ES2197425T3 - Superficies union a ligando. - Google Patents
Superficies union a ligando.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA SUPERFICIE DE UNION DE LIGANTES EN DONDE UN ASOCIADO DE UNION UNIDO A UN RECEPTOR DE LIGANTES SE MEZCLA CON UN AGENTE DE UNION ESPECIFICO PARA EL ASOCIADO DE UNION EN UNA RELACION MOLAR DE MANERA QUE SE FORMEN COMPLEJOS QUE TENGAN ZONAS DE UNION PARA PERMITIR QUE LOS COMPLEJOS SE UNAN AL ASOCIADO DE UNION INMOVILIZADO SOBRE UNA SUPERFICIE. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A SUPERFICIES DE UNION DE LIGANTES PREPARADAS MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO Y AL USO DE LAS SUPERFICIES DE UNION DE LIGANTES EN ENSAYOS.
Description
Superficie unión a ligando.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una superficie unión a
ligando.
La adsorción pasiva de anticuerpos y otras
entidades de unión a ligando a una variedad de sustratos es uno de
los procedimientos de inmovilización más ampliamente utilizados
para la generación de superficies funcionales para uso en ensayos.
El nivel de funcionalidad generado mediante la utilización de este
procedimiento es variable debido a los cambios conformacionales en
la entidad de unión a ligando en la adsorción (Kochwa y col.,
1967; Suter y Buter, 1986; Dieks y col. 1986; Butler y col., 1992; y
Davies y col. 1995). Se han hecho mejoras en el nivel de la
funcionalidad de las superficies bioactivas utilizando el enlace
biotina/avidina. Estas mejoras están bien documentadas (Butler y
col., 1992; Davies y col., 1993; Davies y col., 1994).
Tanto la estreptavidina como la avidina tienen
una muy alta afinidad de enlace (10^{15} M^{-1}) para la
biotina. Esta afinidad de enlace, acoplada junto con la capacidad
de la biotina y sus derivados para incorporarse a varios materiales
biológicos, dota a los sistemas de estreptavidina biotina de gran
versatilidad.
La avidina es una glicoproteína que se encuentra
en la clara de huevo y en los tejidos de los pájaros, reptiles y
anfibios. La estreptavidina es producida por el Streptomyces
avidini. Ambas proteínas de unión a biotina existen como
proteínas tetraméricas que tienen cuatro subunidades idénticas.
La biotina, también conocida como vitamina H o
ácido
cis-hexahidro-2-oxo-1H-
tieno-(3,4)- imidazol-4-pentanoico,
es una vitamina esencial. En mamíferos, los tejidos que tienen las
cantidades mayores de biotina son el hígado, riñones y páncreas.
Las superficies de unión a ligando pueden
prepararse por la adición de un agente de unión (por ejemplo,
estreptavidina o avidina) a una superficie que tiene una pareja
específica de unión (por ejemplo, biotina) inmovilizada sobre ella o
acoplando el agente de enlace a la superficie, químicamente o
mediante una molécula vehículo secundaria; la eliminación de
cualquiera de los compuestos no unidos, la adición de la pareja
específica de unión, a la cual está unida un receptor de ligando
(por ejemplo, un receptor de ligando biotinilado) de modo que se
forman sobre la superficie complejos que comprenden la pareja de
unión que tiene el receptor del ligando unido y el agente de unión;
y la eliminación de cualquiera de los compuestos no unidos. La
Figura 1 da una representación esquemática de dicho procedimiento
para la preparación de las superficies de unión a ligando
utilizando biotina como pareja de enlace y estreptavidina como
agente de enlace.
Se puede observar que la preparación de las
superficies funcionales para uso en ensayos es un procedimiento
complejo multietapas. La etapa final es generalmente la adición de
una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, para
producir una superficie específica de analito. El control de la
cantidad de la pareja de enlace, a la que se une un receptor de
ligando, es crítico para la realización del ensayo final y es
difícil alcanzar niveles de recubrimiento consistentes,
especialmente cuando se requiere una concentración limitante del
receptor del ligando, tal como en formatos de inmunoensayo de
competencia.
