JPH0235944B2 - Tokuitekiketsugokenteiojitsushisuruhohooyobigaihohoojitsushisurutamenoshikenkitsuto - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 試験物質を多分含む検定用試料(a)を固体支持
体上に固定された、試験物質に特異的な結合相手
(b)および検出可能なマーカーに抱合された、試験
物質に特異的な結合相手(c)と反応させることによ
り、存在する試験物質の量と試薬(b)および(c)との
間の反応によりマーカーが試験物質を介して支持
体に固定された複合体を形成させ、そしてマーカ
ーが試料(a)中に存在するどれかの試験物質の量の
指数として検出または検定され、反応成分(a)、
(b)、および(c)すべてを単一反応液中での反応に対
し単一段階で混合される特異的結合検定を実施す
るための方法であつて、試験物質と試薬(b)および
(c)との結合反応間の競合干渉を、反応液と接触し
ている表面上に被覆した上塗りのような緩徐放出
形の試薬(c)との使用により回避することを特徴と
する、前記方法。

２ 成分(b)が免疫吸収剤の表面を有する、液体検
定試薬中に浸けるための棒、ペグまたはびようを
含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載
の方法。

３ 特異的結合反応が生起する水性液体を含むく
ぼみまたはカツプの容量の大部分を占める排除体
の表面上に特異的結合試薬(b)が固定されているこ
とを特徴とする、請求の範囲第１項又は第２項に
記載の方法。

４ 排除体がくぼみまたはカツプと実質的に相補
的でかつそれより幾分小さい形を有することを特
徴とする、請求の範囲第３項に記載の方法。

５ 試薬(c)の上塗りが、水性反応液体を含有すべ
き反応くぼみまたはカツプの表面に被覆されてい
ることを特徴とする、請求の範囲第２、３又は４
項のいずれか一項に記載の方法。

６ 試薬(c)の上塗りが排除体、棒、ペグ又はびよ
う上に被覆されていることを特徴とする、請求の
範囲第２、３又は４項のいずれか一項に記載の方
法。

７ 固定された特異的結合試薬(b)が、固定化抗体
又は被験免疫グロブリンが特異的に結合し得る固
定化物質であつて、マーカー抱合体試薬(c)が結合
相手若しくは抗体試薬(b)に対する特異的なもう一
つの抗体、または被験免疫グロブリンに対して特
異的な抗グロブリンであることを特徴とする、請
求の範囲第１ないし６項のいずれか一項に記載の
方法。

８ 固体支持体上に支えられた、試験物質に対す
る固定された特異的結合相手(i)及び固定された試
薬(i)と接触している反応液へ添加される、試験物
質に対するマーカー抱合特異的結合相手(ii)からな
る特異的結合検定を実施するための試験キツトで
あつて、マーカー抱合特異的結合相手(ii)が反応液
と接触することになる表面上に被覆された上塗り
として存在することを特徴とする、前記キツト。

９ 成分(i)が免疫吸収剤の表面を有する、液体検
定試薬中に浸けるための棒、ペグまたはびようの
表面に固定されていることを特徴とする、請求の
範囲第８項に記載のキツト。

１０ 水性試験反応液体を含有すべきくぼみまた
はカツプの容量の大部分を占める排除体の表面上
に成分(i)が固定されていることを特徴とする、請
求の範囲第８項に記載のキツト。

１１ 上塗りが水性試験反応液体を含有すべきく
ぼみまたはカツプの表面に被覆されていることを
特徴とする、請求の範囲第９項又は１０項に記載
のキツト。

１２ 上塗りが排除体、棒、ペグ又はびよう上に
被覆されていることを特徴とする、請求の範囲第
９項又は１０項に記載のキツト。

明細書 本発明は特異的結合検定、例えばイムノアツセ
イ、を実施するための方法、およびこれらの方法
を実施するための装置、例えば試験キツト、に関
する。

特別な具体例において、本発明は酵素と結合し
た、および螢光性マーカーと結合した特異的結合
検定、例えばイムノアツセイ、に適合可能であ
る。

種々様々なイムノアツセイおよび他の特異的結
合検定が既に知られている。

このような検定法およびそれらに用いる材料の
例はエス・スペクター（S.Spector）、Ann.Rev.
Pharm.（1973）13、359〜70（ラジオイムノアツセ
イ）、エル．イー．エム．マイルズ（L.E.M.
Miles）およびジー．エヌ．ヘイルズ（C.N.
Hales）、Nature（1968）219、186〜189（放射性、
酵素および他のマーカーを用いる検定）、イー．
ヘイバーマン（E.Habermann）、Z.Klin.Chem.u.
Klin.Biochem.（1970）８、51〜55（放射能標識お
よび酵素標識検定法）、および英国特許第1363565
号明細書（酵素標識イムノアツセイ）および米国
特許第4150949号および第4160818号明細書（螢光
標識イムノアツセイ）に示されている。

このような検定の一つの重要な群は特定の吸着
剤、検定下におかれた材料、および検定下におか
れた物質に対し特異的な結合能をもつマーカー抱
合物質（「コンジユゲート」）の間で三成分複合体
を形成させるものからなる。この種のある検定法
は「サンドイツチ」または「抗グロブリン」検定
と呼ばれて来た。これらは特定の吸着剤に固定さ
れるようになるマーカーの量が三成分複合体に関
与する検定下の物質の量と直接（逆にではなく）
関係づけられる性質をもち、そしてこれは使用し
たマーカーに適した仕方で残留する遊離の印づけ
られた接合物から固定された物質を分離した後に
簡単に測ることができる。

しかし、例えば上記のヘイバーマン（1970）の
発行文献および英国特許第1363565号明細書から
明らかなように、これら検定法の使用性は難点が
ないわけではない。これらは検定反応を実施する
ために幾つかの連続した処理工程を要求するか、
またはさもなければ低感度を蒙むり、試薬の注意
深い選択はこれまで克服されたことがない。

