JPH02196962A - イムノアッセイ法並びに該方法に用いる材料及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合検定、例えばイムノアッセイ、を実
施するための方法、およびこれらの方法を実施するため
の装置、例えば試験キット、に関する。

特別な具体例において、本発明は酵素と結合した、およ
び螢光性マーカーと結合した特異的結合検定、例えばイ
ムノアッセイ、に適用可能である。

種々様々なイムノアッセイおよび他の特異的結合検定が
既に知られている。

このような検定法およびそれらに用いる材料の例はニス
、スベクター（Ｓ、　５ｐｅｃｔｏｒ）　、　Ａｎｎ、
　Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍ、　（１９７３）　１３．３５９〜７Ｇ　（
ラジオイムノアッセイ）、エル、イー、エム、マイルズ
（Ｌ、　Ｅ、　ＨＭｉｌｅｓ）およびシー、エヌ、ヘイ
ルズ（ｃ，ＮＨａｉｅｓ）、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９６
８）　２１９．　１８６〜１８９（放射性、酵素および
他のマーカーを用いる検定）、イーヘイバーマン（Ｅ、
　ｌｌａｂｅｒｍａｎｎ）　、　１．にｆｉｎ、　Ｃｈ
ｅｓ。

ｕ、　ｋｌｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｇｉ、　（１９７０）
　８．５１〜５５　（放射能標識および酵素標識検定法
）、および英国特許第１、３６３．５６５号明細書（酵
素標識イムノアッセイ）および米国特許第４，１５０，
９４９号および第４．１６０，８１８号明ｔｓｍ＜螢光
標識イムノアッセイ）に示されている。

このような検定の一つの重要な群は特定の吸着剤、検定
下におかれた材料、および検定下におかれた物質に対し
特異的な結合能をもつマーカー抱合物質（「コンジユゲ
ート」）の間で三成分複合体を形成させるものからなる
。この種のある検定法は「サンドイッチ」または「族グ
ロブリン」検定と呼ばれて来た。これらは特定の吸着剤
に固定されるようになるマーカーの量が三成分複合体に
関与する検定下の物質の量と直接（逆にではなく）関係
づけられる性質をもち、そしてこれは使用したマーカー
に適した仕方で残留する遊離の印づけられた接合物から
固定されたｖＪＪ質を分離した後に簡単に測ることがで
きる。

しかし、例えば上記のへイバーマン（１９７Ｇ＞の発行
文献および英国特許第１．３６３．５６５号明細書から
明らかなように、これら検定法の使用性は難点がないわ
けではない。これらは検定反応を実施するために幾つか
の連続した処理工程を要求するか、またはさもなければ
低感度を蒙むり、試薬の注意深い選択はこれまで克服さ
れたことがない。

次のものから本質的になる市販試験キットが入手できる
： （ａｔ　　場合に応じて抗体または抗原で被覆された管
または予かしめ形づくられたくぼみの列からなるプレー
ト。

（ｂ）　　試験試料中に存在するかもしれない検出すべ
き物質に対する適切な抗体（いわゆるコンジユゲート）
に結合した酵素。

（ｃ）　　酵素活性の測定のための基質。

抗原または抗体の検定を行なうための一つの標準法は下
記のものを含む： （１）試験試料に対し使用希釈を決定する、（２）りぼ
みを感作するために用いた抗体または抗原の過剰分を除
去する、 （３）りぼみを洗浄する、 （４）ある割合の適当に希釈した試験試料を導入する、 （５）約２時間インキュベートして試験試料中の検出す
べき物質を感作物質に結合させる、（６）りぼみを洗浄
して未反応物質を除去する、（１）適当に希釈したコン
ジュゲートを導入する（約２時間インキュベーシミンす
る）、（８）りぼみを洗浄して未反応物質を除去する、
（９）基質の溶液を加える、 （１０）基質とＩＩ素との反応の結果として適当な強度
の色が現われるまでインキュベーションする、（１１）
反応を、例えば強アルカリで止める、（１２）反応した
基質溶液の光学密度を測定する。

この手順は幾つかの抗体／抗原反応の各々が反応平衡ま
で数時間を要するので時間消費でもある。

実際上はより短いインキュベーション時間が用いられる
が、感度および（または）経済性を犠牲にしてはじめて
なしうることである。

本研究の結果によれば、より少ない検定段階の使用に対
する障害は成分の二つの間の妨害反応から生ずる望む固
定複合体の形成による望まない干渉であると考えられる
。選ばれたせまい特異性の、あるいは緩徐放出形の特異
的結合材の使用によりこのような干渉を回避でき、そし
てより少ない処理段階を用いて＾感度の検定を行なうこ
とができる。

本発明によると、試験物質を多分含有する検定下におか
れた試料（ａ）を固体支持体上に固定された試験物質に
対する特異的結合相手（ｂ）とまた検出可能なマーカー
に抱合された試験物質に対し特異的な結合相手（ｃ）と
反応させることにより、存在する試験物質の聞と試薬（
ｂ）および（ｃ）との間の反応によりマーカーが試験物
質を介して支持体に固定された複合体を形成させ、そし
てマーカーが試料（ａ）中に存在する試験物質の何れか
の量の指数として検出または検定される特異的な結合検
定（例えば、イムノアッセイ）を実施する方法が提供さ
れるが、その特徴とするところは反応成分（ａ）、（ｂ
）　、１５よび（ｃ）すべてを単一反応液中で反応に対
し単一段階で混合し、試験物質と試薬（ｂ）および（ｃ
）との結合反応間の競合干渉をせまい特異性の抗体、例
えばモノクローン抗体の使用により干渉を避けるか、あ
るいは緩徐放出形の試薬（ｃ）の使用により回避するこ
とにある。

抗体の要求されるせまい特異性は試験下の物質と特異的
に結合するが、試験下の物質とその他の特異的な結合相
手との間の結合反応を妨害しない能力である。このよう
な抗体は、試験下の物質に対する親和性をもつ幾つかの
抗体の中から、検定で試験すべき物質と選ばれるべき狭
特異性抗体との間であらかじめ形成された複合体と他の
特異的結合相手との間の結合反応の進行を証明するため
の通常の方法を用いることにより選び出すことができる
。