Existe por ello una necesidad de un procedimiento
de preparación de superficies funcionales que pueda ser más
fácilmente controlable y que produzca consistentemente superficies
funcionales que tengan un nivel de recubrimiento requerido. Se
alcanzan en la presente invención una reducción en la complejidad
de los casos de manipulación de líquidos y mejora en el control de
la cantidad de receptor del ligando que recubre la superficie. Un
mayor control sobre la cantidad de receptor del ligando también
mejora el rendimiento de inmunoensayo en términos de precisión,
sensibilidad e intervalo.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la preparación de una superficie de unión a
ligando que comprende:
- i.
- mezclar una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, y un agente de unión específico para la pareja de unión en una relación molar específica de modo que se forman complejos que tienen suficientes sitios de unión libres en el agente de unión para permitir a los complejos que se unan a la pareja de unión inmovilizada sobre una superficie;
- ii.
- poner en contacto una superficie sobre la que la pareja de unión se inmoviliza con los complejos de modo que los complejos llegan a unirse a la superficie; y
- iii.
- eliminar cualquiera de los compuestos no unidos.
El término ``agente de unión'' como se utiliza en
la presente memoria significa cualquier compuesto, proteína o
agente capaz de unirse específicamente a la pareja de unión.
Preferiblemente, el agente de unión es SAV o AV, un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo tal como Fv, Fab y fragmentos
F(ab')_{2}, capaces de unirse a la pareja de unión. Si la
pareja de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se
ha definido anteriormente, entonces preferiblemente, el agente de
unión es un antígeno o uno de sus fragmentos capaces de unirse por
la pareja de unión.
En una realización preferida de la presente
invención, el agente de unión es cualquier compuesto, proteína o
agente que se une a la biotina. Más preferiblemente, el agente de
unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos con afinidad por la
biotina. Más preferiblemente, el agente de unión es estreptavidina y
el homólogo funcional avidita, así como cualquier proteína
estreptavidina o avidina recombinante que se une a biotina tal
como se describe en el Documento WO 97/11183.
El término ``pareja de unión'' como se utiliza en
la presente invención significa cualquier compuesto, proteína o
agente capaz de unirse específicamente al agente de unión. Si el
agente de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos entonces,
preferiblemente, la pareja de unión es un anticuerpo o uno de sus
fragmentos capaces de unirse al agente de unión. Si el agente de
unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos entonces,
preferiblemente, la pareja de unión es un anticuerpo o uno de sus
fragmentos tal como Fv, Fab y fragmentos F(ab')_{2},
capaces de unirse al agente de unión.
En una realización preferida, la pareja de unión
es biotina o un derivado o uno de sus homólogos funcionales, en
los que el agente de unión es cualquier compuesto, proteína o
agente que se une a biotina. Aquellos expertos en la técnica sabrán
que sólo se requiere el anillo bicíclico intacto de la biotina para
unirse fuertemente con la estreptavidina, avidina o sus homólogos
funcionales. El grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido
pentanoico de la biotina tiene poco que hacer en la interacción.
Por ello, los derivados de la biotina pueden prepararse por
modificación del grupo carboxilo del ácido pentanoico sin
alteración significativa de la capacidad del derivado para unirse
a la estreptavidina, avidina o sus homólogos funcionales. Dichos
derivados de la biotina se describen en Biomethods, 7 (1996), ``A
laboratory guide to biotin labelling in biomolecule analysis'',
T.M. Cier y F. Fahrenholz eds., Birkhäuser Verlag, Switzerland.
El término ``receptor de ligando'' como se
utiliza en la presente memoria significa cualquier entidad que
tenga la capacidad de unirse a un ligando en el que el ligando
puede ser cualquier compuesto o molécula. Los agentes de unión a
ligando preferidos incluyen antígenos (en los que el ligando es un
anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos o sus
fragmentos funcionales tales como fragmentos Fv, Fab y
F(ab')_{2} que son capaces de unirse a un ligando
enlazante, Factor Intrínseco, proteína de unión a folato y
receptores celulares.
