CZ283008B6 - Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách - Google Patents
Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283008B6 CZ283008B6 CZ931455A CZ145593A CZ283008B6 CZ 283008 B6 CZ283008 B6 CZ 283008B6 CZ 931455 A CZ931455 A CZ 931455A CZ 145593 A CZ145593 A CZ 145593A CZ 283008 B6 CZ283008 B6 CZ 283008B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cyclosporin
- enzyme
- polymeric
- bound
- csa
- Prior art date
Links
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 title claims abstract description 98
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 title claims abstract description 93
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 claims abstract description 30
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- -1 GlyLeuPheGly Chemical compound 0.000 claims abstract description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 claims abstract description 5
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- ZIWDVJPPVMGJGR-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CCNC(=O)C(C)=C ZIWDVJPPVMGJGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 31
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 claims description 17
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical group NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 2
- 108010054843 cyclosporin receptor Proteins 0.000 claims 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 abstract description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 0.000 abstract description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 abstract description 2
- SWPMNMYLORDLJE-UHFFFAOYSA-N n-ethylprop-2-enamide Chemical compound CCNC(=O)C=C SWPMNMYLORDLJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N N-(2-aminophenyl)-4-[[[4-(3-pyridinyl)-2-pyrimidinyl]amino]methyl]benzamide Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC1=NC=CC(C=2C=NC=CC=2)=N1 HRNLUBSXIHFDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940117913 acrylamide Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 3
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical class CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCOCC HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- CKRJGDYKYQUNIM-UHFFFAOYSA-N 3-fluoro-2,2-dimethylpropanoic acid Chemical compound FCC(C)(C)C(O)=O CKRJGDYKYQUNIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052949 galena Inorganic materials 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- XCAUINMIESBTBL-UHFFFAOYSA-N lead(ii) sulfide Chemical compound [Pb]=S XCAUINMIESBTBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000012673 precipitation polymerization Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Polymerní konjugáty cyklosporinu obsahující 40 až 1000 zpolymerizovaných monomerních jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakrylamid, akrylamid, , N-vinylpyrrolidon, kyselina methylakrylová a akrylová ve formě svých sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, s výhodou N2-hydroxypropyl)methakrylamid, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde k jednotkám methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů je kovalentně navázán enzym vybraný ze skupiny zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a .beta.-gala-
ktosidázu, jejich příprava a použití pro stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách.
ŕ
Description
Předmětem vynálezu je polymemí konjugát cyklosporinu A (CsA), způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, zejména v kvalitativní a kvantitativní analýze hladin volného cyklosporinu A (CsA) a jeho metabolitů, přítomných v lidských tělních tekutinách.
Stav techniky
Monitorování hladin cyklosporinu A (CsA) v krvi pacientů, imunosuprimovaných Sandimunem® (Sandoz), nebo Consuprenem® (Galena, Opava), je nezbytným předpokladem pro zajištění optimálního dávkování farmaka. Úzké koncentrační rozmezí účinných hladin CsA, vysoké riziko vedlejších vlivů CsA, individuální farmakokinetika CsA u jednotlivých léčených pacientů podmiňují trvalou kontrolu hladin CsA v krvi. V současné době je stanovení hladin CsA prováděno metodou vysoko účinné chromatografie (Hold, D., Marsden, J., Johnston, A., Transplant. Proč. 22, 1234, 1990), v klinické praxi pak především saturační radioimunoanalýzou (RIA), využívající CsA, značeného buď 3H (Quesmiaux, V., Tees, R., Schreier, M., et al. Clin. Chem. 44, 43, 1987), nebo 1251 (Knepil, J., McPhilips, M., Clin. Chem. 35, 181, 1989). Další rutinně užívaná metoda polarizované imunofluorescence (FPIA) je založena na měření změn fluorescence fluoresceinisothiokyanátem (FITC) značeného CsA (Wang, O., Morrison, M., Wang, N., Clin. Chem. 32, 1061, 1986). Dále byla vyvinuta imunoanalýza, označovaná jako ACMIA (Affinity-Column-Mediated-Immunoassay). která používá jako detekční prvek enzym (β-galaktosidázu), navázaný na