JPH0830705B2 - 固相マトリツクスの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、殊にイムノアツセイの原理によるヘテロゲ
ン分析法で使用するための不溶性担体材料に結合した特
異的に結合しうる物質の製法に関する。

特異的に結合しうる物質の測定のために、屡々、イム
ノアツセイの原理による方法を使用する。この際、特異
的に相互に結合しうる物質対のパートナーの１つを公知
方法で標識されているそれに対して特異的なレセプター
と反応させる。次いでこれら２物質からの接合体を、こ
の接合体に対して又はこの接合体の２成分の１方に対し
て特異的であるレセプターと反応させることができる。
この免疫学的方法に関しては、多くの変法が存在する。
この際、レセプターの１方が固相に結合して存在する場
合が有利である。このことは、結合している反応成分と
結合していない成分との分離を容易にする。次いで、特
異的に結合しうる物質の測定のために、固相に結合して
いる標識された反応成分又は溶液中に存在する標識され
た反応成分の量を測定し、測定すべき反応成分の量に公
知方法で関連させる。

免疫学的方法では、固相として通例、プラスチツク小
管又はマイクロ滴定プレート（この内面に反応成分が固
定される）又はボール（この外面に反応成分が固定され
る）が使用される。これらプラスチツク小管、マイクロ
滴定プレート又はボールは、通例、比較的不活性のプラ
スチツク材料よりなり、従つて、反応成分の結合は困難
である。

更に、それぞれの表面への特異的反応成分の結合を、
これがそれに対して特異的に結合しうる物質の特異的結
合の能力を失なわないように行なうべきである。この理
由から、固相への反応部分の結合は大抵吸着的に行な
う。従つて、固相への反応成分の固定は、この結合を仲
介するカツプリング剤を介して実現することが既に提案
された。この場合には、カツプリング剤への反応成分の
結合は、分子の特異的反応領域を破壊せず、もしくは、
反応成分がその反応性位置が固相がはなれて、結合成分
に向いているように結合することにも留意すべきであ
る。更に、西ドイツ特許出願公開第2533701号明細書中
には、良好な結合を得るために、個々の免疫学的に作用
する蛋白質を架橋し、次いでポリスチロールボールに吸
着させることが提案されている。この文献中に、もう１
つの可能性として、同時に、免疫学的特性を有する蛋白
質と不活性蛋白質を架橋させることが挙げられており、
これにより、架橋された生成物は、不活性及び活性の蛋
白質より成り、これは再びポリスチロールボールに吸着
される。しかしながら、架橋のこの方式は、選択される
反応条件に依り、架橋されておらず不溶性にされる蛋白
質の変動性分との種々の再現不能な架橋をもたらす。更
に、種々の架橋度に依り、種々の結合特性を有する生成
物が生じる。類似の方法が欧州特許（EU-A）第122209号
明細書に記載されており、同じ欠点をも有する。従つ
て、これら公知のすべての方法は、なお満足すべきもの
ではなく、特異的に結合しうる物質の最適付着性をもた
らさず、被覆された固相の再現可能な製造には好適性が
低い。

もう一つの問題は、この固相に結合した抗体が、一般
に、異なるテストのためには異なるべきであることにあ
る。従つて、各テストのために、１個の特定の被覆され
た固相を供給すべきである。このことは、非常に経費が
かかる。更に、公知方法で固定された（immobilisier
t）各抗体が結合可能に残ることは、保証されない。そ
れというのも、非特異的結合も屡々起り、かつ更に、従
来公知の方法での剥離率（Ablsungsrate）も非常に高
く、この抗体は大過剰で使用すべきであるからである。
それにもかかわらず、結合場所の数は限られている。従
つて、高い障害が生じる。このことは、抗体は製造困難
であり製造経費がかかるので、欠点である。

従つて、本発明の課題は、特異的に結合しうる物質の
固相への付着性を再現可能に改良する方法を提供し、更
に、すべてのイムノアツセイに普遍的に使用可能である
固相マトリツクスを製造する方法を提供することであ
る。多くの免疫学的方法で、濁り及び非特異的結合をさ
けるために界面活性剤添加のもとに操作されるので、本
発明のもう１つの課題は、付着性を、界面活性剤の存在
でも、この結合した特異的に結合可能な物質がはがれな
い程度に充分改良することであつた。

この課題は、殊にイムノアツセイの原理によりヘテロ
ゲン分析法で使用するための、不溶性担体材料に結合し
た特異的に結合しうる蛋白質物質の製法により達成さ
れ、これは、まず20000より大きい分子量を有し、特異
的結合対の一方のパートナーP₁の多数を有する第１のポ
リマーＩを、不溶性担持材料に結合させ、引続き、特異
的結合対の他方のパートナーP₂の多数を有するか又はこ
れらよりなる第２のポリマーIIに、P₁とP₂との特異的結
合により架橋させることを特徴とし、この際、このポリ
マーIIはP₁に対する結合位置も免疫学的に検出可能な複
合体に対する結合位置をも有する。

この方法で、すべてのイムノアツセイ例えば１工程又
は２工程法でのサンドイツチ−テスト又はコンペテイテ
イブ−テストに使用可能な固相マトリツクスを製造する
ことができる。１工程法でのサンドイツチ−テストのた
めには、例えばパートナーP₂のポリマーIIは、その位置
で、測定すべき複合体を固定する結合位置を提供するこ
とができる。この測定法の間に、測定すべき物質を含有
する試料は、標識されたレセプター並びに標識されてい
ないレセプター（これはポリマーIIと結合しうる）と反
応される生じる測定すべき物質、標識されたレセプター
及びポリマーIIに対する結合位置を有するレセプターか
らの複合体は、次いでその特異的な結合性に基づき、ポ
リマーIIに結合し、こうして複合体全体が固定される。
次いで、相の分離の後に、２相の１つで標識を測定する
ことができる。

２工程法でのサンドイツチ−テストを実施する場合
は、非標識レセプターがポリマーII中に結合されている
固相マトリツクスを使用することができる。次いで、こ
の試料及び標識されたレセプターを、この固相マトリツ
クスの存在でインキユベートする。相の分離の後に、こ
の固相に結合した標識を測定することができる。

コンペテイテイブテストの実施の際には、試料と標識
付き類縁試料とは、非標識レセプターに関して競争す
る。１工程法のテスト変法のために、この場合に、非標
識レセプターが結合しているポリマーIIを使用する。２
工程法の他の変法のために、非標識レセプターを、この
テストの間に競争的に標識レセプターと結合させ、この
場合には、次いでこのレセプターに対する結合位置を有
するポリマーIIを使用する。