La superficie de la presente invención puede ser
cualquier soporte sólido adecuado para la realización de un
ensayo. Las superficies preferidas incluyen la superficie de un
micropocillo (especialmente micropocillos de poliestireno), una
perla (especialmente perlas de látex/magnéticas) o una
varilla.
La pareja de unión puede inmovilizarse sobre una
superficie utilizando cualquiera de los procedimientos estándar
conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la pareja
de unión puede inmovilizarse sobre una superficie por adsorción
pasiva de la pareja de unión sola o acoplada a un vehículo tal
como seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA) o una
poliamina tal como polilisina. Las técnicas adecuadas para la
inmovilización de la pareja de unión se describen en Immunoassays,
(Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academc Pres, London
(1996)) especialmente en las páginas 216 a 222 y 229. La
biotinilación de las superficies (esto es, la inmovilización de la
biotina sobre una superficie) se describe en Bayer y Wilcheck,
1990.
Los receptores de ligando de la presente
invención pueden unirse a la pareja de unión mediante cualquiera de
los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la
técnica. Los procedimientos adecuados incluyen acoplamiento químico
utilizando agentes de entrecruzamiento y el uso de las parejas de
unión activadas (por ejemplo esteres activos de biotina).
Preferiblemente, los receptores de ligando se biotinilan (es
decir, concretamente se unen a la biotina) mediante los
procedimientos descritos en Bayer y Wilcheck, 1990. Además, se
prefiere que los receptores de ligando se unan a la pareja de
unión en tal forma que la actividad de los receptores de ligando no
se reduzca significativamente comparada con la de los receptores de
ligando libres.
En la presente invención, el agente de unión y la
pareja de unión, a los que se une un receptor de ligando, se
mezclan en una relación molar específica de modo que los complejos
que se forman tienen suficientes sitios de unión libres en el agente
de unión para permitir que los complejos se unan a la pareja de
unión inmovilizada sobre una superficie. Por ello, la cantidad de
agente de unión a utilizar se determina por la capacidad de unión
de la superficie sobre la cual la pareja de unión se ha
inmovilizado. La cantidad de pareja de unión, a la que está unida un
receptor de ligando, para complejarse con el agente de unión se
determina por la funcionalidad deseada total de la superficie de
ligando de unión. Por supuesto, esto variará dependiendo del tipo
de ensayo a realizar (competitivo o inmunométrico) y de la relación
de los receptores de ligando unidos a las parejas de unión.
La presente invención permite que el agente de
unión y a la pareja de unión, a los que está unido un receptor de
ligando, se mezclan a sus concentraciones finales antes que se
pongan en contacto con la superficie sobre la cual la pareja de
unión se inmoviliza. Esto posibilita un mayor control sobre la
funcionalidad de la superficie de unión a ligando, mayor
consistencia en la preparación de la superficie de unión a ligando
y una subsecuente mejora en el rendimiento del ensayo.
Preferiblemente, el agente de unión y la pareja
de unión, a la que está unido el receptor de ligando, se mezclan
juntos de modo que se forman complejos. Esto puede llevar hasta 18
horas y es dependiente de la concentración de los compuestos
utilizados. La superficie sobre la cual la pareja de unión se
inmoviliza se pone en contacto con los complejos de modo que los
complejos llegan a unirse. Esto puede llevar hasta 16 horas y es
dependiente de la concentración de los sitios de unión libres en el
agente de unión en los complejos.
En una realización preferida de la presente
invenciones utilizan, las combinaciones de las parejas de unión
que tienen diferentes receptores de ligando unidos, se utilizan
en la preparación de la superficie de unión a ligando, produciendo
así una superficie de unión a ligando multifuncional la cual puede
unir más de un ligando. Dichas superficies de unión a ligando
multifuncionales pueden utilizarse para varios ensayos separados o
para ensayos combinados, especialmente si se utilizan diferentes
especies registradas (por ejemplo enzimas, marcadores radiactivos,
etc) para la detección de diferentes ligandos unidos.
Preferiblemente, la presente invención proporciona un procedimiento
para la preparación de una superficie de unión a ligando
multifuncional que comprende Factor Intrínseco biotinilado y
proteína de unión a folato biotinilada como receptores de
ligando.
