JPH0413659B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は液体試料中の少なくとも二官能性のリ
ガンド（抗原）を測定するための免疫化学的方法
である。
ガンド（抗原）を測定するための免疫化学的方法
である。
異なる抗原決定基に合わせた２種の抗体を使用
する多価抗原（ペプチド、プロテイン）の感度の
高い測定は二部位ラジオイムノアツセイ法もしく
は二部位酵素イムノアツセイ法として例えばJ.
Clin.Chem.Clin.Biochem.第18巻（1980）、第197
〜208頁に記載されている。この公知測定法が最
も多く実施されており、ここではセフアロース、
アガロース、プラスチツク小管等の好適な担持材
に結合させることにより固相に存在する第１の抗
体と測定すべき抗原とをまず共に恒温保持する。
この第１の恒温保持の間、一般に大過剰で存在し
なければならない第１の抗体は測定すべき抗原の
抗原決定基と結合する。次いで、引き続き行なわ
れる第２の恒温保持において人血清プロテインの
ような非特異性物質による、もしくは交叉反応性
抗原による妨害を遮断するために、常法で固相か
ら試料液体を分離する。次いで、一定量の第２の
標識抗体を液相中で固相と共に恒温保持する。こ
の際、測定すべき抗原の同じ結合位に対する両方
の抗体間の競合により試験の感度が低下すること
を防ぐために、第２の抗体の特異性は第１の抗体
とは異なる決定基にあわせて選択されているのが
有利である。
する多価抗原（ペプチド、プロテイン）の感度の
高い測定は二部位ラジオイムノアツセイ法もしく
は二部位酵素イムノアツセイ法として例えばJ.
Clin.Chem.Clin.Biochem.第18巻（1980）、第197
〜208頁に記載されている。この公知測定法が最
も多く実施されており、ここではセフアロース、
アガロース、プラスチツク小管等の好適な担持材
に結合させることにより固相に存在する第１の抗
体と測定すべき抗原とをまず共に恒温保持する。
この第１の恒温保持の間、一般に大過剰で存在し
なければならない第１の抗体は測定すべき抗原の
抗原決定基と結合する。次いで、引き続き行なわ
れる第２の恒温保持において人血清プロテインの
ような非特異性物質による、もしくは交叉反応性
抗原による妨害を遮断するために、常法で固相か
ら試料液体を分離する。次いで、一定量の第２の
標識抗体を液相中で固相と共に恒温保持する。こ
の際、測定すべき抗原の同じ結合位に対する両方
の抗体間の競合により試験の感度が低下すること
を防ぐために、第２の抗体の特異性は第１の抗体
とは異なる決定基にあわせて選択されているのが
有利である。
この第２の恒温保持の間に、同様に規則的に過
剰に存在する標識された第２の抗体は測定すべき
抗体の分子上の全結合位と反応する。第２の恒温
保持後、標識物質の活性は固相に関しても上澄中
でも測定することができる。通常、液相を洗出し
た後、固相を測定する。最も有利な場合は一定の
活性が測定すべき抗原の量にほぼ比例する。
剰に存在する標識された第２の抗体は測定すべき
抗体の分子上の全結合位と反応する。第２の恒温
保持後、標識物質の活性は固相に関しても上澄中
でも測定することができる。通常、液相を洗出し
た後、固相を測定する。最も有利な場合は一定の
活性が測定すべき抗原の量にほぼ比例する。
この２工程サンドイツチ法は場合により交叉反
応性抗原が第１の相分離の際にすでに除去される
という利点を有する。このことは両方の抗体が高
度の感度に対する要求により本当に異なる特異性
を有していなければならないテスト系において特
に重要である。この場合には両方の抗体の１方に
のみ特異性に関して高い要求があり、他方の抗体
は交叉反応性抗原に対し完全に特異性である必要
はない。
応性抗原が第１の相分離の際にすでに除去される
という利点を有する。このことは両方の抗体が高
度の感度に対する要求により本当に異なる特異性
を有していなければならないテスト系において特
に重要である。この場合には両方の抗体の１方に
のみ特異性に関して高い要求があり、他方の抗体
は交叉反応性抗原に対し完全に特異性である必要
はない。
しかしながらこの方法は三つの著しい欠点を有
する。
する。
１ 第１の恒温保持工程において１方の反応体は
固相として存在し、他方の反応体は溶液中に存
在する。従つて、反応の速度定数は両方の反応
対（抗原及び第１の抗体）が溶液中に存在する
より僅かである。結合していない抗体は相分離
の際に除去されて、結果が誤差を有するように
なるので、固相にすべての抗原分子が結合する
まで恒温保持を続けなければならない。
固相として存在し、他方の反応体は溶液中に存
在する。従つて、反応の速度定数は両方の反応
対（抗原及び第１の抗体）が溶液中に存在する
より僅かである。結合していない抗体は相分離
の際に除去されて、結果が誤差を有するように
なるので、固相にすべての抗原分子が結合する
まで恒温保持を続けなければならない。
２ 抗原に特異的に結合性の抗体の固相への結合
はその僅かな結合収量のために比較的多量の第
１の抗体を必要とするが、この抗体は多くの場
合非常に高価な物質であり、特に抗血清を特異
性という理由により小さな動物、例えば家兎、
モルモツト等から獲得しなければならない場合
は高価である。更に固相への結合反応の際に抗
体への親和性の減少が生じ、このことは感度を
低下させる。
はその僅かな結合収量のために比較的多量の第
１の抗体を必要とするが、この抗体は多くの場
合非常に高価な物質であり、特に抗血清を特異
