SH livre do ácido

Este cromogénio reagente pode ser- escolhido entre os reagentes químicos que são utilizados habitualmente neste tipo de reacção, como por exemplo o ácido 5,5’'diti.obisC2-nitrobenzóico>, os produtos de condensação da 4,4'-ditiobisCfenilalanina) :om benzaldeídos, o sistema fenantrolina-Fe +++

Um cromogénio reagente preferido· é o ácido 5,5'-ditiobis<2-nitrobenzôico), designado igualmente por reagente de Ellman, gue produz uma coloração amarexa baseada no acxdo 2—nitro -S-mercaptobenzáico formado· através de uma reacção de permuta com o grupo SH do ácido 2-mercaptoalcanóico,’ a intensidade desta coloração é por isso directamente função da quantidade do ácido· 2-mer c ap toa1c a nóico.

No entanto, para determinadas aplicações, pode ser preferível utilizar-se a coloração vermelha que é produzida pela reacção da fenantrolina com os grupos SH livres na presença de c a t i Ses Fe

A quantidade deste cromogénio reagente tuncac quantidade do ácido 2-mercaptoalcanóico formado na aplicação particular. é preferível trabalhar-se naquelas condições em que quantidade molar de cromogénio reagente se encontra num ligeiro excesso relativamente á quantidade molar máxima do ácido 2-mercaptoalcanóico susceptível de ser formada na fase ' <2> do proces27

Note-se que o enzima R39 deve estar necessariamente presente desde o principio da fase Cí) do processo; da mesma forma, o substrato e o activador devem estar necessariamente presentes no inicio da fase ¢2). No entanto, deve ser possível adicionar-se o activador no inicio da fase < .1.), da mesma forma que deve ser possível adicionar-se o cromogénio reagente no inicio quer da primeira, quer da segunda fase, ou então apenas no fim da fase (2). De acordo com uma forma de realização preferida, na fase (1) do processo proceder-se-á à incubação da solução do enzima. R33 com a amostra do leite na presença do activador, na fase (2) adicionar-se-á o substrato e o cromogénio reagente e executar-se-ão as fases (2) e <3) em simultâneo, em condições sensivelmente idênticas ãs indicadas mais atrás para a fase (2).

Na fase (4) do processo, o valor determinado na fase <3> é comparado com um padrão para se obter a concentração do antibiótico no liquido biológico.

A determinação quantitativa da concentração em antibiótico pode ser efectuada de acordo com o método seguinte.

Em primeiro lugar, prepara-se uma série de amostras do liquido biológico contendo uma concentração conhecida, em antibiótico de B-lactamo.

Esta série conterá, para além de um determinado número de amostras que contêm uma concentração crescente em antibiótico, duas amostras do líquido biológico isentos ds antibióticos.

De seguida, todas estas amostras são tratadas de forma rigorosamente igual, tendo-se seguido as fases <i), (2) e <31 do processo de acordo com o presente invento.

Para uma das amostras isentas de antibiótico, substitui -se todavia a solução de enzima utilizada na fase (1 ) por um volume idêntico de água. Neste caso particular, obtém-se por isso, no fim da fase <3), uma solução que contém todos os reagentes com excepção para o enzima R33. Face è ausência do enzima, nao se formará por isso o ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula II na fase <2? e consequentemente o cromogénio reagente,’ neste caso o ácido S,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) não produzirá nenhuma coloração. Esta amostra será, designada a seguir por amostra branca.

.A outra amostra isenta de antibiótico produzirá ao contrário uma coloração amarela, pronunciada. Com efeito, como a amostra está isenta de antibiótico, o enzima R33 não é inactivado na. fase (1) e formar-se-á uma quantida.de máxima de ácido 2-mercap toalcanóico de fórmula II <correspondente à actividade total do enzima R33 utilizado) e portanto uma quantidade máxima do ácido 5-mercap1ο-2-πi trobenzói c o, e c onsequentemente, produzi r-se-á uma coloração amarela pronunciada. Esta amostra será designada a seguir por amostra testemunha.