本発明の特に適当な具体例によると、抗体と酵素または
他のマーカーの間の抱合体および（または）もしあると
すれば抗体（固体表面に結合されるもの）がモノクロー
ン抗体からなるか、または望む検定反応または反応群が
検定下におかれた試料中に存在する試験物質の量との反
応において抱合体と免疫吸収剤との間の競合を妨害しな
いことを保証する程十分にせまい特異性の他の抗体から
なる。十分にせまい特異性のモノクローン抗体は、例え
ば抗体産生細胞系統から誘導された抗体として、単一の
抗体産生原細胞または細胞群から誘導された抗体として
つくることができる。このような系統は、例えば比較物
質として非常に純粋な抗原を用いる公知の細胞融合、培
養、および単離技術によりつくることができる。

別法として、多くの場合十分にせまい特異性の抗体は、
試験下におかれた物質の明確に区別された化学的または
物理的分子フラグメントに対して育成された抗血清のく
ポリクローン）免疫グロブリン中に得られる、例えば試
験すべき免疫グロブリンのＦｅフラグメントに対する（
あるいはより小さいペプチドフラグメントに対する）抗
体、あるいは試験すぺぎタンパク質抗原の亜−単位また
はペプチドに対する抗体である。各場合における目的は
特に例えば「サンドイッチ」または「抗グ０プリン」試
験形態のイムノアッセイを実施する際に生じつる干渉を
実質的になくすことにある。

「サンドイッチ」試験形態においては、試験下の抗原を
固体表面に拘束した第一抗体へ特異的に吸着させ、そし
て酵素的または他の（例えば、螢光または放射能）マー
カーを支える第二の抗体を試験下の吸着抗原へ特異的に
結合させる。特異的にこのように結合されたマーカーが
被検抗原の測定および定量のために、例えば放射分析ま
たは螢光分析、あるいはＷｇ素マーカーを基質に当て、
次に生成物測定をするといった直接測定による測定のた
めに用いられる。このように、特に適当なサンドインチ
試験においては、用いる二つの抗体が試験下におかれた
同じ抗原に（資）して異なる非干渉特異性を有すること
ができる。

時には、「サンドイッチ」試験形態としても引用される
「抗グロブリン」試験形態においては、手順が類似して
おり、試験下の物質はそれ自身免疫グロブリンである。

固体表面に拘束された物質はその対応する抗原またはハ
プテンであり、マーカーを支える物質は試験下の抗体の
種および免疫グロブリン型に対応する抗グロブリンであ
る。特に適当な抗グロブリン試験においては、抗グロブ
リンはその対応するグロブリンの不溶化抗原への後の吸
着を妨げないように十分せまい特異性を有しつる。

未修飾抗原に対して生じた通常の抗血清からの抗体（ポ
リクローン抗体）をサンドイッチまたは抗グＯプリン試
験で用いるならば、もし全成分を単一段階で混合すると
すれば、二つの特異的な吸着反応の間に干渉があるだろ
うという危険がありそうである。ここに記載した装置を
用いて本発明によりこのような試験を行なう場合、記載
のようなせまい特異性の抗体を用いるか、さもなければ
他の作用剤による拘束がその復の固体表面への吸着を妨
げるかもしれない危険があるならば、固体表面への試験
物質の拘束が他の（マーカー抱合）結合剤への試験物質
の露出前に起ることを保証することによりこのような干
渉を回避ひきる。このような順序は他の（マーカー抱合
）結合剤の緩徐放出に配置することにより保証される。

適当な検定特異性、抗体特異性、および抱合試薬（ｃ）
の緩徐放出形の個々の場合を例として下に述べる。

このような特異的な結合検定を実施する際反応速度論に
おけるやりがいのある改良は、もし成分（ａ）、（ｂ）
　、および（ｃ）を含む反応液をその客間の大部分が排
除体により占められるくぼみまたはカップ内に含めるな
らば得られることも判明した（各種の棒または球形体の
挿入部の使用は伯種のイムノアッセイに関連して知られ
ている、英国特許第１，４１４，４７９号および第１，
４８５，７２９号明ｉＩ書に記載）。

この排除体は、例えばカップまたはくぼみのそれと実質
的に相補的かつそれより幾分か小さい形のもので、特異
的結合試薬の一つを含む液相が排除体とカップまたはく
ぼみとの間の空間を占めるほぼ殻の形をとるようにする
ことができる。排除体はゆるく適合し、固く装着しない
。即ちカップまたはくぼみに対して相対的に動くことが
でき、その結果排除体とくぼみとの間の相対的運動によ
りこれらの間の液体はかきまぜまたはふり動かじの運動
が与えられる。

例えば、丸いくぼみは、くぼみの直径より幾分小さい外
径を有する丸い排除体を有しうる。排除体の存在は、例
えば通常の操作レベルまであるいは最大容量まで満した
場合、くぼみ内の同様な液体レベルに基づいた容量と比
較して、例えばｌ〜１Ｇ、例えば３〜８のファクターだ
けくぼみ内の液体に有効な空間を減少させることができ
る。例えば、通常の検定中その中に満たした３００μｇ
の液体を有するように設計されたミクロタイターくぼみ
を３０〜１５０μｍの液体空ｌ１ｌ（例えば、５０〜１
００μＩＩ）を残す排除体と共に用いることができる。

ここに記述した排除体と一緒にくぼみまたはカップを用
いると検定反応工程の効率を良く１−ることができるが
、それは第一に、与えられた寸法のミクロタイターくぼ
みで遭遇する通常条件と比較して、ミクロタイターくぼ
みの寸法における減少あるいは試１’重量における増加
を伴なうことなく−ｍｓ縮された試薬を使用できるよう
になるからであり、そして第二に、これが与えられた液
体試薬容憧との反応に利用しうる感作された表面積を増
加させ、従って感作された表面上の特異的試薬密度を増
加させねばならないこともなく、あるいは混み合いの問
題に出合うこともなく比較的早い吸着速度論を達成する
ことができるからである。

−組の排除体を、例えばミクロタイタープレート、例え
ば８ｘ　１２＜ぼみの標準プレート上に取り付けること
のできるふたの肝要な部分として、本発明の幾つかの具
体例に与えるのがよい。このセットはプレートの全くぼ
みとあるいはその下のセット、例えば−列、と適合する
のに十分大きくすることができる。排除体の寸法および
くぼみの中に分給すべき液体の体積は前記の仕方でくぼ
みと比較して選ぶことができ、そしてなるべくは試験す
べき液体がくぼみの実質的に主要部と、なるべくはくぼ
みの全内面と接触するようにするのがよい。