性という理由により小さな動物、例えば家兎、
モルモツト等から獲得しなければならない場合
は高価である。更に固相への結合反応の際に抗
体への親和性の減少が生じ、このことは感度を
低下させる。
３ 同じ抗原に異なる特異性の２種の抗体を獲得
することは一般に費用がかかり、かついろいろ
な限定をうけてのみ可能である。例えば、ここ
では異なる２種の動物を免疫化するか、又は１
種の動物からの抗体個体群を測定すべき抗原へ
の免疫吸着により好適なフラグメントに分離し
なければならない。
することは一般に費用がかかり、かついろいろ
な限定をうけてのみ可能である。例えば、ここ
では異なる２種の動物を免疫化するか、又は１
種の動物からの抗体個体群を測定すべき抗原へ
の免疫吸着により好適なフラグメントに分離し
なければならない。
前記の欠点を取除くための種々の実験もすでに
公知である。米国特許第4098876号明細書によれ
ば、抗原とアイソトプ標識化した溶解した抗体と
で第１の恒温保持を実施する。その後固相結合抗
体を加え、第２の恒温保持を行なう。ここでは更
に相分離のみが必要であり、このことは感度と操
作性をある程度高める。しかしながら、両方の抗
体を高い特異性で抗原に合わせなければならない
ので、特異性の問題が解決せずに残る。更に、多
量の交叉反応性抗原の存在により測定すべき抗原
の見かけの濃度が、第２の抗体の場合による非特
異性においては高められ、第１の抗体の非特異性
においては下げられる。
公知である。米国特許第4098876号明細書によれ
ば、抗原とアイソトプ標識化した溶解した抗体と
で第１の恒温保持を実施する。その後固相結合抗
体を加え、第２の恒温保持を行なう。ここでは更
に相分離のみが必要であり、このことは感度と操
作性をある程度高める。しかしながら、両方の抗
体を高い特異性で抗原に合わせなければならない
ので、特異性の問題が解決せずに残る。更に、多
量の交叉反応性抗原の存在により測定すべき抗原
の見かけの濃度が、第２の抗体の場合による非特
異性においては高められ、第１の抗体の非特異性
においては下げられる。
西ドイツ国特許公開第2925565号公報に記載さ
れている方法では固相で存在する第１の抗体及び
標識化し溶解した第２の抗体を抗原と同時に恒温
保持する。ここでも前にあげた方法におけるよう
な同じ問題が生じる。更に前記の基礎とした方法
に関して記載した欠点２及び３は未解決のままで
ある。
れている方法では固相で存在する第１の抗体及び
標識化し溶解した第２の抗体を抗原と同時に恒温
保持する。ここでも前にあげた方法におけるよう
な同じ問題が生じる。更に前記の基礎とした方法
に関して記載した欠点２及び３は未解決のままで
ある。
1978年10月６日付の特願昭53−123802号公報に
記載された方法は、第２の抗体に対して特異的に
合わせた固相抗体を使用し、第２の抗体は測定す
べき抗原と結合性である。ここでは抗原に対して
合わせた抗体の固相への結合は回避させた。しか
しながら、抗原と特異的に結合性の抗体をただ１
種使用するので感度は下がる。測定すべき抗原の
濃度検出は抗原及び一定量のアイソトープ標識化
抗原間の特異的抗体との競合反応に関して行なわ
れる。
記載された方法は、第２の抗体に対して特異的に
合わせた固相抗体を使用し、第２の抗体は測定す
べき抗原と結合性である。ここでは抗原に対して
合わせた抗体の固相への結合は回避させた。しか
しながら、抗原と特異的に結合性の抗体をただ１
種使用するので感度は下がる。測定すべき抗原の
濃度検出は抗原及び一定量のアイソトープ標識化
抗原間の特異的抗体との競合反応に関して行なわ
れる。
更に、Clin.Chem.第27巻６号、1981年、第823
〜827頁にはクレアチンキナーゼ、MB−同種酵
素のラジオメトリーによる測定法が記載されてお
り、この方法では第１の恒温保持において抗原を
同時に異なる特異性で、かつ異なる動物種からの
非標識化及び標識化抗体と反応させる。第２の工
程では第１の恒温保持工程の非標識抗体に対して
特異性を有する固相に存在する抗体を添加する。
この方法の欠点は、２つの異なる抗原特異性抗体
及び３つの異なる動物種を必要とするという点で
ある。
〜827頁にはクレアチンキナーゼ、MB−同種酵
素のラジオメトリーによる測定法が記載されてお
り、この方法では第１の恒温保持において抗原を
同時に異なる特異性で、かつ異なる動物種からの
非標識化及び標識化抗体と反応させる。第２の工
程では第１の恒温保持工程の非標識抗体に対して
特異性を有する固相に存在する抗体を添加する。
この方法の欠点は、２つの異なる抗原特異性抗体
及び３つの異なる動物種を必要とするという点で
ある。
従つて、本発明の課題は前記基礎方法の欠点の
１個以上を従来公知の方法より良好に回避するこ
とである。
１個以上を従来公知の方法より良好に回避するこ
とである。
この課題は第１及び第３のレセプターが液相に
あり、かつ抗原と結合性であり、第２のレセプタ
ーは固相にあり、かつ第１のレセプターと結合性
であり、第３のレセプターは標識を有しており、
かつ第１及び第２のレセプターと交叉反応しな
い、三種の異なるレセプターと恒温保持し、液相
から固相を分離するが、この際抗原を三種すべて
のレセプターと同時に、又は第１及び第２のレセ
プターと同時に恒温保持し、次いで相を分離し、
場合により固相を第３のレセプターと共に恒温保
持し、新たに相を分離し、かつ一方の相の標識を
測定することにより多価抗原を測定するための方
法において、第１及び第３レセプターがそれぞれ
１つの抗体又はこの抗体からのフラグメトを含有