本発明による固相マトリツクスの製造のために、不溶
性担持材料を第１のポリマーＩで被覆し（この際担持材
料への結合は共有結合ではなく、吸着又は交換作用によ
り行なわれる）、第２のポリマーIIと架橋させる。ポリ
マーＩを得るためには、水溶性であり、約20000より大
きい分子量を有する生物学的ポリマーが好適である。ポ
リマーＩを得るために、蛋白質、ペプチド、ヌクレイン
酸ポリマー、炭水化物、並びにアミノ酸と炭水化物とか
らのコポリマーも有利に使用される。誘導体化されたポ
リマー例えば誘導体化された形の炭水化物例えばアミノ
デキストランも好適である。更に、このポリマーＩは特
異的結合対のパートナーP₁多数を有する。このパートナ
ーP₁は、このポリマーと架橋されていてよいか又はこれ
に結合されていてよい。このポリマーＩは、20000より
大きい分子量を有する。それというのも、僅かな分子量
では、不溶性担持材料への結合が、場合によつてはもは
や確保されないからである。45000より大きい特に20000
0より大きい分子量を有するのが有利である。

このポリマーへのパートナーP₁の結合は、公知方法で
行なわれる。好適な結合法は、例えば、イシカワ（Ishi
kawa）によるJ.Immunoassay 4、209〜327（1983）に記
載されている。この場合、ポリマーとの結合に好適であ
るパートナーP₁の官能基が引用されるか又は、適当な官
能基が存在しない場合は、これをP₁−分子内に導入す
る。こうして、例えばP₁としてのビオチンの使用の際に
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル誘導体は、ポリマ
ー中に存在するアミノ基との反応により結合されうる。
他の好適な誘導体化は当業者に公知であり、ここでは説
明する必要はない。

パートナーP₁対ポリマーＩを得るために使用されるポ
リマーの割合は、厳密ではなく、広範囲内で変動しう
る。ポリマー１個当りパートナーP₁ 1〜200モルを使用
するのが有利であることが立証された。この場合、P₁−
量は、使用目的及び使用ポリマーに依り決まる。このポ
リマーＩは、吸着性結合作用をすることができるために
は、全体的に比較的疎水性であるべきであるので、P₁が
親水性である場合には、使用ポリマーの分子量が小さい
程、P₁分は少なくすべきである。このことは、例えばビ
オチンの場合である。

P₁及びP₂として並びにポリマーIIと免疫学的に立証す
べき複合体との間の結合に使用することのできる好適な
結合パートナーは、例えばビオチン−アビジン、ビオチ
ン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、ハプテン−抗
体、プロテインＡ−免疫−γ−グロブリン及びプロテイ
ンＧ−免疫−γ−グロブリンである。抗原もしくはハプ
テンとは、蛋白質と抗原もしくはパプテンもしくはその
フラグメントとの接合体と解される。抗原は、それ自体
抗体、そのFab−、Fab′−又は（Fab′）₂−フラグメン
トでもあつてもよい。抗体とは、モノクローナル及びポ
リクローナルの完全抗体及び抗体フラグメントである。
P₁又はP₂として、プロテインＡもしくはプロテインＧを
使用する場合には、イムノアツセイで、固相に結合すべ
き１個のレセプターのみが完全抗体であり、標識された
レセプターとして標識されたレセプターと固相との非特
異的結合（これは結果を誤まらせる）を起こらせないた
めに、Fab−又はＦ（ab′）₂−フラグメントを使用すべ
きである。

ポリマーＩの製造のために、蛋白質として、パートナ
ーP₁及びP₂よりも疎水性である蛋白質を使用するのが有
利である。殊に、200000より大きく20000000までの分子
量を有する可溶性蛋白質が好適であり、これは、場合に
よつては、10000〜700000の分子量を有する蛋白質から
得られ、特異的結合性の対のパートナーP₁と接合されて
いる。

分子量及び疎水性は当業者に公知の方法で測定され
る。可溶性蛋白質と特異的に結合しうる物質との間の疎
水性の比較のために、例えば次の方法が好適である： −色素への結合後の螢光消失（Biochem.Biophys.Acta.6
24、（1980）、13〜20）、 −疎水性クロマトグラフイでの溶離特性（Biochem.Biop
hys.Acta.576、（1979）、269〜279）、 −表面張力（Biochem.Biophys.Acta.670、（1981）、64
〜73）、 −ヒドロフオビツク・インターラクシヨン・クロマトグ
ラフイ（HIC）での保持時間（Angew.Chemie 98（198
6）、530〜548、J.Chromat.296（1984）、107〜114。An
al.Biochem.137（1984）、464〜472）。

本発明による好適な物質の疎水性の比較は、Sep.Sci.
Technol.14、305〜317（1979）に記載されている。これ
によると、疎水性は、例えば次の順序で上昇する： α₂−マクログロブリン（分子量820000） 牛血清アルブミン／ヒト血清アルブミン（分子量7000
0） 卵アルブミン α₂HS−グリコプロテイン（分子量49000） β_1C／β_1A−グロブリン 免疫グロブリン（分子量150000） トランスフエリン（分子量90000）。

特異的に結合しうる物質として免疫グロブリンを使用
する場合は、例えば、この特別な実施形のためには、可
溶性蛋白質としてのヒト血清アルブミン又はα₂HS−グ
リコプロテインは、更に前処理せずには好適でない。こ
こで、双方の蛋白質は、疎水性化及び分子量の増加をす
べきである。この場合に、トランスフエリンでは、架橋
が満足すべきものであり、α₂−マクログロブリンでは
疎水性化が充分である。

前処理なしに特異的に結合しうる物質としての免疫グ
ロブリンとの結合のために好適である蛋白質は、例えば
β−リポ蛋白質（分子量約32000000）又はα₂−リポ蛋
白質（分子量約5000000〜20000000）である。

疎水性化は、例えば熱の使用、酸、変性抗原及び／又
はカオトロープイオン（Chaotropen Ion）での処理及び
／又は疎水性化合物との化学的結合により行なうことが
できる。

分子量の増大は、例えば、熱の使用、酸、変性試薬及
び／又はカオトロープイオンでの処理及び／又は２−又
は多官能性の蛋白質試薬を用いる架橋により行なうこと
ができる。

充分に疎水性ではないか又はその分子量が充分に高く
ない蛋白質を、200000有利に45000、特に200000以上の
分子量を有する蛋白質ポリマーが得られるまで長時間処
理する。500000〜20000000の分子量を有する蛋白質ポリ
マーを使用するのが特に有利である。

この蛋白質が架橋されるべき場合には、架橋の前、間
又は後に疎水性化を行なうことができる。しかしなが
ら、この疎水性化は、特異的に結合しうる物質が蛋白質
であり、その疎水性化によりその生物学的活性を失なう
場合には、特異的に結合しうる物質の存在で行なうこと
はできない。