Compreender-se-á também que quando as amostras contêm uma quantidade molar de antibiótico inferior á quantidade molar de enzima R33 utilizado, apenas uma fracção deste enzima será inactivada pelo antibiótico na fase < 1),’ neste caso, formar-se-á assim uma quantidade de ácido 2-mercaptoalcanóico de fórmula II que corresponderá à actividade residual da fracção do enzima que não foi inactivado pelo antibiótico e, por consequência, também uma quantidade correspondente de ácido S-mercapto-2-nitrobenzóico Neste caso, produzir-se-á igualmente uma coloração amarela, mas de uma intensidade inferior â observada com a amostra testemunha.

F i na1mente, quando molar de antibiótico que é de enzima R39 utilizado, o pe .1 o an t i b i ô t i c o du r an te a

ácido 2-mercaptoalcanói.co de fórmula permanecerá imutável. Neste caso coloração idêntica â observada com a as amostras contêm uma quantidade igual ou superior à quantidade molar enzima será, completamente inaciivado fase Cl); não se formará por isso o

IJ. e o cromogénio reagente ooter-se-á por tarifo uma amos t r a br anca.

Para se obter uma determinação precisa, mede-se com o espectrofotômetro a densidade óptica das colorações obtidas respectivamente em todas as amostras, incluindo as amostras branca e testemunha.

Como também foi encontrado determinado valor de densidade óptica, valor dos encontrados respectivamente para as outras amostras.

para a amostra branca um ê necessário deduzir este para a amostra testemunha e

A partir dos valores de densidade calcula-se a percentagem de actividade residual para cada amostra. Esta percentagem é igual, vista relativo e se multiplicada por 100, para densi dade óp t i c a eneont r a dos respec t i vamen te pa ra óp t i c a ob t i dos, Co enzima R39 3 de um ponto de os valores de uma determ i nada amostra e para a amostra testemunha.

Estabelece-se de seguida um gráfico em que nas abscissas são representadas as concentrações em antibiótico e em ordenadas as percentagens de actividade residual do enzima R39.

Obtém-se uma recta que corta respectivamente a ordenada num ponto correspondente á amostra testemunha <100% de actividade enzimática residual) © a abscissa num ponto correspondente â amostra que contém uma quantidade de antibiótico igual

quantidade molar de enzima enzimá t i c a res i duaI).

R39 u t i 1 i zado C 0% de a c: t i v i dade g râfico ob t i do

-los ite modo constitui uma 'padrão'·' que permite determinar uma concentração desconhecida em antibiótico β-lactamo numa amostra do líquido biológico que serviu para o seu estabelecimento. Rara este efeito, trata-se esta amostra de maneira rigorosamente idêntica,· seguindo-se as fases Cl), C2) e C'3) do processo de acordo com o invento.: mede-se com o espectrofotómetro a densidade óptica da coloração obtida: diminui-se o valor da densidade óptica encontrado para a amostra branca: calcula-se a percentagem de actividade enzimática residual da maneira indicada mais atrás e obtém-se a concentração em antibiótico da amostra relativamente ao padrão.

Pode-se determinar de maneira quantitativa concentraç Ses em a n t i b i ó t i c o tão f r a c a s biológico no prazo de 15 minutos como 0,002 U.l./ml num líquido

No entanto, este método requer, em primeiro lugar e em certos casos, a clarificação do liquido biológico para permitir o emprego de um espectrofotómetro e deve por isso, em princípio, ser executado num laboratório. Ou, se se pretender determinar unicamente se a concentração em antibiótico ultrapassa ou não um determinado patamar Cpor exemplo, no caso do leite, uma concentraimposta pelas normas legais), não é necesário recorrer-se a um espectrofotómetro.

Isto necessití a1gumas exp1i c aç Ses.

no entantí em p ri me i r ο Iuga r, de

Conforme se viu anteriormente, a curva de aferição corta a abscissa num ponto correspondente a uma amostra que

contém uma quantidade de antibiótico igual â quantidade molar de enzima R39 utilizado. Com esta concentração crítica em antibiótico, a percentagem de actividade enzimática residual é igual a zero dado que no final da fase (3) do processo de acordo· com o invento obtém-se uma coloração idêntica â obtida com a amostra branca.