し、かつ両方の抗体もしくはフラグメントが同じ
動物種から由来する、第１及ひ第３レセプターを
使用することにより解決する。
あり、かつ抗原と結合性であり、第２のレセプタ
ーは固相にあり、かつ第１のレセプターと結合性
であり、第３のレセプターは標識を有しており、
かつ第１及び第２のレセプターと交叉反応しな
い、三種の異なるレセプターと恒温保持し、液相
から固相を分離するが、この際抗原を三種すべて
のレセプターと同時に、又は第１及び第２のレセ
プターと同時に恒温保持し、次いで相を分離し、
場合により固相を第３のレセプターと共に恒温保
持し、新たに相を分離し、かつ一方の相の標識を
測定することにより多価抗原を測定するための方
法において、第１及び第３レセプターがそれぞれ
１つの抗体又はこの抗体からのフラグメトを含有
し、かつ両方の抗体もしくはフラグメントが同じ
動物種から由来する、第１及ひ第３レセプターを
使用することにより解決する。
レセプターとしては本発明の範囲において特異
的に結合性の完全抗体、抗体フラグメント又は抗
体又は抗体フラグメントとハプテンとの結合体を
使用する。第１のレセプターとしては完全抗体又
はハプテンと共有結合した抗体を使用するのが有
利である。
的に結合性の完全抗体、抗体フラグメント又は抗
体又は抗体フラグメントとハプテンとの結合体を
使用する。第１のレセプターとしては完全抗体又
はハプテンと共有結合した抗体を使用するのが有
利である。
第２のレセプターとしては第１のレセプターの
１部とのみ結合性の抗体を使用するのが有利であ
り、特に第１のレセプターのFc部と結合性であ
る抗体が有利である。選択的に第２のレセプター
として第１のレセプターのハプテン部又はFab−
部又は第１のレセプター全体と特異的に結合性の
抗体を使用することもできる。第３のレセプター
は第２のレセプターと交叉反応してはいけない。
１部とのみ結合性の抗体を使用するのが有利であ
り、特に第１のレセプターのFc部と結合性であ
る抗体が有利である。選択的に第２のレセプター
として第１のレセプターのハプテン部又はFab−
部又は第１のレセプター全体と特異的に結合性の
抗体を使用することもできる。第３のレセプター
は第２のレセプターと交叉反応してはいけない。
第１のレセプターの１部、例えばフラグメント
からなり、従つて第１のレセプターと同じ動物種
から得られる第３のレセプターを使用するのが有
利である。このことは第１のレセプターがハプテ
ンを有する抗体からなり、かつ第２のレセプター
はこのハプテンとのみ結合性である場合にも言え
る。第３のレセプターが第１のレセプターのFab
フラグメントである場合に有利である。このこと
は３種のレセプターにとつてわずかに２種の動物
種を必要とするという利点を有する。第２のレセ
プターがハプテンとのみ結合性である場合、三種
のレセプターすべてにわずか１種の動物種のみが
必要である。
からなり、従つて第１のレセプターと同じ動物種
から得られる第３のレセプターを使用するのが有
利である。このことは第１のレセプターがハプテ
ンを有する抗体からなり、かつ第２のレセプター
はこのハプテンとのみ結合性である場合にも言え
る。第３のレセプターが第１のレセプターのFab
フラグメントである場合に有利である。このこと
は３種のレセプターにとつてわずかに２種の動物
種を必要とするという利点を有する。第２のレセ
プターがハプテンとのみ結合性である場合、三種
のレセプターすべてにわずか１種の動物種のみが
必要である。
公知量で使用される第３のレセプターは専門家
に公知の方法で標識化される。標識化は酵素、蛍
光物質、化学発光性物質又は放射性物質とカツプ
リングすることにより行なわれる。この種のレセ
プターの標識化法は専門家に公知であり、例えば
Clin.Chim.Acta第81巻（1977年）第１〜40頁に
記載されており、ここでは詳しい説明は省略す
る。
に公知の方法で標識化される。標識化は酵素、蛍
光物質、化学発光性物質又は放射性物質とカツプ
リングすることにより行なわれる。この種のレセ
プターの標識化法は専門家に公知であり、例えば
Clin.Chim.Acta第81巻（1977年）第１〜40頁に
記載されており、ここでは詳しい説明は省略す
る。
本発明の方法は測定すべき、少なくとも２価の
抗原を含有する試料を三種すべての受容体と同時
に恒温保持するこより実施することができる。こ
の場合、恒温保持の後固相及び液相を分離し、標
識化した第３のレセプターの量を液相中で又は有
利に固相中で測定する。
抗原を含有する試料を三種すべての受容体と同時
に恒温保持するこより実施することができる。こ
の場合、恒温保持の後固相及び液相を分離し、標
識化した第３のレセプターの量を液相中で又は有
利に固相中で測定する。
しかしながら本発明の有利な実施形によれば、
抗原含有試料を先ず第１及び第２のレセプターと
共に恒温保持し、その後この相を分離し、分離し
た固相のみを第３のレセプターと共に第２の恒温
保持工程で恒温保持する。その後、再び液相から
固相を分離し、前記のように標識化した第３のレ
セプターの量を１方の相で測定する。第１又は第
３のレセプターが抗原と特異的に結合性であり、
他のレセプターは他の抗原とも結合性である、す
なわち非特異性である場合、この２工程恒温保持
で十分である。１工程恒温保持、すなわち三種全
部のレセプターとの１工程恒温保持の場合、第１
及び第３のレセプターは特異的に結合性でなけれ
ばならない。
抗原含有試料を先ず第１及び第２のレセプターと
共に恒温保持し、その後この相を分離し、分離し
