DE69814543T2

DE69814543T2 - Liganden bindende Oberflächen

Info

Publication number: DE69814543T2
Application number: DE69814543T
Authority: DE
Inventors: Adrian Charles Windsor Dawkes; Jayne Beverly Shaw Berkshire Hipkiss; Heather Anne Tring Edgar; Dymphna Ann Lowbridge
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Ltd
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Ltd
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-08
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2018-09-09
Also published as: CA2246894A1; EP0903582A3; DK0903582T3; PT903582E; CA2246894C; EP0903582B1; ATE240521T1; JPH11164686A; ES2197425T3; JP4302798B2; GB9719140D0; EP0903582A2; DE69814543D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Liganden-bindenden Oberflä che.
Die passive Adsorption von Antikörpern und anderen Ligand-bindenden Gruppen an eine Vielzahl von Substraten ist eine der am meisten verbreitet verwendeten Immobilisierungsverfahren zur Erzeugung von funktionellen Oberflächen zur Verwendung in Tests. Die Spiegel von erzeugter funktionalität unter der Verwendung dieses Verfahrens sind aufgrund konformationeller Veränderungen der Liganden-bindenden Gruppe bei Adsorption variabel (Kochwa et al., 1967; Suter and Butler, 1986; Dierks et al., 1986; Butler et al., 1992; and Davies et al., 1995). Verbesserungen im Spiegel der Funktionalität von bioaktiven Oberflächen wurden unter der Verwendung der Biotin/Avidinverbindung durchgeführt. Diese Verbesserungen sind gut dokumentiert (Butler et al., 1992; Davies et al., 1993; Davies et al., 1994).
Sowohl Streptavidin als auch Avidin weisen eine sehr hohe Bindungsafinität für Biotin auf (10¹⁵M^–1). Diese Bindungsaffinität, gekoppelt mit der Fähigkeit von Biotin und seinen Derivaten, in verschiedene biologische Materialien inkorporiert zu werden, verleiht den Streptavidin-Biotinsystem große Vielseitigkeit.
Avidin ist ein Glycoprotein, das in Eiweiß und den Geweben von Vögeln, Reptilien und Amphibien gefunden wird. Streptavidin wird durch Streptomyces avidini produziert. Beide diese Biotin-bindenden Proteine existieren als tetramere Proteine, die vier identische Untereinheiten aufweisen.
Biotin, als auch Vitamin H oder cis-Hexahydro-2-oxo-1H-thieno-(3,4)-imidazol-4-pentanonsäure bekannt, ist ein essentielles Vitamin. In Säugern sind die Gewebe, die den höchsten Gehalt von Biotin aufweisen die Leber, Nieren und Pankreas.
Liganden-bindende Oberflächen können durch Hizufügen eines Bindemittels (zum Beispiel Streptavidin oder Avidin) zu einer Oberfläche, die einen darauf immobilisierten spezifischen Bindungspartnner (zum Beispiel Biotin) aufweist, hellt werden oder durch Koppeln des Bindemittels, chemisch oder über ein zweites Trägermolekül an die Oberfläche; Entfernen jeglicher nicht-gebundenen Komponenten, Hinzufügen des spezifischen Bindepartners, an den ein Ligandenrezeptor (zum Beispiel biotinylierter Ligandenrezeptor) angebracht ist, so daß Komplexe, die Bindepartner umfassen, die den Ligandenrezeptor angebracht aufweisen und Bindemittel auf der Oberfläche gebildet werden; und Entfernen jeglicher nicht-gebundener Komponenten. 1 zeigt eine schematische Darstellung solch eines Verfahrens zur Herstellung von Ligand-bindenden. Oberflächen unter der Verwendung von Biotin als den Bindepartner und Streptavidin als den Bindemitel.
Es kann gesehen werden, daß die Herstellung von funktionellen Oberflächen zur Verwendung in Tests ein komplexer Multi-Schritt-Prozeß ist. Der finale Schritt ist im allgemeinen die Zugabe eines Bindepartners, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, um eine Analyten-spezifische Oberfläche herzustellen. Die Kontrolle der Menge von Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, ist kritisch für die Durchführung des finalen Tests, und es ist schwierig, konsistente Beschichtungsspiegel zu erreichen, insbesondere wo der Ligan denrezeptor in einer begrennzenden Konzentration benötigt wird, wie zum Beispiel in Kompetitions-Immuntestformaten.
Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von funktionellen Oberflächen, das leichter kontrolliert werden kann und das konsistent funktionelle Oberflächen ergibt, die einen erforderlichen Beschichtungsspiegel aufweisen. Eine Verrigerung in der Komplexität von flüssigen Handhabungsvorgängen und eine Verbesserung in der Kontrolle der Quantität von Ligandenrezeptor, der auf die Oberfläche beschichtet wird, werden durch die vorliegende Erfindung erreicht. Eine bessere Kontrolle über die Quantität von Ligandenrezeptor verbessert auch die Performance eines Immuntests im Hinblick auf Präzision, Sensitivität und Bereich.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Liganden-bindenden Oberfläche zur Verfügung, umfassend:

