JPH02500687A

JPH02500687A - 固相マトリツクスの製法

Info

Publication number: JPH02500687A
Application number: JP1502567A
Authority: JP
Inventors: ベルガー，ミヒヤエル; デーガー，アルノ; マイアー，ヨーゼフ
Original assignee: ベーリンガー　マンハイム　ゲゼルシヤフト　ミツト　ベシユレンクテル　ハフツング
Priority date: 1988-02-29
Filing date: 1989-02-28
Publication date: 1990-03-08
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: WO1989008259A1; EP0331127A1; JPH0830705B2; DE3806431A1; GR3009564T3; EP0331127B1; CA1335265C; ATE90790T1; DE58904672D1; ES2058361T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】固相マトリックスの製法本発明は、殊にイムノアッセイの原理によるヘテロデン分析法で使用するだめの不溶性担体材料に結合した特異的に結合しうる物質の製法に圓する。

特異的に結合しうる物質の測定のために、漠々、イムノアッセイの原理による方法を使用する。この際、特異的に相互に超合しうるｐｆｙ！Ｊ質対のパートナ− の１つを公知方法で標識されているそれに対して特異的なレセプターと反応させる。次いでこれら２物質からの接合体を、この接合体に対して又はこの接合体の２成分の１方に対して特異的であるレセプターと反応させることができる。この免疫学的方法に関し℃は、多くの変法が存在する。この除、レセプターの１方が固相に結合して存在する場合が有利である。このことは、結合してめる反応成分と結合して込ない成分との分離を容易にする。次いで、特異的に結合しうる物質の押」足のために、固相に結合している襟はされた反応成分又は溶液中に存在する標識された反応成分のｊ［を也り足し、測定すべき反応成分の倉に公知方法で関連さセる。

免疫学的方法では、固相として通例、プラスチック小管又はマイクロ餉足プレート（この円面に反応成分が固定される）又はボール（この外面に反応成分が固定される）が使用される。これらプラスチック小管、マイクロ滴定プレート又はボールは、通例、比較的不活性のプラスチック材料よりなり、従って、反応成分の結合は困難である。

更に、それぞれの表面への特異的反応成分の結合を、これがそれに対して特異的に結合しうる物質の特異的結合の能力を矢なわなりように行なうべきである。この理由から、固相への反応成分′の結合は大ｉｌ＆層的に行なう。従って、固相への反応成分の固定は、この結合を仲介するカップリング剤を介して笑現することが既に提案された。この場合には、カップリング剤への反応成分の結合は、分子の特異的反応領域を破壊せず、もしくは、反応成分がその反応性位置が固相がはなれて、結合成分に向いているように結合することにも笛意丁べきである。更に、西ドイツ特許出思公開第２５３３７０１号明＆’ｌ中には、艮好な結合を得るために、個々の免疫学的に作用する蛋臼貴全呆檎し、次いでポリスチロールボールに！＆看させることが提案されて因る。この文献中に、もう１つの可能性として、同時に、免役学的Ｉ９５任を有する蛋Ｓ質と不活性蛋白質を条項させることが挙げられており、これにより、架橋された生成物は、不活性及び活性の蛋白質より成り、これは再びポリスチロールざ−ルに吸着される。しかしながら、架橋のこの方式は、選択される反応条件に依り、架橋されておらず不溶性にされる蛋白質の変動性分との種々の再現不能な架ａｔ−もたらす。更に、種々の架橋度に依り、種々の結合特性を有する生成物が生じる。類似の方法が欧州特許（３ｎＵ−Ａ）第１２２２０９号明細書に記載されており、同じ欠点をも有する。従って、これら公知のすべての方法は、なお満足すべきものではな（、特異的に結合しうる物質の最適付着性をもたらさず、被接された同相の再現可能な製造には好適性が低い。

もう一つの問題は、この面相に結合した抗体が、一般に、異なるテストのためには異なるべきであることにある。従って、各テストのために、１伽の特定の複機された固花を供給すべきである。このことは、非常に仕置がかかる。更に、公知方法で１足された（　ｉｍｍｏｂｉユ１ｓｉｅｒｔ　）各抗体が結合可能に残ることは、保旺されない。それというのも、非特異的結合も屡々起り、かつ更に、従来公知の方法での剥難半（Ａｂｌ’６ｓｕｎｇｓｒａｔｅ　）も非常に高く、この抗体は大過剰で使用丁べきであるからである。それにもかかわらず、結合ｉ所の数は限られている。従って、高い障害が任じる。このことは、抗体は製造因島であり製造仕置がかかるので、欠点である。

従って、本発明の課題は、特異的に結合しうる物質の固相への付！ａを再挽可能に改良する方法ヲ徒供し、史に、すべてのイムノアッセイに晋逼釣に使用可能でである。多くの免疫学的方法で、濁り及び非特異的結合をさけるために界面活性剤添加のもとに操作されるので、本発明のもう１つの課題は、付着性を、界面活性剤の存在でも、この結合した特異的に結合可能な物質がはがれない程度に光分改良することであった。

この課題は、殊にイムノアッセイの原理によりヘテロデン分析法で使用するための、不溶性担体材料に結合した特異的に結合しうる蛋白質物質の羨法により達成され、これは、まず約２００００’ｎより太きｂ分子量を有し、特異的結合対のパートナ−Ｐｌの多１：ｉ’ｔ−有する第１のポリマー１を、不溶性担持材料に結合させ、引続き、特異的結合対の他パートナ−Ｐ２の多数を有するか又はこれらよりなる第２のポリマー」に、ＰｌとＰ２との特異的結合により架橋させることを脣似とし、この際、このポリマーＩはＰｌに対する結合位置も免疫学的に検出可能ｊ給体に対する結合位置をも有する。

この方法で、すべてのイムノアッセイカえば１工程又は２工程法でのサンドイッチ−テスト又はコンペテイテイプーテストに使用可能な同相マトリックスヲ製造することができる。１工程法でのサンドインチ−テストのためには、例えはパートナ−Ｐ２のポリマー１は、その位置で、副足すべ一吟体を固定する結合位置ｔ −徒供することができる。この測定法の間に、測定子べき物質七含臂する試料は、標識されたレセプター基ひに標識されていないレセプター（これはポリマー」と結合しうる）と反応される生じる測定すべき物質、ｍｈされたレセプター及びポリマーＨに対する結合位置を有するレセプターから四軸りは、次いでその特異的な結合性に基づぎ、ポリマー■に結合し、こうしてｍ全体が固定される。次いで、相の分離の後に、２相の１つで標識を測定することができる。

２工程法でのサンドイッチ−テストを実施する場合は、非襟にレセプターがポリマー１　ｃＰＫ！合されてｂる固相マトリックスを使用することができる。次いで、この試料及び標識されたレセプターを、この固相マトリックスの存在でインキュベートする。相の分離の後に、この固相に結合した標識を測定することができる。

；ンペテイティプテストの冥尻の際には、試料と榛臓付き類縁試料とは、非１ａ臓レセプターに関して炊争する。１工程法のテスト変法のために、この場合に、非標識レセプターが結合しているポリマー■を使用する。２工程法の他の変法のために、非標識レセプターを、このテストの間に競争的に標線レセプターと結合させ、この場合には、次いでこのレセプターに対する結合位ｆ［’ｔ−有するポリマーｎｔ使用する。

本発明による固相マトリックスの製造のために、不溶性担持材料１ｃ第１のポリマー１で板極しくこの際担持材料への結合は共有結合ではなく、奴瀦又は交換作用により行なわれる）、第２のポリマー■と呆伽させる。ポリマー１を得るためには、水溶性であり、約２００００より大きい分子量を有する生物学的ポリマーが好適である。ポリマーＩ′ｔ−得るために、蛋白質、ペプチド、ヌクレイン酸ポリマー、炭水化物、工びにアミノ酸と炭水化物とからのコポリマーも有利に使用される。誘導体化されたポリマー例えば誘導体化された形の炭水化物例えばアミノデキストランも好適である。更に、このポリマーＩは特異的結合対のパートナ−Ｐ】多数を有する。このパートナ−Ｐｌは、このポリマーと架橋されていてよいか又はこれに結合されてめてよい。このポリマー■は、２００００より大きい分子量を有する。それというのも、僅かな分子量では、不溶性担持材料への結合が、場合によってはもはや確保されなりからである。４５０００より大きい特に２０００００より大きい分子量を有するのが有利である。

