DE19521388C2 - Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz gemäß dem Anspruch 1. Das verwendete Verfahren ist bevorzugterweise ein immunologisches Testsystem.

Immunologische Testsysteme unterschiedlicher Art finden weitgehende Verwendung in der klinischen Diagnostik für die Detektion von Substanzen wie Drogen, Vitamine, Hormone, Proteine, Metaboliten, Mikroorganismen oder andere interessierende Substanzen in biologischen Proben.

Die Testsysteme beruhen auf Antigen-Antikörper-Reaktionen, die nach entsprechender Inkubation mit dem Analyten nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck muß wenigstens ein Stoff, entweder das Antigen oder der Antikörper, mit einer Signal erzeugenden Ver­ bindung markiert sein.

EP-263 401 offenbart ein immunometrisches Bestimmungsverfahren für eine mindestens zwei Antikörperbindungsstellen aufweisende antigene Substanz, bei dem man eine die antigene Substanz (a) enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem auf einer Festphase immobiliserten, unmarkierten, für (a) spezifischen Antikörper (b) und einem weiteren für (a) spezifischen, markierten Antikörper (c) sequenziell oder in einem Schritt inkubiert, wobei sich ein festphasengebundener, ternärer Komplex aus (a), (b) und (c) bildet, der ein nachweisbares Signal entsprechend der Menge von (a) aussendet, und man dabei in einer ersten Messung die Antigenkonzentration über den gesamten Meßbereich, bestehend aus Kernmeßbereich und erweitertem Meßbereich, ermittelt, und danach die Probe, für die eine Antigenkonzentration im erweiterten Meßbereich festgestellt wurde, nach Erhöhung der Menge des Antigens einer zweiten Messung unterwirft.

DE-43 09 393 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probeflüssigkeit durch Bindung des Analyten an einen mit dem Analyten spezifisch bindefähigen Rezeptor R₁, der auf einem in der Probeflüssigkeit befindlichen, teilchenförmigen Trägermaterial immobilisiert ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probeflüssigkeit weiterhin einen löslichen, mit dem Analyten spezifisch bindefähigen Rezeptor R₂ enthält, der mindestens zwei Bindungsstellen für den Analyten besitzt.

Für die Einteilung der Testprinzipien existieren verschiedene Kriterien. Nach der Anzahl der verschiedenen Reaktionspartner je Antigenmolekül kann beispielsweise eine Einteilung in 1- Seiten- oder in 2-Seiten-Bindungsassays (z. B. Sandwichassay) erfolgen.

Generell ist jeder Assay als homogener oder als heterogener Test möglich.

In einem homogenen Assay unterscheiden sich das emittierte Signal des spezifisch gebundenen markierten Reaktanten von jenem des freien markierten Reaktanten. Somit ist "frei" von "gebunden" unterscheidbar.

In einem heterogenen Assay ist das Signal von gebundenem Reaktanten von jenem in freier Form nicht unterscheidbar.

Auf Grundlage des immunologischen Reaktionsprinzips ist weiters eine Unterteilung der heterogenen Assays in kompetitive und nicht-kompetitive Techniken möglich. Grundlage der kompetitiven Techniken ist die Konkurrenz von unmarkierten und markierten Reaktanten um die Bindung an einen immobilisierten Reaktanten.

Aufgrund des Kompetitionsprinzips wird um so weniger markiertes Antigen bzw. markierter Antikörper gebunden, je mehr Analyt in der Probe enthalten ist. Die gemessene Aktivität des Immunkomplexes ist damit indirekt proportional der Konzentration an zu bestimmender Substanz.

Bei einem nicht-kompetitiven Assay liegen immobilisierte und markierte Reaktanten im Vergleich zur Konzentration des zu bestimmenden Analyten im Überschuß vor. Unter diesen Bedingungen ist es innerhalb bestimmter Grenzen möglich, alle in der Probe vorhandenen Antigene bzw. Antikörper zu binden. Die Assays sind in der Regel nach dem Sandwich Prinzip aufgebaut.

In Abhängigkeit von der Reaktionsfolge wird zwischen simultanen und sukzessiven Ein-Schritt- und Zwei-Schritt-Testsystemen unterschieden.

Bei der Ein-Schritt-Technik werden die zu bestimmende Substanz, immobilisierte und markierte Antikörper bzw. Antigene gemeinsam inkubiert. Die Zugabe des markierten Antikörpers kann auch zeitlich versetzt erfolgen. Ungebundene Reaktanten werden von den gebundenen vor der Marker-Substrat-Reaktion separiert (sogenannte "bound-free-Trennung" = BF- Trennung).