次のものから本質的になる市販試験キツトが入
手できる： (a) 場合に応じて抗体または抗原で被覆された管
または予かじめ形づくられたくぼみの列からな
るプレート。

(b) 試験試料中に存在するかもしれない検出すべ
き物質に対する適切な抗体（いわゆるコンジユ
ゲート）に結合した酵素。

(c) 酵素活性の測定のための基質。

抗原または抗体の検定を行なうための一つの
標準法は下記のものを含む： (1) 試験試料に対し使用希釈を決定する、 (2) くぼみを感作するために用いた抗体または
抗原の過剰分を除去する、 (3) くぼみを洗浄する、 (4) ある割合の適当な希釈した試験試料を導入
する、 (5) 約２時間インキユベートして試験試料中の
検出すべき物質を感作物質に結合させる、 (6) くぼみを洗浄して未反応物質を除去する、 (7) 適当に希釈したコンジユゲートを導入する
（約２時間インキユベーシヨンする）、 (8) くぼみを洗浄して未反応物質を除去する、 (9) 基質の溶液を加える、 (10) 基質と酵素との反応の結果として適当な強
度の色が現われるまでインキユベーシヨンす
る、 (11) 反応を、例えば強アルカリで止める、 (12) 反応した基質溶液の光学密度を測定する。

この手順は幾つかの抗体／抗原反応の各々が反
応平衡まで数時間を要するので時間消費でもあ
る。実際上はより短いインキユベーシヨン時間が
用いられるが、感度および（または）経済性を犠
性にしてはじめてなしうることである。

本研究の結果によれば、より少ない検定段階の
使用に対する障害は成分の二つの間の防害反応か
ら生ずる望む固定複合体の形成による望まない干
渉であると考えられる。選ばれたせまい特異性
の、あるいは緩徐放出形の特異的結合剤の使用に
よりこのような干渉を回避でき、そしてより少な
い処理段階を用いて高感度の検定を行なうことが
できる。

本発明によると、試験物質を多分含有する検定
下におかれた試料(a)を固体支持体上に固定された
試験物質に対する特異的結合相手(b)とまた検出可
能なマーカーに抱合された試験物質に対し特異的
な結合相手(c)と反応させることにより、存在する
試験物質の量と試薬(b)および(c)との間の反応によ
りマーカーが試験物質を介して支持体に固定され
た複合体を形成させ、そしてマーカーが試料(a)中
に存在する試験物質の何れかの量の指数として検
出または検定される特異的な結合検定（例えば、
イムノアツセイ）を実施する方法が提供される
が、その特徴とするところは反応成分(a)、(b)およ
び(c)すべてを単一反応液中で反応に対し単一段階
で混合し、試験物質と試薬(b)および(c)との結合反
応間の競合干渉をせまい特異性の抗体、例えばモ
ノクローン抗体の使用により干渉を避けるか、あ
るいは緩徐放出形の試薬(c)の使用により回避する
ことにある。

抗体の要求されるせまい特異性は試験下の物質
と特異的に結合するが、試験下の物質とその他の
特異的な結合相手との間の結合反応を妨害しない
能力である。このような抗体は、試験下の物質に
対する親和性をもつ幾つかの抗体の中から、検定
で試験すべき物質と選ばれるべき狭特異性抗体と
の間であらかじめ形成された複合体と他の特異的
結合相手との間の結合反応の進行を証明するため
の通常の方法を用いることにより選び出すことが
できる。

本発明の特に適当な具体例によると、抗体と酵
素または他のマーカーの間の抱合体および（また
は）もしあるとすれば抗体（固定表面に結合され
るもの）がモノクローン抗体からなるか、または
望む検定反応または反応群が検定下におかれた試
料中に存在する試験物質の量との反応において抱
合体と免疫吸収剤との間の競合を妨害しないこと
を保証する程十分にせまい特異的の他の抗体から
なる。十分にせまい特異性のモノクローン抗体
は、例えば抗体産生細胞系統から誘導された抗体
として、単一の抗体産生原細胞または細胞群から
誘導された抗体としてつくることができる。この
ような系統は、例えば比較物質として非常に純粋
な抗原を用いる公知の細胞融合、培養、および単
離技術によりつくることができる。

別法として、多くの場合十分にせまい特異性の
抗体は、試験下におかれた物質の明確に区別され
た化学的または物理的分子フラグメントに対して
育成された抗血清の（ポリクローン）免疫グロブ
リン中に得られる、例えば試験すべき免疫グロブ
リンのFeフラグメントに対する（あるいはより
小さいペプチドフラグメントに対する）抗体、あ
るいは試験すべきタンパク質抗原の亜−単位また
はペプチドに対する抗体である。各場合における
目的は特に例えば「サンドイツチ」または「抗グ
ロブリン」試験形態のイムノアツセイを実施する
際に生じうる干渉を実質的になくすことにある。

「サンドイツチ」試験形態においては、試験下
の抗原を固体表面に拘束した第一抗体へ特異的に
吸着させ、そして酵素的または他の（例えば、螢
光または放射能）マーカーを支える第二の抗体を
試験下の吸着抗原へ特異的に結合させる。特異的
にこのように結合されたマーカーが被検抗原の測
定および定量のために、例えば放射分析または螢
光分析、あるいは酵素マーカーを基質に当て、次
に生成物測定をするといつた直接測定による測定
のために用いられる。このように、特に適当なサ
ンドイツチ試験においては、用いる二つの抗体が
試験下におかれた同じ抗原に関して異なる非干渉
特異性を有することができる。

時には、「サンドイツチ」試験形態としても引
用される「抗グロブリン」試験形態においては、
手順が類似しており、試験下の物質はそれ自身免
疫グロブリンである。固体表面に拘束された物質
はその対応する抗原またはパプテンであり、マー
カーを支える物質は試験下の抗体の種および免疫
グロブリン型に対応する抗グロブリンである。特
に適当な抗グロブリン試験においては、抗グロブ
リンはその対応するグロブリンの不溶化抗原への
後の吸着を妨げないように十分せまい特異性を有
しうる。