i. Mischen eines Bindungspartners, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, und ein Bindungsmitel, das für den Bindungspartner spezifisch ist, in einem spezfischen molaren Verhältnis, so daß Komplexe gebildet werden, die ausreichend freie Bindungsstellen auf dem Bindmittel aufweisen, um es den Komplexen zu ermöglichen, an auf einer Oberfläche immobilisierten Bindungspartner gebunden zu werden,
ii. in Kontakt bringen einer Oberfläche, auf der Bindungspartner immobilisiert ist, mit den Komplexen, so daß die Komplexe auf die Oberfläche angebracht werden; und
iii. Entfernen aller nicht gebundenen Komponenten.

Der Begriff "Bindemittel", wie hier verwendet, bedeutet jede Verbindung, Protein oder Mritel, das in der Lage ist, spezifisch an den Bindungspartner zu binden. Bevorzugterweise ist das Bindemittel SAV oder AV, ein Antikörper oder Antikörperfragment, wie zum Beispiel Fv, Fab und F(ab')₂-Fragmente, die in der Lage sind, an den Bindungspartner zu binden. Falls der Bindepartner ein Antikörper oder Antikörperfragment wie oben definiert ist, dann ist das Bindungsmittel bevorzugterweise ein Antigen oder Fragment davon, das in der Lage ist, durch den Bindungspartner gebunden zu werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Bindemittel jede Vebindung Protein oder Mittel, das Biotin bindet. Weiter bevorzugt ist das Bindemittel ein Antikörper oder Fragment davon mit Affinität für Biotin. Am meisten bevorzugt ist das Bindemittel Streptavidin und das funktionelle Homolog Avidin, sowie jede rekombinanten Streptavidin oder Avidin-Proteine, die Biotin binden, wie diejenigen, beschrieben in WO 97111183.
Der Begriff "Bindepartner", wie hier verwendet, bedeutet jede Verbindung, Protein oder Mittel, das in der Lage ist, spezifisch an das Bindemittel zu binden. Falls das Bindemittel ein Antikörper oder Fragment davon ist, dann ist der Bindepartner bevorzugterweise ein Antigen oder Fragment davon, das in der Lage ist, an das Bindemittel zu binden. Falls das Bindemittel ein Antigen oder Fragment davon ist, dann ist bevorzugterweise der Bindepartner ein Antikörper oder Fragment davon, wie zum Beispiel Fv, Fab und F(ab')₂-Fragmente, die in der Lage sind, an das Bindemittel zu binden.
In einen bevorzugten Ausführungsform ist der Bindepartner Biotin oder ein Derivat oder ein funktionelles Homolog davon, wobei das Bindemittel jede Verbindung, Protein oder Mittel ist, das Biotin bindet. Die Fachleute im Stand der Technik werden wissen, daß nur der intakte bizyklische Ring von Biotin für eine starke Bindung an Streptavidin, Avidin oder funktionelle Homologe davon erforderlich ist. Die Carboxylgruppe der Pentanonsäure-Seitenkette von Biotin hat mit der Interaktion wenig zu tun. Demzufolge können Biotinderivate durch Modifizieren der Pentanonsäure-Carboxylgruppe hergestellt werden, ohne signifikant die Fähigkeit des Derivats zu verändern, an Streptavidin, Avidin oder funktionelle Homologe davon zu binden. Solche Biotinderivate sind beschrieben in, Biomethods, 7, (1996), "A laboratory guide to biotin labelling in biomolecule analysis", T. M. Cier and F. Fahrenholz Eds., Birkhäuser Verlag, Schweiz.
Der Begriff "Ligandenrezeptor", wie hier verwendet, bedeutet jede Gruppe, die die Fähigkeit aufweist, an einen Liganden zu binden, wobei der Ligand jede gewünschte Verbindung oder Molekül sein kann. Bevorzugte Ligandenbinder schließen Antigene (wobei der Ligand ein Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon ist), Antikörper oder funktionale Fragmente davon, wie zum Beispiel Fv, Fab und F(ab')₂-Fragmente ein, die in der Lage sind, einen Liganden, Intrinsischen-Faktor, Folat-bindendes Protein und zelluläre Rezeptoren zu binden.