.Acima desta concentração crítica, obtém-se Ígualmente uma coloração idêntica à da amostra branca, dado que a. percentagem de actividade enzimática residual é sempre igual a zero %. Por contrário, abaixo desta concentração critica, obtém-se uma coloração· amarela, uma. vez que contínua, a. subsistir uma certa pe r c en tagem de a c t i v i dade enz i má t i o a. r es i dua. 1.

Por consequência, baseando-se simplesmente na coloração observada no fim da fase (3) do processo, pode-se avaliar directamente numa amostra, ss a concentração em antibiótico ultrapassa ou não a referida concentração· critica.

É por isso suficiente conhecer-se previamente a referida. concentração critica, para que se possa em seguida, sem se ter que recorrer a um espec trof otómetro, determinar rapioísmenie se uma amostra convêm uma concentração· em antibiótico 3 lactamo que ultrapassa, (ou não) esta concentração· critica. Para este efeito, trata—se esta amostra de maneira idêntica de acordo com as fases (í), (2) e (3) do processo de acordo com o· invento e em seguida observa—se simplesmente a coloração· obtida,¹ se esta corresponder á da amostra branca, a concentração em antibiótico será pelo menos igual á concentração crítica,¹ se, por contrário, eia for amarela, a concentração será inferior á concentração critica.

Pode-se assim determinar, visualmente e com precisão, amostras possuem mais ou menos do que Ο,004 U.I. de antibiótico por ml de liquido biológico, e isto num periodo de ÍS minutos.

Além disso,· por uti 1 ização de uma carta de cores e tendo em consideração a variação de intensidade da coloração amarela obtida em função da concentração em antibiótico, será poss i ve1 de te r mina r-se sem i-quant i tat i vamen te c onc en t r a ç ões intermédias entre 0 U.I./ml e a concentração* crítica. Deste modo, numa, aplicação em que a concentração critica seja de 0,004 U.I./ml, será possível determinar, pelo menos sem uma dificuldade pa r t i c u1a r, uma c on c en t r aç ão de 0,002 U. I. /m1.

Este método com ou sem carta de cores é por isso* perfeitamente conveniente para o exame em série de amostras de leite, mesmo fora de um laboratório, por exemplo numa herdade, por pessoal não especializado.

método de determinação quantitativa e qualitativa da concentração em antibiótico* de acordo com o presente invento acabc*u de ser explicado* em pormenor, com referência, muito* especial â mudança, de cor produzida pelo ácido 5,5'-dit.iohis(2-nitrofoenzóico). No* entanto, o* homem da espec ial idade compreenderá fac i I mente que se utilizar neste método* outros cromogénios reagentes, só a. cor observada, será diferente.

Um outro objectivo do presente invento consiste em proporcionar um sistema de ensaio utilizável na colocação em prática do processo do presente invento, ou seja, que possa servir para a determinação* de um antibiótico de núcleo D-lactamo num 1í qu i do b io1óg i c o.

Este sistema compreende especialmente:

Cí) uma quantidade determinada de D-alani1-D-alanina-carboxipep~ tidase solúvel produzida pela Ac11nomadura R33;

£2) uma quantidade determinada de um substrato que é um tioéster de fórmula geral

R -R^-S-CH-COOH i

I

R._, cn na qual R.

dfi %

R_ representa o radical benzoílo, fenilaeetilo ou N

-ac et x1 -L- 1 i s x 1 o, representa o radical glicilo ou D-alanxlo, e é um átomo de hidrogénio ou um radical metilo, £3) uma quantidade determinada de um ácido aminado de configuração D ou de glicina, £4) um reagente que permita s determinação de um ácido 2-mercaptoalca.nóxco de fórmula

HS-CH-COOH

R..

na qual R._, tem o significado anteriormente referido,' £5) eventualmente um padrão, relativamente ao qual os resultados dos ensaios realizados com os reagentes Cí), £2), £3) e £4) podem ser c ompa r a dos.