検定すべき物質に対する固定された特異的結合相手（試
薬（ｂ））は検定反応を行なうくぼみまたはカップの壁
土に固定できる。別法として利点と使用上の便利さとを
独立して提供することのできる本発明の−・つの特徴に
よれば、液体検定試薬中に浸けるための、例えば棒、ペ
グ、またはびょうの形をした液体排除体は免疫吸収剤の
表面を有しうる。これは一つの試薬から次に運ばれるこ
とが必要な検定物質の部分、および付随する処理を、感
作された表面が中空のくぼみの部分である場合より−・
層容易に取り扱いできるようにする。このような液体排
除体にかわるもう−っの形式は適当な材料の剛毛の房ま
たは葉あるいは大きい表面積をもつ同等な物体である。

更にもう一つの形式はその表面の比較的中空のそして突
き出した部分をもつ、例えばみぞおよび合同したうねを
もつ、例えば環状のみぞをもつびょうまたはペグである
。

このような装置は丈夫さ、感作された表面積の増加、お
よびよりよい反応性を与えることができる。

このように、本発明の関連した具体例による試験装置は
共通の取り掻い棒、リンクまたはふたに連結されたかか
る形式の一つ以上の感作された液体排除体の一セットか
らなり、そして検定に用いる残りの材料のどれかを含む
相補的くぼみセットあるいはセット群と組み合わせて使
用される。このセットの幾つかの排除体は一つまたは複
数の異なる検定型を同時にこなすことができるように同
じかまたは異なる感作を有しうる。、望むならば、排除
体を操作棒、リンク、またはふた上にとりはずしできる
ようにそして交換できるように装着し、その結果幾組か
の望む特異性を息のままに求める様式に従い多数の試験
を行なうため共通の原料から組み上げることができる。

このような配列の一つの長所は、くぼみに投与する分憬
から生ずる濃度の変動状態を避けながら幾つかの排除体
を液体試薬の同じ排除体内で感作できることである。

この具体例において排除体は共有結合によりあるいは吸
着による免疫吸収剤の製造に適した材料、例えばポリス
チレン、ナイロン、または酢ｊｌｌルロースのどれでも
よい。感作が排除体表面でなくくぼみ表面上にあるよう
にする場合、（ｆＩ除鉢体表面性質はそれが不活性であ
る限り問題とはならない）。排除体への抗体、抗原など
の結合は公知の結合法により、例えばナイロン表面の部
分酸化水分解、露出したアミン表面のグルタルアルデヒ
ドによる置換、および拘束しようとする物質、例えば抗
体または抗原の固定されたアルデヒド基へのカップリン
グにより実施できる。種々なもののうち適当な方法は、
例えばインマンおよびホルンバイ（Ｉｎｉａｎ　＆　Ｈ
ｏｒｎｂｙ）　（１９７２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
　１２９゜２５５；ギャンベル、ホルンバイおよびモー
リス（ｃａｌｐｂｅｌｌ、　　Ｈｏｒｎｂｙ　＆　Ｈｏ
ｒｒｉｓ）　　（１９７５）　　ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏ
ｐｈｙｓ、　ＡＣｔａ　３８４．３０７：　Ｖチェイン
ンおよび二ルソン（Ｈａｔｔｉａｓｓｏｎ　＆　Ｈｉｌ
ｓｓｏｎ）　　Ｆ、　Ｅ、　Ｂ、　Ｓ。

Ｌｅｔｔｅｒｓ　７Ｂ、　２５１　；および英国特許筒
１，４７０，９５５号および第１．４８５．１２２号明
ＩＩ書により与えられる。

本発明はまた特異的タンパク賀結合検定を実施するため
の試験材料キットを提供するものであり、これは固体支
持体上に支えられた試験物質に対する固定された特異的
結合相手ｍと試験物質に対するマーカー抱合特異的結合
相手（ｉｉ）からなることがわかるが、このものは反応
液と接触している固定された試薬（ｉ）へ緩徐成形とし
て、あるいは試薬（ｉ）と（ｉｉ）の中の特異的結合相
手がせまい特異性の抗体を含み、そして試薬（ｉ）およ
び（１１）が試験物質との互の結合反応を妨害しない限
りどんな形ででも添加できる。任意にこのキットは検定
中固定されたマーカーの量を後で算定するための物質も
含みうる。

試薬（ｉ）は前述したように反応＜　ＧＦみに対する排
除体あるいは反応くぼみ壁土に固定できる。試薬（ｉｉ
）の緩徐放出形は例えば前記のように排除体またはくぼ
み壁の何れかの相補的表面上のシー糖または等価な上塗
りでよい。せまい特異性の抗体は例えば既述のようにモ
ノクローン抗体から選ぶことができる。

本発明を以下の詳細と図面を引用して更に説明する。図
中、 第１図は本発明による特異的結合検定を実施するための
容器および排除体の配置の垂直断面図である。

第２図は第１図に示した装置の幾つかの配列を図式的に
示している。

第３図および第４図は本発明の幾つかの具体例を実施す
るための排除体の組み立てを図式的側面図および一部を
断面で示した末端図で示したものである。

図面の第１図は幾分小さい相補的形状の丸い断面の丸い
底をした排除体２を含む丸底プラスチックミクロタイタ
ーくぼみ形容器１を垂直断面図で示している。排除体２
はガラス製でもプラスチック材料のものでもよい。くほ
み１の通常の容量は３００μｍ試料用である。排除体２
の存在は有効容部を５０μｍに減少させる。液体３のこ
の量はくぼみの通常容量の表面積の全体とかつ排除体２
と接触する殻を形成する。このように液体３の表面対容
量比は、排除体２が存在しない場合にくぼみの通常の容
量を満す液体の実質のそれより数倍人きい。

排除体２は検定にくぼみを使用している閤くぼみ１に与
えられた動揺が液体３のかきまぜを起こすようにゆるい
ままにしておく。他方、排除体２はまっすぐ動かしても
よい。第２図に示した一つの配置において、くぼみ１に
似たくぼみの二次元配列を含むトレー４はふた５をもち
、これに排除体２と同様の排除体の相補的１組が装着さ
れ、これら排除体は、例えば中空の成形した突出部の形
にあるふた５と共に完全に形成される。もう一つの配置
においては排除体の固定されたセットが完全な配列より
少ない１列または複数列だけを形成しうる。

例えば、ＥＬＩＳＡ型のイムノアッセイに用いるには、
くぼみ１の壁の底および下方部を免疫学的試薬で被覆し
て免疫吸収剤を形成させ、適当な希釈および媒質中の被
検物質の５０μｍ間を排除体２の使用によりくぼみ壁お
よび底部と接触させる。