Die Oberfläche der vorliegenden Erfindung kann jede feste Oberfläche sein, die zur Durchführung eines Tests geeignet ist. Bevorzugte Oberflächen schließen die Oberfläche eines Mikro-Tüpfels (insbesondere Polystyrol-Mikro-Tüpfel) einer Perle (insbesondere Latex/magnetische Perlen) oder einen Tauchstreifen ein.
Der Bindepartner kann auf eine Oberfläche unter der Verwendung jedes der Standartverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, immobilisiert werden. Zum Beispiel kann der Bindepartner auf eine Oberfläche durch passive Adsorption des Bindepartners selber immobilisiert werden, oder an einen Träger, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin (BSA), Humanserumalbumin (HSA) oder ein Polyamin, wie zum Beispiel Polylysin, gekoppelt werden. Geeignete Techniken zur Immobilisierung des Bindepartners sind in Immuntests beschrieben, (Diamandis, E. P. and Christopoulos T. K., Eds., Academic Press, London (1996)), besondere auf Seiten 216 bis 222 und 229. Die Biotinylierung von Oberflächen (d. h. die Immobilisierung von Biotin auf einer Oberfläche) ist in Bayer und Wilcheck, 1990, beschrieben.
Die Ligandenrezeptoren der vorliegenden Erfindung können an dem Bindungspartner durch jedes der Standartverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angebracht werden. Geeignete Verfahren schließen chemische Kopplung unter der Verwendung von kreutzvernetzenden Mitteln und die Verwendung von aktivierten Bindungspartnern (z. B. Biotin-aktiven Estern) ein. Bevorzugterweise sind die Ligandenrezeptoren biotinyliert (d. h. an Biotin angebracht) durch das Verfahren beschrieben in Bayer und Wilcheck, 1990. Es ist weiter bevorzugt, daß die Ligandenrezeptoren an den Bindepartner auf solch eine Weise angebracht sind, daß die Aktivität des Ligandenrezeptors nicht signifikant verringert ist, verglichen zu dem freien Ligandenrezeptoren.
In der vorliegenden Erfindung werden das Bindemittel und der Bindungspartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, bei einem spezifischen molaren Verhältnis gemischt, so daß Komplexe gebildet werden, die ausreichend freie Bindungsstellen auf dem Bindungsmittel aufweisen, um es den Komplexen zu ermöglichen, an Bindungspartner gebunden zu werden, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind. Demzufolge ist die Menge von Bindemittel, das verwendet werden muß, durch die Bindungskapazität der Oberfläche gesteuert, auf die Bindungspartner immobilisiert wurde. Die Menge von Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, der mit dem Bindemittel komplexiert werden soll, wird durch die gewünschte gesamte Funktionalität der Liganden-Bindungsoberfläche bestimmt. Dies wird natürlich in Abhängigkeit von dem Typ des Tests, der durchgefürt werden soll (kompetitiv oder immunometrisch) und dem Verhältnis von Ligandenrezeptoren, die an die Bindepartner angebracht sind, variieren.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es dem Bindemittel und dem Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, in ihren finalen Konzentrationen gemischt zu werden, bevor sie in Kontakt mit der Oberfläche gebracht werden, auf die der Bindepartner immobilisiert wird. Dies ermöglicht eine bessere Kontrolle über die Funktionalität der Ligandenbindungsoberfläche, eine großere Konsistenz bei der Herstellung der Liganden-bindenden Oberfläche und eine anschließende Verbesserung bei der Testperformance.