未修飾抗原に対して生じた通常の抗血清からの
抗体（ポリクローン抗体）をサンドイツチまたは
抗グロブリン試験で用いるならば、もし全成分を
単一段階で混合するとすれば、二つの特異的な吸
着反応の間に干渉があるだろうという危険があり
そうである。ここに記載した装置を用いて本発明
によりこのような試験を行なう場合、記載のよう
なせまい特異性の抗体を用いるか、さもなければ
他の作用剤による拘束がその後の固体表面への吸
着を妨げるかもしれない危険があるならば、固体
表面への試験物質の拘束が他の（マーカー抱合）
結合剤への試験物質の露出前に起ることを保証す
ることによりこのような干渉を回避できる。この
ような順序は他の（マーカー抱合）結合剤の緩徐
放出に配置することにより保証される。

適当な検定特異性、抗体特異性、および抱合試
薬(c)の緩徐放出形の個々の場合を例として下に述
べる。

このような特異的な結合検定を実施する際反応
速度論におけるやりがいのある改良は、もし成分
(a)、(b)、および(c)を含む反応液をその容量の大部
分が排除体により占められるくぼみまたはカツプ
内に含めるならば得られることも判明した。（各
種の棒または球形体の挿入部の使用は他種のイム
ノアツセイに関連して知られている、英国特許第
1414479号および第1485729号明細書に記載）。

この排除体は、例えばカツプまたはくぼみのそ
れと実質的に相補的かつそれより幾分か小さい形
のもので、特異的結合試薬の一つを含む液相が排
除体とカツプまたはくぼみとの間の空間を占める
ほぼ穀の形をとるようにすることができる。排除
体はゆるく適合し、固く装着しない。即ちカツプ
またはくぼみに対して相対的に動くことができ、
その結果排除体とくぼみとの間の相対的運動によ
りこれらの間の液体はかきまぜまたはふり動かし
の運動が与えられる。

例えば、丸いくぼみは、くぼみの直径より幾分
小さい外径を有する丸い排除体を有しうる。排除
体の存在は、例えば通常の操作レベルまであるい
は最大容量まで満した場合、くぼみ内の同様な液
体レベルに基づいた容量と比較して、例えば２〜
10、例えば３〜８のフアクターだけくぼみ内の液
体に有効な空間を減少させることができる。例え
ば、通常の検定中その中に満たした300マイクロ
リツトルの液体を有するように設計されたミクロ
タイマーくぼみを30〜150マイクロリツトルの液
体空間（例えば、50〜100マイクロリツトル）を
残す排除体と共に用いることができる。

ここに記述した排除体と一緒にくぼみまたはカ
ツプを用いると検定反応工程の効率を良くするこ
とができるが、それは第一に、与えられた寸法の
ミクロタイターくぼみで遭遇する通常条件と比較
して、ミクロタイターくぼみの寸法における減少
あるいは試薬重量における増加を伴なうことなく
一層濃縮された試薬を使用できるようになるから
であり、そして第二に、これが与えられた液体試
薬容量との反応に利用しうる感作された表面積を
増加させ、従つて感作された表面上の特異的試薬
密度を増加させねばならないこともなく、あるい
は混み合いの問題に出合うこともなく比較的早い
吸着速度論を達成することができるからである。

一組の排除体を、例えばミクロタイタープレー
ト、例えば８×12くぼみの標準プレート上に取り
付けることのできるふたの肝要な部分として、本
発明の幾つかの具体例に与えるのがよい。このセ
ツトはプレートの全くぼみとあるいはその下のセ
ツト、例えば一列、と適合するのに十分大きくす
ることができる。排除体の寸法およびくぼみの中
に分給すべき液体の体積は前記の仕方でくぼみと
比較して選ぶことができ、そしてなるべくは試験
すべき液体がくぼみの実質的に主要部と、なるべ
くはくぼみの全内面と接触するようにするのがよ
い。

検定すべき物質に対する固定された特異的結合
相手〔試薬(b)〕は検定反応を行なうくぼみまたは
カツプの壁上に固定できる。別法として利点と使
用上の便利さとを独立して提供することのできる
本発明の一つの特徴によれば、液体検定試薬中に
浸けるための、例えば棒、ペグ、またはびようの
形をした液体排除体は免疫吸収剤の表面を有しう
る。これは一つの試薬から次に運ばれることが必
要な検定物質の部分、および付随する処理を、感
作された表面が中空のくぼみの部分である場合よ
り一層容易に取り扱いできるようにする。このよ
うな液体排除体にかわるもう一つの形式は適当な
材料の剛毛の房または葉あるいは大きい表面積を
もつ同等な物体である。更にもう一つの形式はそ
の表面の比較的中空のそして突き出した部分をも
つ、例えばみぞおよび合同したうねをもつ、例え
ば環状のみぞをもつびようまたはペグである。こ
のような装置は丈夫さ、感作された表面積の増
加、およびよりよい反応性を与えることができ
る。

このように、本発明の関連した具体例による試
験装置は共通の取り扱い棒、リンクまたはふたに
連結されたかかる形式の一つ以上の感作された液
体排除体の一セツトからなり、そして検定に用い
る残りの材料のどれかを含む相補的くぼみセツト
あるいはセツト群と組み合わせて使用される。こ
のセツトの幾つかの排除体は一つまたは複数の異
なる検定型を同時にこなすことができるように同
じかまたは異なる感作を有しうる。望むならば、
排除体を操作棒、リンク、またはふた上にとりは
ずし出来るようにそして交換できるように装着
し、その結果幾組かの望む特異性を意のままに求
める様式に従い多数の試験を行なうため共通の原
料から組み上げることができる。