La superficie de unión a ligando de la presente
invención puede utilizarse en una variedad de diferentes ensayos
que incluyen ensayos en sándwich, ensayos de competición, ensayos
inmunométricos, ensayos de antígenos y anticuerpos que son
indicativos de enfermedades infecciosas, y ensayos de captura de
tipos de anticuerpos. Dichos ensayos se describen en Immunoassays,
(Diamandis, E.P. y Christopoulos T.K., Eds., Academc Pres, London
(1996)). La superficie de unión a ligando de la presente invención
puede utilizarse también en procedimientos cromatográficos tales
como cromatografía de afinidad. La superficie de ligando de unión
de la presente invención puede utilizarse también como un
inmunosensor utilizando, por ejemplo, el ensayo de banco de
sangre por resonancia de plasmón de superficie o pruebas de
embarazo.
La presente invención se describe ahora
adicionalmente además por ejemplo con referencia a las figuras
adjuntas en las que:
La Figura 1 muestra el procedimiento de la
técnica anterior para la preparación de una superficie de unión a
ligando, en el que en la etapa 1, el vehículo biotinilado (pareja
de unión) se añade a la superficie; en la etapa 2, se elimina por
lavado el exceso de vehículo; en la etapa 3, la estreptavidina
(agente de unión) se añade a la superficie; en la etapa 4, se
elimina por lavado el exceso de estreptavidina; en la etapa 5, se
añade a la superficie; el receptor de ligando biotinilado (pareja
de unión a la que está unida un receptor de ligando) y en la etapa
6, se elimina por lavado el exceso de receptor de ligando
biotinilado;
La Figura 2 muestra el procedimiento de la
presente invención, en el que en la etapa 1, el vehículo
biotinilado (pareja de unión) se añade a la superficie; en la etapa
2, se elimina por lavado el exceso de vehículo; en la etapa 3, la
estreptavidina (agente de unión) y el receptor de ligando
biotinilado (pareja de unión a la que está unida un receptor de
ligando) se mezclan juntos; y en la etapa 4, el complejo
estreptavidina-receptor de ligando biotinilado se
añade a la superficie;
La Figura 3 es una curva patrón de la vitamina
B12 en un pocillo funcional dual;
La Figura 4 es una curva patrón de folato en un
pocillo funcional dual; y
La Figura 5 es un gráfico de bloques que muestra
los niveles de señal obtenidos usando superficies de unión a
ligando preparadas mediante el procedimiento de la presente
invención y utilizando el procedimiento de la técnica anterior.
- 1.
- Se biotiniló BSA de acuerdo con procedimientos publicados (Bayer y Wilchek(1990), incorporados a la presente memoria como referencia).
- 2.
- Los micropocillos de poliestireno (obtenidos de PCMD Kodak) se recubrieron con BSA biotinilada mediante adsorción pasiva.
- 3.
- La proteína de unión a Folato biotinilada (B-FBP) preparada de acuerdo con los procedimientos publicados (Bayer y Wilchek(1990)) y la estreptavidina se mezclaron en la relación molar de 1,0 x10^{-8} moles de B-FBP a 1,0 x10^{-8} moles de estreptavidina en tampón de borato 0,075 M a pH 9,30. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 18 - 25ºC.
- 4.
- 200 \mul de este disolución se añadieron a cada micropocillo recubierto.
- 5.
- Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.
- 6.
- Los micropocillos se lavaron con una disolución tampón Tris (pH 8,5 , 0,1 M) que contiene sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.
A un tubo de ensayo se añaden:
- 1.
- 150 \mul de muestra;
- 2.
- 50 \mul de estabilizador (ditiotreitol al 0,8%; ácido ascórbico al 2%);
- 3.
- Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;
- 4.
- Se añaden 100 \mul de desnaturalizante (NaOH 0,85 M; tetraborato de sodio 0,15 M; colorante Naranja Mordiente al 0,01%);
- 5.
- Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;
- 6.
- Se añaden 100 \mul de neutralizador (ácido bórico 0,6 M, yodato potásico 30 mM, Triton X-100 al 2,5%, antiespumante médico C (obtenido de Dow Corning Francia);
- 7.
- Se mezcla;
- 8.