このポリマーへのパートナ−Ｐｌの結合は、公知方法で行なわれる。好適な結合法は、例えば、イシヵヮ（工ｓｈｉｋａｗａ　）によるＪ、よりｍｕｎｏａｓｓａｙ　４．２０９〜３２７（１９８３）に記ｊＩｉ！されている。この場合、ポリマーとの結合に好適であるパートナ−ｐｚｏＢ能基が引用されるか又は、適当な官能基が存在しない場合は、これｔＰｘ−分子内に導入する。こうして、力えばＰｌとしてのビオチンの使用の際には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、誘導体は、ポリマー中に存在するアミノ基との反応により結合されうる。他の好適な誘導体化は当業者に公知であり、ここでは説明する必要はない。

パートナーアｌ対ポリマー１’に得るために使用されるポリマーの割合は、緻密ではなく、広範囲内で変動しうる。ポリマー１　ｍ当りパートナ−ｐｌ　ｉ〜２００モルを使用するのが有利であることが豆証された。この場合、Ｐ】−童は、使用目的及び使用ポリマーに依り決まる。このポリマー■は、吸瀦性結合作用をすることができるためには、全体的に比較的疎水性であるべきであるので、Ｐｌが版木性である場合には、使用ポリマーの分子量が小さいｕ、Ｐ、分は少なくすべきである。このことは、例えばビオチンの場合である。

Ｐ〕及びＰ２として並びにポリマーｎと免役学的にユ証すべきｍとの間の結合に使用することのできる好適な結合パートナ−は、例えばビオテンーアビジ／、ブテンとは、蛋白質とＶＬ原もしくはハプテンもしくはそのフラグメントとの接合体と糎される。抗原は、それ自体抗体、そのＰａｂ−１Ｆａ　ｂ’−又は（Ｐａｂ’）２−７ラグメントでもあってもよい。抗体とは、モノクローナル及びポリクローナルの完全抗体及び抗体フラグメントである。Ｐｌ又はＰ２として、プロティンＡもしくはプロティンＧを使用する場合には、イムノアッセイで、面相に結合すべき１個のレセプターのみが完全抗体であり、標識されたレセプターとして標識されたレセプターと固札との非特異的結合（これは結果を誤まらせる〕七起こらせなめために、Ｆａｂ−又はＰ（Ｉ！Ｌｂ′）２−７ラグメントヲ使用すべきである。

ポリマー■゛の製造のために、蛋白質として、パートナ−Ｐｌ及びＰ２よりも疎水性である蛋臼５ｊヲ使用するのが有利である。殊に、約２０００００より太き（約２０００００００までの分子量を有する可溶性蛋白質が好適であり、これは、場合によっては、１ｏｏｏ。

〜７０００００の分子量を有する蛋白質から得られ、特異的結合性の対のパートナ−Ｐ、と接合されている。

分子量及び疎水性は当業者に公知の方法で画定される。可溶性蛋白質と特異的に結合しうる物質との間の疎水性の比較のために、例えば次の方法が好適であるニー色素への結合後の螢光消失（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

１ｃｔａ、　６２４、（１９８０）、１３〜２０）、−疎水性クロマトグラフィでの溶離臀性（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（１９８１）、６４〜７３）、 −ヒドロ７オピツク拳インターラクション−クロマトグラフィ（Ｅ工Ｃ）での保持時間（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍｉｅ９８（１９８６）、　５３０〜５４８、　％Ｔ、Ｃｈｒｏｍａｔ。

本発明による好適な物質の疎水性の比較は、Ｓｅｐ。

Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ　１４．３０５〜３１７（１９７９）に記載されて因る。これによると、疎水性は、例えば次の脂汗で上昇する： α２−マクログロブリン（分子量８２００００）牛血清アルブミン／ヒト血清アルブミン（分子量卵アルブミン α２Ｈ８−グリコプロティン（分子量４９０００）βユ。／β□、−グロブリン免疫グロブリン（分子量１５００００）トランスフェリン（分子量９００００　）。

特異的に結合しうる物質として免疫グロブリンを使用する場合は、例えば、この特別な実施形のためには、可溶５蛋白質としてのヒトコ清アルブミン又は０２ＨＢ−グリコプロティンは、更に前処理せずには好適でなＡｏここで、双方の蛋白質は、疎水性化及び分子量の増加をすべきである。この場合に、トランスフェリンでは、架橋が満足丁べきものであり、α２−マクログロブリンでは疎水性化が充分である。

前処理なしに特異的に結合しうる物質としての免疫グロブリンとの結合のために好適である蛋白質は、例えばβ−リポ蛋白質（分子量約３２００００００）又は α２−リボ蛋白質（分子量約５００００００〜２０００００００　）である。

疎水性化は、例えば熱の使用、酸、変性抗原及び／又はカオトロープイオン（Ｃｈａｏｔｒｏｐｅｎ工ｏｎ　）での処理及び／又は疎水性化合物との化学的結合により行なうことができる。

分子量の増大は、例えば、熱の′使用、酸、変性試薬及び／又はカオトロープイオンでの処理及び／又は２−又は多官能性の蛋白質試薬を用論る架橋により行なうことができる。

充分に疎７に性ではないか又はその分子量が充分に高くない蛋白質を、２０００００有利に４５０００、特に２０００００以上の分子量を有する蛋白質ポリマーが得られるまで長時間処理する。５０００００〜２０００００００の分子量を有する蛋白質ポリマーを使用するのが特に有利である。

この蛋白質が架橋されるべき場合には、架橋の前、間又は後に疎水性化を行なうことができる。しかしながら、この疎水性化は、特異的に結合しうる物質が蛋白質であり、その疎水性化によりその生物学的活性を失な５％合には、特異的に結合しうる物質の存在で行なうことはできなり０加熱による疎水性化のためには、通例、例えは２０に記載のように、４０〜９５ ℃の温度を１分〜１０時間で使用する。

酸での処理のために、例えば酢酸、プロピオン酸、乳酸又は塩酸が好適である。

作用時間１０分〜１６時間で、通例の濃度は１〜１００ｍモル／ｌである。

カオトロープイオンでの処理のためには、例えば、チオシアネート、ヨーダイト、フルオリド、プロミド、ペルクロレート及びスルフェートが好適である。変性試薬として、例えば塩酸グアニジン又は尿素を使用することができる。ここでは、通例、１０ｍモル／ｌ〜６モル／ｌの濃度が使用される。

疎水性化合物でのポリマーＩの誘導体化のためには、有利に、可溶性脂肪酸、低分子又は高分子形の脂質１びに合成ポリマー例えばポリプロピレングリコール又はポリスチロールの可＃性コポリマーを使用する。誘導体化は、当業者に慣用の方法で行なう。

架橋を、２官能性又は多官能性化合物を用いて実施する。これらは、少なくとも２個の官能基（これらは同じ又は異なるものであってよく、これら酉能基金介してポリマー１を形成する化合物例えば蛋白質の官能基と反応することができる）を有する化合物である。

末端にスクシンイミド−、マレインイミド−及び／又はアルデヒド基を有するアルキル基から成る化合物が有利である。

次いで、果機は、２官能性又は多官能性化合物を用い公知方法で冥加する。

疎水性化及び／又は架橋ために、１００００〜７０００００分子童を有する蛋白質を分子するのが有利である。

特に牛血清アルブミン、リパーゼ又は免疫−γ−グロブリンを使用するのが有利である。

こうして製造されたポリマー１を次いで、不溶性担体材料に結合させる。この場合、この結合は、ポリマーを介して行なわれ、一般に吸着的である。担体材料としては、慣用の固相例えばルラン（Ｌｕｒａｎ　）　、ガラス、二酸化チタン、ポリスチロール、γ−活性化ポリスチロール、ポリスチロール−７クリロニトリルーコポリマー、耘及び／又はポリオレフィンが好適である。