た固相のみを第３のレセプターと共に第２の恒温
保持工程で恒温保持する。その後、再び液相から
固相を分離し、前記のように標識化した第３のレ
セプターの量を１方の相で測定する。第１又は第
３のレセプターが抗原と特異的に結合性であり、
他のレセプターは他の抗原とも結合性である、す
なわち非特異性である場合、この２工程恒温保持
で十分である。１工程恒温保持、すなわち三種全
部のレセプターとの１工程恒温保持の場合、第１
及び第３のレセプターは特異的に結合性でなけれ
ばならない。
固相中に存在する第２のレセプターの不溶性担
持材への結合は固体の担持物質上に生物学的に活
性の蛋白質を固定するため専門家に公知の常法に
より実施することができる。共有結合でも吸着結
合でも好適である。しかしながら高い収量が達せ
られ、方法も簡単であるので、例えばプラスチツ
クへのただの吸着結合が有利である。この際、特
に好適であるのは内部表面が第２のレセプターを
吸着的に積層しているポリスチロール及び類似の
プラスチツクからなる小試験管である。この第１
及び場合により第２の恒温保持をこの小試験管又
は他の形の容器中で実施し、相分離のためには液
相を小試験管から例えば吸引等により除去するこ
とで十分である。小試験管の洗浄の後、標識の測
定もその中で行ない、特に標識が酵素で行なわれ
ている時有利である。標識酵素、例えばペルオキ
シダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼの活性は一般
に単にこのために公知の方法で測定するだけで十
分である。測定した酵素活性は測定すべき多価抗
原の量の尺度である。第２のレセプターの固体相
担持材としては粒状物質、例えばイオン交換体、
モレキユラーシーブ材料、ガラス小粒子、プラス
チツク小管等を挙げることができる。
持材への結合は固体の担持物質上に生物学的に活
性の蛋白質を固定するため専門家に公知の常法に
より実施することができる。共有結合でも吸着結
合でも好適である。しかしながら高い収量が達せ
られ、方法も簡単であるので、例えばプラスチツ
クへのただの吸着結合が有利である。この際、特
に好適であるのは内部表面が第２のレセプターを
吸着的に積層しているポリスチロール及び類似の
プラスチツクからなる小試験管である。この第１
及び場合により第２の恒温保持をこの小試験管又
は他の形の容器中で実施し、相分離のためには液
相を小試験管から例えば吸引等により除去するこ
とで十分である。小試験管の洗浄の後、標識の測
定もその中で行ない、特に標識が酵素で行なわれ
ている時有利である。標識酵素、例えばペルオキ
シダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼの活性は一般
に単にこのために公知の方法で測定するだけで十
分である。測定した酵素活性は測定すべき多価抗
原の量の尺度である。第２のレセプターの固体相
担持材としては粒状物質、例えばイオン交換体、
モレキユラーシーブ材料、ガラス小粒子、プラス
チツク小管等を挙げることができる。
標識が酵素ではなく放射性物質、アイソトー
プ、蛍光性物質又は化学発光性物質で行なわれる
ならば、ここでも専門家に公知の方法で実施され
る。この測定法の記載はここでは省略する。
プ、蛍光性物質又は化学発光性物質で行なわれる
ならば、ここでも専門家に公知の方法で実施され
る。この測定法の記載はここでは省略する。
意外にも、本発明により常用の二工程サンドイ
ツチ法におけるより明らかに高い感度が達せられ
ることがわかつた。更に、第１のレセプターが固
相に存在する場合に可能である濃度よりより著し
く僅かな濃度で第１のレセプターを使用すること
ができる。
ツチ法におけるより明らかに高い感度が達せられ
ることがわかつた。更に、第１のレセプターが固
相に存在する場合に可能である濃度よりより著し
く僅かな濃度で第１のレセプターを使用すること
ができる。
本発明の有利な実施形により、第１のレセプタ
ーのFc−部又は第１のレセプターとカツプリン
グしているハプテンに対して合わせた第２のレセ
プターを使用すると、第１のレセプターの結合部
と抗原との結合反応の場合により存在する立体的
障害が回避されるので、更に感度の上昇が達せら
れる。このことは抗原を特に僅かな濃度で測定し
なければならない時、例えば血清中のチレオトロ
ピンの測定における場合、特に有利である。
ーのFc−部又は第１のレセプターとカツプリン
グしているハプテンに対して合わせた第２のレセ
プターを使用すると、第１のレセプターの結合部
と抗原との結合反応の場合により存在する立体的
障害が回避されるので、更に感度の上昇が達せら
れる。このことは抗原を特に僅かな濃度で測定し
なければならない時、例えば血清中のチレオトロ
ピンの測定における場合、特に有利である。
本発明により第３のレセプターとして第１のレ
セプターのFab−フラグメントを使用するなら
ば、レセプター２は抗体のFc−部に対する、又
は抗体とカツプリングしたハプテンに対する決定
基のみを有しているのでレセプター１及びレセプ
ター３は同じ動物種からのものが有利であるとい
うことは明らかである。
セプターのFab−フラグメントを使用するなら
ば、レセプター２は抗体のFc−部に対する、又
は抗体とカツプリングしたハプテンに対する決定
基のみを有しているのでレセプター１及びレセプ
ター３は同じ動物種からのものが有利であるとい
うことは明らかである。
本発明のもう１つの課題は多価抗原の測定のた
めの乾燥試薬であり、この試薬は異なる溶解性
の、抗原と結合性の、そのうちの１種が標識を有