加熱による疎水性化のためには、通例、例えばBioche
m.Biophys.Acta.624、（1980）13〜20に記載のように、
40〜95℃の温度を１分〜10時間で使用する。

酸での処理のために、例えば酢酸、プロピオン酸、乳
酸又は塩酸が好適である。作用時間10分〜16時間で、通
例の濃度は１〜100mモル/lである。

カオトロープイオンでの処理のためには、例えば、チ
オシアネート、ヨーダイド、フルオリド、ブロミド、ペ
ルクロレート及びスルフエートが好適である。変性試薬
として、例えば塩酸グアニジン又は尿素を使用すること
ができる。ここでは、通例、10mモル/l〜６モル/lの濃
度が使用される。

疎水性化合物でのポリマーＩの誘導体化のためには、
有利に、可溶性脂肪酸、低分子又は高分子形の脂質並び
に合成ポリマー例えばポリプロピレングリコール又はポ
リスチロールの可溶性コポリマーを使用する。誘導体化
は、当業者に慣用の方法で行なう。

架橋を、２官能性又は多官能性化合物を用いて実施す
る。これらは、少なくとも２個の官能基（これらは同じ
又は異なるものであつてよく、これら官能基を介してポ
リマーＩを形成する化合物例えば蛋白質の官能基と反応
することができる）を有する化合物である。末端にスク
シンイミド−、マレインイミド−及び／又はアルデヒド
基を有するアルキル基から成る化合物が有利である。

次いで、架橋は、２官能性又は多官能性化合物を用い
公知方法で実施する。

疎水性化及び／又は架橋ために、10000〜70000の分子
量を有する蛋白質を使用するのが有利である。特に牛血
清アルブミン、リパーゼ又は免疫−γ−グロブリンを使
用するのが有利である。

こうして製造されたポリマーＩを次いで、不溶性担体
材料に結合させる。この場合、この結合は、ポリマーを
介して行なわれ、一般に吸着的である。担体材料として
は、慣用の固相例えばルラン（Luran）、ガラス、二酸
化チタン、ポリスチロール、γ−活性化ポリスチロー
ル、ポリスチロール−アクリロニトリル−コポリマー、
紙及び／又はポリオレフインが好適である。この担体材
料は、更に加工する前に物理的又は化学的に前処理する
ことができる。例えば、プラスチツク表面を、予め膨潤
させるか又は他の公知方法で活性化することができる。
この担体材料は、一般に、小管、マイクロ滴定プレート
又はボールの形で存在する。しかしながら、他の形も同
様に可能である。

不溶性担体材料は既に被覆された材料であつてもよ
い。例えば、ポリストレプトアビジンで予め被覆された
小管または重合された抗原で予め被覆された小管が好適
である。この場合、不溶性担持材料は、ポリマーＩに関
する結合位置を提供するから、ポリマーＩの結合は、吸
着的にのみ行なわれるのではない。こうして、非常に強
力な結合が得られる。吸着性被覆の際に、このポリマー
Ｉは非常に強くは結合しない。しかしながら、このこと
は、大抵の用途には充分である。それというのも、いく
つかのP₁の溶解時に、この壁付着は、ポリマーIIとの架
橋により安定化されるからである。特別な目的のために
は、強力な結合が望まれる。この場合には、不溶性担体
材料として予め被覆された材料を使用することができ
る。

ポリマーＩは、多数のパートナーP₂を有する第２のポ
リマーIIと架橋される。このポリマーIIは、P₂のみから
又はP₂と他の成分との混合物から成つていてよい。この
ポリマーIIは、P₂により提供されるP₁に関する結合位置
だけでなく、次にレセプターと称されうる免疫学的に検
出すべき複合体（Komplex）に関する結合位置をも有す
る。この場合、レセプターとしては、特異的に結合しう
る物質、殊に、特異的に結合しうる複雑な抗体（これは
ポリクローナル又はモノクローナルであつてよい）、そ
の抗体フラグメント又は抗体又は抗体フラグメントとハ
プテン又は抗原との接合体並びにハプテン、抗原又は結
合蛋白質（例えばチロキシン結合グロブリン）が使用さ
れる。レセプターに関する結合位置は、P₂から提供され
るか又はポリマーIIの他の成分から提供される。

個々のパートナーP₂は、ホモ−又はヘテロ−２価又は
多価の化合物（リンカー）を介して相互に結合していて
よい。次いで、２価リンカー（これは重合度の容易な分
散を可能にするので）との架橋を実施するのが有利であ
る。しかしながら、多価のリンカーも同様に好適であ
る。リンカーとしては、水溶液中で特異的に結合しうる
パートナーの官能基と共有結合の形成下に反応すること
のできる反応性基を有するような化合物を使用すること
ができる。当業者には、このために好適な多数の２官能
性又は多官能性のリンカーは公知である。本発明の範囲
で好適なホモ−又はヘテロ−２官能性及び３官能性のリ
ンカーの典型的な例を次の第１表に挙げる。

架橋の実施のために、パートナーP₂の溶液に、直接架
橋をする条件下に、リンカー分子を加えることができ
る。この場合、架橋の程度は、添加リンカーの量により
制御される。

もう１つの有利な実施形によれば、結合パートナーP₂
を、P₁及び測定すべき複合体に関して不活性である結合
しうる好適な成分と架橋させる。このためには、例えば
前記のような可溶性蛋白質殊に牛血清アルブミン又はヒ
ト血清アルブミンが好適である。

不均一架橋は、例えば、「不活性成分」として使用さ
れる蛋白質材料も特異的に結合しうるパートナーP₂も活
性化された結合しうる基を有し、引続き反応させること
により行なうことができる。こうして、充分に多数の結
合しうるパートナーP₂を有する架橋されたポリマーが得
られる。この場合、もちろん、蛋白質へのパートナーP₂
の結合は、これにより、パートナーP₁との特異的結合性
も悪影響されず、測定すべき錯体に対する特異的結合位
置も遮断されないように行なうべきである。

本発明の方法のもう１つの有利な実施形では、結合パ
ートナーP₂を、レセプターに対する特異的結合位置を有
する他の成分と架橋させる。この実施形は、P₂がP₁との
結合のための１個の特異的結合位置のみを有する場合に
有利に使用される。次いで、他の成分は、結合すべきレ
セプターに対する結合位置を提供する。他成分として
は、特異的結合位置を有する物質、殊に先に定義された
ような特異的結合対のパートナーが好適である。

不溶性担体材料をポリマーＩ及びIIで被覆するために
は、種々の変法がある。１実施形では、不溶性担体材料
をまずポリマーＩで被覆し、この際、担体材料をポリマ
ーＩを含有する溶液と共にインキユベートする。ポリマ
ーＩが結合したら、引続きポリマーIIを含有する溶液を
加え、この際、P₁とP₂との特異的結合により、双方のポ
リマーが架橋する。