酵素マーカーに一抱合した免疫学的試薬は、もし反応液
体中にくまなくすでに分散されていないならば、別の方
法で反応液へ加えられる。排除体は検出可能な酵素また
は他のマーカーと免疫学的試薬、例えば抗原または抗体
との抱合体で被覆できる。

適量の抱合体を、なるべくは、例えばショ糖の上塗り中
に排除体のチップで乾かして抱合体分子の集合を防止し
、かつ抱合体の緩徐な可溶化を保証することにより免疫
吸収剤が検出すべき物質と反応する機会を得る前に抱合
体による免疫吸収剤の飽和を避ける。次に試験を、例え
ば患もの血清からなる試験試料の適量をくぼみの中に分
給し、続いてくぼみの中に排除体を挿入することにより
実行される。このようにして、試料と抱合体が殆ど同時
（加えられることにより時・間を消費する操作手順を減
らすことができる。例えば、抱合体とショ糖との溶液の
蒸発により形成された排除体２のチップ上の乾燥した上
塗りからの抱合物質の緩徐放出後（あるいは前分散した
試薬から検定複合体の形成後）、特異的に固定された酵
素マーカーの量を常法により測定する。試験のための試
薬の薬量学および定量化をよく確立された方法に従い実
施１゛るが、それら自体は本発明の一部をなさない。

図面の第３図および第４図は例として示したこれ以上の
有利な配置に従い特異的結合検定を実施するための排除
体の組み立てを図式的な側面図および末１（一部断面）
図で示している。このような排除体の組み立ては検定に
用いる液体を支えるための相補的くぼみまたはくぼみ群
と共に、このような組み立て（あるいは本発明による単
一・のこのような排除体）からなる本発明による複合装
置の一部をなしうる。（なるべくは）排除体、またはく
ぼみの何れかが固定された特異的結合剤を支える。

第３回および第４図を参照すると、各くぼみ内で検定を
行なうための装置の特徴的成分は、ここに記載したよう
に検定くぼみ内の液体中に浸けるように示したびよう、
棒またはペグの形をした液体排除体１１である。排除体
１１は例えばナイロン、酢ｍｔ−ルロース、またはポリ
スチレンといった適当な材料で成形または削り出しによ
り形づくられる。一つの特に適当な形は、例えば最大直
径約５厘あるいは共同したマイクロタイターくぼみの内
径より幾分せまい、そしてこのようなくぼみから突き出
る約１５〜２０＃１Ｉ１１の高さのナイロンペグである
。

例えば、約８ｍｌ＋の排除体１１の下方先端１２、ある
いは他の下方部分は、図面には詳しく示していないが、
その表面積を増加させるため、みぞ、ねじ細脈、丸みぞ
、または他の不規則性を設けるのが便利であり、第３図
および第４図において、このようなみぞの形成による排
除体１１のみぞ付き先端１２の幾分かの全体的狭小だけ
を示している。

各排除体１１は取扱いピース１３上に取り付けられ、そ
してこれは例えば図示したように一次元配列で、あるい
は第２図の配置に相当する二次元配列で１個の排除体１
１をもつか、または望むだけ多くを取り付けることがで
きる。排除体１１は取り扱いピースと共に−・体として
、あるいは望むならば交換可能な別々の取り付は可能な
部品として形づくることができる。例えば、相補的ミク
ロタイタープレートにおけるくぼみ間隔に相当する約９
１１１１間隔で、記載型の交換できるように８着する排
除体１１に対するソケット−ねじ配置を例示している。

取り扱いピースは適当な材料、例えばナイロンなどのよ
うなプラスチック、あるいは金属、例えば黄銅、銅また
はステンレス鋼のものでよい。

排除体１１、例えばその下方のみぞ付き先端１２、の生
物学的／化学的整調は、例えばイムノアラ廿イのような
特異的結合検定を行なうために材料を適合させるには次
のように行なうのがよい。排除体は望むならば例１に記
載のように用いることがつくることができる。例えば、
望む検定構造（それ自体では本発明の一部をなさない）
に適した型の抗体または抗原をみぞ付き先端１２へ物理
的吸着により（特に、ボリスヂレンを用いる場合）、ま
たはくなるべくは）共有結合により、例えば既に本文に
引用した方法により付着できる。

次に、検定を例えば次のように行なう。試薬および（ま
たは）試験溶液を、排除体を挿入したときにのみ、くぼ
みを満すのに十分な容量までくぼみに入れる（例えば、
５０〜２００μＩ）。排除体が存在すると結合反応が起
こり、排除体を取り出し、例えば流れる水道水下でこれ
らを洗うことにより、簡単に洗浄をなしとげることがで
きる。

たとえ二つの結合反応が要求されることがあつでも（例
えば、試験抗体を固定された抗原に結合させ、次に酵県
−抱合抗グロブリンが試験抗体に結合する）、この結合
順序を単一段階で完了させることが可能である。これは
前記のように抱合抗体が試験物質の結合部位のすべてと
競合せずそしてそれを免疫吸収剤への結合から防止する
ように試薬の注意深い選択を必要とする。

くぼみ中の排除体の存在は流体試料をかきまぜるという
重要な操作に備えている。このことは−層迅速な結合反
応を許すだけでなく抱合体をかたい安定な状態でくぼみ
中に前乾燥できるようにするので、このようなかきまぜ
によりこれを再構成するだけでよい。かきまぜは全結合
工程の持続中続けるか、あるいは最初の結合反応が終了
した侵ではじめて開始してもよい。被覆の一つの適当な
形式は抱合体を含む乾燥ショ糖上塗りをくぼみ底部に与
えることである。これは前述したように結合反応の望む
順序をなしとげるのに十分ゆっくり解放することができ
る。

結合反応終了後排除体を洗浄し、酵素基質の溶液を含む
くぼみのもう一組へ移し、ここにそれらは陽性対照が十
分な色を現わす（そして陰性対照が依然として十分にブ
ランクである）まで留まる。

標準ＥＬＩＳＡにおいて酵素／基質反応は２Ｍ水酸化ナ
トリウム溶液のような試薬を加えることにより止めねば
ならないが、本発明装置を用いる場合にはこの工程です
ら免除することができる。反応は基質溶液から排除体を
とり除くことにより簡単に停止でき、基質含有くぼみを
次に測定と結果の記録のために標準ミクＤ−Ｅ１．ＩＳ
Ａ読取器に単に置くだけでよい。現存する市販ＥＬＩＳ
Ａ系において、免疫吸収剤成分（通常はミクロタイター
くぼみまたは同等物）は必然的に使い捨て品目であるが
、本発明による方式においては、可能な共有原子価アタ
ッチメントあるいは抗原が免疫吸成剤を再使用できるよ
うにしている（もし、そうすることを望むなら）。結合
反応は排除体を４Ｍ塩化マグネシウム、または硫酸ドデ
シルナトリウムのような解放剤中に浸すことにより逆転
できるが、一方共有結合でイ」いた試薬は完全なまま残
る。