この担体材料は、更に加工する前に物理市又は化学的に前処理することができる。例えば、プ２スナック表面を、予めｍ潤させるか又は他の公知方法で活性化することができる。この担体材料は、一般に、小管、マイクロ滴定グレート又はボールの形で存在する。しかしながら、他の形も同様に可能である。

不溶性担体材料は既に夜憶された材料であってもよい。例えば、ポリストレプトアビジンで予め夜伽された小管又は重合された！５′Ｌ原で予め一１１＆された小管が好適である。この場合、不溶性担持材料は、ポリマー■に関する結合位置を提供するから、ポリマーＩの結合は、吸着的にのみ行なわれるのではない。こうして、非常に強力な結合が得られる。吸着性夜伽の際に、このポリマー■は非常に強くは結合しない。しかしながら、このことは、大抵の用途には充分である。それというのも、いくつかのＰｌの溶解時に、この壁付着は、ホリマー■との架橋により安定化されるからである。

特別な目的のためには、強力な結合が望まれる。この場合には、不溶性担体材料として予め夜会された材料を使用することができる。

ポリマー１は、多数のパートナ−Ｐ２を有する第２のポリマー■と架橋される。

このポリマー１は、Ｐ２のみから又はＰ２と他の成分との混合物から成っていてよい。このポリマーＢは、Ｐ２により提供されるＰｌに関する結合位置だけでなく、次にレセプターと称されうる免疫学的に検出すべき楽淋（Ｋｏｍｐｌｓｘ　）に関する結合位ｔｖも有する。この場合、レセプターとしては、特異的に結合しうる物質、殊に、特異的に結合しうる複雑な抗体（これはポリクローナル又はモノクローナルであってよい）、その抗体７ラグメント又は抗体又は抗体フラグメントとハプテン又は抗原との接合体亜びにハプテン、抗原又は結合蛋白ＩＸ（例えばチロキシン結合グロブリン）が使用される。レセプターに関する結合位置は、Ｐ２から提供されるか又はポリマー］の他の成分から提供される。

個々のパートナ−Ｐ２は、ホモ−又はへテロ−２１１１１ｉ又は多価の化合物（リンカ−）を介して相互に結合していてよい。次いで、２．（ｉ［ｉｌｌ！ｊンカー（これは１合度の容易な分散を可能にするので）との架橋を実施するのが有利である。しかしながら、多価のυツカーも同様に好適である。リンカ−としては、水溶液中で特異的に結合しうるパートナ−の官能基と共有結合の形成下に反応することのできる反応性基を有するような化合物を使用することができる。当業者には、このために好適な多数の２官能性又は多官能性のリンカ−は公知である。不発明の範囲で好適なホモ−又はヘテＯ−２官能性及び３官能性のりン刀− の典型的な例を次の第１表に挙げる。

第　１　表５ＰＤＰ　Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ビリジルジテ：ｒ）−プロピオネートＥＡＤＢ　エチル４−アジＶフェニルー１，４−ジチオプチルイミデート・ＥＣＩＦＮＰＡ　４−　フルオロ−３−二トロンエニルアジドＲ８ＡＢ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエートＭＡＢエ　メチル−４−アジドベンゾイミデート・ＥＣＩＭＢＳ　ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル１ＪＨ８−ＡＳＡ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジｒサリチル酸ＭＢＳ　マレイミダヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＤＮＰ−ＤＴＰ　ｐ−二）！１７フエニルー２−ジアゾー３゜３．６−ドリフルオロプロビオネート８ＡＤＰ　Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフエニル）−１，３’−ジチオプロピオネート５ＡＮＤ　スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−０−二トロベンズアミド）− エチル−１，３′−ジチオプロピオネート５ＡＮＰＡＥ　Ｎ−スクシンイミジル−６（４′−アジド−２′−二トロフェニルーアミノ）−ヘキサノエート８ＡＳＤ　スルホスクシンイミジル−２−Ｃｐ−アジドブリチルアミド）エチル −１゜６′−ジテオプロピオネートＳ工ＡＢ　Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル〕アミノベンゾエートＳＭＣＣスクシンイミジル−４−（ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１ −カルざキシレートＳＭＰＢ　スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートＤＳＳ　ジスクシンイミジルスベラートＤＭＳ　ジメチルスペルイミダートＳＡＭＢＡ　Ｓ’−７セチルーメルカプトコハク酸ア架橋の実施のために、パートナ−Ｐ２の溶液に、厘接架９＃をする条件下に、リンカ−分子を加えることができる。この場合、架橋の程度は、添加リンカ−の童により制御される。

もう１つの有利な実施形によれば、結合パートナ−Ｐ２を、Ｐｌ及び測定すべき［Ｋ関して不活性である結合しうる好適な取分と架橋させる。このためには、例えは前記のような可溶性蛋白質殊に牛ｍ渭アルブミン又はヒトＪｆｎ清アルブミンが好適である。

不均一架橋は、例えば、「不活性成分」として使用される蛋白質材料も特異的に結合しうるパートナ−Ｐ２も活性化された結合しうる基を有し、引続き反応させることにより行なうことができる。こうして、充分に多数の結合しうるパートナ −Ｆ２ｋＮする架橋されたポリマーが得られる。この場合、もちろん、蛋白質へのパートナ−Ｐ２の結合は、これにより、パートナ−Ｐｌとの特異的結合性も悪影響されず、測定子べき錯体に対する特異的結合口重も連断されないように行なうべきである。

本発明の方法のもう１つの有利な実施形では、結合パートナ−Ｐ２を、レセプターに対する特異的結合位置を有する他の成分と架橋させる。この実施形は、Ｐ２がＰｌとの結合のための１個の特異的結合位置のみを有する場合に有利に１１ｅ用される。次いで、他の成分は、結合すべきレセプターに対する結合位ｔを提供する。

他成分としては、特異的結合性ｗＬを有する物質、殊に先に定義されたような特異的結合対のパートナ−が好適である。

不溶性担体材料をポリマー■及び」で被検するためには、種々の変法がある。１笑施形では、不溶性担体材料をまずポリマー１で核種し、この際、担体材料をポリマー１に含有する浴数と共にインキュベートする。

ポリマーＩが結合したら、引続きポリマーＩｌを含有する溶液を加え、この際、ＰｌとＰ２との特異的結合により、双方のポリマーが架橋する。

本発明の方法の他の１笑施形では、不溶の担体材料をポリマーＩ及びポリマー１及び付加的ＶｃＰユとＰ２の結合を阻止する阻害物質を含有する浴液と共にインキュベートする。可逆反応をし、簡単な除云又は化学的変更によりその内杏作用を消失する阻害物質を使用する。この阻害物質の存在でパートナ−Ｐｌ及びＰ２はまったく均一に公比され、非常にゆつ（り開始する粘合に基づき、担体材料とそのＳ度所望の結合活性物質（これは大夙僕バッチ中でも先金に一様かつ再現可能な結果をもたらす）での完全に一様な被＆を得ることができる。この実施形は、結合対ＰニーＰ２として、抗原もしくはハプテン−抗体又はビオチン−ストレプトアビジンもしくはアビジンを使用する際に好適である。

Ｐｌ及びＰ２の結合の阻害物質として、本発明のこの実施形の範囲では、色素吸漕５梢製時に脱着剤として使用されうるような物質を使用するのが有利である。

このために、酸、塩基又は例えばストラフチャ・アンド・スタビリテイ・オブ・ノ々イオロジカル中マクロモレキＭａｃｒｏｍＯ１ｅｃｕｌｅ、　ｉ　９６９．　Ｍａｒｃｒｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、工ｎｃ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　４２７負）に記載のようなホ７マイスター系のカオトロープイオン（Ｌｙｏｔｒｏｐｅ　Ｒｅ１ｈｅ　）　、並びに特定の有機化合物又は溶剤例えばアセトニトリル、尿巣又はグリセリンを使用するのが特に有利である。