Bevorzugterweise werden das Bindemittel und der Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, zusammengemischt, so daß sich Komplexe bilden. Dies kann bis zu 18 Stunden dauern und ist abhängig von der Konzentration der verwendeten Komponenten. Die Oberfläche, auf die der Bindepartner immobilisiert wird, wird mit den Komplexen in Kontakt gebracht so daß die Komplexe angebracht werden. Dies kann bis zu 16 Stunden dauern und ist abhängig von der Konzetration der freien Bindungsstellen auf dem Bindemittel indem Komplexen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Kombinationen von Bindepartnern, die verschiedene daran angebrachte Ligandenrezeptoren aufweisen, bei der Herstellung der Ligandenoberfläche verwendet, wobei eine multi-funktionelle Ligandenobindungsoberfläche hergestellt wird, die mehr als einen Liganden binden kann. Solche multi-funktionalen Liganden-bindenden Oberflächen können für verschiedene getrennte Tests oder für kombinierte Tests verwendet werden, insbesondere wenn verschiedene Reporterspezies (zum Beispiel Enzyme, radioaktive Marker, usw.) zum Nachweis der veschiedenen gebundenen Liganden verwendet werden. Bevorzugterweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer multi-funktionellen Liganden-bindenen Oberfläche zur Verfügung, umfassend biotinylierten, Intrinsischen Faktor und biotinyliertes Folat-bindendes Protein als Ligandenrezeptoren.
Die Liganden-bindende Oberfläche der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von veischiedenen Tests verwendet werden, einschließlich Sandwichtests, kompetitiven Tests, immunometrischen Tests, Tests auf Antigen und Antikörper, die für infektiöse Erkrankungenen anzeigend sind, und Antikörperklasse-Fangtests. Solche Tests sind in Immunassays beschrieben, (Diamandis, E. P. and Christopoulos T. K., Eds., Academic Press, London (1996)). Die Liganden-bindende Oberfläche der vorliegenden Erfindung kann auch in chromatographischen Verfahren, wie zum Beispiel Affinitätschromatographie, verwendet werden. Die Liganden-bindende Oberfläche der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Immunsensor verwendet werden, unter der Verwendung von zum Beispiel Oberflächen-Plasmonresonanz, Blutbanktests oder Schwangerschaftests.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft weiter unter Bezug auf die begleitenden Figuren beschrieben, in denen:
1 das Verfahren des Stands der Technik zur Herstellung einer Liganden-bindenen Oberfläche zeigt, wobei in Schritt 1 biotinylierter Träger (Bindepartner) zur Oberfläche hinzugefügt wird, in Schritt 2 über schüssiger Träger abgewaschen wird, in Schritt 3 Streptavidin (Bindemittel) zur Oberfläche hinzugefügt wird, in Schritt 4 überschüssiges Streptavidin abgewaschen wird. in Schritt 5 biotinylierter Ligandenrezeptor (Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist) zur Oberfläche hinzugefügt wird, und in Schritt 6 überschüssiger biotinylierter Ligandenrezeptor weggewachen wird.
2 zeigt das Verfahren der vorliegenden Erfindung wobei in Schritt 1 biotinylierter Träger (Binde partner) zur Oberfläche hinzugefügt wird, in Schritt 2 überschüssiger Träger weggewaschen wird, in Schritt 3 Streptavidin (Bindemittel) und biotinylierter Ligandenrezeptor (Bindepartner, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist), zusammengemischt werden und in Schritt 4 der Streptavidin-biotinylierten Rezeptorkomplex zur Oberfläche hinzugefügt wird.
3 ist eine Vitamin B12 Standardkurve auf einem dual funktionellen Tüpfel;
4 ist eine Folat-Standardkurve auf einem dual funktionellen Tüpfel; und
5 ist ein Balkendiagramm, das Signalspiegel zeigt, die unter der Verwendung der Ligandenbindenden Oberflächen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden und unter Verwendung des Verfahrens des Standes der Technik erhalten wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung einer Mikro-Tüpfeloberfläche zur Verwendung in einem Folattest

