CZ283008B6 - Polymerní konjugát cyklosporinu A, způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách - Google Patents

Abstract

Polymerní konjugáty cyklosporinu obsahující 40 až 1000 zpolymerizovaných monomerních jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakrylamid, akrylamid, , N-vinylpyrrolidon, kyselina methylakrylová a akrylová ve formě svých sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, s výhodou N2-hydroxypropyl)methakrylamid, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde k jednotkám methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů je kovalentně navázán enzym vybraný ze skupiny zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a .beta.-gala- ktosidázu, jejich příprava a použití pro stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách. ŕ

Description

Předmětem vynálezu je polymemí konjugát cyklosporinu A (CsA), způsob jeho přípravy a použití v in vitro diagnostických testech, zejména v kvalitativní a kvantitativní analýze hladin volného cyklosporinu A (CsA) a jeho metabolitů, přítomných v lidských tělních tekutinách.

Stav techniky

Monitorování hladin cyklosporinu A (CsA) v krvi pacientů, imunosuprimovaných Sandimunem® (Sandoz), nebo Consuprenem® (Galena, Opava), je nezbytným předpokladem pro zajištění optimálního dávkování farmaka. Úzké koncentrační rozmezí účinných hladin CsA, vysoké riziko vedlejších vlivů CsA, individuální farmakokinetika CsA u jednotlivých léčených pacientů podmiňují trvalou kontrolu hladin CsA v krvi. V současné době je stanovení hladin CsA prováděno metodou vysoko účinné chromatografie (Hold, D., Marsden, J., Johnston, A., Transplant. Proč. 22, 1234, 1990), v klinické praxi pak především saturační radioimunoanalýzou (RIA), využívající CsA, značeného buď 3H (Quesmiaux, V., Tees, R., Schreier, M., et al. Clin. Chem. 44, 43, 1987), nebo 1251 (Knepil, J., McPhilips, M., Clin. Chem. 35, 181, 1989). Další rutinně užívaná metoda polarizované imunofluorescence (FPIA) je založena na měření změn fluorescence fluoresceinisothiokyanátem (FITC) značeného CsA (Wang, O., Morrison, M., Wang, N., Clin. Chem. 32, 1061, 1986). Dále byla vyvinuta imunoanalýza, označovaná jako ACMIA (Affinity-Column-Mediated-Immunoassay). která používá jako detekční prvek enzym (β-galaktosidázu), navázaný na specifickou protilátku (Prince, C., Davey, C., Medculp, E., et al., Clin. Chem. 36, 1932, 1990). Další neizotopová imunochemická metoda, chemiluminiscenční imunostanovení CsA (CLIA), byla vypracována při použití hemisukcinátu-CsC, značeného N-(4aminobutyl)-N-ethylisol-aminolem (Stabler, T., Lieger, A., Clin. Chem. 36, 906, 1990). V roce 1990 byly prezentovány soupravy pro stanovení hladin CsA v systému EMIT (EnzymeMultiplica-Immunoassay Technigue) s CsA, značeným glukozo-6-fosfát dehydrogenázou (Beresini, M., Totan-Quinn, R., Bamett, B., et al., Clin. Chem. 36, 1034, 1990). Vedle tradičních imunochemických technik byla vletech 1990-1992 pro stanovení hladin CsA publikována metoda receptorové analýzy, využívající cílovou molekulu farmaka jako analytické reagens. Předností tohoto metodologického přístupu před tradičním reagens-protilátkou je selektivita interakce, která reflektuje biologickou účinnost farmaka ajeho metabolitů (Paul, K., Harding, W.H., Marks, M.W., Handschumacher, R.G., Lorber, M.S., Transplant. Proč. 23, 974, 191, Hašková, V., Rozprimová, L., Svobodová, J., Folia Biol. 37, 134, 1991, Kullinger, B., Wolfram,