この装置は正確さ、信頼度、速度および（または）感度
の点で利益をもたらすことができる。製造省および使用
者などにとってしばしば欠乏していて高価である免疫試
薬の使用において重要な節約でありうる。

本発明の上記形式で与えられる更にもう−・つの任意の
特徴は個々の反応混合物の正確な加熱のそれである。結
合速度および酵素／基質反応の速度ｔよ温度に依存し、
ミクロタイタープレートを横切る温度差は関連した応答
の変動を起こし、従って較正および再現性に重大な欠陥
をつくり出１゜通常、ＥＬＩＳＡ反応はトレーを標準空
気インキュベーター内に置くことにより加速されるが、
くぼみが加熱される速度はトレー内のそれらの位置によ
って決まるので、このことは満足しつるに至らない。空
気インキ１ベーター内の熱交換の速度はかなりおそく、
全プレートは比較的ゆっくり温まる。個別のヒーターを
つくり（例えば、測定モードでなく加熱モードで使用す
る精密な抵抗温度計から）、そして排除体、例えば第１
図から第４図までに例示したもの、の中心に挿入するこ
とができ、その位置で排除体表面を通る熱の迅速かつ効
果的な供給を保証しつる。それ故にこの系（公知の種類
の適当なザーモスタット制御を組み入れる）はより早い
反応を与え、かつインキュベーターに対する要求に応じ
て分与すると同時にくぼみからくぼみへの変動を減少さ
せることができる。

例１ 免疫検定のための材料の調製および本発明検定を実施す
るための例示的概要を、第３図および第４図に示した排
除体を使用して用いるために下に記述する。例示された
特別な検定の構成はたまたま大豆タンパク質に対する抗
体の検定に向けられた酵素結合した抗グロブリン試験で
ある。他の構成および特異性も用いることができ、そし
て本発明の装置が例えば、米国特許第３，６５４，０９
０号、第３．９７１，９３２号、第３，８３９．１５３
＠、第３，８５０．７５２号、第３．８７９．２６２号
および第３．９９６．３４５号明細寝に記述されたもの
の多くと同様これらに適用することは明らかであろう。

豆タンパク　　八　除　べ　の　１ 第３図および第４図に関して前述したナイロンペグを３
．６Ｍ　　ＨＣｊに浸し、４８℃で３５分間保ち、その
後これらを流れている水道水の下で洗浄し、次に蒸留水
中に浸す。次に、これらを冷却した１２．５％水性グル
タルアルデヒドに浸し、４〜８℃に２０分間保つ。ペグ
を水道の流水下で洗浄し、次にそれらを大量の蒸留水中
に少なくとも２時間浸すことにより反応を止める。

この活性化の順序の後、ペグを大豆タンパク質の溶液（
トウィーン洗浄剤（ＰＢＳＴ）＋　０．１％チメロサー
ルを含むリン酸塩緩衝食塩水中３００μｇ／ａｔり　　
２００μｇと共にミクロタイタートレーのくぼみに入れ
る。これらトレーおよびペグを封じた容器に入れ、反応
を３１℃で５４時間続ける。

最債に、ペグを１．５Ｍエタノールアミン２００μｐを
含む他のくぼみの組に移し、そこで室温に２４時間保つ
ことにより未使用活性部位を封鎖する。

使用前に、これらをＰＢＳ＋０．１５％トウイーン中に
室温で更に３日間浸す。

別の調製法においては、加水分解およびグルタルアルデ
ヒド処理が同一・であるが、表面に結合するタンパク質
３００μｇ／ｌｌｌ１！の代りに、ペグを　１００μｇ
／ｄのポリーＬ−リジン（ＰＬＬ）で３７℃において１
８時間処理する。水道水そして次にＰＢＳＴでよく洗浄
模、結合したＰＬＩ−を１２．５％グルタルアルデヒド
での処理により活性化する（３７℃で１８時間）、、＠
後に、処理されたペグを１００μｇ／Ｉ１１の大豆タン
パク質２００μｍ中３７℃で１８時間インギュベーショ
ンすることにより大豆タンパク質をグルタルアルデヒド
−置換ＰＬＬに結合させる。過剰の活性基を　１．５Ｍ
エタノールアミン中ｐＨ８，５で７時間処理することに
より封鎖する。

更に他の手順においては、ナイロンをジメチル−１，３
−プロパンジアミンで処理してナイロン重合体鎖を開裂
し、次に遊離アミン基をグルタルアルデヒドで置換し、
任意にアミンおよびアルデヒド１−スペーサー」基を更
に挿入後、結合させたいタンパク質を末端アルデヒドに
結合する。

更にもう一つの別法においては、ナイロンの重合体鎖開
裂を含まず、排除体をＰＢＳ＋　２％ドデシル硫酸ナト
リウム中に浸し、次に空気中空温で−・晩乾燥させる。

これらを１００％硫酸ジメチル中に室温で３分間浸すこ
とにより０−アルキル化する。ペグを水冷エタノールで
次に冷水で洗浄することにより反応を止める。その後直
ちにペグを大豆タンパク質の溶液（１００μｇ／ｄ）に
浸し、室温に３日問保つ。ｌ後にこれらをエタノールア
ミンの１０ｍＭ溶液へ移し、ここで更に２日問室温に保
った後トリス／ＨＣｊｌｉ衝液、ｐＨ８，０中で最後の
洗浄を行なう。別法として、用いるアルキル化剤は前に
引用したインマンとホルンバイ（１９７２）により記述
されているように、トリエチルオキソニウムテトラフル
オロボレートでよい。選択しつる適当なカップリング法
は、例えば英国特許第１，３１６，９９０号、第１，４
７０，９５５号、第１．４８５．１２２〜３号明細書お
よび米国特許第３，８１７，８３７号明細書（例えば、
１１１３１〜３４）に述べられている。