好適な酸とし℃は、揮発性又は不揮発注の酸がこれに該当する。弾発性酸は、その阻害作用金除くために、例えば、加温、真壁等により容易に除去される。不揮発性の酸の場合には、同様な効果が、不揮発−の酸で分層される弾発性酸の塩の使用により、弾発性酸の遊離下に又は再楓衡化により得ることができる。弾発性酸としての有利な例は、プロピオン酸及び塩販である。

Ｐｌ＆に、弾発性及び不迦発狂塩基例えばアンモニア及びｔ−ホスフェートを使用することができる。更に、阻害物質として、可逆的に蛋白質にもＸ構造にも影響することができ、例えば５ｔｒｕｃｔｕｒｓ　ａｎｄ　５ｏｌｉｂｉ：１ｉｔｙｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅａ　ｉ　９６７　、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、工ｎｃ、　ｌＪｅｗ　Ｙｏｒｋ　２１３〜２９０頁中の、Ｔ、　Ｆ。

Ｂｒａｎｄｔｓ、Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉａｌ　Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ　Ｗａｔｅｒに記載の有機化合物が好適である。特に、グリセリン及び尿素ｔ−使用するのが有利である。阻害物質としては、カオトロープイオン例えばチオシアネート及びヨーダイＶがこれに該当する。同様にフルオリド、プロミド、ベルクロレート、グアニジン及びスルフェートが好適である。

結合阻止を止めるためのその除去は、例えば有機溶剤又は有＠溶剤の混合物又は有様溶剤と水との混合勧告えば水／アルコール混合物例えば水／アルコール混合物を用いて、場合によりイソホロン及び類似物を添加して抽出することにより行なうことができる。この場合、一般に、所望の効果を得るために、イオン濃度を変えれば充分であるが、阻害物Ｔｉを完全に除去することもできる。例えば阻害性金Ｉｌｌ塩例えばＭｇＣ１Ｈの除去のために、錯形成剤例えばＥＤＴＡの添加も、使用される。

ポリマー■及び」に対して結合対としてビオチン及びストレプトアビジンもしくはアビジンを使用すると、阻害物質としてｍを使用するのが特に有利である。この双方のパートナ−の強力な結合は、４以下の＠ｊｊｉｔまでの−の低下により、高めることができる。このために、揮発性１ｉｋ使用するのが有利であり、この結合作用は、弾発性酸の遊離時に得られる。

双方の特異的に結合するパートナ−Ｐｌ及びＰ２及び場合によっては他の成分は、Ｐ２及び場合によっては他の成分がレセプターの結合のためには、その結合パートナ−に比べて洒刺に存在するような割合で使用するのが有利である。こうして、固定すべき錯体に対する多数の結合位置が提供される。使用される特異的結合対の１パートナ−が遊離の形で分析すべき試料溶液中で既に本来のまま存在する場合は、これにより障害を排除するために、高い結合能を提供することが特に有利である。従って、例えは、特異的に結合する対としてビオチン及びストレプトアビジンもしくはアビジンを使用する場合には、ビオチンに対する非常に高い結合能を提供することが特に有利である。ビオチンは、体液中に存在し、殊に例えばビオチンの摂取後に血清値は着るしく高めと、ビオチン−接合体を使用する測定の分析値が誤まることがある。この場合には、ビオチンに対する非常に高い結合能を有する固相マトリックスを製造することが特に有利である。このことは、本発明の方法により達成でき、この際、ビオチンに対する２　００　Ｑ９／１１１以上の結合能を与えることができる。

本発明により衾遺された固相マトリックスを、イムノアッセイの原理により使用する。これは、サンドイッチ−テストの変法にも、コンペテイテイプテストの変法にも好適である。この測定のためには、多くの変法がある。この場合、例えば、測定すべき物質を含有する試料を、標識を有するレセプター及び少なくとももう１糧のレセプター（これに、特異的に結合するパートナ−Ｐ２のポリマーと特異的に結合しうる物質が結合している）と反応させることができる。従って、測定すべき複鵠特に、結合したレセプターの１つは、このポリマーと結合しうる１１−の位ｍｔ有する。この結合位置は、Ｐｌのそれと同じであるか又はこれとは異なるものであってよめ。この反応は、既に、本発明によるマトリックスで核種された小管又は相応して核種されたマイクロ滴定プレート中で行なうことができる。同様に、仇えはボールの形の固相マトリックスをインキュベーションの後にはじめて添加することもできる。固相マトリックスとの接触の際に、測定すべき物質、標誠付きレセプター及び特異的に結合する物質と接合されたレセプターからｃ側惟は、Ｐｌ及び蛋白５ｋを介して担体に結合して藝るポリマーに結合する。

このようにして、鉤定丁べき船体を固定することかでり、これはｆ１２００　Ｄ　００より大きい分子量ｔ−Ｎし、特異的な結合対のパートナ−Ｐｌ多数を有するポリマー■が結合して因る不溶性担体材料よりなり、これは、特異的結合対の佃パートナーＰ２多数よりなるポリマーＵと架橋しており、この際、このポリマー１は、Ｐ１に対する結合位置も免役学的に検出すべきｍに対する結合位置も有する。

イムノアッセイの実施のために、蛋白質が２０００００〜２００００００００分子量を有する可溶性蛋白質及び多数のビオチン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子より成る接合体である固相マトリックスが特に好適である。更に、そのポリマー■がビオチン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子よりなる固相マトリックスを使用するのが有利である。このポリマーｉは、有利に、ビオチン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子及び疎水性化された蛋白質より形成される。

本発明によれば、すべての公知のイムノアッセイに使用することのできるユニバーサルマトリックス及びその製法が提供される。

この固相マトリックスは、使用レセプターの種廟に無関係である。更に、これは、高す安定性により優れている。

〔実施例〕

次に添付図面及び実施例につき本発明を説明する。

第１図は、本発明による固相マトリックスの２徳の実施形を示す図である。

ａ〕は、本発明の固相マトリックスの１笑尾形を示している。固相１に、蛋白質３と特異的結合対Ｐ１の１パートナ−５との接合体が吸着されて−る。５に、特異的結合対の他パートナ−Ｐ２よりなるポリマー７が結合してｂる。このポリマーは均−架橋された同一分子よりなる。このポリマーに、イムノアッセイの実施の際に抗体９が結合し、これはＰｌと接合している。

ｂ）は、本発明の面相マトリックスのもう１つの実施形全示している。ここでは、固相１に蛋白質３及び特異的結合対Ｐｌの１パートナ−５からなる接合体が吸着されている。５にはポリマー７が結合している。

このポリマーは、特異的結合対Ｐ２の他成分蓬びにレセプターＲよりなる。このポリマーに、イムノアッセイの実施の際に、レセプターＲと結合しうる物質と接合している抗体９が結合する。

第２図は糧々の被覆された小管に関する較正曲憑を示した図である。この曲線は次の小管を用いて得た：×：　サーモ−Ｒ８Ａ−ビオチン及び均一架橋ストレプトアビジンよりなる２成分マトリックスでｗＬ機されたル２ン小管 △：　サーモ−ＲＳム−ビオチン及びサーモ−Ｒ８Ａ−ストレプトアビジンよりなる２成分マトリックスでｗｔ＆されたルラ／小管＋：　γ照射され、ＲＳム−ストレプトアビジンで被覆されたポリスチロール小管 ◇：　γ照射され、均一架橋されたストレプトアビジンで被覆されたポリスチロール管口：　均一架橋されたストレプトアビジンで被覆されたルラン管第３図は、本発明による固相マトリックスの１実施形を示す図である。

この実施形において、担体材料１に、特異的結合対のパートナ−多数を有する第１底分３が吸着結合してｂる。特異的結合系の他成分多数を五する第２成分５は、双方成分の特異的結合７を介して第１成分３に結合しており、この際、担体材料１上に、架橋されたかなりの大きさのポリマーが生じている。