1. BSA wurde gemäß publizierten Verfahren biotinyliert (Bayer und Wilcheck (1990)), hier durch Bezugnahme aufgenommen).
2. Polystrol-Mikrotüpfel (erhalten von PCMD Kodak) wurden mit biotinyliertem BSA durch passive Adsorption beschichtet.
3. Biotinyliertes Folat-bindendes Protein (B-FBP), hergestellt gemäß veröffentlichen Verfahren (Bayer und Wilcheck (1990)) und Streptavidin wurden im molaren Verhältnis von 1,0 × 10^–8 Mol B-FBP mit 1,0 × 10^–8 Mol Streptavidin in 0,075 M Boratpuffer pH 9,30 gemischt. Dies wurde zur Äqilibrierung für mindestens 18 Stunden bei 18–28°C stehen gelassen.
4. 200 μl dieser Lösung wurden zu jedem beschichteten Mikro-Tüpfel hinzugefügt.
5. Die Mikro-Tüpfel wurden bei Raumtemperatur für mindestens 16 Stunden inkubiert.
6. Die Mikro-Tüpfel wurden mit einer Tris-Pufferlösung (pH 8,5, 0,1 M), enthaltend 5% Saccharose gewaschen, geleert und getrocknet.

Folattestprotokoll
Zu einem Teströhrchen füge hinzu:

1. 150 μl einer Probe;
2. 50 μl Stabilisator (0,8% Dithiothreitol und 2% Ascorbinsäure);
3. Mische und Inkubiere bei Raumtemperatur für 15 Minuten;
4. Füge 100 μl denaturierendes Mittel hinzu (0,85 M NaOH, 0,15 M Dinatriumtetraborat, 0,01% Mordant Orange-Farbstoff);
5. Mische und Inkubiere bei Raumtemperatur für 15 Minuten;
6. Füge 100 μl neutralisierendes Mittel hinzu (0,6 M Borsäure, 30 mM Kaliumjodat, 2,5% Triton X-100, 0,01% medizinisches Antischaum C (erhalten von Dow Coming France));
7. Mische;
8. Überführe 80 μl in den beschichteten Tüpfel;
9. Füge 100 μl Folat-Meerrettich-Peroxidasekonjugatreagenz hinzu, hergestellt durch EDAC-Kopplung (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,4, enthaltend: Folat-HRP-Konjugat, um 0,16 μg/ml HRP-Konzentration zu ergeben; 0,5% menschliches Serumalbumin; 0,5% Bronidox-L; 0,29% Natriumchlorid; 0,01% Kaliumferricyanid und 5% Saccharose);
10. Inkubiere für 45 Minuten bei 37°C mit Schütteln;
11. Wasche und füge Signalreagenz unter der Verwendung von Vitos Eci-Reagenzien hinzu, die käuflich erhältlich von Orthoo Clinical Diagnostics (O.C.D.) Amersham UK zur Verfügung gestellt werden; und
12. Messe Lumineszenz nach 5 Minuten und vor 20 Minuten. Bitte bemerke, daß alle Prozentsätze unter Bezug auf Volumen angegeben sind und alle Lösungen wässrig sind.