.Oe acordo com uma forma de realização preferida, o substrato é o ácido CCN-benzoil-D-alanil)tiol-acético, o ácido aminado de configuração 0 é a D-alanina e o reagente £4) é o ácido 5,5'-ditiobis£2-nitrobenzôico).

De acordo com uma forma de realização particularmente e o reagente que permitem efectuar a 2-mercaptoalcanóico são reunidos sob a os excipientes apropriapreferida, o substrato determinação do ácido forma ds um comprimido em associação co dos geralmente utilizados para formar um comprimido.

Como padrão, pode-se eventualmente incorporar no sistema um gráfico que estabeleça a relação entre as concentrações em antibiótico e as percentagens de actividade residual do enzima R39. Pode-se deste modo realizar as determinações quantitativas conforme foi explicado anteriormente. Este gráfico não é todavia indespensável. Com efeito, se o sistema só servir para determinar se a concentração em antibiótico ultrapassa ou não um determinado limite, é suficiente indicar no modo de emprego qual ê o valor de concentração em antibiótico á qual se observa uma viragem da. coloração, após tratamento da amostra de acordo com o processo do presente invento.

Os exemplos seguintes ilustram o presente invento, sem no entanto o limitarem.

Exesaplo 1

Este exemplo mostra qu© o ppoceso de acordo com o invento permite efectuar uma determinação muito rápida de fracas concentrações de penicilina G no leite.

Preparam-se uma série de amostras de 50 .ul de leite que contém concentrações conhecidas de penicilina S, bem como duas amostras (branca e testemunha) de -50 .ul de leite, isentas de penicilina G.

A cada amostra (amostra testemunha + amostras que contêm a penicilina Q), adicionam-se 1,5 picorooles de enzima R33 dissolvidos em 10 .ul de tampão Hepes 0,5 M CpH = 8) que contém .NaCl 0,5 M e NgCl.., 0,25 M e 20 ul de uma solução aquosa que contêm 50 mg/ml de D-alanina. Na amostra branca, o enzima R39 dissolvido no tampão Hepes é substituído por 10 .ul de Hepes 0,5 M CpH = 8) que contém NaCl 0,5 N e HgCl.-, 0,25 M CHepes = ácido 4-hidroxietil-l-piperazinoetanossulfónico). A mistura é incubada a 47° durante 4 mi nutos.

J

De seguida adicionam-se 5ul de uma solução aquosa que contém 5 mg/ml de ácido ECN-benzoil„D~alani 1 >tio.l-acético e 10 .ul de uma solução de tampão fosfato CpH = 8,0, Κ.Η._,Ρ0^ + Κ,-,ΗΡΟ^) que contém 2 mg/ml de ácido 5,5'-ditiobisC2-nitrobenzáico? e incuba-se a mistura a 47 °C durante 1 minuto.

Observam-se de seguida, as coloracSes obtidas com as d i ve r sa s amos t r a s.

Os resultados obtidos são reproduzidos no quadro I

QUADRO I

J

Concentração em penicilina. Q

Amostra	. Cem U.I./ml).............	Coloração
testemunha	0	amarelo muito inten·
1	0,004	ama reIo i ntenso
·***« .ri-	0,008	amarelo médio
	0,012	ama. r e 1 o pá I i do
4	0,015	branco
S	0,020	branco
6	0,025	branco
branco	0	branco

No quadro I, observa-se que para uma concentração em penicilina G igual ou superior a 0,016 U.I./ml, obtém—se uma coloração branca idêntica ã obtida para a amostra branca, ao passo que abaixo desta concentração se desenvolve uma coloração amarela cada vez mais intensa, em função da diminuição da concentração em penicilina G, até se alcançar uma coloração amarela muito intensa correspondente a uma concentração nula em penicilina G (amostra testemunha).

invent

Pa re c e c1a ramente permite, no prazo de que o processo de acordo com o 5 minutos, determinar visuaImente se uma amostra de leite contém uma 0,01-5 U.I./ml ou mais, o que atraente para uma análise rápida concentração em penicilina G de torna, o processo especialmente do leite, quer na leitaria, quer na herdade.