specifickou protilátku (Prince, C., Davey, C., Medculp, E., et al., Clin. Chem. 36, 1932, 1990). Další neizotopová imunochemická metoda, chemiluminiscenční imunostanovení CsA (CLIA), byla vypracována při použití hemisukcinátu-CsC, značeného N-(4aminobutyl)-N-ethylisol-aminolem (Stabler, T., Lieger, A., Clin. Chem. 36, 906, 1990). V roce 1990 byly prezentovány soupravy pro stanovení hladin CsA v systému EMIT (EnzymeMultiplica-Immunoassay Technigue) s CsA, značeným glukozo-6-fosfát dehydrogenázou (Beresini, M., Totan-Quinn, R., Bamett, B., et al., Clin. Chem. 36, 1034, 1990). Vedle tradičních imunochemických technik byla vletech 1990-1992 pro stanovení hladin CsA publikována metoda receptorové analýzy, využívající cílovou molekulu farmaka jako analytické reagens. Předností tohoto metodologického přístupu před tradičním reagens-protilátkou je selektivita interakce, která reflektuje biologickou účinnost farmaka ajeho metabolitů (Paul, K., Harding, W.H., Marks, M.W., Handschumacher, R.G., Lorber, M.S., Transplant. Proč. 23, 974, 191, Hašková, V., Rozprimová, L., Svobodová, J., Folia Biol. 37, 134, 1991, Kullinger, B., Wolfram,
J., Hamilton, G., Hrozemsky, M., Kovařík, K., Woluszuk, W., Steiner, G., Transplant. Proč. 22, 1702, 19909, 10). Námi navrhovaná technika využívá výše zmíněného přístupu, vlastní molekula farmaka je kovalentní vazbou spojena s molekulou polymemího nosiče, modifikovaného enzymem, umožňujícím snadnou detekci a vyhodnocení analýzy metodami, běžně dostupnými v každé biochemické laboratoři.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je polymemí konjugát cyklosporinu A. sestávající z polymemího nosiče, obsahujícího 40-1000 zpolymerovaných monomerních jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)-methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakrylamid, akrylamid, N-vinylpyrrolidon nebo kyselina akrylová a methakrylová ve formě svých
- 1 CZ 283008 B6 sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryioylovaných oligopeptidů s terminálně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde k uvedeným methakryloylovaným aminokyselinám, vybraným ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, leucin, fenylalanin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaným oligopeptidům, vybraným ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyValGly, je kovalentně navázán enzym, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a βgalaktosidázu. Výhodné provedení polymemího konjugátu podle vynálezu představuje konjugát, obsahující 20 až 99 % mol. N-(2-hydroxypropyl)methakiylamídu.
Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu podle vynálezu spočívá v tom, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem, nebo vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, popřípadě vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.
Dalším význakem vynálezu je použití polymemích konjugátů cyklosporinu A podle předmětného vynálezu pro neizotopové stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách.
Stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách způsobem podle vynálezu spočívá v tom, ze roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin A a jeho metabolity, nebo roztok polymemího konjugátu cyklosporinu a roztok tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin a jeho metabolity, se nechá reagovat s cyklofilinem jakožto receptorem pro volný i na polymer vázaný cyklosporin, načež se koncentrace na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu svázaným enzymem stanoví pomocí enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen. To znamená, že se využívá enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen, ke stanovení koncentrace tohoto na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu s vázaným enzymem.
Při stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách způsobem podle vynálezu lze postupovat také tak, ze se místo cyklofilinu jako receptorů pro vazbu volného cyklosporinu a polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem použije protilátka proti cyklosporinu, vybraná ze skupiny, zahrnující monoklonální myší anti-CsA protilátku, polyklonální ovčí anti-CsA protilátku, polyklonální králičí anti-CsA protilátku nebo polyklonální slepičí anti-CsA protilátku.
Polymemí konjugáty cyklosporinu s vázaným enzymem podle předmětného vynálezu (CsA-PEnz), vycházející zN-substituovaných akryl a methakrylamidů, mohou být popsány obecným vzorcem:
R! CH3CH
I II —(CHt-C—)x—(CH-—C--)y--(CH->--C-)z
I II c=o c=o c=o
I II
R2 R3 Rj kde RI je -H (arylamidy) nebo -CH3 (methakrylamidy), R2 je - NHCH2CH3, -NHCH2CH(OH)CH3 nebo -NH2 skupina, R3 je aminokyselina či oligopeptid s terminálně navázaným cyklosporinem a Ri je aminokyselina nebo oligopeptid s terminálně navázaným enzymem, x je v rozmezí 20 až 99 % mol., y je v rozmezí 0,2 až 20 % mol. a z je v rozmezí 0,2 až 15 % mol..