Folat-Testergebnisse Eichkurve für einen Folattest unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
Eichkurve für einen Folattest unter der Verwendung des Verfahrens des Standes der Technik
Genauigkeit für Plasma-Pool, der 3 ng/ml Folat enthält (n = 12 Replikate) (d. h. die Messung der Reproduzierbarkeit des Folattests durch wiederholtes Messen der Konzentration einer Probe (in diesem Fall eine Plasmaprobe, die 3 ng/ml Folat enthält)).
Ergebnis unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
Ergebnisse unter der Verwendung des Verfahrens des Standes der Technik
Die Testpräzision ist unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung signifikant besser.
Beispiel 2
Herstellung von Mikro-Tüpfeloberflächen zur Verwendung mit einem Vitamin B12-Test

1. Polystyrol-Mikrotüpfel wurden mit biotinyliertem BSA wie in Beispiel 1 beschichtet.
2. Biotinylierter Intrinsischer Faktor (B-IF) und Streptavidin wurden bei molaren Verhältnissen von 7 × 10^–10 Mol B-IF mit 14 × 10^–10 Mol Streptavidin in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0 gemischt. Dies wurde für Äquilibrierung für mindestens 18 Stunden bei 20–28°C stehen gelassen.
3. 28 × 10^–10 Mol von biotinyliertem BSA (B-BSA) wurden hinzugefügt, um an BIF-Streeptavidinkomplex zu binden. Ein Verhältnis von 1 : 2 : 4 von B-IF : Streptavidin : B-BSA ist erforderlich, um scherzustellen, daß alles IF gebunden ist.
4. 210 μl dieser Lösung wurden zu jedem beschichteten Mikro-Tüpfel hinzugefügt.
5. Die Mikro-Tüpfel wurden bei Raumtemperatur für mindestens 16 Stunden inkubiert.
6. Die Mikro-Tüpfel werden zweimal mit einem Tris-Puffer und einmal mit einem Tris-Puffer, der 5% Saccharose enthält, gewaschen, geleert und getrocknet.

Vitamin B12-Testprotokoll
Zu einem Teströhrchen füge hinzu:

1. 150 μl einer Probe;
2. 50 μl Stabilisator (1,6% Dithiothreitol in 0,8% Natriumchlorid);
3. 100 μl denaturierendes Mittel (0,85 M NaOH, 0,01% KCN 0,15 M Dinatriumtetraborat, 0,01% Mordant Orange-Farbstoff;
4. Mische und Inkubiere bei Raumtemperatur für 15 Minuten;
5. Füge 100 μl neutralisirendes Mittel hinzu (0,6 M Borsäure, 30 mM Kaliumjodat, 2,5% Triton X-100, 0,01% medizinisches Antischaum C);
6. Mische;
7. Transferiere 60 μl zu dem beschichteten Mikro-Tüpfel;
8. Inkubiere für 15 Minuten bei 37°C;
9. Füge 100 μl B-12-Meerrettich-Peroxidasekonjugat, hergestellt durch EDAC-Kopplung hinzu (50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,4, enthaltend: Folat HRP-Konjugat, um 0,16 μg/ml HRP-Konzentration zu ergeben; 0,5% menschliches Serumalbumin; 0,5% Bronidox-L; 0,29% Natriumchlorid; 0,01% Kaliumferricyanid und 5% Saccharose);
10. Inkubiere für 30 Minuten bei 37°C mit Schütteln;
11. Wasche und füge Signalreagenz unter der Verwendung der wie in Beispiel 1 beschribenen Reagenzien hinzu; und
12. Messe Lumineszenz nach 5 Minuten und vor 20 Minuten.