J., Hamilton, G., Hrozemsky, M., Kovařík, K., Woluszuk, W., Steiner, G., Transplant. Proč. 22, 1702, 19909, 10). Námi navrhovaná technika využívá výše zmíněného přístupu, vlastní molekula farmaka je kovalentní vazbou spojena s molekulou polymemího nosiče, modifikovaného enzymem, umožňujícím snadnou detekci a vyhodnocení analýzy metodami, běžně dostupnými v každé biochemické laboratoři.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je polymemí konjugát cyklosporinu A. sestávající z polymemího nosiče, obsahujícího 40-1000 zpolymerovaných monomerních jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)-methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakrylamid, akrylamid, N-vinylpyrrolidon nebo kyselina akrylová a methakrylová ve formě svých

- 1 CZ 283008 B6 sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryioylovaných oligopeptidů s terminálně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde k uvedeným methakryloylovaným aminokyselinám, vybraným ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, leucin, fenylalanin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaným oligopeptidům, vybraným ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyValGly, je kovalentně navázán enzym, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a βgalaktosidázu. Výhodné provedení polymemího konjugátu podle vynálezu představuje konjugát, obsahující 20 až 99 % mol. N-(2-hydroxypropyl)methakiylamídu.

Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu podle vynálezu spočívá v tom, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem, nebo vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, popřípadě vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.

Dalším význakem vynálezu je použití polymemích konjugátů cyklosporinu A podle předmětného vynálezu pro neizotopové stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách.

Stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách způsobem podle vynálezu spočívá v tom, ze roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin A a jeho metabolity, nebo roztok polymemího konjugátu cyklosporinu a roztok tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin a jeho metabolity, se nechá reagovat s cyklofilinem jakožto receptorem pro volný i na polymer vázaný cyklosporin, načež se koncentrace na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu svázaným enzymem stanoví pomocí enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen. To znamená, že se využívá enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen, ke stanovení koncentrace tohoto na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu s vázaným enzymem.

Při stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách způsobem podle vynálezu lze postupovat také tak, ze se místo cyklofilinu jako receptorů pro vazbu volného cyklosporinu a polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem použije protilátka proti cyklosporinu, vybraná ze skupiny, zahrnující monoklonální myší anti-CsA protilátku, polyklonální ovčí anti-CsA protilátku, polyklonální králičí anti-CsA protilátku nebo polyklonální slepičí anti-CsA protilátku.

Polymemí konjugáty cyklosporinu s vázaným enzymem podle předmětného vynálezu (CsA-PEnz), vycházející zN-substituovaných akryl a methakrylamidů, mohou být popsány obecným vzorcem:

R! CH₃CH

I II —(CHt-C—)_x—(CH-—C--)_y--(CH->--C-)_z

I II c=o c=o c=o

I II

R₂ R₃ Rj kde R_I je -H (arylamidy) nebo -CH₃ (methakrylamidy), R₂ je - NHCH₂CH₃, -NHCH₂CH(OH)CH₃ nebo -NH₂ skupina, R₃ je aminokyselina či oligopeptid s terminálně navázaným cyklosporinem a Ri je aminokyselina nebo oligopeptid s terminálně navázaným enzymem, x je v rozmezí 20 až 99 % mol., y je v rozmezí 0,2 až 20 % mol. a z je v rozmezí 0,2 až 15 % mol..

V případě nosičů, připravených na bázi kopolymerů N-vinylpyrrolidonu, výraz pro x rovno 20 až 99 % mol. odpovídá molámímu zastoupení N-vinylpyrrolidonu v kopolymeru.

Při přípravě polymemích konjugátů cyklosporinu podle vynálezu se postupuje tak, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym. Enzym je navázán amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem, nebo vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, případně vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.