するレセプター２種と、溶解性の非標識レセプタ
ーとのみ結合性の不溶性のレセプター１種とを含
有し、かつ標識化レセプターが可溶性の非標識レ
セプターの１部を含有し、かつここで不溶性レセ
プター及び可溶性非標識レセプターが物理的に分
離して存在することを特徴とする。
めの乾燥試薬であり、この試薬は異なる溶解性
の、抗原と結合性の、そのうちの１種が標識を有
するレセプター２種と、溶解性の非標識レセプタ
ーとのみ結合性の不溶性のレセプター１種とを含
有し、かつ標識化レセプターが可溶性の非標識レ
セプターの１部を含有し、かつここで不溶性レセ
プター及び可溶性非標識レセプターが物理的に分
離して存在することを特徴とする。
物理的分離とは例えば不溶性レセプター及び可
溶性非標識レセプターを段階的に順次凍結乾燥さ
せるが、その際例えば糖からなつていてよい不活
性中間層をはじめに凍結乾燥したアクセプターの
層上に担持させることにより行なうことができ
る。こうして、例えば第２レセプターを先ずプラ
スチツク小管の内壁上に凍結乾燥により不溶性と
し、その上に例えば蔗糖からなる不活性中間層を
凍結乾燥させ、次いで同様に凍結乾燥した非標識
化可溶性レセプターである第１のレセプターを加
えることにより可能である。この際第３の可溶性
標識化レセプターは第１のレセプターと混合し
て、又はこれと分離して添加することができる。
不活性中間層としては炭水化物の他にも容易に可
溶性のポリマーを、例えば水溶性ポリマーからの
箔の形で使用することができる。
溶性非標識レセプターを段階的に順次凍結乾燥さ
せるが、その際例えば糖からなつていてよい不活
性中間層をはじめに凍結乾燥したアクセプターの
層上に担持させることにより行なうことができ
る。こうして、例えば第２レセプターを先ずプラ
スチツク小管の内壁上に凍結乾燥により不溶性と
し、その上に例えば蔗糖からなる不活性中間層を
凍結乾燥させ、次いで同様に凍結乾燥した非標識
化可溶性レセプターである第１のレセプターを加
えることにより可能である。この際第３の可溶性
標識化レセプターは第１のレセプターと混合し
て、又はこれと分離して添加することができる。
不活性中間層としては炭水化物の他にも容易に可
溶性のポリマーを、例えば水溶性ポリマーからの
箔の形で使用することができる。
本発明は少なくとも抗原決定基を２つ有するす
べての抗原を測定するために好適である。このた
めの例はチレオトロピン（TSH）、１−フエトプ
ロテイン（AFP）、hCG、癌胎生的抗原、黄体化
ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、β2
−ミクログロブリン、酸性前立腺ホスフアター
ゼ、プロラクチン、フエリチン及びインシユリン
である。
べての抗原を測定するために好適である。このた
めの例はチレオトロピン（TSH）、１−フエトプ
ロテイン（AFP）、hCG、癌胎生的抗原、黄体化
ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、β2
−ミクログロブリン、酸性前立腺ホスフアター
ゼ、プロラクチン、フエリチン及びインシユリン
である。
本発明においてはレセプター１は抗原と同一相
間で反応する。従つて、この反応は固相に結合し
た第１のレセプターを使用する場合におけるより
高い速度定数を有する。固相への固定の際の抗体
損失を回避することができるので、第１のレセプ
ターの量は更に減少させることができる。
間で反応する。従つて、この反応は固相に結合し
た第１のレセプターを使用する場合におけるより
高い速度定数を有する。固相への固定の際の抗体
損失を回避することができるので、第１のレセプ
ターの量は更に減少させることができる。
Clin.Chem.第27巻６号（1981）に記載されて
いる方法と異なり、第１及び第３レセプターを２
種の異なる動物種から獲得し、かつレセプター２
がレセプター１とだけ反応し、レセプター３と反
応しないように選択するということは本発明にお
いては必要ないのである。
いる方法と異なり、第１及び第３レセプターを２
種の異なる動物種から獲得し、かつレセプター２
がレセプター１とだけ反応し、レセプター３と反
応しないように選択するということは本発明にお
いては必要ないのである。
レセプター１及びレセプター３のための抗体を
同一動物種から獲得することは抗血清獲得のため
に大きな動物を利用することをも可能とする。
同一動物種から獲得することは抗血清獲得のため
に大きな動物を利用することをも可能とする。
前記の利点は唯一の恒温保持工程を有する本発
明方法を実施する際にも言える。しかしながら唯
一の恒温保持工程を有する場合、二回の恒温保持
工程を有する有利な実施形におけるような高い特
異性は達せられない。
明方法を実施する際にも言える。しかしながら唯
一の恒温保持工程を有する場合、二回の恒温保持
工程を有する有利な実施形におけるような高い特
異性は達せられない。
更に、本発明により感度も上昇する。TSHに
とつて感度は40pｇ／ml（1μU∧＝170pｇ／ml）よ
り小さいことが判明し、２部位アツセイ法（サン
ドイツチ法）においては100pｇ／mlを越える。
とつて感度は40pｇ／ml（1μU∧＝170pｇ／ml）よ
り小さいことが判明し、２部位アツセイ法（サン
ドイツチ法）においては100pｇ／mlを越える。
次に実施例につき本発明を更に詳細に説明す
る： 例 １ チレオトロピン（TSH）の測定 家兎IgＧからのFcY−フラグメントで免疫化す
ることにより得られた羊抗−家兎−FcY約100n