Vitamin B12-Testergebnisse
Tests, die auf Mikro-Tüpfeloberflächen durchgeführt wurden, die unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beschichtet wurden, stimmen besser mit den erwarteten Werten aus dem RIA-Verfahren überein und der Test-dynamische Bereich war erhöht.
Beispiel 3
Herstellung von einem dualen funktionellen Mikro-Tüpfel zur Verwendung in gleichzeitigen oder getrennten Vitamin B12- und Folat-Tests

1. Polystyrol-Mikrotüpfel wurden mit biotinyliertem Träger beschichtet (in diesem Falle biotinyliertes BSA).
2. Biotinyliertes Folat bindendes Protein (B-FBP), biotinylierter Intrinsischer Faktor (B-IF) und Streptavidin wurden in den molaren Verhältnissen von 1,0 × 10^–8 Mol B-FBP mit 6,0 × 10^–10 Mol B-IF und 2,0 × 10^–8 Mol Streptavidin in 0,075 M Boratpuffer, pH 9,3 gemischt Dieses wurde zur Ägilibrierung für mindestens 18 Stunden bei 18–20°C stehen gelassen.
3. 200 μl dieser Lösung wurden zu jedem beschichteten Mikro-Tüpfel hinzugefügt.
4. Die Mikro-Tüpfel wurden bei Raumtemperatur für mindestens 16 Stunden inkubiert.
5. Die Mikro-Tüpfel wurden mit einer Tris-Pufferlösung, enthaltend 5% Saccharose gewaschen, geleert und getrocknet. Vitamin B12 und Folattestprotokolle sind wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben Die Standardkurven, die unter der Verwendung der Mikro-Tüpfel hergestellt wurden, sind in 3 und 4 gezeigt.

Beispiel 4
Herstellung eines Mikro-Tüpfels zur Verwendung in einem NTx (Kreutz-vernetzte N-Telopeptide von Typ I-Kollagen) Test

1. Polystyrol-Mikrotüpfel werden mit biotinyliertem Träger (in diesem Falle biotinyliertes BSA) beschichtet.
2. Biotinyliertes NTx-Peptid und Streptavidin werden in den molaren Verhältnissen von 5,13 × 10^–8 Mol von Peptid von 1,33 × 10^–8 Mol Streptavidin oder 1,00 × 10^–7 Mol Peptid zu 1,66 × 10^–8 Mol Streptavidin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 gemischt.
3. 200 μl dieser Lösung wurden zu jedem beschichteten Mikro-Tüpfel hinzugefügt.
4. Die Mikro-Tüpfel wurden bei Raumtemperatur für mindestens 16 Stunden inkubiert.
5. Die Mikro-Tüpfel wurden mit einem Tris-Puffer (pH 8,4, 0,1M), der 5% Sacharose enthielt, gewaschen, geleert und getrocknet.

Evaluierung von NTx-Tüpfeln

1. Füge 200 μl einer Meerrettich-Peroxidase markierten anti-NTx-Antkörper-Konjugatlösung zu den wie oben beschriebenen Tüpfeln und zu Tüpfeln, die unter der Verwendung des Verfahrens des Standes der Technik hergestellt wurden, hinzu (Das Beschichtungsverfahren des Standes der Technik verwendet biotinyliertes NTx-Peptid bei 100 ng/ml und freies Biotin bei 100 ng/ml als die biotinylierte Ligandenbinderlösung die zu den Tüpfeln in Schritt 5 des Beschichtungsverfahrens des Standes der Technik, wie in 1 gezeigt, hinzugefügt wird).
2. Inkubiere für 30 Minuten bei 37°C mit Schütteln;
3. Wasche und füge Signalreagenz unter der Verwendung von Vitros Eci-Reagenzien, die käuflich durch O.C.D. Amersham UK zur Verfügung gestellt werden; und
4. Messe Lumineszenz nach 5 Minuten.
Die Ergebnisse sind in 5 angegeben und zeigen, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Liganden-bindende Oberfläche ergibt, die eine großere Fähigkeit aufweist, Ligand zu binden.