V případě nosičů, připravených na bázi kopolymerů N-vinylpyrrolidonu, výraz pro x rovno 20 až 99 % mol. odpovídá molámímu zastoupení N-vinylpyrrolidonu v kopolymeru.
Při přípravě polymemích konjugátů cyklosporinu podle vynálezu se postupuje tak, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym. Enzym je navázán amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem, nebo vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, případně vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.
K vazbě na nosič byly použity semisyntetické deriváty přírodního cyklosporinu, popsané v patentech 277471 a 277472, obsahující aldehydickou skupinu nebo deriváty, vzniklé jejich modifikací ethylendiaminem, hexamethylendiaminem nebo hydrazinem. Derivát cyklosporinu A je vkonjugátu vázán k aminokyselině nebo oligopeptidu v postranním řetězci polymeru amidickou (-CONH-) vazbou, hydrazidickou vazbou (-NHNHCO-), nebo vazbami, (-C=N-NH-), (-CH-NH-) a (-CH-NH-NH-).
Jednotky monomerů N-methakryloylovaných aminokyselin a oligopeptidů, zapojených do řetězce polymemího nosiče, vycházejí z biogenních aminokyselin, jako glycin, alanin, leucin, fenylalanin, kyselina amínokapronová, nebo jejich oligopeptidů GlyGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyValGly. Enzymy, použité ke značení polymemích konjugátů, jsou křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a β-galaktosidáza.
Tyto enzymy jsou připojeny k polymeru prostřednictvím aminokyselinového nebo oligopeptidického spaceru o amino-kyselinovém složení, uvedeném výše, vždy přes -COOH konec aminokyseliny nebo oligopeptidu amidickou -CONH- vazbou (vzniklé acylací aminoskupin enzymu aktivovaným karboxylem v postranním řetězci polymeru), nebo vazbami -CONH(CH2)nNHCH-, -CONHN=CH- a CONHNHCH2 - vzniklých reakcí polymeru, jehož postranní aminokyselinové či oligopeptidické řetězce jsou zakončeny amino nebo hydrazo skupinou, s enzymem mírně oxidovaným pomocí perjodátu sodného a případně následnou redukcí borohydridem, eventuálně kyanoborohydridem sodným.
Metoda stanovení volného cyklosporinu A podle vynálezu využívá principu saturační receptorové analýzy. Jako receptor pro volný cyklosporin (CsA) nebo cyklosporin, konjugovaný s polymerem a enzymem (CsA-P-Enz), je použit cyklofilin (Cph) nebo anti-CsA protilátky, jako monoklonální myší, polyklonální ovčí, králičí, slepičí. Vyhodnocení analýzy, tj. stanovení koncentrací volného CsA ze vzorku a CsA, vázaného na polymemí nosič, značený enzymem (CsA-P-Enz), obou vázaných na receptor, vychází z kompetice vazby obou forem CsA a stanovení koncentrace CsA-P-Enz, využívající enzymové reakce enzymu, vázaného na nosič, s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen.
Analytické stanovení volného cyklosporinu (CsA) na základě kompetitivní vazby volného a vázaného CsA na substrát je možné provádět trojím způsobem.
a) Oba typy cyklosporinu (CsA z testovaného roztoku i CsA, vázaný v činidle - polymemím konjugátu) se nejdříve v roztoku naváží na cyklofilin a tento se posléze zakotví na mikrotitračních destičkách s imobilizovaným imunoglobulinem, specifickým proti cyklofilinu.
- 3 CZ 283008 B6
Koncentrace konjugovaného CsA, zakotveného na destičce, se stanoví z absorbance roztoku, zabarveného v důsledku barevné enzymatické reakce.
b) Inkubace s roztoky činidla (CsA-P-Enz) a testovaného vzorku se provede přímo na mikrotitrační destičce s předem pevně zakotveným cyklofilinem, vyhodnocení je obdobné jako v případě a), tj. na základě barevné enzymatické reakce polymemího konjugátu se substrátem.
c) Inkubace roztoku činidla a zkoumané látky s protilátkou proti cyklosporinu (anti-CsA-Ab) se provede v roztoku, cyklosporinem modifikovaná protilátka se zakotví na mikrotitrační destičce s povrchem, modifikovaným protilátkou proti anti-CsA-Ab, a koncentrace navázaného konjugátu (CsA-P-Enz) se stanoví měřením absorbance roztoku, zabarveného stejnou enzymatickou reakcí, jako v obou předešlých případech.