ｇを吸着的に積層した（積層法は常用の公知法と
同じ）プラスチツク小試験管中に試料又は標準液
（チレオトロピンを上昇量で又は未知量で含有）
200μ及び緩衝剤Ａ及び家兎の抗−TSH−抗体
20nｇ／mlからなる溶液1000μをピペツトで入
れる。（緩衝剤Ａ：NaH2PO4／KH2PO410ｍＭ、
PH7.0） この溶液を室温で12〜16時間恒温保持する；そ
の後試験管内容物を吸引除去し、0.9％NaCl溶液
で１回洗浄し、引き続きペルオキシダーゼ濃度67
ｍＵ／mlでPODが共有結合している羊の抗−
TSH−抗体の水溶液からなる共存溶液1000μを
小試験管にピペツトで入れる。
る： 例 １ チレオトロピン（TSH）の測定 家兎IgＧからのFcY−フラグメントで免疫化す
ることにより得られた羊抗−家兎−FcY約100n
ｇを吸着的に積層した（積層法は常用の公知法と
同じ）プラスチツク小試験管中に試料又は標準液
（チレオトロピンを上昇量で又は未知量で含有）
200μ及び緩衝剤Ａ及び家兎の抗−TSH−抗体
20nｇ／mlからなる溶液1000μをピペツトで入
れる。（緩衝剤Ａ：NaH2PO4／KH2PO410ｍＭ、
PH7.0） この溶液を室温で12〜16時間恒温保持する；そ
の後試験管内容物を吸引除去し、0.9％NaCl溶液
で１回洗浄し、引き続きペルオキシダーゼ濃度67
ｍＵ／mlでPODが共有結合している羊の抗−
TSH−抗体の水溶液からなる共存溶液1000μを
小試験管にピペツトで入れる。
室温で恒温保持２時間後、試験管の内容物を吸
引除去し、洗浄し、引き続きペルオキシダーゼ活
性を検出するための試薬1000μを試験管にピペ
ツトで入れる。
引除去し、洗浄し、引き続きペルオキシダーゼ活
性を検出するための試薬1000μを試験管にピペ
ツトで入れる。
試薬としてはABTS（1.8ｍＭ、過硼酸塩3.3ｍ
Ｍ、燐酸塩／クエン酸塩−緩衝液100ｍＭ中、PH
4.4）を使用する。更に室温で１時間恒温保持し
た後、内容物をクイベツト中に入れ、吸光を空値
として試薬に対し405nｍで測定する。得られた
吸光から第１図に記載した検量線が得られる。
Ｍ、燐酸塩／クエン酸塩−緩衝液100ｍＭ中、PH
4.4）を使用する。更に室温で１時間恒温保持し
た後、内容物をクイベツト中に入れ、吸光を空値
として試薬に対し405nｍで測定する。得られた
吸光から第１図に記載した検量線が得られる。
抗体へのペルオキシダーゼの共有結合（カツプ
リング）はウイルソン（M.B.Wilson）、ナカネ
（Paul K.Nakane）の方法、エルゼンフイア／ノ
ースホランド．ビオメデイカル．プレス
（Elsevier／North−Holland Biomedical
Press）の“イムンフルオレツセンス・アンド・
リレイテツド・ステイニング・テクニツクス
（Immunfluorescence and Related Staining
Techniques）”、1978年の第215〜224頁、“リーセ
ント・デベロツプメンツ・イン・ザ・パーヨーデ
イト・メトード・オブ・コンニユゲイテイング・
ホース・ラデイツシユ・パーオキシダーゼ
（HRPO）・ツー・アンチボデイーズ（Recet
Developments in the Perjodate Methode of
Conjugating Horse Radish Peroxidase
（HRPO）to Antibodies）”中に記載の方法によ
り行なわれる。
リング）はウイルソン（M.B.Wilson）、ナカネ
（Paul K.Nakane）の方法、エルゼンフイア／ノ
ースホランド．ビオメデイカル．プレス
（Elsevier／North−Holland Biomedical
Press）の“イムンフルオレツセンス・アンド・
リレイテツド・ステイニング・テクニツクス
（Immunfluorescence and Related Staining
Techniques）”、1978年の第215〜224頁、“リーセ
ント・デベロツプメンツ・イン・ザ・パーヨーデ
イト・メトード・オブ・コンニユゲイテイング・
ホース・ラデイツシユ・パーオキシダーゼ
（HRPO）・ツー・アンチボデイーズ（Recet
Developments in the Perjodate Methode of
Conjugating Horse Radish Peroxidase
（HRPO）to Antibodies）”中に記載の方法によ
り行なわれる。
ABTS＝２，2′−アジノジ〔３−エチル−ベン
ズチアゾリン−スルホネート６〕。
ズチアゾリン−スルホネート６〕。
例 ２
α1−フエトプロテイン（AFP）の測定
試料又はAFPの上昇量を含有する標準200μ
を燐酸塩緩衝液、100ｍＭ、PH6.8、1000μ中に
溶けている抗−AFP−抗体3onｇと共に、例１に
使用した（家兎IgGのFc−フラグメント含有）小
試験管中にピペツトで装入する。
を燐酸塩緩衝液、100ｍＭ、PH6.8、1000μ中に
溶けている抗−AFP−抗体3onｇと共に、例１に
使用した（家兎IgGのFc−フラグメント含有）小
試験管中にピペツトで装入する。
室温で２時間恒温保持した後吸引除去し、洗浄
し、ペルオキシダーゼに結合した羊の抗−AFP
−抗体からなる結合体1000μ（ナカネによる）
を小試験管中にピペツトで入れる。更に室温で２
時間恒温保持した後、あらたに吸引除去し、洗浄
し、基質溶液を小試験管壁に固定したペルオキシ
ダーゼ活性の検出のためにピペツトで測り入れ
る。１時間恒温保持した後、405nｍで光度計に
より吸収を測定する。