例　１１ａ）サーモ−牛血清アルブミン−ビオチンの製造牛血清アルブミン（ＲＳム）１．９ｔ−５０ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７，８）５０１ｕ中に溶かす。攪拌下に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＤ−ビオチニル−γ−７ミノカプロン酸−に一ヒドロキシスクシンイミげエステル（Ｎ１１Ｂ　−Ｘ−ビオチン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ）　（２０”９／”　）　１．９　ｍｌｔ滴加−ｔ−る、　引＆Ｙｔ、２５℃で３時間インキュベートする。この反応の後に、４℃で、５０倍量の２０！ｌｌＬＭ燐酸カリウム（ｐ）１７．０　）に対して１晩透析させる。保留液に同量の２　Ｑ　ｍＭ燐酸カリウム／　２００　ｍＭ塩化ナトリウムＣｐＨ７，０）を加え、７０℃に加熱し、注意深い攪拌下にこの温度で４時間インキュベートする。引続き、この溶液を室温まで冷却し、濾過する。濾液を４℃で、５０倍量の引続き凍結乾燥させる。得られる生成物を固相に吸着させ、本発明のマトリックス中に可溶性蛋白質に結合したパートナ −Ｐｌを製出させる。

１ｂ）　マレイミド−へキサメイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでのストレプトアビジンの活性化ストレプトアビジン３０Ｍ９を３・Ｑ　ｍＭ燐酸カリウム／ｉ　Ｑ［］ｍ１ｌｌ塩化ナトリウム（ｐ）１７．１）３１Ｌｔ中に溶かし、２５℃の温度にする。攪拌下にＤＭＳＯ中のマレイミド−ヘキサメイル−Ｎ−とにロキシスクシンイミＰエステル（ＭＥＳ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）（１０〜／ゴ）０．１５１ｕを滴加する。２５℃で１時間の反応時間の後に、この溶液を水浴中で冷却する。引続き、４℃で、５ＱｍＭ％酸カリウム／１００ｍＭ塩化ナトリウム（ＰＩ−１５，０）１１！に対して、２回透析させる。

ｉｃ）　Ｓ−７セチルメルカゾトコハク酸アンヒドリドでのストレプトアビジンの活性化ストレプトアビジン３０〜を１００　ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７，８）３℃千に溶かし、２５℃に加熱する。攪拌下にＤＭＳＯＣＰのＳ−７セチルメルカプトコハク散アンヒドリド（ＳＡＭＢＡ　）　（Ｉ　Ｄｗ／ｍ）　０．１７５１ｎｔＴｈ渦加する。２５℃で３時間の反応時間の後に、４℃で、５０ｍＭｍ酸カリウム７２　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ）１６．５　）　１１に対して２回透析させる。

１ａ）　ストレプトアビジンの均一架橋活性化ＳＡＭＢＡ−ストレプトアビジンの溶液（１０〜／１）（例１Ｃで製造）３ｍを２５℃まで加熱し、１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ６，５）５０μｌを加える。２５℃で３０分後にｓｏｍＭ＝散カリウム／１０　Ｑ　ｍｎ塩化ナトリウム７１ｍＭ　ＩＣＤＴム（ｐＨ６，５）１５１の添加により、稀釈する。ストレプトアビジンの均−架橋を、活性化ＭＥ８−ストレプトアビジン（１０■／ＭＬｔ）（例１ｂで製造）３ｉｄの添加により開始させる。注意深い攪拌下における２５℃で２時間の反応時間の後に、１００　ｍＭシスティン／　ＥＣ１０，２ｍｌの添加により、この反応を終結させる。２５℃で３０分のインキュベーション時間の後に、１Ｍ燐酸水素二カリウムの添加により、溶液の一値を７．５に調節する。５［］ＱｍＭヨードアセタミド０．２　ｍの添加の後に、２５℃で更に１時間インキュベートする。引続き、４℃ で、ｓｏｍｎ燐酸カリウム／　１００　ｍＭ塩化ナトリウム（−７，５）３７に対して２回透析する。接合体を透析の後に限外ａ過セル甲での凝紬する。

この均−架橋されたストレプトアビジンは、直接又は’ｙ”　ｋ　２ｍ！４　（５ｕｐｅｒＯ１ｉ　（５ｐｒｅｐ、　ｇｒ＆６＠、　ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｐｓａｌａ　）及び改めての！鰯の後に、固相への吸着のために使用することができる。本発明によるマトリックス中で、ポリマー川が生じる。

例　２ポリマーｌとして不発明のマトリックス中で使用される不均一架橋されたストレプトアビジンを製造する。

ａ）活性化ＳＡＭＢＡ−サーモーＲ８ムの製造例１２Ｌ）に記載のようなサーモ −Ｒ８Ａを製造を行なうが、ここではビオチニル化を省略する。

サーモ−Ｒ８Ａ　６８　Ｗを０．１Ｍ燐酸カリウム（−７，８）２ゴ中に溶かし、ＳＡＭＢＡ　（ＤＳＭＯ中１０１１１＆／１１７）［１，３８ｍを徐々に加える。２５℃で３．５時間の反応時間の後に、４℃で、５　Ｑ　ｍＭ燐酸カリウム（−６，５）１１に対して２回透析させる。

ｂ）　サーモ−Ｒ８Ａ−ストレプトアビジン−接合体の製造サーモ−Ｒ８Ａでのストレプトアビジンの不均一架橋を、例１　ａ）に記載の均一架橋と同様に行なう。この場合、活性化ＭＥＳ−ストレプトアビジン（例１ｂにより製造）６０＃’ｅ活性化ＳＡＭＢムーサーモーＲ８Ａ（ｓ　、　ｏ　、　）６８１Ｒ９と反応させる。反応生成物をデル濾過（５ｕｐｒｏｓ＋ｓ　６ｐｒｏｐ、　ｇｒａｄｅ　）により精製し、限外７ａ過セル中で濃縮する。得られる生成物を、引続き凍結乾燥させる。この生成物は、Ｐ２として使用することがルランー（ポリスチロール−７クリロニトリルーコポリマーンもしくはγ−照射ポリスチロールー／」１管の被覆例１及び例２により得られた生成物を５０鮨燐酸カリウム（ｐＨ７，４）中に溶かして１０μｍ／／Ｉｌｌの濃度にする。次いで、被覆すべき各小管中に例１ａ）で製造したサー七−ＲＳムーピオチンー接合体の溶液に１．５Ｎを光損し、まず３〜５時間負荷させる。引続き完全吸収の後に、この小管内に、例１による均一架橋ストレプトアビジンもしくは例２による不均一架橋ストレプトアビジンの溶液１．５１を加え、室温で１晩インキユベートする。その後、この小管を完全に空にし、相応するテストに使用する。

比較のために、小管を例１もしくは例２で架橋されたストレプトアビジンのみで、又はストレプトアビジンと例７により得られるサーモ−ＲＳムとからの接合体で、ビオチン化蛋白質での処ａｔ行なうことなしに、被覆する。

例　４例３で製造した小管の結合能（Ｂｉｎｃｌｅｋａｐａｚｉｔｉｉｔ　）を測定する。

種々異なるストレプトアビジンポリマーにより本発明で被検された／Ｊ−、管並びに比較小管を、オランダガラシカラノビオテニル化されたペルオキシダーゼの溶液（ビオチン−ＰＯＤ　、シグマ）（５０！ＩｃＬＭＩ＆酸カリウム１０．５％午Ｉｔｎｎｔアルブミン（ｐＨ７，４）中の１０　ｍＵ／ｄ）１肩ｔと共に室温で４５分間インキュベートする。次いでこの小管を仝にし、再蒸溜水で２回洗浄する。引続チアゾリン−６−スルホン酸のアンモニウムｕ）’１いて、室温で３０分間、検出反応を行なう。この測定は、４０５　ｎｍで光度測定法で行なう、この結合能は、置換曲線（ＶｅｒｄｒＭｎｇｕｎｇｅｋｕｒｖｅ　）を介して測定する。

このために、ビオチン−ＰＯＤ−溶液に、増加性濃度（０〜１５もしくは０〜２０　Ｏｎｉ／／ＩＬｔ　）のＤ−ビオチン（シグマ）を添加する。次いで、この結合能は個々の値のプロットにより得られる一曲線から、半最大吸光度（ｈａｌｂｚａｘｉｍａｌｅｎ　Ｅｘｔｉｎｋｔｉｏｎ　）から算出される。