Způsob stanovení vazebné aktivity činidla - konjugátu CsA-P-Enz v systému saturační receptorové analýzy je uvedeno na příkladu polymemího konjugátu cyklosporinu A s křenovou peroxidázou (CsA-P-HRP) v příkladu 3.
Princip metody stanovení cyklosporinu vychází z použití činidla vodorozpustného polymemího nosiče, na který je pomocí oligopeptidických sekvencí kovalentní vazbou navázáno jak léčivo cyklosporin, tak i enzym, dávající se substráty barevné reakce a umožňující tak kvantitativní vyhodnocení koncentrace konjugátu v roztoku.
V dalším je vynález objasněn na příkladech, aniž se na ně omezuje.
Seznam použitých zkratek
CsA cyklosporin A,
MA methakryloyl,
Gly, Phe, Leu, Gly, Val L-aminokyseliny,
P - polymemí nosič,
HRP křenová peroxidáza,
-ONp p-nitrofenoxy skupina,
TRIS.HC1 pufr, připravený z tris(hydroxymethyl) aminomethanu, pH upraveno HC1,
Cph cyklophilin,
GPC gelová permeační chromatografie,
DMF dimethylformamid,
Enz enzym.
Příklady provedení
Příklady syntézy polymemího konjugátu CsA-P-Enz
Příklad 1: Syntéza polymemího konjugátu CsA-P-HRP, enzym vázaný aminolyticky
Syntéza sestává ze tří fází: a) syntéza polymemího nosiče, b) vazba cyklosporinu na nosič, c) vazba enzymu na nosič, čištění a charakterizace konjugátu.
a) Polymemí nosič (R; methyl, Rj-NHCFLCHfOHjCHj, R3 oligopeptid - GlyPheLeuGlyONp, x = 92 % mol., y = 8 % mol. a z = 0) byl připraven radikálovou srážecí polymerizací 1,5 g N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu s 0,58 g methakryloylovaného p-nitrofenylového esteru glycylfenylalanylleucylglycinu (MAGlyPheLeuGlyONp) v 18 ml acetonu za iniciace 90 mg azobis-isobutyronitrilu při teplotě 50 °C. Polymerizační směs byla v ampuli probublána žárovkovým
-4CZ 283008 B6 dusíkem, ampule zatavena a umístěna do termostatu na 24 hod.. Molekulová hmotnost připraveného polymeru byla 25 000 g/mol.
b) 0,1 g cyklosporinu A, modifikovaného hydrazo skupinou, bylo rozpuštěno v 1,8 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a za míchání byl přidán roztok 0,30 g polymemího nosiče (příprava viz a) ve 2 ml DMSO. Po 6 hod. reakce při 25 °C byl polymer izolován vysrážením do směsi aceton-diethylether 1:1. Obsah navázaného CsA byl stanoven analýzou aminokyselin v hydrolyzátu polymeru (obsah 18 % hmot.), pomocí UV stanovený obsah zbývajících p-nitrofenyl esterových skupin byl 3,7 % mol.
c) 90 mg polymeru, připraveného v případě b), bylo rozpuštěno v 1 ml vody a za chlazení (4 °C) přidán roztok 30 mg křenové peroxidázy ve fosfátovém pufru pH 7. Během 4 hod. bylo pH roztoku zvyšováno až k hodnotě 9,2 přídavkem roztoku tetraboritanu sodného. Po dalších 3 hod. reakce byl produkt přečištěn GPC (Sephadex G-15) a lyofilizován. Polymemí konjugát byl charakterizován pomocí gelové permeační chromatografie GPC (Sepharosa 4B a6B, 1:1) a elektroforézou.
Příklad 2: Syntéza polymemího konjugátu CsA-P-HRP, enzym vázaný prostřednictvím aldehydových skupin, zavedených do enzymu mírnou oxidací.
Pro přípravu konjugátu byl použit polymemí nosič, jehož příprava byla popsána v příkladu 1 a). 10 %ní roztok tohoto polymeru v dimethylformamidu (DMF) byl za intenzivního míchání přidán do roztoku 100 násobného molámího přebytku ethylendiaminu (počítáno na obsah reaktivních -ONp skupin), po 1 hod. reakce byl vyizolován polymemí prekurzor 1, nesoucí v postranních řetězcích primární aminoskupinu (R3 - GlyPheLeuGlyNFŘCFLhNFL). Stejným způsobem, avšak reakcí s hydrazinhydrátem, byl připraven i polymemí prekurzor 2, nesoucí v postranních řetězcích hydrazoskupinu (Rj-GlyPheLeuGlyNHNFF).