K vazbě na nosič byly použity semisyntetické deriváty přírodního cyklosporinu, popsané v patentech 277471 a 277472, obsahující aldehydickou skupinu nebo deriváty, vzniklé jejich modifikací ethylendiaminem, hexamethylendiaminem nebo hydrazinem. Derivát cyklosporinu A je vkonjugátu vázán k aminokyselině nebo oligopeptidu v postranním řetězci polymeru amidickou (-CONH-) vazbou, hydrazidickou vazbou (-NHNHCO-), nebo vazbami, (-C=N-NH-), (-CH-NH-) a (-CH-NH-NH-).

Jednotky monomerů N-methakryloylovaných aminokyselin a oligopeptidů, zapojených do řetězce polymemího nosiče, vycházejí z biogenních aminokyselin, jako glycin, alanin, leucin, fenylalanin, kyselina amínokapronová, nebo jejich oligopeptidů GlyGly, GlyPheLeuGly, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyValGly. Enzymy, použité ke značení polymemích konjugátů, jsou křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a β-galaktosidáza.

Tyto enzymy jsou připojeny k polymeru prostřednictvím aminokyselinového nebo oligopeptidického spaceru o amino-kyselinovém složení, uvedeném výše, vždy přes -COOH konec aminokyseliny nebo oligopeptidu amidickou -CONH- vazbou (vzniklé acylací aminoskupin enzymu aktivovaným karboxylem v postranním řetězci polymeru), nebo vazbami -CONH(CH₂)_nNHCH-, -CONHN=CH- a CONHNHCH₂ - vzniklých reakcí polymeru, jehož postranní aminokyselinové či oligopeptidické řetězce jsou zakončeny amino nebo hydrazo skupinou, s enzymem mírně oxidovaným pomocí perjodátu sodného a případně následnou redukcí borohydridem, eventuálně kyanoborohydridem sodným.

Metoda stanovení volného cyklosporinu A podle vynálezu využívá principu saturační receptorové analýzy. Jako receptor pro volný cyklosporin (CsA) nebo cyklosporin, konjugovaný s polymerem a enzymem (CsA-P-Enz), je použit cyklofilin (Cph) nebo anti-CsA protilátky, jako monoklonální myší, polyklonální ovčí, králičí, slepičí. Vyhodnocení analýzy, tj. stanovení koncentrací volného CsA ze vzorku a CsA, vázaného na polymemí nosič, značený enzymem (CsA-P-Enz), obou vázaných na receptor, vychází z kompetice vazby obou forem CsA a stanovení koncentrace CsA-P-Enz, využívající enzymové reakce enzymu, vázaného na nosič, s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen.

Analytické stanovení volného cyklosporinu (CsA) na základě kompetitivní vazby volného a vázaného CsA na substrát je možné provádět trojím způsobem.

a) Oba typy cyklosporinu (CsA z testovaného roztoku i CsA, vázaný v činidle - polymemím konjugátu) se nejdříve v roztoku naváží na cyklofilin a tento se posléze zakotví na mikrotitračních destičkách s imobilizovaným imunoglobulinem, specifickým proti cyklofilinu.

- 3 CZ 283008 B6

Koncentrace konjugovaného CsA, zakotveného na destičce, se stanoví z absorbance roztoku, zabarveného v důsledku barevné enzymatické reakce.

b) Inkubace s roztoky činidla (CsA-P-Enz) a testovaného vzorku se provede přímo na mikrotitrační destičce s předem pevně zakotveným cyklofilinem, vyhodnocení je obdobné jako v případě a), tj. na základě barevné enzymatické reakce polymemího konjugátu se substrátem.

c) Inkubace roztoku činidla a zkoumané látky s protilátkou proti cyklosporinu (anti-CsA-Ab) se provede v roztoku, cyklosporinem modifikovaná protilátka se zakotví na mikrotitrační destičce s povrchem, modifikovaným protilátkou proti anti-CsA-Ab, a koncentrace navázaného konjugátu (CsA-P-Enz) se stanoví měřením absorbance roztoku, zabarveného stejnou enzymatickou reakcí, jako v obou předešlých případech.