Referenzen:

1. Kochwa, S., Bronwell, M., Rosenfield, R. E. and Wasserman, L. R. (1967) Adsorption of proteins by polystyrene particles. L Molecular unfolding and acquired immunogenicity of IgG. J. Immunol. 99.981.
2. Suter, M. and Butler, J. E. (1986) The immunochemistry of sandwich ELISAs. II. A novel system prevents denaturation of capture antibodies. Immunol. Lett. 14 313.
3. Dierks S. E., Butler, J. E. and Richardson, H. B. (1986) Altered recognition of surface-absorbed compared to antigen bound antibodies in the ELISA. Mol. Immunol. 23.927.
4. Butler, J. E., Ni, L., Nessler, R., Joshi, K. S., Suter, M., Rosenberg, B., Chang, J., Brown, W. R. and Cantarero, L. A. (1992) The physical and functional behaviour of capture antibodies adsorbed on polystyrene. J. Immunol. Methods 150, 77–90.
5. Davies, J., Dawkes, A. C., Haymes, A. G., Sunderland, R. F. and Edwards, J. C., (1995) Scanning tunnelling microscopy and dynamic contact angle studies of the effects of partial denaturation on imununoassay solid phase antibody. J. Immunol. Methods 186, 111–123.
6. Davies, J., Dawkes, A. G., Haymes, A. G., Roberts, C. J. Sunderland, R. F., Wilkins,. M. J., Davies, M. c., Tendler, S. J. B., and Edwards, J. C. (1994), A scanning tunnelling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtitre wells. J. Immunol. Methods, 167, 263–269.
7. Davies J., Roberts, C. J. Dawkes. A. C., Sefton, J., Edwards, J. C., Claseby, T. O., Haymes, A. G., Davies, M. C., Jackson D. E., Lomas, M., Shakeshift, K. M., Tendler, S. J. B., Wilkins, M. J. and Williams, P. M. (1994) Use of scanning probe microscopy and surface plasmon resonance as analytical tools in the study of antibody coated microtitre wells. Langmiur 10(8) 2654–2661.
8. Bayer, E. A. and Wilchek, M. (1990) Protein biotinylation. In: M Wilchek and E. A. Bayer (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 184. Academic Press, New York, pp 138.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Liganden-bindenden Oberfläche, umfassend: i. Mischen eines Bindungspartners, an den ein Ligandenrezeptor angebracht ist, und eines Bindungsmittels, das für den Bindungspartner spezifisch ist, in einem bestimmten molaren Verhältnis, so daß Komplexe gebildet werden, die ausreichend freie Bindungsstellen auf dem Bindungsmittel aufweisen, um es den Komplexen zu erlauben, an Oberflächenimmobilisierte Bindungspartner zu binden; ii. In-Kontakt-bringen einer Oberfläche, auf die ein Bindungspartner immobilisiert ist mit den Komplexen, so daß die Komplexe auf die Oberfläche angebracht werden; und iii. Entfernen jeglicher nicht gebundener Komponenten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bindungsmittel eine Verbindung Protein oder Mittel ist, das Biotin bindet.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bindungsmittel Streptavidin ist.
Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 3, wobei der Bindungspartner Biotin oder ein Derivat oder ein funktionelles Homolog davon ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Anspruche, wobei die Ligandenrezeptoren Antikörper oder funktionelle Fragmente davon sind.
Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 4, wobei die Ligandenrezeptoren Intrinsischer Faktor oder Folat-bindendes Protein sind.
Verfahren nach einem der voranstehenden Anspruche, wobei die Oberfläche die eines Mikrotüpfels, eines Beads oder eines Meßstabes ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Anspruche, wobei eine multi-funktionelle Ligandenbindende Oberfläche, unter der Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Ligandenrezeptoren präpariert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die verschiedenen Ligandenrezeptoren Intrinsischer Faktor und Folat-bindendes Protein sind.