例　５蛋白質及びビオチン及びそれぞれストレプトアビジン−ポリマーで被覆されたマトリックスの表面付着性の安定性を、板積された小管と界面活性剤含有剥離緩衝液（ａｂｘｉ：１ｓｅｐｕｆｒｅｒ　；　５０　ｍＭ燐酸カリウムとＦＪ（７，０）中のＴｗｅａｎ　２０　０．２％）１．５１Ｍとのインキュベーションにより試験する。室温で１時間のインキュベーション時間の後に、剥離された接合体量を測定するために、この／Ｊ％管からの各１Ｒ１ｆサーモーＲ８Ａ−ピオチン（例１ａで製造）で被覆された小管中に移す。平行して、較正６祿の調査のために、ブーモーＲ８Ａ−ビオチンー小管に、増加性凍度のストレプトアビジンを含有する剥Ｔ＠緩衝液１ｄを加える。室温で１時間のインキュベーション時間の後に、この小管を完全に空にし、５０ｍＭｍ＠カリクム（ｐ）１７．０　）甲のビオチン−ＰＯＤ　−溶＆（１００ｍＵ／ｍ）　１ｍを加える。室温で更に６０分間インキュベーションの後に、小管を空にし、引続き再蒸溜水で３回洗浄する。

結合したビオチン−ＰＯＤの量は、管壁かも剥離される接合体量に比例し、ムＢＴＳとの基質反応（室温で１時間インキュベーション）により、光度測定法により測定される。較正曲線を用いて、剥離された接合体を定量し、剥離されたビオチン−結合能と称する。

第２表に、種々の被検されたもしくはγ−照射ポリスチロールー小管に関して、例４で測定したビオチン−結合能と例５で測定された接合体の脱着の関係を示す。直接、固相上に結合した均一架橋された特異的結合パートナ−（比較）（例えばポリ−ストレプトアビジン）のビオチン−結合能（及びこれに伴なうビオチン化された抗体に対する結合能）は、直接、面相上に結合した不均一架橋された特異的結合対（比較）（例えばＲ８Ａ−ストレプトアビジン、ｆＩｌｌｅと同様に、活性化ＳＡＭＢＡ　−Ｒ８Ａ及び活性化ＭＥＳ−ストレプトアビジンから久造〕のそれよりも明らかに大きい。しかしながら、剥離データが示して因るように、予め、ｗｒＪ呆橋された蛋白質（これは、特異的結合対ｐＨΩちビオチンを共役結合含有してめる〕でのｗＬａをその場で反応させる場合に、架橋された特異的結合対Ｐ２は、高い結合能でのみ、かつ所望の堅固な壁付着性でのみ厖与することができる。界面活性剤の使用下に笑九される機能試験の感度に及ぼす種々の接合体の結合能及び固相−剥離の影響を例６に詳述する。

８２表Ｊ−を材料　γ−ＰＳ　γ−ＰＳ　ルラン　ルラン　ルラン％Ｂｉ−Ｂｉｋａ− 損失　０．３　０．５　１５．５　０．０３　０．０１略字：　Ｒ８Ａ−８Ａ− 牛ｍ慣アルブミン−ストレプトアビジン−法合体、ｐｓＡ−均一呆機されたストレプトアビジンポリＴ−ＲＢＡ−ビオチンもしくは一８Ａ躊サーモ−ＲＢム−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン γ−ＰＳ−γ−照射ポリスチロール小管ビオチン−ＢｉｋａもしくはＢｉ−Ｂｉｋ＆＝ビオチン−結合能例　６例３で得られた小管をＴＳＥ−テストに使用する。

試薬：試薬１（抗体−インキュベーション溶？り：ｇ１ｉ酸塩緩衝剤（ｐＪ（６，９）　１６ｍモル／１ＴＳＨに対するビオチニル化されたモノクローナル抗体（ＢＣＡＣＣ８７１２２２０１）　（ビオチニル化はＪＡＣ８１００（１９７８）　、３５８只５９０にょう、ビオチンを用い、Ｎ− ヒｒロキシスクシンイミドービオテンとの比１０：１での反応により行なった）１．５μ９／μ 試薬２（抗体−ＰＯＤ−接合体溶液〕：燐酸塩緩衝剤（ｐＨ６，９）　３６ｍモル／１ＰＯＤとＴＳＥに対するモノクローナル抗体からの接合体（ＥＣＡＣＣ８７１２２２０２）　２．０１１７　／ｍ／試桑試薬基質−クロモデンー溶液）：燐酸塩−クエン酸塩−緩衝剤（ｐＨ４，４）　１００ｍモル／Ｅ過ホウ素酸ナトリウム　３．２ｍモル／ｊＡＢＴＳ　（２ｙ　２’−アジド−ジー〔３−ニチルーペンズテアゾリソースルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩）　１．９ｍモル／ｌ固相として例３に記載のように種々のマトリックスで被種されている小管を使用する。この小管内に、試料（ＴＳヨー標＊）ｏ、２ｍｔ、試薬１０．９ゴ及び試薬２０．１ｍｌを加え、室温で２時間インキュベートする。引続きこの小管を完全に空にし、水で３回洗浄する。次すで、この管壁に結合したＰＯＤ−活性を、試薬３１−の添加及び１時間のインキュベーションの後に、４０５　ｎｍでの吸光度測定により測定する。呈色反応の強さは、標準のＴＳｎ−濃度に比例する。

結果を第２図に示す。

真２図に示されているように、界面活性剤含有インキュベーション緩衝剤の使用の際に、較正曲線（従ってテストの感度）の頌斜は、１成分マトリックスで複機された小管よりは、本発明による２成分−マトリックスで被検されている小管の方で明らかに増大している。更に、最大感度は、灰分Ｂとして均−呆伽さｎた結合パートナ−（ここではストレプトアビジンポリマーンを有する２成分−マトリックスの使用により達成固相上にブーモーＲＢムが吸滑され、これにパートナ− Ｐｌとしてのストレプトアビジンが粘合しているマトリマウスを製造する。次いで、このストレプトアビジンに、均一架橋され、ビオチニル化されたプロティンＡをパートナ−Ｐ２として結合させる。

ａ）サーモ−Ｒ３Ａ−ストレプトアビジンの製造この製造は、ｆＩ＋２に記載と同様に行なう。

ｂ）均一架橋され、ビオチン化されたプロティンＡの製造プロティｙ　Ａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）　５０ｘｙｔ−３０ｒ、Ｍ燐酸カリウム（ＦＪ（７，１）５−中に溶かし、１０モル過剰のＮＥＳ　−Ｘ〜ビオチン（ＤＭＳＯ中に１０■／１まで溶かす）を加える。２５℃で１時間のインキュベーション時間の後に、反応混合物を、４℃で５０ｍＭ燐＆カ燐酸カリウム８−０）１０／に対して１晩透析させる。保留准を引続き限外濾過セル中でビオチン−プロティンＡ　５０Ｍ９／”の濃度まで製動する。

ビオチンープロテインムの＃溶液を２５℃まで加温する。引続ざ、注！深い潰拝下にジスクシンイミジルスベラートー溶液（ＤＳＳ、　Ｐａ、　Ｐｉｅｒｃｅ　；ジオキサン中７１に９／１１７）５０μｊ′ｔ−添加する。架橋を、ＴＳＫ　３０００デル７Ｉ１１通カラム（ＬＫＢ　）でのＨＰＩ、Ｃにより制御する。

１時間間隔で、ＤＳＢ−溶液各５０μ！！を、プロティンＡそツマ−のざ−クがその当初値の１０％より低くなるまで加える。その後％ＩＭメタノールアミン（ｐ）１８．０　）５０μｊの添加により、更なる架橋を停止させる。

４℃で１＄ｌインキユベートし、引吐き２２ＩＬＭ　燐酸カリウム（ｐＨ７，５）２１！に対して２回透析させる。このプロティンＡ七ツマ−の分離は、５ｕｐｅｒ０８８１２　ｐｒｅｐ。