Způsob stanovení vazebné aktivity činidla - konjugátu CsA-P-Enz v systému saturační receptorové analýzy je uvedeno na příkladu polymemího konjugátu cyklosporinu A s křenovou peroxidázou (CsA-P-HRP) v příkladu 3.

Princip metody stanovení cyklosporinu vychází z použití činidla vodorozpustného polymemího nosiče, na který je pomocí oligopeptidických sekvencí kovalentní vazbou navázáno jak léčivo cyklosporin, tak i enzym, dávající se substráty barevné reakce a umožňující tak kvantitativní vyhodnocení koncentrace konjugátu v roztoku.

V dalším je vynález objasněn na příkladech, aniž se na ně omezuje.

Seznam použitých zkratek

CsA cyklosporin A,

MA methakryloyl,

Gly, Phe, Leu, Gly, Val L-aminokyseliny,

P - polymemí nosič,

HRP křenová peroxidáza,

-ONp p-nitrofenoxy skupina,

TRIS.HC1 pufr, připravený z tris(hydroxymethyl) aminomethanu, pH upraveno HC1,

Cph cyklophilin,

GPC gelová permeační chromatografie,

DMF dimethylformamid,

Enz enzym.

Příklady provedení

Příklady syntézy polymemího konjugátu CsA-P-Enz

Příklad 1: Syntéza polymemího konjugátu CsA-P-HRP, enzym vázaný aminolyticky

Syntéza sestává ze tří fází: a) syntéza polymemího nosiče, b) vazba cyklosporinu na nosič, c) vazba enzymu na nosič, čištění a charakterizace konjugátu.

a) Polymemí nosič (R; methyl, Rj-NHCFLCHfOHjCHj, R₃ oligopeptid - GlyPheLeuGlyONp, x = 92 % mol., y = 8 % mol. a z = 0) byl připraven radikálovou srážecí polymerizací 1,5 g N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu s 0,58 g methakryloylovaného p-nitrofenylového esteru glycylfenylalanylleucylglycinu (MAGlyPheLeuGlyONp) v 18 ml acetonu za iniciace 90 mg azobis-isobutyronitrilu při teplotě 50 °C. Polymerizační směs byla v ampuli probublána žárovkovým

-4CZ 283008 B6 dusíkem, ampule zatavena a umístěna do termostatu na 24 hod.. Molekulová hmotnost připraveného polymeru byla 25 000 g/mol.

b) 0,1 g cyklosporinu A, modifikovaného hydrazo skupinou, bylo rozpuštěno v 1,8 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a za míchání byl přidán roztok 0,30 g polymemího nosiče (příprava viz a) ve 2 ml DMSO. Po 6 hod. reakce při 25 °C byl polymer izolován vysrážením do směsi aceton-diethylether 1:1. Obsah navázaného CsA byl stanoven analýzou aminokyselin v hydrolyzátu polymeru (obsah 18 % hmot.), pomocí UV stanovený obsah zbývajících p-nitrofenyl esterových skupin byl 3,7 % mol.

c) 90 mg polymeru, připraveného v případě b), bylo rozpuštěno v 1 ml vody a za chlazení (4 °C) přidán roztok 30 mg křenové peroxidázy ve fosfátovém pufru pH 7. Během 4 hod. bylo pH roztoku zvyšováno až k hodnotě 9,2 přídavkem roztoku tetraboritanu sodného. Po dalších 3 hod. reakce byl produkt přečištěn GPC (Sephadex G-15) a lyofilizován. Polymemí konjugát byl charakterizován pomocí gelové permeační chromatografie GPC (Sepharosa 4B a6B, 1:1) a elektroforézou.

Příklad 2: Syntéza polymemího konjugátu CsA-P-HRP, enzym vázaný prostřednictvím aldehydových skupin, zavedených do enzymu mírnou oxidací.