Oba polymemí prekurzory byly použity k syntéze konečného konjugátu, která byla dvoustupňová.
V prvém reakčním kroku 100 mg polymemího prekurzoru (1 nebo 2) bylo reagováno v methanolu s 33 mg cyklosporinu A (CsA), modifikovaného aldehydickou skupinou (polymemí meziprodukt izolován srážením do směsi aceton - diethylether), v dalším kroku byla provedena vazba 33 mg enzymu HRP (oxidovaného v 0,lM acetátovém pufru pH 4,0 perjodátem sodným) na polymemí nosič v borátovém pufru při pH 9 (prekurzor 1), nebo pH 8 (prekurzor 2). Polymemí konjugáty byly přečištěny pomocí GPC (Sephadex G 15), vazba mezi nosičem a navázanými komponentami stabilizována redukcí kyano-boro-hydridem sodným a finální produkty přečištěny, lyofilizovány a charakterizovány analogicky jako v příkladě 1.
Příklady použití konjugátu ke stanovení koncentrace CsA
Příklad 3: Stanovení vazebné aktivity CsA-P-HRP v systému saturační receptorové analýzy
Jako vazebná liganda-receptor je v systému používán cyklofilin (Cph), izolovaný z hovězího thymu ultrafiltrací tkáňového homogenátu přes Diaflo membrány XM-300-XM-30 na zařízení AMICON. Pro použití v analytice je filtrát, obsahující bílkoviny o MW menší než 30 kD, zahuštěn filtrací přes membránu YM-10. Vazebná aktivita receptoru k cyklosporinu A (CsA) je stanovena při použití triciem značeného CsA (3H-CsA). Pro saturační radioreceptorovou analýzu (RRA) byla použita koncentrace cyklofilinu (Cph), odpovídající 50 % maximální vazebné aktivity.
- 5 CZ 283008 B6
Základní roztoky (20 mg/1) testovaných konjugátů - (činidla CsA-P-HRP) byly připraveny rozpuštěním preparátu v lOmM TRIS.HC1 pufru pH 7,3, obsahujícím 50 mM merkaptoethanol, 2 mM dithiotreitol, 2 mM kalcium laktát a 1% (w/v) hovězí sérový albumin (ředicí pufr). Ze zásobních roztoků byly připraveny pracovní roztoky 10-1 mg konjugátu/1 1 pufru. Ke 200 μΐ testovaného vzorku bylo přidáno 50 μΐ 3H-CsA a po přidání 50 μΐ optimálně naředěného Cph byla směs inkubována 60 minut při 8 °C. Po ukončení inkubace bylo k reakční směsi přidáno 500 μΐ suspenze aktivního uhlí (10 mg/mL) a směs byla inkubována 8 minut na ledové vodní lázni. Po skončené inkubaci byla suspenze centrifugována a 500 μΐ supematantu bylo přeneseno do 10 ml scintilačního roztoku SLD 31 a měřena aktivita β - záření. Naměřené hodnoty byly po odečtení pozadí a přepočtu k Bo graficky zpracovány.
Z výsledků inhibice interakce Cph x 3H-CsA připravenými konjugáty CsA-P-HRP vyplývá identita mezi oběma typy derivátů CsA (3H-CsA a CsA-P-HRP) ve vztahu k vazebné ligandě, tj. cyklofilinu. Znamená to, že konjugáty CsA-P-HRP mohou být použity jako detekční sloučeniny v kvalitativní i kvantitativní analýze. Výsledky saturační analýzy prokázaly účinnost konjugátu v systému receptorové analýzy v koncentračním rozsahu CsA, potřebném pro monitorování imunosupresivní terapie Sandimunem®, respektive Consuprenem®.