- Se transfieren 80 \mul al pocillo recubierto;
- 9.
- Se añaden 100 \mul de reactivo conjugado de peroxidasa de rábano picante- folato, preparado medianteacoplamiento con EDAC (tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 6,4 que contiene: conjugando folato - HRP para dar una concentración de 0,16 \mug/ml de HRP; seroalbúmina humana al 0,5%; bronidox - L al 0,5%; cloruro de sodio al 0,29%; ferricianuro potásico al 0,01%; y sacarosa al 5%);
- 10.
- Se incuba durante 45 minutos a 37ºC con agitación;
- 11.
- Se lava y se añade reactivo señal usando reactivos Vitros Eci suministrados comercialmente por Ortho Clinical Diagnostics (O.C.D.) Amersham UK; y
- 12.
- Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos y antes de 20 minutos.
Por favor nótese que todos los porcentajes se dan
con respecto al volumen y que todas las soluciones son
acuosas.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Nivel de Calibración \+ Unidades lumínicas \+ Unidades lumínicas \+
Unidades\cr Unidades\+\+\+\cr (Folato ng/ml) \+ para Repetición I
\+ Repetición 2 \+ lumínicas\cr medias\+\+\+\cr
0 \+ 60,87 \+ 61,12 \+ 61,00\cr 0,93
\+ 55,93 \+ 52,64 \+ 54,29\cr 1,83 \+
42,22 \+ 44,87 \+ 43,55\cr 4,12 \+ 23,37
\+ 22,23 \+ 22,80\cr 11,1 \+ 7,16 \+
7,50 \+ 7,33\cr 19,4 \+ 3,03 \+ 3,00
\+
3,02\cr}
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Nivel de Calibración \+ Unidades lumínicas \+ Unidades
lumínicas \+ Unidades\cr Unidades\+\+\+\cr (Folato ng/ml) \+
para Repetición I \+ Repetición 2 \+ lumínicas\cr
medias\+\+\+\cr 0 \+ 110,65 \+ 113,65 \+
112,15\cr 0,93 \+ 107,65 \+ 105,22 \+
106,44\cr 1,83 \+ 91,29 \+ 91,21 \+
91,25\cr 4,12 \+ 63,60 \+ 64,42 \+
64,01\cr 11,1 \+ 20,93 \+ 21,43 \+
21,18\cr 19,4 \+ 6,53 \+ 6,72 \+
6,63\cr}
Precisión para depósitos de plasma que contienen
3 ng/ml de folato (n = 12 repeticiones) (concretamente, la medida
de la reproducibilidad del ensayo de folato mediante determinación
repetitiva de la concentración de una muestra (en este caso una
muestra de plasma que contiene 3 ng/ml de folato)).
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Unidades lumínicas \+ % C.V de Unidades \+ Dosis
Media \+ % C. V de\cr medias \+ lumínicas \+ de Folato
dosis\+\cr 20,02 \+ 2,56 \+ 3,06 ng/ml \+
3,25\cr}
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Unidades lumínicas \+ % C.V de Unidades \+ Dosis Media
\+ % C. V de\cr medias \+ lumínicas \+ de Folato \+
dosis\cr 55,02 \+ 4,59 \+ 2,92 ng/ml \+
10,65\cr}
La precisión del ensayo es significativamente
mejor utilizando el procedimiento de la presente invención
- 1.
- Se recubrieron micropocillos de poliestireno con BSA biotinilada como en el Ejemplo 1.
- 2.
- El Factor Intrínseco Biotinilado (B - IF) y la estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 7 10^{-10} moles de B -IF con 14 10^{-10} moles de estreptavidina en tampón de fosfato 0,1 M de pH 7,0. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 20 - 28ºC.
- 3.
- Se añadieron 28 10^{-10} moles de BSA biotinilada (B - BSA) para unirse al complejo BIF - estreptavidina. Se requiere una relación de 1:2:4 de B -IF : estreptavidina: B - BSA se requiere para asegurar que todo el IF esté unido.
- 4.
- Se añadieron 210 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.
- 5.
- Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.
- 6.
- Los micropocillos se lavaron dos veces con Tampón Tris y una vez con tampón Tris que contenía sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.