Pro přípravu konjugátu byl použit polymemí nosič, jehož příprava byla popsána v příkladu 1 a). 10 %ní roztok tohoto polymeru v dimethylformamidu (DMF) byl za intenzivního míchání přidán do roztoku 100 násobného molámího přebytku ethylendiaminu (počítáno na obsah reaktivních -ONp skupin), po 1 hod. reakce byl vyizolován polymemí prekurzor 1, nesoucí v postranních řetězcích primární aminoskupinu (R₃ - GlyPheLeuGlyNFŘCFLhNFL). Stejným způsobem, avšak reakcí s hydrazinhydrátem, byl připraven i polymemí prekurzor 2, nesoucí v postranních řetězcích hydrazoskupinu (Rj-GlyPheLeuGlyNHNFF).

Oba polymemí prekurzory byly použity k syntéze konečného konjugátu, která byla dvoustupňová.

V prvém reakčním kroku 100 mg polymemího prekurzoru (1 nebo 2) bylo reagováno v methanolu s 33 mg cyklosporinu A (CsA), modifikovaného aldehydickou skupinou (polymemí meziprodukt izolován srážením do směsi aceton - diethylether), v dalším kroku byla provedena vazba 33 mg enzymu HRP (oxidovaného v 0,lM acetátovém pufru pH 4,0 perjodátem sodným) na polymemí nosič v borátovém pufru při pH 9 (prekurzor 1), nebo pH 8 (prekurzor 2). Polymemí konjugáty byly přečištěny pomocí GPC (Sephadex G 15), vazba mezi nosičem a navázanými komponentami stabilizována redukcí kyano-boro-hydridem sodným a finální produkty přečištěny, lyofilizovány a charakterizovány analogicky jako v příkladě 1.

Příklady použití konjugátu ke stanovení koncentrace CsA

Příklad 3: Stanovení vazebné aktivity CsA-P-HRP v systému saturační receptorové analýzy

Jako vazebná liganda-receptor je v systému používán cyklofilin (Cph), izolovaný z hovězího thymu ultrafiltrací tkáňového homogenátu přes Diaflo membrány XM-300-XM-30 na zařízení AMICON. Pro použití v analytice je filtrát, obsahující bílkoviny o MW menší než 30 kD, zahuštěn filtrací přes membránu YM-10. Vazebná aktivita receptoru k cyklosporinu A (CsA) je stanovena při použití triciem značeného CsA (³H-CsA). Pro saturační radioreceptorovou analýzu (RRA) byla použita koncentrace cyklofilinu (Cph), odpovídající 50 % maximální vazebné aktivity.

- 5 CZ 283008 B6

Základní roztoky (20 mg/1) testovaných konjugátů - (činidla CsA-P-HRP) byly připraveny rozpuštěním preparátu v lOmM TRIS.HC1 pufru pH 7,3, obsahujícím 50 mM merkaptoethanol, 2 mM dithiotreitol, 2 mM kalcium laktát a 1% (w/v) hovězí sérový albumin (ředicí pufr). Ze zásobních roztoků byly připraveny pracovní roztoky 10-1 mg konjugátu/1 1 pufru. Ke 200 μΐ testovaného vzorku bylo přidáno 50 μΐ 3H-CsA a po přidání 50 μΐ optimálně naředěného Cph byla směs inkubována 60 minut při 8 °C. Po ukončení inkubace bylo k reakční směsi přidáno 500 μΐ suspenze aktivního uhlí (10 mg/mL) a směs byla inkubována 8 minut na ledové vodní lázni. Po skončené inkubaci byla suspenze centrifugována a 500 μΐ supematantu bylo přeneseno do 10 ml scintilačního roztoku SLD 31 a měřena aktivita β - záření. Naměřené hodnoty byly po odečtení pozadí a přepočtu k B_o graficky zpracovány.

Z výsledků inhibice interakce Cph x 3H-CsA připravenými konjugáty CsA-P-HRP vyplývá identita mezi oběma typy derivátů CsA (3H-CsA a CsA-P-HRP) ve vztahu k vazebné ligandě, tj. cyklofilinu. Znamená to, že konjugáty CsA-P-HRP mohou být použity jako detekční sloučeniny v kvalitativní i kvantitativní analýze. Výsledky saturační analýzy prokázaly účinnost konjugátu v systému receptorové analýzy v koncentračním rozsahu CsA, potřebném pro monitorování imunosupresivní terapie Sandimunem®, respektive Consuprenem®.