Příklady experimentálního stanovení cyklosporinu A (CsA)
Příklad 4
Ke 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny se přidá 100 μΐ optimálně naředěného konjugátu Cs-A-HRP v ředicím pufru. Po dokonalém promíchání obou složek je přidáno v 50 μΐ ředicího pufru optimální množství Cph (odpovídajícího 50% Bmax). Směs je opět dokonale promíchána a inkubována 60 minut při 8 °C. Po ukončení inkubace je 200 μΐ reakční směsi přeneseno do jamky mikrotitrační destičky (MaxiSorp F8 NUNC), na jejímž povrchu je imobilizována imunoglobulinová frakce králičího imunního séra proti hovězímu cyklofilinu. Po 60 minutách inkubace při 18 °C je obsah jamek odsát, jamky 3x promyty ředicím pufrem bez hovězího albuminu a přítomnost konjugátu CsA-P-HRP prokazována enzymovou aktivitou přidáním 150 μΐ substrátového roztoku, obsahujícího chromogen. Po ukončení enzymové reakce jsou změřeny absorbance jednotlivých vzorků a výsledky graficky zpracovány. Hodnota enzymové aktivity daného vzorku je nepřímo úměrná koncentraci CsA v testovaném materiálu, tj. tělní tekutině, respektive tkáňovém extraktu.
Příklad 5
Optimální množství cyklofilinu (Cph) je imobilizováno na povrch jamek mikrotitračních destiček (MaxiSorp F8 NUNC). K zabránění nespecifické adsorpce analytu je po imobilizaci Cph provedena blokace povrchu jamek 1% roztokem želatiny. Do použití jsou mikrotitrační destičky s imobilizovaným Cph skladovány při 4 °C pod roztokem 1% želatiny, obsahujícím 0,01% azid sodný. Před použitím jsou jamky po odsátí želatiny 3x promyty promývacím roztokem (0,8% (W/v) NaCl, pH 7,3, 0,002% (v/v) Tween 20). Po odsátí zbytků promývacího roztoku se do jamek nanese 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny, bezprostředně poté je do každé jamky přidáno 100 μΐ optimálně naředěného konjugátu CsA-P-HRP. Po 60 minutové inkubaci při 8 °C je dále po odsátí reakční směsi a promytí jamek postupováno jako v příkladě 1.
-6CZ 283008 B6
Příklad 6
100 μΐ optimálně naředěného konjugátu CsA-HRP v ředicím pufru bez merkaptoethanolu a dithiotreitolu je smícháno se 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny. Po promíchání je ke směsi přidáno 200 μΐ optimálně naředěné protilátky (monoklonální myší, polyklonální ovčí, králičí, slepičí) a směs inkubována při 8 °C 60 minut. Po ukončené inkubaci je 200 μΐ směsi přeneseno do jamek mikrotitrační destičky, na jejichž povrch byla imobilizována frakce protilátek proti protilátkám příslušného živočišného druhu, tj. anti myší, respektive anti ovčí, anti králičí, anti slepičí a směs v jamkách inkubována při 8 °C po dobu 60 minut. Po ukončené inkubaci byl obsah jamek odsát a jamky 3x promyty promývacím roztokem a dále postupováno jako v příkladě 1.
Využitelnost vynálezu
Polymerní konjugát podle vynálezu a způsob jeho použití pro in vitro diagnostické testy podle vynálezu představuje neizotopovou techniku stanovení volného cyklosporinu A, která může být využita ve všech biochemických laboratořích a v nemocnicích, kde je třeba monitorovat hladiny cyklosporinu v tělních tekutinách pacientů, kterým je tento lék podáván. Na základě výsledků testů může být individuálně upravováno dávkování léčiva. Výhodou metody podle vynálezu je její jednoduchost a možnost provádění v jakékoli biochemické laboratoři, protože metoda nevyžaduje povolení práce s radioizotopy.
Claims (7)
1. Polymerní konjugáty cyklosporinu A, sestávající zpolymemího nosiče, obsahujícího 40 až 1000 zpolymerizovaných monomemích jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxvpropyl)methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakiylamid, akrylamid, N-vinylpyrrolidon nebo kyselina akrylová a methakrylová ve formě svých sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15% mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde kjednotkám methakryloylovaných aminokyselin, vybraných ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, fenylalanin, leucin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaných oligopeptidů, vybraných ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGIy, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyPheGly, je kovalentně navázán enzym, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a β-galaktosidázu.
2. Polymerní konjugáty cyklosporinu A, sestávající z polymemího nosiče, obsahujícího 40 až 1000 zpolymerizovaných monomemích jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů. kde kjednotkám methakryloylovaných aminokyselin, vybraných ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, fenylalanin, leucin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaných oligopeptidů, vybraných ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGIy, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyPheGly, je kovalentně navázán enzy m, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a β-galaktosidázu.