本発明の方法の他の１実施形では、不溶の担体材料を
ポリマーＩ及びポリマーII及び付加的にP₁とP₂の結合を
阻止する阻害物質を含有する溶液と共にインキユベート
する。可逆反応をし、簡単な除去又は化学的変更により
その阻害作用を消失する阻害物質を使用する。この阻害
物質の存在でパートナーP₁及びP₂はまつたく均一に分配
され、非常にゆつくり開始する結合に基づき、担体材料
とその都度所望の結合活性物質（これは大規模バツチ中
でも完全に一様かつ再現可能な結果をもたらす）での完
全に一様な被覆を得ることができる。この実施形は、結
合対P₁‐P₂として、抗原もしくはハプテン−抗体又はビ
オチン−ストレプトアビジンもしくはアビジンを使用す
る際に好適である。P₁及びP₂の結合の阻害物質として、
本発明のこの実施形の範囲では、色素吸着性精製時に脱
着剤として使用されうるような物質を使用するのが有利
である。このために、酸、塩基又は例えばストラクチヤ
・アンド・スタビリテイ・オブ・バイオロジカル・マク
ロモレキユール（Structure and Stability of Biologi
cal Macromolecule,1969,Marcel Dekker,Inc.New York
427頁）に記載のようなホフマイスター系のカオトロ−
プイオン（Lyotrope Reihe）、並びに特定の有機化合物
又は溶剤例えばアセトニトリル、尿素又はグリセリンを
使用するのが特に有利である。好適な酸としては、揮発
性又は不揮発性の酸がこれに該当する。揮発性酸は、そ
の阻害作用を除くために、例えば、加温、真空等により
容易に除去される。不揮発性の酸の場合には、同様な効
果が、不揮発性の酸で分解される揮発性酸の塩の使用に
より、揮発性酸の遊離下に又は再緩衝化により得ること
ができる。揮発性酸としての有利な例は、プロピオン酸
及び塩酸である。

同様に、揮発性及び不揮発性塩基例えばアンモニア及
びｔ−ホスフエートを使用することができる。更に、阻
害物質として、可逆的に蛋白質にも水構造にも影響する
ことができ、例えばStructure and Solibility of Biol
ogical Macromolecules 1967、Marcel Dekker,Inc.New
York 213〜290頁中のJ.F.Brandts,Conformatial Transi
tions of Proteins in Waterに記載の有機化合物が好適
である。特に、グリセリン及び尿素を使用するのが有利
である。阻害物質としては、カオトロープイオン例えば
チオシアネート及びヨーダイドがこれに該当する。同様
にフルオリド、ブロミド、ペルクロレート、グアニジン
及びスルフエートが好適である。結合阻止を止めるため
のその除去は、例えば有機溶剤又は有機溶剤の混合物又
は有機溶剤と水との混合物例えば水／アルコール混合物
例えば水／アルコール混合物を用いて、場合によりイソ
ホロン及び類似物を添加して抽出することにより行なう
ことができる。この場合、一般に、所望の効果を得るた
めに、イオン濃度を変えれば充分であるが、阻害物質を
完全に除去することもできる。例えば阻害性金属塩例え
ばMgCl₂の除去のために、錯形成剤例えばEDTAの添加
も、使用される。

ポリマーＩ及びIIに対して結合対としてビオチン及び
ストレプトアビジンもしくはアビジンを使用すると、阻
害物質として酸を使用するのが特に有利である。この双
方のパートナーの強力な結合は、４以下の領域までのpH
の低下により、高めることができる。このために、揮発
性酸を使用するのが有利であり、この結合作用は、揮発
性酸の遊離時に得られる。

双方の特異的に結合するパートナーP₁及びP₂及び場合
によつては他の成分は、P₂及び場合によつては他の成分
がレセプターの結合のためには、その結合パートナーに
比べて過剰に存在するような割合で使用するのが有利で
ある。こうして、固定すべき錯体に対する多数の結合位
置が提供される。使用される特異的結合対の１パートナ
ーが遊離の形で分析すべき試料溶液中で既に本来のまま
存在する場合は、これにより障害を排除するために、高
い結合能を提供することが特に有利である。従つて、例
えば、特異的に結合する対としてビオチン及びストレプ
トアビジンもしくはアビジンを使用する場合には、ビオ
チンに対する非常に高い結合能を提供することが特に有
利である。ビオチンは、体液中に存在し、殊に例えばビ
オチンの摂取後に血清値は著るしく高いと、ビオチン−
接合体を使用する測定の分析値が誤まることがある。こ
の場合には、ビオチンに対する非常に高い結合能を有す
る固相マトリツクスを製造することが特に有利である。
このことは、本発明の方法により達成でき、この際、ビ
オチンに対する200ng/ml以上の結合能を与えることがで
きる。

本発明により製造された固相マトリツクスを、イムノ
アツセイの原理により使用する。これは、サンドイツチ
−テストの変法にも、コンペテイテイブテストの変法に
も好適である。この測定のためには、多くの変法があ
る。この場合、例えば、測定すべき物質を含有する試料
を、標識を有するレセプター及び少なくとももう１種の
レセプター（これに、特異的に結合するパートナーP₂の
ポリマーと特異的に結合しうる物質が結合している）と
反応させることができる。従つて、測定すべき複合体特
に、結合したレセプターの１つは、このポリマーと結合
しうる１個の位置を有する。この結合位置は、P₁のそれ
と同じであるか又はこれとは異なるものであつてよい。
この反応は、既に、本発明によるマトリツクスで被覆さ
れた小管又は相応して被覆されたマイクロ滴定プレート
の中で行なうことができる。同様に、例えばボールの形
の固相マトリツクスをインキユベーシヨンの後にはじめ
て添加することもできる。固相マトリツクスとの接触の
際に、測定すべき物質、標識付きレセプター及び特異的
に結合する物質と接合されたレセプターからの複合体
は、P₁及び蛋白質を介して担体に結合しているポリマー
に結合する。このようにして、測定すべき複合体を固定
することができる。

本発明のもう１つの目的物は、固相マトリツクスであ
り、これは200000より大きい分子量を有し、特異的な結
合対の一方のパートナーP₁の多数を有するポリマーＩが
結合している不溶性担体材料よりなり、これは、特異的
結合対の他方のパートナーP₂の多数を有するポリマーII
と架橋しており、この際、このポリマーIIは、P₁に対す
る結合位置も免疫学的に検出すべき複合体に対する結合
位置も有する。