このような配列の一つの長所は、くぼみに投与
する分量から生ずる濃度の変動状態を避けながら
幾つかの排除体を液体試薬の同じ排除体内で感作
できることである。

この具体例において排除体は共有結合によりあ
るいは吸着による免疫吸収剤の製造に適した材
料、例えばポリスチレン、ナイロン、または酸酸
セルロースのどれでもよい。感作が排除体表面で
なくくぼみ表面上にあるようにする場合、（排除
体表面の性質はそれが不活性である限り問題とは
ならない）。排除体への抗体、抗原などの結合は
公知の結合法により、例えばナイロン表面の部分
酸加水分解、露出したアミン表面のグルタルアル
デヒドによる置換、および拘束しようとする物
質、例えば抗体または抗原の固定されたアルデヒ
ド基へのカツプリングにより実施できる。種々な
もののうち適当な方法は、例えばインマンおよび
ホルンバイ（Inman＆Hornby）（1972）
Biochem.J.129、255：キヤンベル、ホルンバイ
およびモーリス（Campbell、Hornby＆Morris）
（1975）Biochem.Biophys.Acta384、307；マチ
エイソンおよびニルソン（Mattiasson＆
Nilsson）F.E.B.S.Letters78、251；および英国
特許第1470955号および第1485122号明細書により
与えられる。

本発明はまた特異的タンパク質結合検定を実施
するための試験材料キツトを提供するものであ
り、これは固体支持体上に支えられた試験物質に
対する固定された特異的結合相手(i)と試験物質に
対するマーカー抱合特異的結合相手(ii)からなるこ
とがわかるが、このものは反応液と接触している
固定された試薬(i)へ緩徐放形として、あるいは試
薬(i)と(ii)の中の特異的結合相手がせまい特異性の
抗体を含み、そして試薬(i)および(ii)が試験物質と
の互の結合反応を妨害しない限りどんな形ででも
添加できる。任意にこのキツトは検定中固定され
たマーカーの量を後で算定するための物質も含み
うる。

試薬(i)は前述したように反応くぼみに対する排
除体あるいは反応くぼみ壁上に固定できる。試薬
(ii)の緩徐放出形は例えば前記のように排除体また
はくぼみ壁の何れかの相補的表面上のシヨ糖また
は等価な上塗りでよい。せまい特異的の抗体は例
えば既述のようにモノクローン抗体から選ぶこと
ができる。

本発明を以下の詳細と図面を引用して更に説明
する。図中、 第１図は本発明による特異的結合検定を実施す
るための容器および排除体の配置の垂直断面図で
ある。

第２図は第１図に示した装置の幾つかの配列を
図式的に示している。

第３図および第４図は本発明の幾つかの具体例
を実施するための排除体の組み立てを図式的側面
図および一部を断面で示した末端図で示したもの
である。

図面の第１図は幾分小さい相補的形状の丸い断
面の丸い底をした排除体２を含む丸底プラスチツ
クミクロタイターくぼみ形容器１を垂直断面図で
示している。排除体２はガラス製でもプラスチツ
ク材料のものでもよい。くぼみ１の通常の容量は
300マイクロリツトル試料用である。排除体２の
存在は有効容量を50マイクロリツトルに減少させ
る。液体３のこの量はくぼみの通常容量の表面積
の全体とかつ排除体２と接触する殻を形成する。
このように液体３の表面対容量比は、排除体２が
存在しない場合にくぼみの通常の容量を満す液体
の実質のそれより数倍大きい。

排除体２は検定にくぼみを使用している間くぼ
み１に与えられた動揺が液体３のかきまぜを起こ
すようにゆるいままにしておく。他方、排除体２
はまつすぐ動かしてもよい。第２図に示した一つ
の配置において、くぼみ１に似たくぼみの二次元
配列を含むトレー４はふた５をもち、これに排除
体２と同様の排除体の相補的１組が装着され、こ
れら排除体は、例えば中空の成形した突出部の形
にあるふた５と共に完全に形成される。もう一つ
の配置においては排除体の固定されたセツトが完
全な配列より少ない１列または複数列だけを形成
しうる。

例えば、ELISA型のイムノアツセイに用いる
には、くぼみ１の壁の底および下方部を免疫学的
試薬で被覆して免疫吸収剤を形成させ、適当な希
釈および媒質中の被検物質の50マイクロリツトル
量を排除体２の使用によりくぼみ壁および底部と
接触させる。酵素マーカーに抱合した免疫学的試
薬は、もし反応液体中にくまなくすでに分散され
ていないならば、別の方法で反応液へ加えられ
る。排除体は検出可能な酵素または他のマーカー
と免疫学的試薬、例えば抗原または抗体との抱合
体で被覆できる。適量の抱合体を、なるべくは、
例えばシヨ糖の上塗り中に排除体のチツプで乾か
して抱合体分子の集合を防止し、かつ抱合体の緩
徐な可溶化を保証することにより免疫吸収剤が検
出すべき物質と反応する機会を得る前に抱合体に
よる免疫吸収剤の飽和を避ける。次に試験を、例
えば患者の血清からなる試験試料の適量をくぼみ
の中に分給し、続いてくぼみの中に排除体を挿入
することにより実行される。このようにして、試
料と抱合体が殆ど同時に加えられることにより時
間を消費する操作手順を減らすことができる。例
えば、抱合体とシヨ糖との溶液の蒸発より形成さ
れた排除体２のチツプ上の乾燥した上塗りからの
抱合物質の緩徐放出後（あるいは前分散した試薬
から検定複合体の形成後）、特異的に固定された
酵素マーカーの量を常法により測定する。試験の
ための試薬の薬量学および定量化をよく確立され
た方法に従い実施するが、それら自体は本発明の
一部をなさない。

図面の第３図および第４図は例として示したこ
れ以上の有利な配置に従い特異的結合検定を実施
するための排除体の組み立てを図式的な側面図お
よび末端（一部断面）図で示している。このよう
な排除体の組み立ては検定に用いる液体を支える
ための相補的くぼみまたはくぼみ群と共に、この
ような組み立て（あるいは本発明による単一のこ
のような排除体）からなる本発明による複合装置
の一部をなしうる。（なるべくは）排除体、また
はくぼみの何れかが固定された特異的結合剤を与
える。