-7CZ 283008 B6
3. Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem.
4. Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároku 3, vyznačený tím, že se enzym naváže vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, popřípadě vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.
5. Použití polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároků 1 a 2 pro stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách.
6. Způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách, vyznačený tím, že se roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin nebo jeho metabolity, nebo roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a roztok tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin nebo jeho metabolity, nechají reagovat s cyklofilinem, jakožto receptorem pro volný i na polymer vázaný cyklosporin, načež se koncentrace na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu s vázaným enzymem stanoví pomocí enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen.
7. Způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách podle nároku 5, vyznačený tím, že se místo cyklofilinu, jako receptoru pro vazbu volného cyklosporinu a polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem, použije protilátka proti cyklosporinu, vybraná ze skupiny, zahrnující monoklonální myší anti-CsA protilátku, polyklonální ovčí anti-CsA protilátku, polyklonální králičí anti-CsA protilátku nebo polyklonální slepičí anti-CsA protilátku.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ931455A CZ283008B6 (cs) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ931455A CZ283008B6 (cs) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ145593A3 CZ145593A3 (en) | 1995-02-15 |
| CZ283008B6 true CZ283008B6 (cs) | 1997-12-17 |
Family
ID=5463312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ931455A CZ283008B6 (cs) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ283008B6 (cs) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000007543A3 (en) * | 1998-08-04 | 2000-05-11 | Watson Lab Inc Utah | Conjugates targeted to the interleukin-2 receptors |
| WO2001060848A3 (en) * | 2000-02-18 | 2002-04-25 | Watson Pharmaceuticals Inc | Conjugates targeted to target receptors |
-
1993
- 1993-07-20 CZ CZ931455A patent/CZ283008B6/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6251866B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-06-26 | Watson Laboratories, Inc. | Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor |
| WO2000007543A3 (en) * | 1998-08-04 | 2000-05-11 | Watson Lab Inc Utah | Conjugates targeted to the interleukin-2 receptors |
| WO2001060848A3 (en) * | 2000-02-18 | 2002-04-25 | Watson Pharmaceuticals Inc | Conjugates targeted to target receptors |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ145593A3 (en) | 1995-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2627124B2 (ja) | 三官能共役体、その製造方法及びその使用方法 | |
| US6114180A (en) | Synthetic calibrators for use in immunoassays, comprising the analytes or partial sequences thereof which are conjugated to inert carrier molecules | |
| CA1206877A (en) | Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments - an index of glycemia | |
| US4886761A (en) | Polysilicon binding assay support and methods | |
| CA1303495C (en) | Use of immobilized biotinylated receptor in test device, kit and method for determining a ligand | |
| EP0005271A2 (en) | Method and kit for enzyme immunoassay of biological substances | |
| JP3524401B2 (ja) | 酵素抗体複合体およびその製造方法 | |
| JPH10507778A (ja) | ポリペプチド：デンドリマー複合体 | |
| JPH07119764B2 (ja) | イオン捕捉試薬およびそれを用いた結合イムノアッセイ法 | |
| JPH0737988B2 (ja) | イオン捕捉イムノアッセイ法および装置 | |
| JPH11511558A (ja) | 蛍光および発光ラベル組成物ならびにそれらの使用方法 | |
| JPH0731199B2 (ja) | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 | |
| AU654833B2 (en) | The use of pairs of peptides with extremely high specific affinity for one another in the area of in vitro diagnosis | |
| JPS60501573A (ja) | 新規な視覚化ポリマ−及びこれらのポリマ−の診断薬への応用 | |
| EP0047784A1 (en) | Detection of antibiotics in milk | |
| AU640635B2 (en) | Avidin-biotin assisted immunoassay | |
| JPH04223270A (ja) | ホスホリル化されたチロシンを含有する蛋白質を検出する方法及び組み合せ試薬 | |
| EP0256117A1 (en) | Latex agglutination using avidin/biotin system | |
| CZ283008B6 (cs) | Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách | |
| JPH02500687A (ja) | 固相マトリツクスの製法 | |
| JPH0376919B2 (cs) | ||
| FI68653B (fi) | Metod foer bestaemning av tyroxin-bindningsindex i serum och testfoerpackning foer utfoerande av bestaemningen | |
| JP3282129B2 (ja) | 固相非分離酵素分析 | |
| GB2089979A (en) | Method for assaying superoxide dismutase | |
| JPH08136496A (ja) | バイオセンサー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20030720 |