イムノアツセイの実施のために、蛋白質が200000〜20
000000の分子量を有する可溶性蛋白質及び多数のビオチ
ン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子より成る
接合体である固相マトリツクスが特に好適である。更
に、そのポリマーIIがビオチン−、アビジン−又はスト
レプトアビジン分子よりなる固相マトリツクスを使用す
るのが有利である。このポリマーIIは、有利に、ビオチ
ン−、アビジン−又はストレプトアビジン分子及び疎水
性化された蛋白質より形成される。

本発明によれば、すべての公知のイムノアツセイに使
用することのできるユニバーサルマトリツクス及びその
製法が提供される。

この固相マトリツクスは、使用レセプターの種類に無
関係である。更に、これは、高い安定性により優れてい
る。

〔実施例〕

次に添付図面及び実施例につき本発明を説明する。

第１図は、本発明による固相マトリツクスの２種の実
施形を示す図である。

第1a図は、本発明の固相マトリツクスの１実施形を示
している。固相１に、蛋白質３と特異的結合対の一方の
パートナーP₁である５との接合体が吸着されている。５
に、特異的結合対の他方のパートナーP₂よりなるポリマ
ー７が結合している。このポリマーは均一架橋された同
一分子よりなる。このポリマーに、イムノアツセイの実
施の際にP₁と接合している抗体９が結合している。

第1b図は、本発明の固相マトリツクスのもう１つの実
施形を示している。ここでは、固相１に蛋白質３及び特
異的結合対の一方のパートナーP₁である５からなる接合
体が吸着されている。５にはポリマー７が結合してい
る。このポリマーは、特異的結合対の他方の成分P₂並び
にレセプターＲよりなる。このポリマーに、イムノアツ
セイの実施の際に、レセプターＲと結合しうる物質と接
合している抗体９が結合する。

第２図は種々の被覆された小管に関する較正曲線を示
した図である。この曲線は次の小管を用いて得た： ×：サーモ−RSA−ビオチン及び均一架橋ストレプトア
ビジンよりなる２成分マトリツクスで被覆されたルラン
小管 △：サーモ−RSA−ビオチン及びサーモ−RSA−ストレプ
トアビジンよりなる２成分マトリツクスで被覆されたル
ラン小管 ＋：γ照射され、RSA−ストレプトアビジンで被覆され
たポリスチロール小管 ◇：γ照射され、均一架橋されたストレプトアビジンで
被覆されたポリスチロール管 □：均一架橋されたストレプトアビジンで被覆されたル
ラン管 第３図は、本発明による固相マトリツクスの１実施形
を示す図である。

この実施形において、担体材料１に、特異的結合対の
一方のパートナーの多数を有する第１成分３が吸着結合
している。特異的結合対の他方の成分の多数を有する第
２成分５は、双方成分の特異的結合７を介して第１成分
３に結合しており、この際、担体材料１上に、架橋され
たかなりの大きさのポリマーが生じている。

例１ 1a）サーモ−牛血清アルブミン−ビオチンの製造 牛血清アルブミン（RSA）1gを50mM燐酸カリウム（pH
7.8）50ml中に溶かす。攪拌下に、ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）中のＤ−ビオニチル−γ−アミノカプロン酸
−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS-X-ビオ
チン、Boehringer Mannheim GmbH）（20mg/ml）1.9mlを
滴加する。引続き、25℃で３時間インキユベートする。
この反応の後に、４℃で、50倍量の20mM燐酸カリウム
（pH7.0）に対して１晩透析させる。保留液に同量の20m
M燐酸カリウム/200mM塩化ナトリウム（pH7.0）を加え、
70℃に加熱し、注意深い攪拌下にこの温度で４時間イン
キユベートする。引続き、この溶液を室温まで冷却し、
濾過する。濾液を４℃で、50倍量の2mM燐酸カリウム（p
H7.0）に対して１晩透析させ、引続き凍結乾燥させる。
得られる生成物を固相に吸着させ、本発明のマトリツク
ス中に可溶性蛋白質に結合したパートナーP₁を製出させ
る。

1b）マレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルでのストレプトアビジンの活性化 ストレプトアビジン30mgを30mM燐酸カリウム/100mM塩
化ナトリウム（pH7.1）3ml中に溶かし、25℃の温度にす
る。攪拌下にDMSO中のマレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（MHS）（Boehringe
r Mannheim GmbH）（10mg/ml）0.15mlを滴加する。25℃
で１時間の反応時間の後に、この溶液を氷浴中で冷却す
る。引続き、４℃で、50mM燐酸カリウム/100mM塩化ナト
リウム（pH5.0）１に対して、２回透析させる。

1c）S-アセチルメルカプトコハク酸アンヒドリドでのス
トレプトアビジンの活性化 ストレプトアビジン30mgを100mM燐酸カリウム（pH7.
8）3ml中に溶かし、25℃に加熱する。攪拌下にDMSO中の
Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸アンヒドリド（SAMB
A）（10mg/ml）0.175mlを滴加する。25℃で３時間の反
応時間の後に、４℃で、50mM燐酸カリウム/2mM EDTA（p
H6.5）１に対して２回透析させる。

1d）ストレプトアビジンの均一架橋 活性化SAMBA−ストレプトアビジンの溶液（10mg/ml）
（例1cで製造）3mlを25℃まで加熱し、1Mヒドロキシル
アミン（pH6.5）50μｌを加える。25℃で30分後に50mM
燐酸カリウム/100mM塩化ナトリウム/1mM EDTA（pH6.5）
15mlの添加により、稀釈する。ストレプトアビジンの均
一架橋を、活性化MHS−ストレプトアビジン（10mg/ml）
（例1bで製造）3mlの添加により開始させる。注意深い
攪拌下における25℃で２時間の反応時間の後に、100mM
システイン/HC1 0.2mlの添加により、この反応を終結さ
せる。25℃で30分のインキユベーシヨン時間の後に、1M
燐酸水素二カリウムの添加により、溶液のpH値を7.5に
調節する。500mMヨードアセタミド0.2mlの添加の後に、
25℃で更に１時間インキユベートする。引続き、４℃
で、50mM燐酸カリウム/100mM塩化ナトリウム（pH7.5）3
lに対して２回透析する。接合体を透析の後に限外濾過
セル中での濃縮する。

この均一架橋されたストレプトアビジンは、直接又は
ゲル濾過（Superos 6 prep,grade,Pharmacia Uppsala）
及び改めての濃縮の後に、固相への吸着のために使用す
ることができる。本発明によるマトリツクス中で、ポリ
マーIIが生じる。

例２ ポリマーIIとして本発明のマトリツクス中で使用され
る不均一架橋されたストレプトアビジンを製造する。

ａ）活性化SAMBA−サーモ−RSAの製造 例1a）に記載のようなサーモーRSAを製造を行なうが、
ここではビオチニル化を省略する。

サーモ−RSA 68mgを0.1M燐酸カリウム（pH7.8）2ml中
に溶かし、SAMBA（DSMO中10mg/ml）0.38mlを徐々に加え
る。25℃で3.5時間の反応時間の後に、４℃で、50mM燐
酸カリウム（pH6.5）１に対して２回透析させる。