A un tubo de ensayo se añaden:
- 1.
- 150 \mul de muestra;
- 2.
- 50 \mul de estabilizador (ditiotreitol al 1,6% en cloruro de sodio al 0,8%);
- 3.
- 100 \mul de desnaturalizante (NaOH 0,85 M, KCN al 0,01%, tetraborato disódico 0,15 M, colorante Naranja Mordiente al 0,01%);
- 4.
- Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;
- 5.
- Se añaden 100 \mul de neutralizador (ácido bórico 0,6 M, iodato potásico 30 mM, Triton X-100 al 2,5%, antiespuma C Médica);
- 6.
- Se mezcla;
- 7.
- Se transfieren 60 \mul al pocillo recubierto;
- 8.
- Se incuba durante 15 minutos a 37ºC;
- 9.
- Se añaden 100 \mul de conjugado B12-peroxidasa de rábano picante, preparado medianteacoplamiento con EDAC (tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 6,4 que contiene: conjugado de folato - HRP para dar una concentración de 0,16 \mug/ml de HRP; seroalbúmina humana al 0,5%; bronidox - L al 0,5%; cloruro de sodio al 0,29%; ferricianuro potásico al 0,01%; y sacarosa al 5%);
- 10.
- Se incuba durante 30 minutos a 37ºC con agitación;
- 11.
- Se lava y se añade reactivo señal usando reactivos como se describieron en el ejemplo 1; y
- 12.
- Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos y antes de 20 minutos.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Número de \+ Vitamina B12 \+ Vitamina B12 \+ Vitamina
B12\cr Muestra \+ Esperada pg/ml \+ pg/ml procedimiento
\+ pg/ml procedimiento\cr \+ (por RIA) \+ de la técnica \+ de la
invención\cr \+ \+ anterior\+\cr 3135 \+ 1491 \+ 148 \+
189\cr 2993 \+ 134 \+ 174 \+ 131\cr 2986 \+ 403 \+
386 \+ 400\cr 3019 \+ 204 \+ 294 \+ 254\cr 3133 \+
1644 \+ 857 \+ 1161\cr 3230 \+ 1114 \+ 749 \+
1169\cr}
Los ensayos realizados sobre las superficies de
micropocillo recubiertas utilizando el procedimiento de la
presente invención se corresponden más exactamente con los valores
esperados a partir del procedimiento RIA y el intervalo dinámico del
ensayo se incrementó.
- 1.
- Se recubrieron micropocillos de poliestireno con vehículo biotinilado (en este caso BSA biotinilada).
- 2.
- La proteína de unión de Folato biotinilada (B - FBP), Factor Intrínseco biotinilado (B - IF) y estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 1,0 10^{-8} moles de B - FBP con 6,0x10^{-10} moles de B - IF y 2,0 x10^{-8} moles de estreptavidina en tampón borato 0,075 M de pH 9,30. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 20 - 28ºC.
- 3.
- Se añadieron 210 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.
- 4.
- Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.
- 5.
- Los micropocillos se lavaron con Tampón Tris que contenía sacarosa al 5%, se llenaron y secaron.
Los protocolos de ensayo de Vitamina B12 y Folato
son como se describen en los Ejemplos 1 y 2. Las curvas patrón
producidas utilizando los micropocillos se muestran en las figuras
3 y 4.
- 1.
- Se recubrieron micropocillos de poliestireno con vehículo biotinilado (en este caso BSA biotinilada).
- 2.
- El péptido NTx biotinilado y la estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 5,13 x10^{-8} moles de péptido de 1,33 x10^{-8} moles de estreptavidina o 1,00 x10^{-7} moles de péptido a 1,66 10^{-8} moles de estreptavidina en tampón de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,0.
- 3.
- Se añadieron 200 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.
- 4.
- Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.
- 5.
- Los micropocillos se lavaron con un tampón Tris (pH 8,4 , 0,1 M) que contenía sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.
- 1.