第３図および第４図を参照すると、各くぼみ内
で検定を行なうための装置の特徴的成分は、ここ
に記載したように検定くぼみ内の液体中に浸ける
ように示したびよう、棒またはペグの形をした液
体排除体１１である。排除体１１は例えばナイロ
ン、酢酸セルロース、またはポリスチレンといつ
た適当な材料で成形または削り出しにより形づく
られる。一つの特に適当な形は、例えば最大直径
約５mmあるいは共同したマイクロタイターくぼみ
の内径より幾分せまい、そしてこのようなくぼみ
から突き出る約15〜20mmの高さのナイロンペグで
ある。例えば、約８ミリメートルの排除体１１の
下方先端１２、あるいは他の下方部分は、図面に
は詳しく示していないが、その表面積を増加させ
るため、みぞ、ねじ細脈、丸みぞ、または他の不
規則性を設けるのが便利であり、第３図および第
４図において、このようなみぞの形成による排除
体１１のみぞ付き先端１２の幾分かの全体的狭小
だけを示している。

各排除体１１は取扱いピース１３上に取り付け
られ、そしてこれは例えば図示したように一次元
配列で、あるいは第２図の配置に相当する二次元
配列で１個の排除体１１をもつか、または望むだ
け多くを取り付けることができる。排除体１１は
取り扱いピースと共に一体として、あるいは望む
ならば交換可能な別々の取り付け可能な部品とし
て形づくることができる。例えば、相補的ミクロ
タイタープレートにおけるくぼみ間隔に相当する
約９ミリメートル間隔で、記載型の交換できるよ
うに装着する排除体１１に対するソケツト−ねじ
配置を例示している。取り扱いピースは適当な材
料、例えばナイロンなどのようなプラスチツク、
あるいは金属、例えば黄銅、銅またはステンレス
鋼のものでよい。

排除体１１、例えばその下方のみぞ付き先端１
２、の生物学的／化学的整調は、例えばイムノア
ツセイのような特異的結合検定を行なうために材
料を適合させるには次のように行なうのがよい。
排除体は望むならば例１に記載のように用いるこ
とができるが、別法として、またなるべくは免疫
吸収剤または他の特異的な結合吸収剤を支えるよ
うにつくることができる。例えば、望む検定構造
（それ自体では本発明の一部をなさない）に適し
た型の抗体または抗原をみぞ付き先端１２へ物理
的吸着により（特に、ポリスチレンを用いる場
合）、または（なるべくは）共有結合により、例
えば既に本文に引用した方法により付着できる。

次に、検定を例えば次のように行なう。試薬お
よび（または）試験溶液を、排除体を挿入したと
きにのみ、くぼみを満すのに十分な容量までくぼ
みに入れる（例えば、50〜200マイクロリツト
ル）。排除体が存在すると結合反応が起こり、排
除体を取り出し、例えば流れる水道水下でこれら
を洗うことにより、簡単に洗浄をなしとげること
ができる。

たとえ二つの結合反応が要求されることがあつ
ても（例えば、試験抗体を固定された抗原に結合
させ、次に酵素−抱合抗グロブリンが試験抗体に
結合する）、この結合順序を単一段階で完了させ
ることが可能である。これは前記のように抱合抗
体が試験物質の結合部位のすべてと競合せずそし
てそれを免疫吸収剤への結合から防止するように
試薬の注意深い選択を必要とする。

くぼみ中の排除体の存在は流体試料をかきまぜ
るという重要な操作に備えている。このことは一
層迅速な結合反応を許すだけでなく抱合体をかた
い安定な状態でくぼみ中に前乾燥できるようにす
るので、このようなかきまぜによりこれを再構成
するだけでよい。かきまぜは全結合工程の持続中
続けるか、あるいは最初の結合反応が終了した後
ではじめて開始してもよい。被覆の一つの適当な
形式は抱合体を含む乾燥シヨ糖上塗りをくぼみ底
部に与えることである。これは前述したように結
合反応の望む順序をなしとげるのに十分ゆつくり
解放することができる。

結合反応終了後排除体を洗浄し、酵素基質の溶
液を含むくぼみのもう一組へ移し、ここにそれら
は陽性対照が十分な色を現わす（そして陰性対照
が依然として十分にブランクである）まで留ま
る。標準ELISAにおいて酵素／基質反応は2M水
酸化ナトリウム溶液のような試薬を加えることに
より止めねばならないが、本発明装置を用いる場
合にはこの工程ですら免除することができる。反
応は基質溶液から排除体をとり除くことにより簡
単に停止でき、基質含有くぼみを次に測定と結果
の記録のために標準ミクロ−ELSIA読取器に単
に置くだけでよい。現存する市販ELISA系にお
いて、免疫吸収剤成分（通常はミクロタイターく
ぼみまたは同等物）は必然的に使い捨て品目であ
るが、本発明による方式においては、可能な共有
原子価アタツチメントあるいは抗原が免疫吸収剤
を再使用できるようにしている（もし、そうする
ことを望むなら）。結合反応は排除体を4M塩化マ
グネシウム、または硫酸ドデシルナトリウムのよ
うな解放剤中に浸すことにより逆転できるが、一
方共有結合で付いた試薬は完全なまま残る。この
装置は正確さ、信頼度、速度および（または）感
度の点で利益をもたらすことができる。製造者お
よび使用者などにとつてしばしば欠乏していて高
価である免疫試薬の使用において重要な節約であ
りうる。