し、ペルオキシダーゼに結合した羊の抗−AFP
−抗体からなる結合体1000μ（ナカネによる）
を小試験管中にピペツトで入れる。更に室温で２
時間恒温保持した後、あらたに吸引除去し、洗浄
し、基質溶液を小試験管壁に固定したペルオキシ
ダーゼ活性の検出のためにピペツトで測り入れ
る。１時間恒温保持した後、405nｍで光度計に
より吸収を測定する。
評価を例１におけると同様に記載した第２図の
検量線により行なう。
検量線により行なう。
例 ３
α1−フエトプロテインの測定
この実施形においては家兎の抗−ジゴキシン−
抗体を吸着的に積層した（抗−ジゴキシン−抗体
100nｇ）小試験管を使用する。
抗体を吸着的に積層した（抗−ジゴキシン−抗体
100nｇ）小試験管を使用する。
抗体１としてはジゴキシン及び羊の抗−AFP
−抗体（20nｇ／ml）からなる結合体を使用す
る。結合体の製造は西ドイツ国特許第2537129号
明細書中に記載されている。
−抗体（20nｇ／ml）からなる結合体を使用す
る。結合体の製造は西ドイツ国特許第2537129号
明細書中に記載されている。
これ以外は例２と同様に行なう。得られた検量
線を第３図に記載する。
線を第３図に記載する。
第１図〜第３図は本発明による実施例により得
られた検量線の図であり、第１図は実施例１の方
法により得られた試料中のチレオトロピンの量と
405nｍにおける吸光度との関係を示す検量線の
図であり、第２図は実施例２の方法により得られ
た試料中のAFPの量と405nｍにおける吸光度と
の関係を示す検量線の図であり、第３図は実施例
３の方法により得られた検量線の図である。
られた検量線の図であり、第１図は実施例１の方
法により得られた試料中のチレオトロピンの量と
405nｍにおける吸光度との関係を示す検量線の
図であり、第２図は実施例２の方法により得られ
た試料中のAFPの量と405nｍにおける吸光度と
の関係を示す検量線の図であり、第３図は実施例
３の方法により得られた検量線の図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 第１及び第３のレセプターが液相中に存在
し、かつ抗原と結合性であり、第２のレセプター
は固相中に存在し、かつ第１のレセプターと結合
性であり、第３のレセプターは標識を有してお
り、かつ第１及び第２のレセプターと交叉反応し
ない、三種の異なるレセプターと恒温保持し、液
相から固相を分離するが、この際、抗原を三種す
べてのレセプターと同時に、又は第１及び第２の
レセプターと同時に恒温保持し、次いで相を分離
し、場合により固相を第３とレセプターと共に恒
温保持し、新たに相を分離し、かつ一方の相の標
識を測定することにより多価抗原を測定するため
の方法において、第１及び第３レセプターがそれ
ぞれ１つの抗体又はこの抗体からのフラグメント
を含有し、かつ両方の抗体もしくはフラグメント
が同じ動物種から由来する、第１及び第３レセプ
ターを使用することを特徴とする多価抗原の測定
法。 ２ 第１のレセプターとして抗体を使用する特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 第１のレセプターとしてハプテンと共有結合
した抗体を使用する特許請求の範囲第２項記載の
方法。 ４ 第１のレセプターの１部とだけ結合性の第２
のレセプターを使用する特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ５ 第１のレセプターのFc−部又はハプテン部
と結合性である第２のレセプターを使用する特許
請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 第３のレセプターとして第１のレセプターの
１部を使用する特許請求の範囲第２項から第５項
までのいずれか１項に記載の方法。 ７ 第１のレセプターのFab−フラグメントであ
る第３のレセプターを使用する特許請求の範囲第
６項記載の方法。 ８ 第２のレセプターとして第１及び第３のレセ
プターと同じ動物種から由来する抗体を使用する
特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれか
１項に記載の方法。 ９ 酵素、蛍光性物質、化学発光性物質又は放射
性物質で標識されている第３のレセプターを使用
する特許請求の範囲第１項から第８項までのいず
れか１項に記載の方法。 １０ 第１及び第３のレセプターが液相中に存在
し、かつ抗原と結合性であり、第２のレセプター
は固相中に存在し、かつ第１のレセプターと結合
性であり、第３のレセプターは標識を有してお
り、かつ第１及び第２のレセプターと交叉反応し
ない、三種の異なるレセプターと恒温保持し、液
相から固相を分離するが、この際、抗原を三種す
べてのレセプターと同時に、又は第１及び第２の
レセプターと同時に恒温保持し、次いで相を分離
し、場合により、固相を第３のレセプターと共に
恒温保持し、新たに相を分離し、かつ一方の相の
標識を測定することにより多価抗原を測定するた
めの試薬であつて、抗原と結合性の異なる溶解性
の、そのうちの１種が標識を有するレセプター２
種と、可溶性の非標識レセプターと結合性の不溶
性の第３のレセプターとを含有する乾燥試薬にお
いて、両方の可溶性レセプターが同じ動物種から
由来する抗体又は抗体からのフラグメントを含有
し、ここで不溶性レセプター及び可溶性非標識レ
セプターが物理的に分離して存在することを特徴
とする多価抗原の測定試薬キツト。 １１ 不溶性レセプターが可溶性レセプター中の