Příklady experimentálního stanovení cyklosporinu A (CsA)

Příklad 4

Ke 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny se přidá 100 μΐ optimálně naředěného konjugátu Cs-A-HRP v ředicím pufru. Po dokonalém promíchání obou složek je přidáno v 50 μΐ ředicího pufru optimální množství Cph (odpovídajícího 50% B_max). Směs je opět dokonale promíchána a inkubována 60 minut při 8 °C. Po ukončení inkubace je 200 μΐ reakční směsi přeneseno do jamky mikrotitrační destičky (MaxiSorp F8 NUNC), na jejímž povrchu je imobilizována imunoglobulinová frakce králičího imunního séra proti hovězímu cyklofilinu. Po 60 minutách inkubace při 18 °C je obsah jamek odsát, jamky 3x promyty ředicím pufrem bez hovězího albuminu a přítomnost konjugátu CsA-P-HRP prokazována enzymovou aktivitou přidáním 150 μΐ substrátového roztoku, obsahujícího chromogen. Po ukončení enzymové reakce jsou změřeny absorbance jednotlivých vzorků a výsledky graficky zpracovány. Hodnota enzymové aktivity daného vzorku je nepřímo úměrná koncentraci CsA v testovaném materiálu, tj. tělní tekutině, respektive tkáňovém extraktu.

Příklad 5

Optimální množství cyklofilinu (Cph) je imobilizováno na povrch jamek mikrotitračních destiček (MaxiSorp F8 NUNC). K zabránění nespecifické adsorpce analytu je po imobilizaci Cph provedena blokace povrchu jamek 1% roztokem želatiny. Do použití jsou mikrotitrační destičky s imobilizovaným Cph skladovány při 4 °C pod roztokem 1% želatiny, obsahujícím 0,01% azid sodný. Před použitím jsou jamky po odsátí želatiny 3x promyty promývacím roztokem (0,8% (W/v) NaCl, pH 7,3, 0,002% (v/v) Tween 20). Po odsátí zbytků promývacího roztoku se do jamek nanese 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny, bezprostředně poté je do každé jamky přidáno 100 μΐ optimálně naředěného konjugátu CsA-P-HRP. Po 60 minutové inkubaci při 8 °C je dále po odsátí reakční směsi a promytí jamek postupováno jako v příkladě 1.

-6CZ 283008 B6

Příklad 6

100 μΐ optimálně naředěného konjugátu CsA-HRP v ředicím pufru bez merkaptoethanolu a dithiotreitolu je smícháno se 100 μΐ testovaného vzorku (extraktu) tělní tekutiny. Po promíchání je ke směsi přidáno 200 μΐ optimálně naředěné protilátky (monoklonální myší, polyklonální ovčí, králičí, slepičí) a směs inkubována při 8 °C 60 minut. Po ukončené inkubaci je 200 μΐ směsi přeneseno do jamek mikrotitrační destičky, na jejichž povrch byla imobilizována frakce protilátek proti protilátkám příslušného živočišného druhu, tj. anti myší, respektive anti ovčí, anti králičí, anti slepičí a směs v jamkách inkubována při 8 °C po dobu 60 minut. Po ukončené inkubaci byl obsah jamek odsát a jamky 3x promyty promývacím roztokem a dále postupováno jako v příkladě 1.

Využitelnost vynálezu

Polymerní konjugát podle vynálezu a způsob jeho použití pro in vitro diagnostické testy podle vynálezu představuje neizotopovou techniku stanovení volného cyklosporinu A, která může být využita ve všech biochemických laboratořích a v nemocnicích, kde je třeba monitorovat hladiny cyklosporinu v tělních tekutinách pacientů, kterým je tento lék podáván. Na základě výsledků testů může být individuálně upravováno dávkování léčiva. Výhodou metody podle vynálezu je její jednoduchost a možnost provádění v jakékoli biochemické laboratoři, protože metoda nevyžaduje povolení práce s radioizotopy.