本発明の上記形式で与えられる更にもう一つの
任意の特徴は個々の反応混合物の正確な加熱のそ
れである。結合速度および酵素／基質反応の速度
は温度に依存し、ミクロタイタープレートを横切
る温度差は関連した応答の変動を起こし、従つて
較正および再現性に重大な欠陥をつくり出す。通
常、ELISA反応はトレーを標準空気インキユベ
ーター内に置くことにより加速されるが、くぼみ
が加熱される速度はトレー内のそれらの位置によ
つて決まるので、このことは満足しうるに至らな
い。空気インキユベーター内の熱交換の速度はか
なりおそく、全プレートは比較的ゆつくり温ま
る。個別のヒーターをつくり（例えば、測定モー
ドでなく加熱モードで使用する精密な抵抗温度計
から）、そして排除体、例えば第１図から第４図
までに例示したもの、の中心に挿入することがで
き、その位置で排除体表面を通る熱の迅速かつ効
果的な供給を保証しうる。それ故にこの系（公知
の種類の適当なサーモスタツト制御を組み入れ
る）はより早い反応を与え、かつインキユベータ
ーに対する要求に応じて分与すると同時にくぼみ
からくぼみへの変動を減少させることができる。

例 １ 免疫検定のための材料の調製および本発明検定
を実施するための例示的概要を、第３図および第
４図に示した排除体を使用して用いるために下に
記述する。例示された特別な検定の構成はたまた
ま大豆タンパク質に対する抗体の検定に向けられ
た酵素結合した抗グロブリン試験である。他の構
成および特異性も用いることができ、そして本発
明の装置が例えば、米国特許第3656090号、第
3971932号、第3839153号、第3850752号、第
3879262号および第3996345号明細書に記述された
ものの多くと同様こられに適用することは明らか
であろう。

大豆タンパク質結合排除体ペグの調製 第３図および第４図に関して前述したナイロン
ペグを3.6M HClに浸し、48℃で35分間保ち、そ
の後これらを流れている水道水の下で洗浄し、次
に蒸留水中に浸す。次に、これらを冷却した12.5
％水性グルタルアルデヒドに浸し、４〜８℃に20
分間保つ。ペグを水道の流水下で洗浄し、次にこ
れらを大量の蒸留水中に水なくとも２時間浸すこ
とにより反応を止める。

この活性化の順序の後、ペグを大豆タンパク質
の溶液〔トウイーン洗浄剤（PBST）＋0.1％チメ
ロサールを含むリン酸塩緩衝食塩水中300μｇ／
ml〕200μと共にミクロタイタートレーのくぼ
みに入れる。これらトレーおよびペグを封じた容
器に入れ、反応を37℃で54時間続ける。

最後に、ペグを1.5Mエタノールアミン200μ
を含む他のくぼみの組に移し、そこで室温に24時
間保つことにより未使用活性部位を封鎖する。使
用前に、これらをPBS＋0.15％トウイーン中に室
温で更に３日間浸す。

別の調製法においては、加水分解およびグルタ
ルアルデヒド処理が同一であるが、表面に結合す
るタンパク質300μｇ／mlの代りに、ペグを100μ
ｇ／mlのポリ−Ｌ−リジン（PLL）で37℃にお
いて18時間処理する。水道水そして次にPBSTで
よく洗浄後、結合したPLLを12.5％グルタルアル
デヒドでの処理により活性化する（37℃で18時
間）。最後に、処理されたペグを100μｇ／mlの大
豆タンパク質200μ中37℃で18時間インキユベ
ーシヨンすることにより大豆タンパク質をグルタ
ルアルデヒド−置換PLLに結合させる。過剰の
活性基を1.5Mエタノールアミン中PH8.5で７時間
処理することにより封鎖する。

更に他の手順においては、ナイロンをジメチル
−１，３−プロパンジアミンで処理してナイロン
重合体鎖を開裂し、次に遊離アミン基をグルタル
アルデヒドで置換し、任意にアミノおよびアルデ
ヒド「スペーサー」基を更に挿入後、結合させた
いタンパク質を末基アルデヒドに結合する。

更にもう一つの別法においては、ナイロンの重
合体鎖開裂を含まず、排除体をPBS＋２％ドデ
シル硫酸ナトリウム中に浸し、次に空気中室温で
一晩乾燥させる。これらを100％硫酸ジメチル中
に室温で３分間浸すことによりＯ−アルキル化す
る。ペグを氷冷エタノールで次に冷水で洗浄する
ことにより反応を止める。その後直ちにペグを大
豆タンパク質の溶液（100μｇ／ml）に浸し、室
温に３日間保つ。最後にこれらをエタノールアミ
ンの10ｍＭ溶液へ移し、ここで更に２日間室温に
保つた後トリス／HCl緩衝液、PH8.0中で最後の
洗浄を行なう。別法として、用いるアルキル化剤
は前に引用したインマンとホルンバイ（1972）に
より記述されているように、トリエチルオキソニ
ウムテトラフルオロボレートでよい。選択しうる
適当なカツプリング法は、例えば英国特許第
1316990号、第1470955号、第1485122〜３号明細
書および米国特許第3817837号明細書（例えば、
欄31〜34）に述べられている。

酵素標識した羊抗家兎IgGの調製 家兎グロブリン（硫酸ナトリウム沈殿により家
兎血清より調製）を製造者により記述された標準
的な手順により臭化シアン−活性化セフアロース
4B（フアルマシア）上に固定する。家兎グロブリ
ンに対する高力価羊抗血清〔セワード ラボラト
リー（Seward Laboratory）、インムノスチクス
（商標）プロダクトBS01）〕をカラムに通し、フ
ラクシヨン中結合しない流下物を捨てる。カラム
に0.5M酢酸を通すことにより拘束された抗体を
解放する。タンパク質含有フラクシヨンを集め、
PBSに対して透析すると抗体調製物が得られ、
これを次の手順により酵素で抱合する。