Exesplo 2

Neste exemplo é mostrado que o processo de acordo com o invento é muito sensível.

processo exac tamente mesmo exemp 1 ο ί , sa 1 v;

que;

adicionam—ss ás amostras 0,-4 pico.moles do enzima R33 (em vez de 1,5 p i c orno 1 es),' a primeira incubação dura 10 minutos (em vez de 4 minutos) e a. segunda incubação dura 5 minutos (em vez de 1 minuto).

Os resultados obtidos reproduzidos no quadro II.

Concentração era penicilina S

QUADRO II

Amostra	(era U.I./ml)	Coloração
testemunha	0	a m a r e I o m u i t o i i
1	0,001	ama re1o i n tenso
	0,002	ciΓίϊ-θ P © 10 FftSíd i o
	0,003	ama re1o pá1i do
	0,004	branco
5	0,005	branco
6	0,003	branco
7	0,010	branco
branco	0	branco

quadro mostra que por aplicação do processo de acordo com o presente invento, é possive.1 detectar vi suai men te no leite concentrações em penicilina G pelo menos iguais a 0,004 U.I. por ml de leite, no prazo de 15 minutos. Além disso, por referência a uma carta de cores, é mesmo possxvel detectar concentrações mais fracas tais como 0,002 U.I./ml. Este processo permite por isso determinar se o leite contém uma concentração em antibiótico que ultrapasse (ou não) as normas legais, mesmo nos países onde CvSV.o.s normas são rezativamente severas.

Exesaplo 3

Este exemplo mostra que e possxvel uti 1 izar o processo de acordo com o invento por medição das concentrações em antibiótico em volumes de amostras mais importantes.

processo é realizado da mesma maneira que no 1, excepto que;

©xsíiíip* 1 o

as amostras contêm 3 adicionam-se a cada dissolvido em 150 .ul vez de 1,5 p i c omo .1 es 5 e ml de leite Cem vez de 50 ul);

amostra 24 picomoles de enzima R33 de tampão Hepes 0,5 M CpH = 8,0) Cem

800 ul de uma solução aquosa de

D-alanina que contêm 100 mg/ml de D-alanina,* a primeira incubação e realizada durante io minutos (em vez de 4 minutos);

adiciona-se a seguir¹ .120 ul da solução aquosa do acido ul de uma. solução de tampão fosfato CpH = 8,0) que contém 5 mg/ml do ácido 5,5'-ditiobis<2~nitrobenzóico>; a segunda incubação dura 5 minutos Cem vez de .1 minuto). Os resultados obtidos são apresentados no quadro III;

QUADRO III

Concentração em penicilina G mm o st r a C em U.X./m1i Coloração

tes temunha	0	amarelo	mui to
1	0,002	amarelo	méd i o
j£.	0,003	amarelo	pálido
3	0,004	branco
4	0,008	branco
branco	0	branco

Este quadro mostra psrmite detectar visualmente (3 ml) a presença de 0,004 U no prazo de .15 minutos. Ele muito facilmente por pessoas que o processo do presente invento em volumes importantes de amostras I. de penicilina G por ml de leite, pode por isso ser posto em prática não espec i ali zadas.

LJh?Ízê?i*!i***í5Sl* FíiS?íiiOl¹ ê* 3U 3.

processo do presente invento para medir pen i c i 1 i na C em vo X umes de .1. γϊϊ X de X e i 1 e .

quado se emprega o as concentrações em

Exesapl© 4Este exemplo mostra que é possível utiliza do invento com outros substratos para além do ácido -D-a 1 an i 1) t i o 1 -a c é t .i c o.

o proc©sso £ (N-benzoiΙΟ processo é realizado da mesma maneira que no exemplo 3. No entanto, após a primeira incubação, adicionam-se 120 λιΙ de uma solução aquosa que contém 5 mg/ml de ácido £(ÍM—fenilaceii1—D— -a 1 an i 1) t i o .1 —a c é t ico.