ｇｒａｄｓでのデル濾過により行なう。均一架橋された生成物を集め、限外濾過セル中で濃縮させる。次いで、この双方の成分を用いて小管を偽３に依り被債する。

例　８Ｐｌとしてのサーモ−Ｒ８ＡとマウスのＰｃγ−７２グメントとの接合体及びＰ２としての年の均一架橋ポリクローナル抗−マウス−Ｆｃγ−抗体よりなるマトリックスを製造する。

ａ）　サーモ−Ｒ８Ａ−マウス−Ｆｃγ−フラグメントの製造マウスの免疫グロブリンＧのパパイン分解及び常法でのＤｘ−５２−セルロースを用するイ万ン交洪−クロマトグラフイによるＦａｂ−フラグメントの分離によりＦｃγ−７ラグメ／トを製造する。

活性化ＭＨ８〜ストレプトアビジンの製造（例１ｂ）と同様にして、活性化ＭＥＳ　−Ｆｃγ−７ラグメントを製造する。例２の記載と阪様にして、活性化ＳＡＭＢＡ−サーモ−Ｒ８Ａを調製する。活性化ＳＡＭＢＡ−ブーモーＲｓムロ８■ と活性ＭＥ８−　Ｐｃγ−７ラグメント１０■との接合を不均一架橋されたストレプトアビジンの製造〔偽２〕と同様な方法で行なう。反応生成物を５ｕｐｒｏｓｓ　６ｐｒｏｐでのグル濾鳩によりａ製し、限外濾過セル中で凝縮し、引続き凍結乾決させる。

ｂ）均一架橋された抗−マウス？Ｃγ−抗体の製造抗−マウスーＰａγ−抗体５０■を５ＱｍＭ燐酸カリウム（ｐ）１８．０）１−中に溶かし、２５℃まで加温する。

均一架橋されたプロティンＡ（例２′ｂ〕の製造と同様にして、１時間の間隔で、それぞれ、ＤＤＳ−溶液（ジオキサン中７　Ｗ／ｒＬｔ）　５０　μｌ　ｋ、ＴＳＫ　３０００デル瀘過カラムでのＥＰＬＣ−分析において七ノマーエｇＧｓのピークがその当初値の１０％に低下するまで、添加する。引続き、例７　ｂ）に記載のように、エタノールアミンで停止させ、透析させる。この工ｇσモノマーｔＭ７ｂ）に記載と同様にデルｆＩｔ過により分離する。場合により、この架偏された工ｇＧ　’ｆｃ限外濾過により６８する。この均一架橋生成物は、抗体を魁１及びＳＡＭＢＡ（例１）及び１Ｃと同様に製造）で活性化し、引続き架橋（例１ｄと同様に）することにより、製造することができる。

このａ）及びｂ）により得られた生成物で例３による小管を孜稜する。

例　９Ｐｌとしての７−モーＲＳム−ジギトキシデニンー接合体及びア２としての羊からの均−架橋された抗−ジゴキシン−抗体よりなるマトリックスヲ製造する。

ａ）サーモ−Ｒ８Ａ−ジゴキシデニ／の製造例ｉ　ａ）の記載と同様にしてサーモ〜Ｒ８Ａ　七製造する。サーモ−Ｒ６Ａ　（５Ｆ３〜を５３ｍＭ燐版カリウム／１００鮨塩化ナトリウム（＋、）−１８，５）　６．８縦中に溶かし、２５℃ に加温する。遺拌下に、ジオキサン０．６８ｍ中のジゴキシゲニンー３−スクシンイミジルーヒｒロキシスクシンイミドエステル２．８６７ａ９を添加する。２５℃で３時間の反応時間の後に、２ｍＭｍ酸カリウム（Ｐｉ１７．２　）１１！に対して２回透析させる。引続き、反応生成Ｗを限外ａ過セル中で＃紀する。

ｂ）均−架橋仇一ジゴキシンー抗体の製造均−架橋抗−マウスーＰｃ−抗体の製造（ｆｌｌ　８　ｂ　）に関すると同様な方法で均−架ａ抗−ジゴキシンー抗体の製造を行なう。

ぢ１続き、小管に、脂次にこの双方の生成物の溶液を複機させる。

イムノアッセイで、ジゴキシｒニンー律臓抗体’ｋｌｊ！用する。このように標漱された抗体の製造は、例９ａと芦］様に、ジゴキシデニンー３−スクシンイミジルーヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて行なう。

例１０固相を同時にポリマーＩ及び■と共にインキュベートする方法でマトリックスを製造する。

酢酸５ｍモル／’　ｌ　ｔＰのポリ−ストレプトアビジン（例１ｄで製造）１０ μ＆／Ｉｌｌ及びサーモ−ＲＢム−ビオｆ７（Ｍｌａで製造）０．７μｙ／謔からなる溶液をポリスチロール−管中で２０時間インキュベートする。

複機溶液の除去の後に、１ｏＴｎモル／ｊ燐飯カリクムー緩衝液ｐ）１７．２　／　３１／　Ｒ８Ａで後被珈（３Ｃ１分）し、吸引の後に乾燥させる。

例１１ａ）　アミノ−デキストラン−５００のビオチニル化アミノデキストラン（分子量５ｏｏｏｏｏ、５月２−基２３０／デキストラン１モル）１００％を１００ｍｍ燐酸カリウム緩衝！（ｐ）１８．５）５ゴ中に溶かす。これにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　ｌ　Ｉｎｔ中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ｏｓｕ）１０１１１９からなる溶液９０μｌを徐々に撹拌下に添加する。

室温で２時間佐に、２００ｍモル／ｌリジンーＥＣＭ、（ｐＨ８，５）５０μｌで反応を停止させる。

引続き、このバッチｔ５０ｍモル／ｌ震散カリウム緩衝液（ｐｉ−１７，２）　５００倍量に対して透析させ、４０ｍモル／ｌ燐酸刀リウす綾衝准（南７．０）で１０μｙ／彪の良度まで稀釈する。

ｂ）抗−デキストラン−ビオチンでのポリスチロール−管の板積その都度、この複機溶液１．５鯰をポリスチロール小管中に充填し、室温で６時間インキュベートする。

これに引続いて、吸引除去し、均−又は不均−架橋されたポリ−ストレプトアビジン（例１又は２）ｉ、ｓｍｔ加え、１晩インキユベートする。七の後、／Ｊ）管を完全に壁にし、相応するテストに使用する。

例１２ブーモーＲ８Ａ−ストレプトアビジン−管（ＥＰ−Ａ第０２６９０９２により製造）をサーモ−ＲＳム−ビオチン−溶液（例１ａで製造）１０μ９／ゴと共に５０ｍモル／ｌ燐散カリウムＣｐｉ−１７，２）中で２０時間インキュベートする。

溶液の兜全吸引除云の後に、ポリ−ストレプトアビジン−溶液（例１又は２による）１．５１ｉ１１７を添加し、室温で１晩インキユベートする。その後、この小ｔを完全に空にし、相応するテストに使用する。

飢１３ａ）ポリ（Ｌｙｓ　／Ｐｈｅ　）のビオチニル化ボ’Ｊ　（Ｌｙθ／Ｐｈｅ　）　ＨＢｒ　（リジンとフェニルアラニンとからのコポリマーの臭化水素酸塩）（Ｌ−Ｌｙａ／Ｌ　Ｐｈｅ　１：　１　、分子量４６ｋＤ、Ｈ造者−８／ｇｍａ　）１００■をＥＰ０２５厄中に溶かす。

これにＤＭＳＯ１ｒｎｔ中のビオチン−０８ｕ　５■からの浴数１８０μｔを加え、この際、−値を自動滴定装置を用いて８．０に一定に保佇する。

室温で２時間の後に、２０Ｄｍモル／ｌリジンーＲＣユ５０μｌを用いて反応を停止させる。

引続き、バッチを５００倍童０再蒸留水に対して透析させ、１０μ＆／ＦＩＬＬの１＃度筐で殉釈する。

ｂ）　ポリ（Ｐｈｅ　／　Ｌｙｓ　）ビオチンでのポリスチロール管の夜伽その都度、被伽溶液１．５１をγ−照射したメリスチロールー小管中に充填し、室温で６時間インキュベートする。それに引続き吸引除去し、ポリ−スチロールアビジン溶液（缶１又は２で製造）１．５ｍを加え、室温で１晩インキユベートする。その後、この小管を完全に空にし、相応するテストに使用する。