下記の方法はイングバルとパールマン
（Ingvall and Perlmann）（1971）
（Immunochemistry、８、871）により記述され
た方法に基づく。家兎IgGに対する羊抗血清の
IgGフラクシヨン〔セワードラボラトリー、イン
ムノスチクス（商標）、プロダクトBS01）を５
mg／mlの濃度に調節する。これの0.1ml部分を用
いてシグマ型アルカリ性ホスフアターゼ
（3.2M硫酸アンモニウム中の懸濁液として供給さ
れる）1.5mgを溶かす。生じた溶液をリン酸塩緩
衝食塩水（PBS）に対して透析し、次に25％グ
ルタルアルデヒド溶液（水性）5μと混合する。
グルタルアルデヒドとの反応を室温で２ 1/2時間
続け、次にPBSで１mlに希釈し広汎な透析を行
なうことにより止める。最後に、生成物を卵アル
ブミン50mg／ml、塩化マグネシウム0.2mg／ml、
アジ化ナトリウム0.2％、およびメチオレート0.2
％を含む0.05Mトリス／HCl緩衝剤（PH8.0）で10
mlに希釈する。この抱合体をシヨ糖溶液中に濃縮
することによりミクロタイターくぼみ底部に適用
し、次に５〜50マイクロリツトル部分を37℃で蒸
発させてかきまぜたときゆつくり解放する硬いシ
ヨ糖上塗りとする。

大豆抗原の調製 抗原として用いるタンパク質はコー（Koh）
（1978）−Can.Inst.Food Sci.Technol.J.、11、124
により記述された手順に基づいた方法により大豆
粉から調製される。大豆粉（10ｇ）をPBS（100
ml）中に分散し、十分よくかきまぜた後、懸濁液
を遠心して透明な上澄溶液を得る。

この溶液の一部分を30ｇの尿素と混合して最終
体積50mlとする。この溶液を蒸気浴上で１時間加
熱後１mlの２−メルカプト−エタノールを加え
る。蒸気加熱を更に45分間続ける。室温まで冷却
後、溶液を先ず水道の流水に対して２時間、次に
２×５リツトルの0.15M塩化ナトリウムに対し透
析する。最後の透析された溶液は80mlに膨潤し、
非常にわずかに乳白外観を呈する。

復元大豆タンパク質に対する家兎抗体の調製 家兎へ水の系の中に多重油中水型として乳化さ
せたフロイントの完全補助剤中復元大豆抗原（２
mg）の筋肉内注射を与える。各動物へ与えた容量
は2.0mlである。最初の接種から31日、100日、
108日および115日後に、食塩水（0.25〜0.5ml）
中抗原の皮下ブースター注射を与える。この計画
中種々な時に血清試料を採り、下記の検定計画に
よる試験抗体の給源として用いる。

感作した（大豆タンパク質結合）排除体を用いる
イムノアツセイ 家兎抗血清および羊抗家兎／酵素抱合体を
PBST中に適当に希釈し、次に下記の操作順序に
従う。

１ 希釈抗血清をくぼみに置き、次に直ちに感作
排除体ペグを置く。

２ 排除体ペグ＋くぼみ（抱合体のシヨ糖上塗り
を含む）＋試料を封じた容器に入れ、37℃で約
90分間インキユベーシヨンする。かきまぜはこ
のインキユベーシヨン時間の約半分が経過した
後ではじめて行なう。

３ 排除体ペグを取り除き、水道の流水下で次に
PBSTで洗浄する。

４ 洗浄した排除体ペグを酵素のための基質〔シ
グマ104（商標）〕を含むくぼみに入れる。

５ 排除体ペグ＋くぼみ＋基質を封じた容器内に
入れ、37℃で45分間インキユベーシヨンする。

６ 排除体ペグを取り除き、基質試料の光学密度
を測定する。

この試験の標準化と較正はそれ自体十分に確立
された方法により行なわれ、この方法は本発明の
一部をなさない。

例 ２ 抗（大豆）抗体の検出または算定のためのもう
一つの検定および検定材料セツトはモノクローン
抗体を使用する。これら材料および検定は例１と
同様に行なうが、次の点が異なる。以前に用いた
家兎IgGに対する（ポリクローン）羊抗血清の代
りに良い親和力をもつマウスモノクローン抗−
（家兎IgG）を用いる。あらかじめ酵素と混合し
抱合すべき抗血清のIgGフラクシヨンの代りに、
モノクローン抗体を含む腹水液フラクシヨンを用
いる。このフラクシヨンは例１と同種の家兎グロ
ブリン抱合セフアロースゲル上の親和性クロマト
グラフイーにより調製されるが、溶離は0.5M酢
酸の代りに4MMgCl₂溶液で後ろに向かつて行な
う。最終の抱合調製物をシヨ糖上塗りとして適用
する代りに工程１で直接くぼみに加え、工程２に
おけるインキユベーシヨン時間を１時間に減らす
ことができる。この検定は時間の利得および簡単
さを与えるだけでなく工程５〜６における最終発
色と工程１で加えた抗−（大豆）抗血清の量との
間に一層精確かつ信頼できる関係をつくり出すこ
とが判つた。

例 ３ Ｋ型免疫グロブリンＧに特異的な検定およびそ
のための材料の調製は次のように行なわれる。

第３図に示した形のナイロン66から成形された
ペグをアルコールおよび蒸留水で洗う。マウスモ
ノクローン抗−（ヒトＫ−鎖）抗体を、他のタン
パク質および洗浄剤を除去したPH８の0.01M水性
リン酸塩緩衝液中抗体の20マイクログラム／ml溶
液に、ペグを室温で数時間または一晩さらすこと
によりペグに固定する。Ｋ鎖に対するモノクロー
ン抗体の調製物（そしてまたγ−鎖に向けられた
下で用いた抗体の調製物）は、例えばヒトIgGに
抱合されたアフイゲル（Affigel）（Biorad、商
標）のカラム上親和力クロマトグラフイーによ
り、それ以外は例１または２と同じ方法で、対応
する腹水液から誘導される。（約10mgIgGをゲル
１mlの抱合に用い、少なくとも２mlのゲルを腹水
液１mlのクロマトグラフイーに用いる）。