Os resultados obtidos são apresentados no quadro IV;

QUADRO IV

	Con cen t raç So em pen i ci1i na G
Amostra	(em U.I./rol)	Coloração
testemunha	O	amarelo muito intenso
1	0,003	ama rei o pé. I i do
	0 ,· 006	branco
branco	0	branco

Este quadro mostra que o processo de acordo com o presente invento pode ser posto em prática com sucesso por utilização do ácido C(M-fenilaceti1-D-alani1)tiol-acético como substrato.

·- 40

Exemplo -5.

Este exemplo mostra que o processo do presente invento pode ser posto em prática por utilização, como activadores da hidrólise do substrato pelo enzima, ds diversos ácidos aminados de configuração D ou da glicina.

processo é realizado da mesma maneira que no exemplo 3. No entanto, a solução aquosa que contém 100 mg/ml de D-alanina ('ensaio I) é substituída respectivamente por uma solução aquosa que contém 100 mg/ml de D~feni1alanina (ensaio II), D-seri na (ensai ο 111), D-hist idina (ensa i ο IV), D-met i on i na (ensaio V), ácido 0-2-aminobutírico (ensaio VI) ou por uma solução aquosa que contém 200 mg/ml de glicina (ensaio VII).

Os resultados obtidos são reproduzidos no quadro Ví

QUADRO '··'

Ensa i o	Amostra	(em U.I./mi:»	Coloração
	testem.	o	amarelo muito intenso
I			ama re1o mu i fo i ntenso
.11			ama ϊ' e .1 o mu i to i n tenso
III			ama re1o mu i to i n tenso
IV			ama reIo mu i to i ntenso
V			ama re1o mu i to i n tenso
VI			ama re1o mu i to i ntenso
VII			amarelo muito intenso
	.1.	0, cyy3
I			ama r e1o pá 1 i do
II			ama r eϊ o pá .1 i do
III			a m a r e 1 ο ρ á I i d o
IV			ama re .1 o pá 1 i do
V			amarelo pálido
VI			ama r e .1 o pá I i do
VII			amarelo pálido

QUADRO V (continuação?

Concentração em pen;i.ci 1 ina β Ensa i o Amostra (em U. I. /ml )

Coloração

I

II II I

IV

V

VI

VII branco branco branco branco branco branco branco branca

I

II

III

IV

V

VI

VII branco branc o branco branco branco branco branco

Este quadro mostra ds uma maneira gerai que os ácidos aminados de configuração D e giicinça são adequados para a colocação em prática do presente invento.

Exemplo 6.

Este exemplo ilustra a. aplicação do processo do presente invento na dosagem de cefapirina, um antibiótico da família das cefalosporinas, no leite.

processo é realizado da mesma maneira gue no exemplo 3, mas as amostras de 3 ml de leite possuem concenfrações conheci das de c e f ap ir i na.

Os resultados obtidos são reproduzidos no quadro VI;

QUADRO VI

Amn«; t ra	Conc ent r aç ão em pen i c i1i na G
(em U.I./ml)	Coloração
testemunha	0	ama re1o mu i to i ntenso
1	0,002	amarelo médio
.>£.	0,003	ama re1o pá1i do
O	0,004	branco
4	0, OOS	branco
branco	0	branco

Este quadro mostra que o processo do presente invento permite detectar visualmente a presença de 0,004 .ul/ml de cefapirina no leite no prazo de 15 minutos.

Exemplo 7.

Este exemplo ilustra a aplicação do processo do invento com dosagens de fracas concentrações de penicilina G no soro.

Procede-se como no exemplo 3, mas substitui-se as amostras de ·„' ml de leite por amostras de 3 mi de soro com concentrações conhecidas de penicilina G.

Além disso, apôs a segunda incubação com uma duração de 5 minutos, as amostras são centrifugadas e os sobrenaoantes são diluídos 1(.5 vezes com água.

5.Js resul tados obtxoos são reproduzidos no quadi^o 011.

Os valores da densidade óptica mencionados no quadro VII são ofotidos por subtracção do valor da densidade óptica encontrado para a amostra branca dos encontrados respectivamente para a amostra testemunha e para as outras amostras.