- Se añaden 200 \mul de una solución de conjugado de peroxidasa de rábano picante y anticuerpo anti-NTX marcado a los pocillos preparados como se describió anteriormente y a los pocillos producidos utilizando el procedimiento de la técnica anterior. (El procedimiento de recubrimiento de la técnica anterior utiliza péptido NTx biotinilado a 100 ng/ml y biotina libre a 100 ng/ml como solución de unión a ligando biotinilado que se adiciona a los pocillos en la etapa 5 del procedimiento de recubrimiento de la técnica anterior mostrado en la Figura 1).
- 2.
- Se incuba durante 30 minutos a 37ºC con agitación;
- 3.
- Se lava y se añade reactivo señal usando los reactivos Vitros Eci suministrados comercialmente por O.C.D. Amersham UK; y
- 4.
- Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos.
Los resultados se dan en la Figura 5 y muestran
que el procedimiento de la presente invención da una superficie
de unión a ligando que tiene una mayor capacidad para unir el
ligando.
- 1.
- Kochwa, S., Bronwell, M., Rosenfield, R.E. and Wasserman, L.R. (1967) Adsorption of proteins by polystyrene particles. I. Molecular unfolding and acquired immunogenicity of IgG. J. Immunol 99.981.
- 2.
- Suter, M. and Butler, J.E. (1986) The Immunochemistry of sandwich ELISAs. II. A novel system prevents denaturation of capture antibodies. Immunol. Lett. 14313.
- 3.
- Dierks S.E., Butler, J.E. and Richardson, H.B. (1986) Altered recognition of surface-absorbed compared to antigen bound antibodies in the ELISA. Mol. Immunol. 23.927.
- 4.
- Butler, J.E., Ni, L., Nessler, R., Joshi, K.S., Suter, M., Rosenberg, B., Chang, J., Brown, W.R., and Cantarero, L.A. (1992) The physical and functional behaviour of capture antibodies adsorbed on polystyrene. J. Immunol. Methods 150, 77 - 90.
- 5.
- Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Sunderland, R.F., and Edwards, J.C. (1995) Scanning tunnelling microscopy and dynamic contact angle studies of the effects of partial denaturation on immunoassay solid phase antibody. J. Immunol. Methods 186, 111 - 123.
- 6.
- Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Roberts, C.J., Sunderland, R.F., Wilkins, M.J., Davies, M.C., Tendler, S.J.B., and Edwards, J.C. (1994) A scanning tunnelling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtitre wells. J. Immunol. Methods 167, 263 - 269.
- 7.
- Davies, J., Roberts, C.J., Dawkes, A.C., Sefton, J., Edwards, J.C., Claseby, T.O., Haymes, A.G., Davies, M.C., Jackson, D.E., Lomas, m., Shakeshift, K.M., Tendler, S.J.B., Wilkins, M.J., and Williams, P.M. (1994) Use of scanning probe microscopy and surface plasmon resonance as analytical tools in the study of antibody coated microtitre wells. Langmuir 10(8) 2654 - 2661.
- 8.
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Claims (9)
1. Un procedimiento para la preparación de una
superficie de unión a ligando que comprende:
- i.
- mezclar una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, y un agente de unión específico para la pareja de unión en una relación molar específica de modo que se forman los complejos que tienen suficientes sitios de unión libres en el agente de unión para permitir que los complejos se unan a la pareja de unión inmovilizada sobre una superficie;
- ii.
- poner en contacto una superficie sobre la que la pareja de unión se inmoviliza con los complejos de modo que los complejos llegan a unirse a la superficie; y
- iii.
- eliminar cualquiera de los compuestos no unidos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el agente de unión es un compuesto, proteína o agente que se
une a biotina.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el agente de unión es la estreptavidina.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la pareja de unión es biotina o
un derivado o uno de sus homólogos funcionales.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones previas, en el que los receptores de ligando son
anticuerpos o sus fragmentos funcionales.
6. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que los receptores de ligando son el
Factor Intrínseco o la proteína de unión a folato.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones previas, en el que la superficie es la superficie
de un micropocillo, una perla o una varilla.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones previas, en el que se prepara una superficie de
unión a ligando multifuncional utilizando al menos dos diferentes
receptores de ligando.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que los diferentes receptores de ligando son el Factor Intrínseco
y la proteína de unión a folato.
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