マウスモノクローン（ヒトγ−鎖）抗体を例１
におけるようにアルカリ性ホスフアターゼで抱合
し検定における他の特異的結合試薬をつくる。

次に、例１または２の一般手順をこれら材料と
共に用いるが、ただし免疫吸収剤を形成する抗体
の吸収の非共有原子価性がPH7.1の反応緩衝剤と
してリン酸塩／食塩水／トウイーン／卵アルブミ
ン緩衝剤（リン酸塩0.15％、Nal0.85％、トウイ
ーン1.5ml／ml、卵アルブミン１mg／ml）を使用
することを推奨できるようにすることを除く。こ
のことはＫ−型ヒトIgGに対する特異的かつ敏感
な検定を与える。本例の検定に対するもう一つの
装置は工程２から抱合体を省き、ペグおよび試験
試料を約60分インキユベーシヨンし、洗浄し、次
に工程３に進む前に同様な緩衝剤に溶かした抱合
体と共にインキユベーシヨンすることを含む。両
検定法ともそのせまい特異性が特異性の小さい試
薬を用いるとこのような特異的検定を不可能にし
たかもしれない妨害交差反応を避けるので、IgG
分子のγ−Ｋ亜集団の高度に特異的な決定を許す
ことで利点を与える。

一連の試行において、検定の結果は0.2mlの検
定反応体積当たり10〜100ngK−IgGの範囲内で
直線にすることができることが判つた（出発の抗
体含量に基づいて約50ngの抱合体を使用）。

λ−型IgGに対する対応検定は、もし免疫吸収
剤、即ちその上に固定された抗体をもつナイロン
66ペグ、の調製において、代つて−鎖に対して向
けられたマウスモノクローン抗体を用いるならば
容易に行ないうる。

上記の特定の方法および材料はより少ない処理
工程の便利さと使用時の妨害副反応の除去を共有
する広範囲の検定を与えるように特異性において
変化させることができることが判る。

公表された手順により得られ本発明における検
定材料として使用するために選ぶことができるモ
ノクローン抗体には、例えば抗ロータウイルス、
抗−（ヒト）IgE、抗−（牛）IgG、抗α−フエト
タンパク質、抗−（ヒトその他）IgA、抗−（チロ
イド結合グロブリン）、抗−β₂マイクログロブリ
ン、抗−プレグナンジオール、抗−エストロンジ
オール、および抗−（ヒト）IgM抗体その他があ
る。本発明によるとこれら試薬は、検定下におか
れた材料の型の全集団あるいは特別な亜集団に相
当するかもしれない対応する特異的な結合相手に
対し高度に特異的な検定の基準を与えるように用
いることができる。上記検定法の何れもこの目的
のために使用できる。

最も厳密な意味で対応する検定のすべてがイム
ノアツセイである必要はない。例えば、モノクロ
ーン抗−（TBG）を用いると、対応する特異的結
合検定は試験TBGの特異的結合相手として固定
されたT₃またはT₄を含み、そして選ばれたマー
カー抱合モノクローン抗TBGは敏感な「サンド
イツチ」型検定を、免疫複合体形成とTBGのT₃
またはT₄への結合との間に干渉なく少数の工程
で実施できるようにする。

特異的免疫複合体の検定は固定されたコングル
チニンおよび検定しようとする免疫複合体の成分
に特異的なマーカー抱合モノクローン抗体の使用
により同様な方法で実施できる。

本発明の他の装置も広い変更および応用を受け
うることはよく理解されるであろう。例えば、第
３図および第４図に示した一組の排除体は、例え
ば８個のペグを取り付けた取り扱いピースまたは
ホルダーからなつてもよく、そして排除体は、例
えばトキソプラズマ、ルベラウイルス、シトメガ
ロウイルスおよびヘルペスウイルスのどれか一つ
またはそれ以上に対しヒト抗体の検定に使用する
ために適当に感作されている。排除体はそれに固
定された対応する抗原を有することができ、マー
カー抱合抗−（ヒトグロブリン）を相応に準備さ
れ較正された試薬と共に化学的には公知の抗グロ
ブリン形式である試験に使用できる。もしすべて
の四つの抗原感作が複製で（各々は第３図〜第４
図に示した組み立ての二つの排除体上にある）表
わされるならば特に便利である。従つて、このよ
うな組み立ては、例えば、四つの上記抗体の各々
に対し複製で単一の患者試料の八つの部分を検定
するように設計された検定工程を経て運ばれる。
このような装置は特定の感作を有する排除体以外
の試験の道具および試薬の残りがすべての検定に
対し定性的に同様でよく、例えば抱合体は適当な
マーカー酵素に結合した抗−（ヒトグロブリン）
抗体でよく、酵素の検出に共通の手段を使用でき
るという点で特に便利である。これらの成分は、
望むならば感作された排除体ペグと関連して調製
されたミクロタイターくぼみの中に適当に供給で
きる。

本発明による他のイムノアツセイ装置は特異性
において、例えば免疫グロブリンＥ（ほかにレア
ジン免疫グロブリンとして記述される）に向ける
ことができ、これに対する抗グロブリン検定は、
用いる抗−IgEまたは他の標識した抗体を抱合す
る他の種のマーカー、例えば前記のように用いら
れる螢光または特に酵素マーカーの代用を任意に
行なつて米国特許第3720760号明細書に記述され
た抗グロブリンを用いるラジオイムノアツセイと
形式上類似する。酵素マーカー以外のマーカーを
用いる場合、適当なそれぞれの公知のカツプリン
グ技術が使用される。同様な検定装置は臨床的診
断用に、例えば血漿Ｃ−反応性タンパク質、尿β₂
−ミクログロブリンまたはフアクター用につく
ることができる。これら抗原試験材料に対しては
サンドイツチ型検定形式を用いるのが便利であ
る。

他の修正および変化は当業者にとつて明らかで
あろう。特に、明細書EP−0014530に記載の可視
固定マーカー方式を用いて本発明に係る検定の印
づけを得ることができる。サンドイツチ型および
抗グロブリン型検定構成のそれ以上の例に対して
も本明細書およびここに引用された文献に言及で
きる。

第１図は本発明による検定を行なうための容器
および排除体の断面図であり、第２図は第１図に
示した装置の配列を示した図であり、第３図およ
び第４図は排除体の組み立ての側面図および部分
断面図である。