Claims (7)

1. Polymerní konjugáty cyklosporinu A, sestávající zpolymemího nosiče, obsahujícího 40 až 1000 zpolymerizovaných monomemích jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxvpropyl)methakrylamid, N-ethylmethakrylamid, N-ethylakiylamid, akrylamid, N-vinylpyrrolidon nebo kyselina akrylová a methakrylová ve formě svých sodných solí, nebo kopolymery těchto výše uvedených monomerů, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15% mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů, kde kjednotkám methakryloylovaných aminokyselin, vybraných ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, fenylalanin, leucin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaných oligopeptidů, vybraných ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGIy, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyPheGly, je kovalentně navázán enzym, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a β-galaktosidázu.

2. Polymerní konjugáty cyklosporinu A, sestávající z polymemího nosiče, obsahujícího 40 až 1000 zpolymerizovaných monomemích jednotek, z nichž 20 až 99 % mol. je N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid, 0,2 až 20 % mol. jednotek methakrylovaných aminokyselin nebo methakrylovaných oligopeptidů s terminálně kovalentně vázaným cyklosporinem a 0,2 až 15 % mol. jednotek methakryloylovaných aminokyselin nebo methakryloylovaných oligopeptidů. kde kjednotkám methakryloylovaných aminokyselin, vybraných ze skupiny, zahrnující glycin, a-alanin, β-alanin, fenylalanin, leucin a kyselinu aminokapronovou, nebo methakryloylovaných oligopeptidů, vybraných ze skupiny, zahrnující GlyGly, GlyPheLeuGIy, GlyLeuPheGly, GlyLeuGly, GlyPheGly a GlyPheGly, je kovalentně navázán enzy m, vybraný ze skupiny, zahrnující křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu a β-galaktosidázu.

-7CZ 283008 B6

3. Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že na připravený polymemí nosič se nejdříve váže cyklosporin A, nesoucí funkční skupinu aldehydickou, hydrazinovou nebo primární aminoskupinu, a poté je navázán enzym amidickou vazbou, vzniklou reakcí primárních aminoskupin, přítomných v molekule enzymu, s polymemím nosičem.

4. Způsob přípravy polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároku 3, vyznačený tím, že se enzym naváže vazbami, vzniklými reakcí polymemího nosiče s aldehydovými skupinami, zavedenými do molekuly enzymu mírnou oxidací, popřípadě vazbami, vzniklými jejich opatrnou redukcí.

5. Použití polymemích konjugátů cyklosporinu A podle nároků 1 a 2 pro stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách.

6. Způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách, vyznačený tím, že se roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin nebo jeho metabolity, nebo roztok polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem a roztok tělní tekutiny, obsahující volný cyklosporin nebo jeho metabolity, nechají reagovat s cyklofilinem, jakožto receptorem pro volný i na polymer vázaný cyklosporin, načež se koncentrace na cyklofilin navázaného polymemího konjugátu cyklosporinu s vázaným enzymem stanoví pomocí enzymové reakce na polymer vázaného enzymu s roztokem substrátu, obsahujícího chromogen.

7. Způsob stanovení volného cyklosporinu A a jeho biologicky účinných metabolitů in vitro v lidských tělních tekutinách podle nároku 5, vyznačený tím, že se místo cyklofilinu, jako receptoru pro vazbu volného cyklosporinu a polymemího konjugátu cyklosporinu s navázaným enzymem, použije protilátka proti cyklosporinu, vybraná ze skupiny, zahrnující monoklonální myší anti-CsA protilátku, polyklonální ovčí anti-CsA protilátku, polyklonální králičí anti-CsA protilátku nebo polyklonální slepičí anti-CsA protilátku.