ｂ）サーモ−RSA−ストレプトアビジン−接合体の製造 サーモ−RSAでのストレプトアビジンの不均一架橋
を、例1d）に記載の均一架橋と同様に行なう。この場
合、活性化MHS−ストレプトアビジン（例1bにより製
造）60mgを活性化SAMBA−サーモ−RSA（s.o.）68mgと反
応させる。反応生成物をゲル濾過（Suprose 6 prep,gra
de）により精製し、限外濾過セル中で濃縮する。得られ
る生成物を、引続き凍結乾燥させる。この生成物は、P₂
として使用することができる。

例３ ルラン−（ポリスチロール−アクリロニトリル−コポリ
マー）もしくはγ−照射ポリスチロール−小管の被覆 例１及び例２により得られた生成物を50mM燐酸カリウ
ム（pH7.4）中に溶かして10μg/mlの濃度にする。次い
で、被覆すべき各小管中に例1a）で製造したサーモ−RS
A−ビオチン−接合体の溶液を1.5mlを充填し、まず３〜
５時間負荷させる。引続き完全吸収の後に、この小管内
に、例１による均一架橋ストレプトアビジンもしくは例
２による不均一架橋ストレプトアビジンの溶液1.5mlを
加え、室温で１晩インキユベートする。その後，この小
管を完全に空にし、相応するテストに使用する。

比較のために、小管を例１もしくは例２で架橋された
ストレプトアビジンのみで、又はストレプトアビジンと
例７により得られるサーモ−RSAとからの接合体で、ビ
オチン化蛋白質での処理を行なうことなしに、被覆す
る。

例４ 例３で製造した小管の結合能（Bindekapazitｔ）を
測定する。

種々異なるストレプトアビジンポリマーにより本発明
で被覆された小管並びに比較小管を、オランダガラシか
らのビオチニル化されたペルオキシダーゼの溶液（ビオ
チン−POD、シグマ）（50mM燐酸カリウム/0.5％牛血清
アルブミン（pH7.4）中の10mU/ml）1mlと共に室温で45
分間インキユベートする。次いでこの小管を空にし、再
蒸溜水で２回洗浄する。引続き、ABTS （2,2′−アジ
ノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
のアンモニウム塩）を用いて、室温で30分間、検出反応
を行なう。この測定は、405nmで光度測定法で行なう、
この結合能は、置換曲線（Verdrngungakurve）を介し
て測定する。このために、ビオチン−POD−溶液に、増
加性濃度（０〜15もしくは０〜200ng/ml）のＤ−ビオチ
ン（シグマ）を添加する。次いで、この結合能は個々の
値のプロツトにより得られる曲線から、半最大吸光度
（halbmaximalen Extinktion）から算出される。

例５ 蛋白質及びビオチン及びそれぞれストレプトアビジン
−ポリマーで被覆されたマトリツクスの表面付着性の安
定性を、被覆された小管と界面活性剤含有剥離緩衝液
（Ablsepuffer;50mM燐酸カリウムとpH7.0）中のTween
20 0.2％）1.5mlとのインキユベーシヨンにより試験す
る。室温で１時間のインキユベーシヨン時間の後に、剥
離された接合体量を測定するために、この小管からの各
1mlをサーモ−RSA−ビオチン（例1aで製造）で被覆され
た小管中に移す。平行して、較正曲線の調査のために、
サーモ−RSA−ビオチン−小管に、増加性濃度のストレ
プトアビジンを含有する剥離緩衝液1mlを加える。室温
で１時間のインキユベーシヨン時間の後に、この小管を
完全に空にし、50mM燐酸カリウム（pH7.0）中のビオチ
ン−POD−溶液（100mU/ml）1mlを加える。室温で更に30
分間インキユベーシヨンの後に、小管を空にし、引続き
再蒸溜水で３回洗浄する。結合したビオチン−PODの量
は、管壁から剥離される接合体量に比例し、ABTSとの基
質反応（室温で１時間インキユベーシヨン）により、光
度測定法により測定される。較正曲線を用いて、剥離さ
れた接合体を定量し、剥離されたビオチン−結合能と称
する。

第２表に、種々の被覆されたもしくはγ−照射ポリス
チロール−小管に関して、例４で測定したビオチン−結
合能と例５で測定された接合体の脱着の関係を示す。直
接、固相上に結合した均一架橋された特異的結合パート
ナー（比較）（例えばポリ−ストレプトアビジン）のピ
オチン−結合能（及びこれに伴なうビオチン化された抗
体に対する結合能）は、直接、固相上に結合した不均一
架橋された特異的結合対（比較）（例えばRSA−ストレ
プトアビジン、例1eと同様に、活性化SAMBA−RSA及び活
性化MHS−ストレプトアビジンから製造）のそれよりも
明らかに大きい。しかしながら、剥離データが示してい
るように、予め、前架橋された蛋白質（これは、特異的
結合対P₁即ちビオチンを共役結合含有している）での被
覆をその場で反応させる場合に、架橋された特異的結合
対P₂は、高い結合能でのみ、かつ所望の堅固な壁付着性
でのみ施与することができる。界面活性剤の使用下に実
施される機能試験の感度に及ぼす種々の接合体の結合能
及び固相−剥離の影響を例６に詳述する。

例６ 例３で得られた小管をTSH−テストに使用する。

試薬： 試薬１（抗体−インキユベーシヨン溶液）： 燐酸塩緩衝剤（pH6.9） 16mモル/l TSHに対するビオチニル化されたモノクローナル抗体（E
CACC87122201）（ビオチニル化はJACS 100（1978）、35
85〜3590により、ビオチンを用い、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド−ビオチンとの比10:1での反応により行なつ
た） 1.5μg/ml 試薬２（抗体−POD−接合体溶液）： 燐酸塩緩衝剤（pH6.9） 36mモル/l PODとTSHに対するモノクローナル抗体からの接合体（EC
ACC87122202） 2.0U/ml 試薬３（基質−クロモゲン−溶液）： 燐酸塩−クエン酸塩−緩衝剤（pH4.4） 100mモル/l 過ホウ素酸ナトリウム 3.2mモル/l ABTS（2,2′−アジド−ジ−〔３−エチル−ベンズチア
ゾリン−スルホン酸（６）〕−ジアンモニウム塩）1.9m
モル/l 固相として例３に記載のように種々のマトリツクスで
被覆されている小管を使用する。この小管内に、試料
（TSH−標準）0.2ml、試薬1 0.9ml及び試薬2 0.1mlを加
え、室温で２時間インキユベートする。引続きこの小管
を完全に空にし、水で３回洗浄する。次いで、この管壁
に結合したPOD−活性を、試薬3 1mlの添加及び１時間の
インキユベーシヨンの後に、405nmでの吸光度測定によ
り測定する。呈色反応の強さは、標準のTSH−濃度に比
例する。結果を第２図に示す。