Ｍ素標識した　抗家兎ＩＱＧの調製 家兎グロブリン（硫酸ナトリウム沈殿により家兎血清よ
り調製）を製造者により記述された標準的な手順により
臭化シアン−活性化セファ０−ス４Ｂ（ファルマシア）
上に固定する。家兎グロブリンに対する高力湯羊抗血清
〔セワード　ラボラトリ−（Ｓｅｗａｒｄ　ＬａｂＯｒ
ａｔＯｒｌ／）　、インムノスチクス（商標）プロダク
トＢ５０１）をカラムに通し、フラクション中結合しな
い流下物を捨てる。カラムに０．５Ｍ酢酸を通すことに
より拘束された抗体を解放づる。タンパク質含有フラク
ションを集め、ＰＢＳに対して透析すると抗体ｙ４製物
が得られ、これを次の手順により酵素で抱合する。

下記の方法はイングバルとパールマン＜Ｉｎ（ｌｖａｌ
ｌａｎｄ　　Ｐａｒｌｍａｎｎ）　　（１９７１）　　
（ｌａｕｅｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　８゜８１１
）により記述された方法に基づく。家兎ＩＱＧに対する
羊抗血清のＩａＧフラクション（セワード　ラボラトリ
−、インムノスチクス（商標）、ブ【１ダクトＢ５０Ｉ
）を５■／ｄの濃度に調節する。

これのＯ，ｌｄ　ａｌ１分を用いてシグマ型■アルカリ
性ホスファターゼ（３，２Ｍ硫酸アンモニウム中の懸濁
液として供給される）１．５ηを溶かす。生じた溶液を
リン酸塩ｍ＊食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、次に２
５％グルタルアルデヒド溶液（水性）５μｇと混合する
。グルタルアルデヒドとの反応を室温で２丁時間続け、
次にＰＢＳで１１ｄに希釈し広汎な透析を行なうことに
より止める。埠後に、生成物を卵アルブミン５０η／蛇
、塩化マグネシウム０．２■／ｄ、アジ化ナトリウム０
．２％、およびメルチオレート０．２％を含む０．０５
Ｍトリス／ＨＣｌ１．緩衝剤（ｐＨ１８，Ｏ）で１０ｔ
ｄに希釈する。この抱合体をシＪ糖溶液中に瀧縮するこ
とによりミクロタイターくぼみ底部に適用し、次に５〜
５０μ９部分を３１℃で蒸発させてかきまぜたときゆっ
くり解放する硬いショ糖上塗りとする。

大豆抗原の調製 抗原として用いるタンパク質は〕−（にｏｈ）〜９７８
）−Ｃａｎ、　Ｔｎｓｔ、　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌ、　Ｊ、、　　１１゜１２４により記述され
た手順に基づいた方法により大豆粉から調製される。大
豆粉（ＩＯＳＦ＞をＰＢＳ（１００ｙｄ）中に分散し、
十分よくかきまぜた後、懸濁液を遠心して透明な上澄溶
液を得る。

この溶液の一部分を３０９の尿素と混合して最終体積５
０ｊ１１１！とする。この溶液を蒸気浴上で１時間加熱
１１ｍの２−メルカプト−エタノールを加える。

蒸気加熱を更に４５分間続ける。室温まで冷却後、溶液
を先ず水道の流水に対して２時間、次に２Ｘ５１の０．
１５Ｍ塩化ナトリウムに対し透析する。最後の透析され
た溶液は８０ｄに膨潤し、非常にわずかに乳白外観を呈
する。

復元大豆タンパク質に対する家兎抗体の調家兎へ水の系
の中に多重油中水型として乳化させたフロイントの完全
補助剤中復元大豆抗原（２η）の筋肉内注射を与える。

各動物へ与えた容器は２．０　ｄである。最初の接種か
ら３１日、１００日、１０８日および１１５日後に、食
塩水（０，２５〜０．５ｄ）中抗原の皮下ブースター注
射を与える。このＪｉ画中種々な時に血清試料を採り、
下記の検定計画による試験抗体の給源として用いる。

家兎抗血清および羊抗家兎／酵素抱合体をＰＢＳＴ中に
適当に希釈し、次に下記の操作順序に従う。

１、希釈抗血清をくぼみに置き、次に直ちに感作排除体
ペグを置く。

２、排除体ペグ＋くぼみ（抱合体のシ」糖上塗りを含む
）十試料を封じた容器に入れ、３７℃で約９０分間イン
キュベーションする。かきまぜはこのインキュベーショ
ン時間の約半分が経過した後ではじめ（行なう。

３、排除体ペグを取り除き、水道の流水下で次にＰＢＳ
Ｔで洗浄する。

４、洗浄した排除体ペグを酵素のための基質〔シグマ１
０４（商標）〕を含むくぼみに入れる。

５、排除体ペグ＋くぼみ十基質を封じた容δ内に入れ、
３７℃で４５５分間インキュページ１ンする。

６、排除体ペグを取り除き、基質試料の光学密度を測定
する。

この試験の標準化と較正はそれ自体十分に確立された方
法により行なわれ、この方法は本発明の一部をなさない
。

例２ 抗（大豆）抗体の検出または算定のためのもう一つの検
定および検定材料セットはモノクローン抗体を使用する
。これら材料および検定は例１と同様に行なうが、次の
点が異なる。以前に用いた家兎１ｇＧに対する（ポリク
ローン）羊抗血清の代りに良い親和力をもつマウス七ツ
クローン抗−（家兎１ｏＧ）を用いる。あらかじめ酵素
と混合し抱合すべき抗血清の１ｇＧフラクシコンの代り
に、モノクローン抗体を含む腹水液フラクションを用い
る。このフラクションは例１と同種の家兎グＯプリン抱
合セファＤ−スゲル上の親和性クロマトグラフィーによ
り調製されるが、溶離は０５Ｍ酢酸の代りに４Ｍ　　Ｍ
ＱＣｊ２１液で復ろに向かつで行なう。最終の抱合調製
物をシ、１糖上塗りとして適用する代りに工程１で直接
くぼみに加え、］ニ工程におけるインキュベーション時
間を１時間に減らすことができる。この検定は時間の利
得および能事さを与えるだけでなく工程５〜６における
最終発色と］二程１で加えた抗−（大豆）抗血清の量と
の間に−ＩＩ精確かつ信頼できる関係をつくり出すこと
が判った。