例１４ポリマー１としてのブーモーＲＳムービオテンー接合体及びポリマー■としてのストレプトアビジンと羊からの抗−ジゴキシン−抗体とからの不均一架橋接合体よりなるマトリックス′（ｉ−製造する。

ａ）サーモ−ＲＳム−ビオチンの製造製造は、例１　ａ）に記載のように行なう。このサーモ−Ｒ８Ａ−ビオチン−接合体は、本発明によるマトリックス中でのポリマー１である。

ｂ）ストレプトアビジンと羊からの抗−ジゴキシン−抗体とからのコポリマーの製造ストレプトアビジン３０１１１９を例ｉ　ｃ）の記載のように、Ｓ−７セチルメルカプトコノ１り酸アンヒドリド（ＳＡＭＡ　）で活性化する。

ｌＷｉ時に仇−ジゴキシン−抗体３０■をマレイミド−へキナノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＥＳ　）を用いて、例１１＋）におけるストレプトアビジンのＭＥＳ−活性化に関する記載とＰ１様な方法で活性化する。この反応のために、抗体に対して５倍モル過剰量のＭＥＳ　（ＤＭＳＯ中に溶解）を使用する。

活性化されたＳＡＭＡ−ストレプトアビジンと活性化されたＭＥＳ−抗体との接合を、例１　ａ）のストレプトアビジンの均−架＆ＫＩ４すｂ記載と同様な方法で行な５゜こうして得られたヌトレプトアビジンー抗体−接合体は、直接又はデルーａ通及び改めての濃縮の後に、固相への吸着のために使用することができる。本発明によるマトリックス田で、これはポリマー■である。

本発明によるマトリックスの六造のために、小管を双方の生成物の溶液で、順次に又は同時に、例１に記載のように、酢酸５ｍモル／　Ｊ　Ｃ存在下に仮積する。

イムノアッセイで、ジゴキシン−抗体ｉ＝された抗体全使用する。このように標歇された抗体の製造は、例９ａと同様にジゴキシグニンー３−スクシンイミジル −ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて行なう。

ＦＩＧ、１ａＦＩＧ、１ｂ吸光度（４０５ニニ）ＦＩＧ、３手続補正書（自発）平成　１　年１０月３ｐ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．不溶性担体材料に結合した、特異的に緒合しうる物費を製造するために、約２００００より大きい分子量を有し、特異的結合対のパートナーＰ１多数を有する第１のポリマーＩを、不溶在担体材料に結合させ、特異的結合対の他のパートナーＰ２多数を有するか又はこれより成るポリマーＩＩと、Ｐ１とＰ２との特異的結合を介して架橋させ、この際、このポリマーＩＩは、Ｐ２に対する結合位置も免疫学的に検出すべき複合体に対する結合位置をも有することを特徴とする、不溶性担体材料に結合した特異的に結合しうる物質の製法。
２．ポリマーΙとして、蛋白質、ペプチド、炭水化物又は核酸ポリマー又はアミノ酸と炭水化物とからのコポリマーを使用する、請求項１記載の方法。
３．ポリマーΙとして、ポリマーＩＩよりも疎水性である蛋白質を使用する、請求項２記載の方法。
４．蛋白質として、約２０００００より大きい分子量を有し、特異的に結合する物質よりも疎水在である可溶在蛋白質及び特異的結合対のパートナーＰ１多数よりなる接合体を使用する、請求項３記載の方法。
５．接合体の製造のために、分子量２０００００〜２００００００００を有する可溶性蛋白質を使用する、請求項４記載の方法。
６．分子量１００００〜７０００００を有する蛋白質から、分子量を２０００００〜２０００００００以上に高めることにより製造した可溶性蛋白質を使用する、請求項５記載の方法。
７．蛋白質を、特異的結合対Ｐ１への結合の前又は後に、二官能性又は多官能性の化合物と、所望の分子量に達するまで、架橋させる、請求項６記載の方法。
８．二官能性化合物として、ジスクシンイミジルスペラートを使用する、請求項７記載の方法。
９．蛋白質を、接合体の形成の前文は後に、熱の使用、酸、変柱剤又はカオトロープイオンでの処理及び／又は疎氷柱化合物との化学的結合により疎水性化する、請求項５記載の方法。
１０．蛋白質として、午血清アルブミン、リパーゼ及び／又は免疫−アーグロブリンを使用する、請求項５から９までのいずれか１項記載の方法。
１１．ポリマーＩＩとして、相互に架橋されている分子Ｐ２のみより成るポリマーを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
１２．パートナーＰ２は、ホモー又はヘテロー２官能性文は多官能性のリンカーを介して相互に架橋されている、請求項１１記載の方法。
１３．ポリマーＩＩとして、特異的パートナーＰ２が旭の成分と架橋されているポリマーを使用する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
１４．Ｐ２を他の成分と架橋させて、同様に特異的結合位にを有するポリマーＩＩにする、請求項１３記載の方法。
１５．特異的パートナーＰ２を疎水性化された蛋白質と架橋させる、請求項１３記載の方法。
１６．Ｐ２は、少なくとも２個の同じ特異的な結合位置を有する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
１７．特異的な結合対として、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗体、プロテインＡ−免疫−ｒ−グロブリン又はプロテインＧ−免疫−ｒ−グロブリンを使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
１８．不溶性担体材料に、ますポリマーＩを被覆し、引続きポリマーＩＩと架橋させる、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
１９．ポリマーＩ及びポリマーＩＩ並びにＰ２へのＰ１の結合に対する阻害物質を含有する溶液を、不溶性担体材料と接触させ、担体材料へのポリマーＩ及びポリマーＩＩの結合の後に、Ｐ１とＰ２との結合を阻害物質の除去又は阻害作用の排除により開始させる、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
２０．Ｐ１及びＰ２として、結合対ビオチン／ストレプトアビジンもしくはアビジンを使用し、阻害物質として酸を使用する、請求項１９記載の方法。
２１．揮発性酸を使用し、これも担体材料の被覆の後に蒸発除去する、請求項記載の方法。
２２．Ｐ１及びＰ２として、抗原もしくはハプテン／抗体もしくはこれらのフラグメントを、かつ阻害物質として酸、塩基、リオトロープ列のカロトロープイオン又は蛋白質構造にも水構造にも影響することのできる有機化合物を使用する、請求項１９記載の方法。
２３．固相として、ルラン、ガラス、二酸化チタン、ポリスチロール、ｒ−活性化ポリスチロール、紙及び／又はポリオレフインを使用する、請求項１から２２までのいずれか１項記載の方法。
２４．固相マトリックスにおいて、これは、約２００００より大きい分子量を有し、特異的結合対のパートナーＰ１多数を有するポリマーＩを結合している不溶性担体材料より成り、このポリマーＩは、特異的結合対の他パートナーＰ２多数からのポリマーＩＩを架橋しており、この際このポリマーＩＩは、Ｐ１に対する結合位置も免疫学的に検出すべき複合体に対する結合位置をも有することを特徴とする、固相マトリックス。
２５．ポリマーＩとして、蛋白質、ペプチド、炭水化物又は核酸ポリマー又はアミノ酸と炭水化物とのコポリマーを各々特異的結合対のパートナーＰ１の多数と共に使用する、請求項２４記載の固相マトリックス。
２６．ポリマーＩは、分子量２０００００〜２０００００００を有する可溶性蛋白質と多数のビオチン−、アビジンー又はストレプトアビジン分子とからの接台体である、請求項の記載の固相マトリックス。
２７．ポリマーＩＩは、ビオチン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子より成る、請求項２４から２６までのいずれか１項記載の固相マトリックス。
２８．ポリマーＩＩは、ビオチン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子及び疎水柱化された蛋白質より成る、請求項２４から２７までのいずれか１項記載の固相マトリックス。