QUADPO VII

Con c en t r aç ão (em U

•i	0 0, (502
	0,003
	0_} 004
4	0,006
branco	0

em penicilina G I./ml)

Densi dade óp t ica (a 410 nm ,5

435

226

175

Este quadro mostra que espec t r o f o t óme t r o, de te rm i na r è possível, por quan t .i. tat i vamen te u t i1i za c ão de um concentrações muito fracas de penicilina θ (tão fracas como 0,005: U.I./ml} numa amostra de soro.

Exemplo 8.

Neste exemplo, o substrato e o reagente que permxtem s f e c t.· u a r a determinação do ácido 2-mercaptoalcanóico são reunidos sob a forma de um comprimido.

processo é realizado da mesma maneira que no exemplo 8. No entanto, depois da primeira incubação com uma duração de 10 minutos, adiciona-se um comprimido que contém 600 jum do ácido í<N~benzoi.1-D-alani 1 )tioJ~acético e 600 .ug do ácido 5,5'-ditioto i s(2-n i trobenzó i c o).

A composição global deste comprimido e a seguxnte *.em % u b s t r a t o + r e a g e n t e F’o 1 i e t i 1 enog 1 i c o 1 6000 A v i c e 1 #

Amidon

Lac tose

Ae r os i 1 ·Φ·

Es teara to de magnési o & c e1u1ose mi c roc ri s ta1i ns ;.fc $ s i 1 x c a c o 1 o i da 1 x, :”!%

27¾

10%

55%

0,5% 0,5%

Os resultados obtidos são apresentados no quadro VIII:

SMADROjan

Concentração em penicilina <3

Amostra	<em U.I./ml)	Coloração
testemunha	0	a ma re1o i ntenso
1	0,002	amarelo médio
2	0,003	amarelo pálido
3	0,004	branco
4	0,006	branco
branco	0	branco

Este quadro mostra, que é possível utilizar o processo de acordo com o invento por associação do substrato ao reagente para se determinar o ácido 2-mercaptoalcanbico sob a. forma de um comprimido, o que representa uma vantagem clara quer do ponto de vista prático, quer' do ponto de vista da esis.bi 1 idade dos reagentes

Claims

Reivindicações;

lâ. - Processo enzimático para a determinação de antibióticos de núcleo β-lactamo num liquido biológico que compreende as fases seguintes;

Cl) a incubação do referido liquido biológico com a D-alanil-Dt·-?? rn’ Ηώ P»—.1¾ bioló—

-ala πi na-ca rbox i pep t i dase so1úve1 p roouz xda

Ac11nomadura R~~; esta incubação do referido liquido gico é conduzida em condições tais que permitam que o antibiótico de β-lactamo eventualmente presente no referido liquido reaja com o enzima, para formar um complexo enzima-antibiótico equimolecular, inactivo e sensivelmente irrever sivel

C2) a incubação ds mistura obtida no fim da fase Cl) com solução de substrato em condições que permitam a do referido substrato pelo enzima, para forma.!¹ um cuja quantidade é proporcional á actividade enzimática residual;

C3) a. determinação da. quantidade do composto formado na fase C2)J

C4) a comparação do valor determinado na fase C3) com um padrão, de modo a se obter a concentração do antibiótico no liquido biológico, caracterxzado por a incubação da fase C2) ser efectuada com um substrato que é um tioéster de fórmula geral hidrólise ompostos,

R.-R.--S-CH-COOH

Λ AÍ..

representa o radical benzoilo, fenilacetilo ou N -ace x- x 1 —L.~ 1 i s i 1 o, na qual

-a 1 f a

R.~, representa o radical glicilo ou D-alanilo, e R'_o é um átomo de hidrogénio ou um radical metilo, de maneira a formar por hidrólise um ácido 2-mercaptoalcanó.ico de fórmula

HS-CH-COOH

R, na um em am gual R.„. tem o significado dado anteriormente e na presença de ácido aminado que activa a hidrólise do substrato pelo enzima, que o referido ácido aminado é escolhido entre um ácido nado de configuração D e a glicina.
2a. ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o substrato ser o ácido ECN-benzoilo-D-alani 1 )tio_l—acético.