例３ に型免疫グロブリンＧに特異的な検定およびそのための
材料の調製は次のように行なわれる。

第３図に示した形のナイロン６６から成形されたペグを
アルコールおよび蒸留水で洗う。マウスモノクローン抗
−（ヒトに一鎖）抗体を、他のタンパク質および洗浄剤
を除去したｐ１１８の０．ＯＩＭ水性リン酸塩１１ｉ液
中抗体ノ２０μｇＺｌｌＩｅｗＩ液に、ペグを室温で数
時間または−・晩さらすことによりペグに固定する。Ｋ
鎖に対する七ツクＯ−ン抗体の調製物（そしてまたγ−
鎖に向けられた下で用いた抗体の調製物）は、例えばヒ
トＩＱＧに抱合されたアフィゲル（Ａｆｆｉｏｅｌ）　
（Ｂｉｏｒａｄ、商標）のカラムＬ親和力クロマトグラ
フイーにより、それ以外は例１または２と同じ方法で、
対応する腹水液から誘導される（約１ｏＩ１ｇＩ　Ｑ　
Ｇをゲル１ｄの抱合に用い、少なくとも２ｄのゲルを腹
水液１−のクロマトグラフィーに用いる）。

マウス七ツクローン（ヒトγ−鎖）抗体を例１における
ようにアルカリ性ホスファターゼで抱合し検定における
他の特異的結合試薬をつくる。

次に、例１または２の−・股手順をこれら材料と共に用
いるが、ただし免疫吸収剤を形成する抗体の吸収の非共
有原子価性がｐＨ７，１の反応緩衝剤としてリン酸塩／
食塩水／トウィーン／卵アルブミン緩衝剤（リン酸塩０
．１５％、Ｎ　ａ　Ｃｊｌ　Ｏ，８５％、トウィーン１
．５ｄ／ａｄ、卵アルブミン１１１ｇ／ｄ）を使用する
ことを推奨できるようにすることを除く。

このことはに−型ヒトｌｏＧに対する特異的かつ敏感な
検定を与える。本例の検定に対するもう一つの装置は１
程２から抱合体を省き、ペグおよび試験試料を約６０分
インキュベーションし、洗浄し、次に］二程３に進む前
に同様なｌ１Ｉｉ衝剤に溶かした抱合体と共にインキュ
ベーションすることを含む。

両横定法ともそのせまい特異性が特異性の小さい試薬を
用いるとこのような特異的検定を不可能にしたかもしれ
ない妨害交差反応を避けるので、ＩＱＧ分子のγ−に亜
集団の高度に特異的な決定を許すことで利点を与える。

一連の試行において、検定の結果は０．２−の検定反応
体積当り１０〜１ｏｏｎｇ　Ｋ−Ｉ　Ｑ　Ｇの範囲内で
直線にすることができることが判った（出発の抗体含量
に基づいＣ約５０ｎｇの抱合体を使用）。

λ−型１ａＧに対する対応検定は、もし免疫吸収剤、即
ちその上に固定された抗体をもつナイロン６６ペグ、の
調製において、代って一鎖に対して向けられたマウスモ
ノクローン抗体を用いるならば容易に行ないうる。

上記の特定の方法および材料はより少ない処理工程の便
利さと使用時の妨害靜１反応の除去を共有する広範囲の
検定を与えるように特異性におい“Ｃ変化させることが
できることが判る。

公表された手順により得られ本発明における検定材料と
して使用するために選ぶことができるセック０−ン抗体
には、例えば抗ロータウィルス、抗−（ヒト）ＩｑＥ１
抗−（牛）ＩＱＧ、抗α−フェトタンパク質、抗−（ヒ
トその他）ＩＯＡ。

抗−（チロイド結合グロブリン）、抗−β２マイクログ
ロブリン、抗−プレグナンジオール、抗−エストロンジ
オール、および抗・−（ヒト＞ＩｇＭ抗体その他がある
。本発明によるとこれら試薬は、検定下におかれた材料
の型の全東回あるいは特別な亜集団に相当するかもしれ
ない対応する特異的な結合相手に対し高度に特異的な検
定の基準を与えるように用いることができる。上記検定
法の何れもこの目的のために使用できる。

最も厳密な意味で対応する検定のすべてがイムノアッセ
イである必要はない。例えば、モノクローン抗−（ＴＢ
Ｇ）を用いると、対応する特異的結合検定は試験］“Ｂ
Ｇの特異的結合相手として固定されたＴ　または■４を
含み、そして選ばれたマーカー抱合モノクローン抗ＴＢ
Ｇは敏感な「ナンドイツチ」型検定を、免疫複合体形成
とＴＢＧのＴ　またはＴ４への結合との間に干渉なく少
数の工程で実施できるようにする。

特異的免疫複合体の検定は固定されたコングルチニンお
よび検定しようとする免疫複合体の成分に特異的なマー
カー抱合モノクローン抗体の使用により同様な方法で実
施ｒきる。

本発明の他の装置も広い変更および応用を受けうること
はよく理解されるであろう。例えば、第３図および第４
図に示した一組の排除体は、例えば８個のペグを取り付
けた取り扱いピースまたはホルダーからなってもよく、
そして排除体は、例えばトキソプラズマ、ルベラウィル
ス、シトメガロウイルスおよびヘルペスウィルスのどれ
か一つまたはそれ以上に対しヒト抗体の検定に使用する
ために適当に感作されている。排除体はそれに固定され
た対応する抗原を有することができ、マーカー抱合抗−
（ヒトグロブリン）を相応に準備され較正された試薬と
共に化学的には公知の族グロブリン形式である試験に使
用できる。もしすべての四つの抗原感作が複製で（各々
は第３図〜第４図に示した組み立ての二つの排除体上に
ある）表わされるならば特に便利である。従って、この
ような組み立ては、例えば、四つの上記抗体の各々に対
し複製で単一の患者試料の八つの部分を検定するように
設計された検定工程を経て運ばれる。

このような装置は特定の感作を有する排除体以外の試験
の道具および試薬の残りがすべての検定に対し定性的に
同様でよく、例えば抱合体は適当なマーカー酵素に結合
した抗−（ヒトグロブリン）抗体でよく、酵素の検出に
共通の手段を使用できるという点で特に便利である。こ
れらの成分は、望むならば感作された排除体ペグと関連
してｉＪ％１されたミクロタイターくぼみの中に適当に
供給できる。