第２図に示されているように、界面活性剤含有インキ
ユベーシヨン緩衝剤の使用の際に、較正曲線（従つてテ
ストの感度）の傾斜は、１成分マトリツクスで被覆され
た小管よりは、本発明による２成分−マトリツクスで被
覆されている小管の方で明らかに増大している。更に、
最大感度は、成分Ｂとして均一架橋された結合パートナ
ー（ここではストレプトアビジンポリマー）を有する２
成分−マトリツクスの使用により達成される。

例７ 固相上にサーモ−RSAが吸着され、これにパートナーP
₁としてのストレプトアビジンが結合しているマトリツ
クスを製造する。次いで、このストレプトアビジンに、
均一架橋され、ビオチニル化されたプロテインＡをパー
トナーP₂として結合させる。

ａ）サーモ−RSA−ストレプトアビジンの製造 この製造は、例２に記載と同様に行なう。

ｂ）均一架橋され、ビオチン化されたプロテインＡの製
造 プロテインＡ（Boehringer Mannheim GmbH）50mgを30
mM燐酸カリウム（pH7.1）5ml中に溶かし、10モル過剰の
NHS-X−ビオチン（DMSO中に10mg/mlまで溶かす）を加え
る。25℃で１時間のインキユベーシヨン時間の後に、反
応混合物を、４℃で50mM燐酸カリウム（pH8.0）10lに対
して１晩透析させる。保留液を引続き限外濾過セル中で
ビオチン−プロテインA 50mg/mlの濃度まで濃縮する。

ビオチン−プロテインＡの濃溶液を25℃まで加温す
る。引続き、注意深い攪拌下にジスクシイミジルスベラ
ート−溶液（DSS、Fa.Pierce;ジオキサン中7mg/ml）50
μｌを添加する。架橋を、TSK 3000ゲル濾過カラム（LK
B）でのHPLCにより制御する。１時間間隔で、DSS−溶液
各50μｌを、プロテインＡモノマーのピークがその当初
値の10％より低くなるまで加える。その後、1Mメタノー
ルアミン（pH8.0）50μｌの添加により、更なる架橋を
停止させる。４℃で１晩インキユベートし、引続き2mM
燐酸カリウム（pH7.5）2lに対して２回透析させる。こ
のプロテインＡモノマーの分離は、Superose 12 prep.g
radeでのゲル濾過により行なう。均一架橋された生成物
を集め、限外濾過セル中で濃縮させる。次いで、この双
方の成分を用いて小管を例３に依り被覆する。

例８ P₁としてのサーモ−RSAとマウスのFc γ−フラグメン
トとの接合体及びP₂としての羊の均一架橋ポリクローナ
ル抗−マウス−Fc γ−抗体よりなるマトリツクスを製
造する。

ａ）サーモ−RSA−マウス−Fcγ−フラグメントの製造 マウスの免疫グロブリンＧのパパイン分解及び常法で
のDE−52−セルロースを用いるイオン交換−クロマトグ
ラフイによるFab−フラグメントの分離によりFcγ−フ
ラグメントを製造する。

活性化MHS−ストレプトアビジンの製造（例1b）と同
様にして、活性化MHS−Fcγ−フラグメントを製造す
る。例２の記載と同様にして、活性化SAMBA−サーモ−R
SAを調整する。活性化SAMBA−サーモ−RSA 68mgと活性M
HS−Fcγ−フラグメント10mgとの接合を不均一架橋され
たストレプトアビジンの製造（例２）と同様な方法で行
なう。反応生成物をSuprose 6 propでのゲル濾過により
精製し、限外濾過セル中で濃縮し、引続き凍結乾燥させ
る。

ｂ）均一架橋された抗−マウスFcγ−抗体の製造 抗−マウス−Fcγ−抗体50mgを50mM燐酸カリウム（pH
8.0）1ml中に溶かし、25℃まで加温する。均一架橋され
たプロテインＡ（例2b）の製造と同様にして、１時間の
間隔で、それぞれ、DDS−溶液（ジオキサン中7mg/ml）5
0μｌを、TSK 3000ゲル濾過カラムでのHPLC−分析にお
いてモノマーIgGsのピークがその当初値の10％に低下す
るまで、添加する。引続き、例7b）に記載のように、エ
タノールアミンで停止させ、透析させる。このIgGモノ
マーを例7b）に記載と同様にゲル濾過により分離する。
場合により、この架橋されたIgGを限外濾過により濃縮
する。この均一架橋生成物は、抗体をMHS及びSAMBA（例
1b及び1cと同様に製造）で活性化し、引続き架橋（例1d
と同様に）することにより、製造することができる。

このａ）及びｂ）により得られた生成物で例３による
小管を被覆する。

例９ P₁としてのサーモ−RSA−ジギトキシゲニン−接合体
及びP₂としての羊からの均一架橋された抗−ジゴキシン
−抗体よりなるマトリツクスを製造する。

ａ）サーモ−RSA−ジゴキシゲニンの製造 例1a）の記載と同様にしてサーモ−RSAを製造する。
サーモ−RSA 68mgを50mM燐酸カリウム/100mM塩化ナトリ
ウム（pH8.5）6.8ml中に溶かし、25℃に加温する。攪拌
下に、ジオキサン0.68ml中のジゴキシゲニン−３−スク
シンイミジル−ヒドロキシスクシンイミドエステル2.86
mgを添加する。25℃で３時間の反応時間の後に、2mM燐
酸カリウム（pH7.2）１に対して２回透析させる。引
続き、反応生成物を限外濾過セル中で濾過する。

ｂ）均一架橋抗−ジゴキシン−抗体の製造 均一架橋抗−マウス−Fc−抗体の製造（例8b）に関す
ると同様な方法で均一架橋杭−ジゴキシン−抗体の製造
を行なう。

引続き、小管に、順次にこの双方の生成物の溶液を被
覆させる。

イムノアツセイで、ジゴキシゲニン−標識抗体を使用
する。このように標識された抗体の製造は、例9aと同様
に、ジゴキシゲニン−３−スクシンイミジル−ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを用いて行なう。

例10 固相を同時にポリマーＩ及びIIと共にインキユベート
する方法でマトリツクスを製造する。

酢酸5mモル/l中のポリ−ストレプトアビジン（例1dで
製造）10μg/ml及びサーモ−RSA−ビオチン（例1aで製
造）0.1μg/mlからなる溶液をポリスチロール−管中で2
0時間インキユベートする。