抗体もしくはフラグメントと同じ動物種から由来
する抗体のフラグメントを含有する特許請求の範
囲第１０項記載の測定試薬キツト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823225027 DE3225027A1 (de) | 1982-07-05 | 1982-07-05 | Immunchemisches messverfahren |
| DE32250274 | 1982-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5923251A JPS5923251A (ja) | 1984-02-06 |
| JPH0413659B2 true JPH0413659B2 (ja) | 1992-03-10 |
Family
ID=6167624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58121160A Granted JPS5923251A (ja) | 1982-07-05 | 1983-07-05 | 多価抗原の測定法及び測定試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4624930A (ja) |
| EP (1) | EP0098590B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5923251A (ja) |
| AT (1) | ATE40602T1 (ja) |
| DE (2) | DE3225027A1 (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE3377531D1 (en) * | 1982-09-29 | 1988-09-01 | Serono Diagnostics Ltd | Immunoassay of antigens |
| FR2549230B1 (fr) * | 1983-06-14 | 1986-04-11 | Bio Merieux | Procede de detection d'un oligomere dans un milieu liquide contenant des monomeres correspondants, dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede et application notamment a la recherche d'allergenes |
| JPS6082966A (ja) * | 1983-10-14 | 1985-05-11 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 抗原の定量法 |
| IL73938A (en) * | 1984-01-02 | 1989-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors |
| JPS60150413U (ja) * | 1984-03-19 | 1985-10-05 | フアインフイ−ルド株式会社 | 回転角検出器 |
| JPH0656383B2 (ja) * | 1985-02-22 | 1994-07-27 | オリンパス光学工業株式会社 | 酵素免疫学的自動分析装置 |
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| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US5061237A (en) * | 1985-07-02 | 1991-10-29 | Cytomed Medizintechnik Gmbh | Method of purifying whole blood |
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| JPH081438B2 (ja) * | 1986-05-13 | 1996-01-10 | 三洋化成工業株式会社 | 酵素免疫測定法 |
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| US5459080A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Ion-capture assays using a specific binding member conjugated to carboxymethylamylose |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3379116D1 (en) | 1989-03-09 |
| DE3225027A1 (de) | 1984-01-05 |
| EP0098590B1 (de) | 1989-02-01 |
| US4624930A (en) | 1986-11-25 |
| EP0098590A2 (de) | 1984-01-18 |
| JPS5923251A (ja) | 1984-02-06 |
| ATE40602T1 (de) | 1989-02-15 |
| EP0098590A3 (en) | 1984-03-07 |
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