本発明による他のイムノアッセイ装置は特異性において
、例えば免疫グロブリンＥ（ほかにレアジン免疫グロブ
リンとして記述される）に向けることができ、これに対
する族グロブリン検定は、用いる抗−ＩＱＥまたは他の
標識した抗体を抱合づる他の種のマーカー、例えば前記
のように用いられる螢光または特に酵素マーカーの代用
を任意に行なって米国特許第３．７２０．７６０号明細
書に記述された族グロブリンを用いるラジオイムノアッ
セイと形式上類似する６Ｗ索マーカー以外のマーカーを
用いる場合、適当なそれぞれの公知のカップリング技術
が使用される。同様な検定装置は臨床的診断用に、例え
ば血漿Ｃ−反応性タンパク質、尿β２−ミクログロブリ
ンまたはファクター■用につくることができる。これら
抗原試験材料に対してはサンドイッチ型検定形式を用い
るのが便利である。

他の修正および変化は当業者にとって明らかであろう。

特に、明細書Ｅ　Ｐ−００１４５３０に記載の可視固定
マーカ一方式を用いて本発明に係る検定の印づけを得る
ことができる。サンドイッチ型および抗グ０プリン型検
定構成のそれ以上の例に対しでも本明細書およびここに
引用された文献に言及できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による検定を行なうための容器および排
除体の断面図であり、第２図は第１図に示した装置の配
列を示した図であり、第３図および第４図は排除体の組
み立ての側面図および部分断面図である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験物質を多分含む検定用試料（ａ）、固体支持
   体上に固定された、試験物質に特異的な非標識結合相手
   （ｂ）および試験物質に特異的な標識結合相手（ｃ）の
   すべてを単一インキュベーション混合物中に混合するこ
   とを含むイムノアッセイを実施する方法において、試験
   物質と試薬（ｂ）および（ｃ）との結合反応間の競合干
   渉を、同一試験抗原に対してせまいかつ異なる非干渉特
   異性の２種のモノクローナル抗体を成分（ｂ）及び（ｃ
   ）に使用にすることにより回避することを特徴とする、
   前記方法。
2. （２）成分（ｂ）が、液体検定試薬中に浸けるための棒
   、ペグ又はびょうであって免疫吸収剤の表面を有してい
   ることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
3. （３）特異的な標識結合相手（ｃ）が抗体と酸素間の抱
   合体であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項記載の方法。
4. （４）固体支持体上に支えられた、試験物質に対する固
   定された特異的結合相手（ｉ）、および試験物質に対す
   る特異的な標識結合相手（ｉｉ）からなり、試薬（ｉ）
   および（ｉｉ）中の特異的な結合相手が試験物質に対し
   てせまいかつ異なる特異性のモノクローナル抗体を含み
   、その結果試薬（ｉ）および（ｉｉ）が試験物質との互
   いの結合反応を干渉しないことを特徴とする、特許請求
   の範囲１項から第３項までのいずれか一項に記載の特異
   的結合検定を実施するための材料。
5. （５）免疫吸収剤の表面を有することによって感作され
   た、棒、ペグ、びょう、剛性の房及び葉の房から成る群
   から選択され共通の操作棒、リンク又はふたに結合して
   いる１セットの液体排除体を検定に用いる液体を含む相
   補的くぼみセットと組み合せて含む、特異的結合検定を
   実施するための試験装置であって、液体排除体は共通の
   操作棒、リンク又はふたに装着された一連の分離した部
   分を形成し異なる免疫学的感作を有することによって複
   数の異なる検定型を同時にこなすことができること特徴
   とする前記装置。
6. （６）免疫吸収剤の表面を有することによって感作され
   た、棒、ペグ、びょう、剛性の房及び葉の房から成る群
   から選択され共通の操作棒、リンク又はふたに結合して
   いる１セットの液体排除体を検定に用いる液体を含む相
   補的くぼみセットと組み合せて含む、特異的結合検定を
   実施するための試験装置であって、各排除体が特異的結
   合反応が生起する水性液体を含む対応するくぼみ又はカ
   ップの容量の大部分を占めることを特徴とする前記装置
   。
7. （７）排除体の形態が、くぼみ又はカップのそれと実質
   的に相補的でありかつそれよりも幾分か小さいものであ
   ることを特徴とする、特許請求の範囲第６項に記載の試
   験装置。
8. （８）くぼみの２次元配列を含むトレー及び液体排除体
   が該トレーのくぼみのセットに内部適合すべく相補的２
   次元配列として配置され装着されたふたを有することを
   特徴とする、特許請求の範囲第５〜７項のいずれか一項
   に記載の試験装置。
9. （９）くぼみの２次元配列を含むトレー及び液体排除体
   が該トレーのくぼみの１列または複数列と内部適合すべ
   く配置された１列または複数列（くぼみの全配列より少
   ない）として装着されたふたを有することを特徴とする
   、特許請求の範囲第５〜７項のいずれか一項に記載の試
   験装置。
10. （１０）液体排除体が共通の操作棒、リンクまたはふた
    に交換できるように装着された一連の分離した部分を形
    成することを特徴とする、特許請求の範囲第５〜９項の
    いずれか一項に記載の試験装置。
11. （１１）液体排除体がみぞ、小さなみぞ、らせん繊条又
    はその他の比較的低度の不規則な表面を有するびょうま
    たはペグの形態であることを特徴とする、特許請求の範
    囲第５〜１０項のいずれか一項に記載の試験装置。
12. （１２）試験物質を多分含む検定用試料（ａ）を固体支
    持体上に固定された試験物質に特異的な結合相手（ｂ）
    および検出可能なマーカーに抱合された、試験物質に特
    異的な結合相手（ｃ）と反応させることにより、存在す
    る試験物質の量と試薬（ｂ）および（ｃ）との間の反応
    によりマーカーが試験物質を介して支持体に固定された
    複合体を形成させ、そしてマーカーが試料（ａ）中に存
    在するどれかの試験物質の量の指数として検出または検
    定される特異的な結合検定（例えば、イムノアッセイ）
    を実施する方法において、反応成分（ａ）、（ｂ）、お
    よび（ｃ）すべてを単一反応液中での反応に対し単一段
    階に混合し、試験物質と試薬（ｂ）および（ｃ）との結
    合反応間の競合干渉を、せまいかつ異なる非干渉特異性
    の抗体、例えばモノクローン抗体の使用により干渉を避
    けるか、または緩徐放出形の試薬（ｃ）の使用により回
    避すること、及び特異的結合試薬（ｂ）が排除体の表面
    上に固定され、該排除体は特異的結合反応が生起する水
    性液体を含むくぼみ又はカップの容量の大部分を占める
    ことを特徴とする前記方法。
13. （１３）排除体がくぼみ又はカップの形態と実質的に相
    補的でありかつそれよりも幾分か小さい形態を有するこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第１２項に記載の方法
    。