被覆溶液の除去の後に、10mモル/l燐酸カリウム−緩
衝液pH7.2/3g RSAで後被覆（30分）し、吸引の後に乾燥
させる。

例11 ａ）アミノ−デキストラン−500のビオチニル化 アミノデキストラン（分子量500000、NH₂−基230/デ
キストラン１モル）100mgを100mM燐酸カリウム緩衝液
（pH8.5）5ml中に溶かす。これにジメチルスルホキシド
（DMSO）1ml中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ビオチン−OSu）10mgからなる溶液90μ
ｌを徐々に攪拌下に添加する。

室温で２時間後に、200mモル/lリジン−HCl、（pH8.
5）50μｌで反応を停止させる。

引続き、このバツチを50mモル/l燐酸カリウム緩衝液
（pH7.2）500倍量に対して透析させ、40mモル/l燐酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）で10μg/mlの濃度まで稀釈す
る。

ｂ）抗−デキストラン−ビオチンでのポリスチロール−
管の被覆 その都度、この被覆溶液1,5mlをポリスチロール小管
中に充填し、室温で６時間インキユベートする。

これに引続いて、吸引除去し、均一又は不均一架橋さ
れたポリ−ストレプトアビジン（例１又は２）1.5mlを
加え、１晩インキユベートする。その後、小管を完全に
空にし、相応するテストに使用する。

例12 サーモ−RSA−ストレプトアビジン−管（EP−Ａ第026
9092により製造）をサーモ−RSA−ビオチン−溶液（例1
aで製造）10μg/mlと共に50mモル/l燐酸カリウム（pH7.
2）中で20時間インキユベートする。

溶液の完全吸引除去の後に、ポリ−ストレプトアビジ
ン−溶液（例１又は２による）1.5mlを添加し、室温で
１晩インキユベートする。その後、この小管を完全に空
にし、相応するテストに使用する。

例13 ａ）ポリ（Lys/Phe）のビオチニル化 ポリ（Lys/Phe）HBr（リジンとフェニルアラニンとか
らのコポリマーの臭化水素酸塩）（Ｌ−Lys/L−Phe 1:
1、分子量46kD、製造者−Sigma）100mgをH₂O25ml中に溶
かす。

これにDMSO 1ml中のビオチン−OSu5mgからの溶液180
μｌを加え、この際、pH値を自動滴定装置を用いて8.0
に一定に保持する。

室温で２時間の後に、200mモル/lリジン−HCl50μｌ
を用いて反応を停止させる。

引続き、バツチを500倍量の再蒸留水に対して透析さ
せ、10μg/mlの濃度まで稀釈する。

ｂ）ポリ（Phe/Lys）ビオチンでのポリスチロール管の
被覆 その都度、被覆溶液1.5mlをγ−照射したポリスチロ
ール−小管中に充填し、室温で６時間インキユベートす
る。それに引続き吸引除去し、ポリ−スチロールアビジ
ン溶液（例１又は２で製造）1.5mlを加え、室温で１晩
インキユベートする。その後、この小管を完全に空に
し、相応するテストに使用する。

例14 ポリマーＩとしてのサーモ−RSA−ビオチン−接合体
及びポリマーIIとしてのストレプトアビジンと羊からの
抗−ジゴキシン−抗体とからの不均一架橋接合体よりな
るマトリツクスを製造する。

ａ）サーモ−RSA−ビオチンの製造 製造は、例1a）に記載のように行なう。このサーモ−
RSA−ビオチン−接合体は、本発明によるマトリツクス
中でのポリマーＩである。

ｂ）ストレプトアビジンと羊からの抗−ジゴキシン−抗
体とからのコポリマーの製造 ストレプトアビジン30mgを例1c）の記載のように、Ｓ
−アセチルメルカプトコハク酸アンヒドリド（SAMA）で
活性化する。

同時に抗−ジゴキシン−抗体30mgをマレイミド−ヘキ
サノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MH
S）を用いて、例1b）におけるストレプトアビジンのMHS
−活性化に関する記載と同様な方法で活性化する。この
反応のために、抗体に対して５倍モル過剰量のMHS（DMS
O中に溶解）を使用する。

活性化されたSAMA−ストレプトアビジンと活性化され
たMHS−抗体との接合を、例1d）のストレプトアビジン
の均一架橋に関する記載と同様な方法で行なう。

こうして得られたストレプトアビジン−抗体−接合体
は、直接又はゲル濾過及び改めての濃縮の後に、固相へ
の吸着のために使用することができる。本発明によるマ
トリツクス中で、これはポリマーIIである。

本発明によるマトリツクスの製造のために、小管を双
方の生成物の溶液で、順次に又は同時に、例１に記載の
ように、酢酸5mモル/lの存在下に被覆する。

イムノアツセイで、ジゴキシゲニン−標識された抗体
を使用する。このように標識された抗体の製造は、例9a
と同様にジゴキシゲニン−３−スクシンイミジル−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルを用いて行なう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイアー，ヨーゼフ ドイツ連邦共和国 Ｄ‐8120 ヴアイルハ イム シユメートルシユトラーセ 15 (56)参考文献 特開 昭60−69100（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−269070（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不溶性担体材料に結合した、特異的に結合
   しうる物質を製造するために、20000より大きい分子量
   を有し、特異的結合対の一方のパートナーP₁の多数及び
   水溶性生物学的高分子又はその誘導体より成る第１のポ
   リマーＩを、不溶性担体材料に結合させ、特異的結合対
   の他方のパートナーP₂の分子のみ又は他の成分と架橋し
   ているP₂の多数から成る第２のポリマーIIと、P₁とP₂と
   の特異的結合を介して架橋させ、この際、このポリマー
   IIは、P₁に対する結合位置も免疫学的に検出すべき複合
   体に対する結合位置をも有することを特徴とする、不溶
   性担体材料に結合した特異的に結合しうる物質の製法。
2. 【請求項２】固相マトリックスにおいて、これは、2000
   0より大きい分子量を有し、特異的結合対の一方のパー
   トナーP₁の多数及び水溶性生物学的高分子又はその誘導
   体より成る第１のポリマーＩを結合している不溶性担体
   材料より成り、このポリマーＩは、特異的結合対の他方
   のパートナーP₂のみ又は他の成分と架橋しているP₂の多
   数から成る第２のポリマーIIと架橋しており、この際、
   このポリマーIIは、P₁に対する結合位置をも免疫学的に
   検出すべき複合体に対する結合位置をも有し、この際、
   ポリマーＩ及びIIは、P₁とP2との特異的結合を介して架
   橋されていることを特徴とする、固相マトリックス。