Processo de acordo com qualquer uma das cações 1 e reivrindiescolhido por o ác ido dentro do grupo que consiste em D-alanina, D-metionina, D-arginina., D-f en i
3. a. 1 an i na, D-ser i na, D-h i st i d i na, D-va 1 i na., D-1 r i pto fano e o ácido D-2-aminobutirico.

:aracterxzaoo aminado ser
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o ácido aminado ser a D-alanina.
5ã. — Processo de acordo cações 1 a 4, caracterizado por as das em s i mu1tá neo.

com qualquer uma das reivindifases tZl e ί·9> serem real, iza—

£.a

P.

— Processo de c a. r a c te r i zado acordo com qualquer uma das reivindipor o liquido biológico ser escolhido cações 3. a entre o leite, o soro, a urina, a saliva, os extractos de carne, os líquidos de fermentação e as soluções aquosas tamponadas.
7â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o antibiótico a determinar ser escolhido entre benzilpenicilina, ampicilina, fenoximetilpenici~ lina, carbenicilina, meticilina, oxacilina, cloxacilina, cefalospor ina C, cefaloglicina, cef a 3. ex ina e cefapirina.

— Processo de cações 1 a 7, caracterizado alcanóic· o ds fórmula

acordo com qualquer uma das reivindi™ por a quantidade do ácido 2-mercaptoHS-CH-COOH ser determinada por incubação da mistura á c i do 5,5 ·' -d i t i ob i s < 2-n i t r obenzói c o ) de coloração cuja intensidade seja função 2-mercaptoal canôi co.

obtida na fase C2) com o maneira a produzir uma da quantidade do ácido
9ã. — Sistema de ensaio para determinação de antibióticos de núcleo β-lactamo num líquido biológico, caracterizado por compreender;

(1) uma quantidade determinada de D-alani 1-D-a.lanina-carboxipeptidase solúvel produzida pela A c t inomadura P39,' <2> uma quantidade determinada de um substrato que é um tioéster de fórmula geral •50

R -R.. 3. s.

-CH-CDOH l

R...

na qua1 R„

-a 1 f a representa o radical benzeiio, fenilacetilo ou hl -ace t i 1 -L- .1 i s i 1 o,

R representa o radical glicilo ou D—al ani lo, e R.-, e um átomo de hidrogénio ou um radical metilo, <3) uma quantidade determinada de um ácido aminado de configuração D ou de glicina, (4) um reagente que permita a determinação de um ácido 2-mercapfoalcanóico de fórmula

HS-CH-COOH

R.„ na qual R._, tem o significado anteriormente,' e <5> eventualmente um padrão, relativamente ao qual os resultados dos ensaios realizados com os reagentes <1), (2), (3) e <4> podem ser comparados.

lôâ. - Sistema de ensaio de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o substrato ser o ácido E(N-benzoílo-D-alani1)t i o1-a c é t i c o.

llã oxsyyema de ensaxo de acOí*do* cop* qualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizado por o ácido aminado configuração D ser escolhido dentro do grupo que consiste D-a 1 an i na., D-me t i on i na, D-a. r g i n i na.,

D”h i s t i d i na, D~va1i na, 0— t rxpto fa no e oe em

D- f e n i 1 a 1 a n i na., D-se r i na., o áci do D-2-am i nobut £ r i c o.

- 51 12ã. - Sistema .1. 1 , a r a c te r i za do po r o D-alanina.

de ensaio de acordo com a reivindicação· ácido aminado ds configuração D ser a .1. Sã.

r e i v i nd i c a ç ões ácido 5,5^J~dit ~ Sistema de ensaio de acordo com qualquer uma das 3 a 12, caracterizado por o reagente <45 ser o ob i s < 2-· n i t robenzó i c o).
14ã. - Si reivindicações 9 a < 4 5 s e r em r eu n i do s sterna. de ensaio de acordo com qualquer 13, caracterizado por o substrato e o sob a forma de um comprimido.