Bei der Zwei-Schritt-Technik erfolgt dagegen eine solche Trennung nach jedem Reaktionsschritt. Vor der Substrat­ reaktion sind zwei Dosierschritte, zwei Inkubationsschritte und zwei BF-Trennungen notwendig. Im Fall eines Antigennachweises wird im ersten Inkubationsschritt der Analyt aus der Probe an den immobilisierten Antikörper gebunden. In der BF-Trennung werden dann unspezifische Probenbestandteile entfernt. In einem zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Reaktion des markierten Antikörpers mit dem gebundenen Analyten. In einer zweiten BF-Trennung werden die ungebundenen, markierten Antikörper entfernt.

Ein entscheidender Vorteil der Ein-Schritt-Technik ist vor allem die Verkürzung der Testinkubationszeit und die einfachere Handhabung der Testdurchführung. Auch ist in der Regel eine geringere Probenverdünnung erforderlich.

Diese praktischen Vorteile von Ein-Schritt-Systemen werden durch den sogenannten "High Dose Hook"-Effekt limitiert, das Phänomen des biphasischen Kurvenverlaufs der Konzentrations-Signal Kurve.

Bei steigender Antigenkonzentration erreicht der gebildete Immunkomplex ein Bindungsmaximum. Eine weitere Erhöhung der Analytkonzentration führt dann zu einer Invertierung der Konzentrations-Signal-Kurve; die Steigung ist negativ. Die Konsequenz dieser glockenförmigen, biphasischen Kurve ist, daß die eindeutige Zuordnung eines Meßwertes zu einer Analytkonzentration nicht mehr gegeben ist. Jedem Meßwert können in Folge des Verlaufs der Konzentrations-Signal-Kurve zwei Konzentrationswerte zugeordnet werden.

In der Literatur wird dieser Effekt häufig als entscheidender Nachteil speziell der Ein-Schritt-Technik beschrieben (siehe Fernando et al., 1992, J.Immunol.Methods, 151, 47). Die Test­ auswertung wird durch die biphasische Natur der Konzentrations-Signal-Kurve vor allem dann kritisch, wenn in pathologischen Situationen der Analyt in extrem hohen Konzentrationen vorkommt und der Meßbereich im ab- oder ansteigenden Kurvenabschnitt für diese Proben nicht eindeutig definiert ist. Die Folge können Störungen in der Wiederfindung der Probe sein. Eine sorgfältige Charakterisierung dieses "Störeffekts" und eine Angabe, welche Analytkonzentration zum Phänomen des "High Dose Hook"- Effekts führt, sind somit unbedingt notwendig.

Eine der Ursachen für den "High Dose Hook" Effekt liegt in der limitierten Bindungskapazität des immobilisierten Antikörpers bzw. Antigens. Eine zweite Ursache liegt in der Konkurrenz des Festphasen- und des Konjugatantikörpers bzw. -antigens während der simultanen Inkubation um die Bindung des Analyten.

Während der simultanen Inkubation kann der Analyt drei verschiedene Immunreaktionen eingehen:

• 1. Bindung des Analyten an den Festphasenantikörper bzw. an das Festphasenantigen unter Bildung eines binären Immunkomplexes aus Antigen und Antikörper. Da einer der Reaktionspartner immobilisiert ist, läuft diese Reaktion an der Grenzfläche der flüssigen und festen Phase ab und ist limitiert durch die immunologische Bindungskapazität der Festphase. Dieser binäre Immunkomplex liefert in dieser Form keinen Signalbeitrag. |←Antikörper (immobilisiert) + Antigen ⇔
  |←Antikörper-Antigen (immobilisiert)bzw.|←Antigen (immobilisiert) + Antikörper ⇔
  |←Antigen-Antikörper (immobilisiert)
• 2. Bindung des Analyten an den Konjugatantikörper bzw. an das Konjugatantigen unter Bildung eines weiteren binären Immunkomplexes. Diese Reaktion läuft in der flüssigen Phase ab. Obwohl einer der beiden Reaktionspartner eine signalgebende Funktion enthält, liefert auch dieser in der flüssigen Phase vorliegende binäre Immunkomplex keinen Signalbeitrag. Antikörper (markiert) + Antigen ⇔ Antikörper-Antigen (markiert)bzw.Antigen (markiert) + Antikörper ⇔ Antigen-Antikörper (markiert)
• 3. Bildung eines für die Bestimmung der Analytkonzentration relevanten immobilisierten und signalgebenden Immunkomplexes. Dieser entsteht entweder aus den binären Immunkomplexen an der Festphase durch Anlagerung des signalgebenden Antikörpers bzw. Antigens oder durch Reaktion des binären Immunkomplexes aus Analyt und signalgebenden Immunpartnern und dem immobilisierten Antikörper bzw. Antigen. Nur der ternäre Immunkomplex dieser Form liefert einen detektierbaren Signalbeitrag. |←Antikörper-Antigen (immobilisiert) + Antikörper (markiert) ⇔
  |←Antikörper-Antigen-Antikörper (markiert und immobilisiert)|←Antikörper (immobilisiert) + Antigen-Antikörper (markiert) ⇔
  |←Antikörper-Antigen-Antikörper (markiert und immobilisiert)|←Antigen-Antikörper (immobilisiert) + Antigen (markiert) ⇔
  |←Antigen-Antikörper-Antigen (markiert und immobilisiert)|←Antigen (immobilisiert) + Antikörper-Antigen (markiert) ⇔
  |←Antigen-Antikörper-Antigen (markiert und immobilisiert)

Die Lage der verschiedenen Gleichgewichte und die Konzentration an ternärem Immunkomplex ist bei konstanter Konzentration an immobilisierten und markierten Antikörpern bzw. Antigenen von der Analytkonzentration abhängig.

Für den Fall, daß der zu bestimmende Analyt ein Antigen ist, gilt somit folgendes:
Im Bereich des Antikörperüberschusses sowohl an immobilisiertem als auch an markiertem Antikörper (Antikörperüberschußbereich) werden binäre und ternäre Immunkomplexe gebildet. Die Bildung der ternären Komplexe aus Festphasenantikörper, Antigen und Antikörperkonjugat ist der Analytkonzentration direkt proportional, bis das durch die Bindekapazität der Festphase gegebene Maximum an ternären Immunkomplexen erreicht ist. Mit der Bildung der ternären Immunkomplexe steigt das Signal bis zu einem Maximum an. Eine weitere Erhöhung der Antigenkonzentration verschiebt das Gleichgewicht zu Ungunsten des ternären Immunkomplexes in Richtung binärer Immunkomplexe in Form immobilisierter Antikörper-Antigen- und markierter Antikörper-Antigen-Komplexe ohne Signalbeitrag (Antigenüberschußbereich). Dies führt zu einer stetigen Abnahme des ternären signalgebenden Immunkomplexes. Die Gleichgewichte nähern sich einem Minimumm an ternären detektierbaren Immunkomplexen und einem Maximum an nicht detektierbaren, binären Immunkomplexen und schließlich auch an freiem Analyten. Die Folge davon ist, daß sich das Messignal asymptotisch einem Minimum nähert. Die Bereiche des Antikörper- und Antigenüberschusses werden durch den Äquivalenzbereich getrennt. In diesem Zustand sind die Bindungsstellen der Festphase mit ternären Immunkomplexen maximal gesättigt. Folge davon ist, daß im Äquivalenzpunkt das maximale Messignal erreicht wird.

Zur Umgehung bzw. Vermeidung des "High Dose Hook" Effekts wird in der Regel die Umstellung auf andere Testsysteme, beispielsweise auf die Zwei-Schritt-Technik empfohlen, bei der dieser Effekt i.a. nicht bzw. seltener beobachtet wurde. Unter Beibehaltung der Ein-Schritt-Technik ist in begrenztem Masse ein Einfluß auf die Lage des Äquivalenzpunktes der Konzentrations-Signal-Kurve möglich. Durch eine sorgfältige Auswahl der Antikörper bzw. Antigene in Bezug auf Affinität und einer Optimierung der Festphasenbindung kann der "High Dose Hook" Effekt zu höheren Konzentrationen verschoben, aber nicht vollständig unterdrückt werden. Der Aussagewert solcher diagnostischer Tests bleibt damit jedoch fraglich.

Neuere Ansätze zur Reduktion bzw. Verschiebung des "Hook" Effekts sind im Stand der Technik beispielsweise von Hoffman K.L. et al., "Elimination of "Hook Effect" in two site immunoradiometric assays by kinetic rate analysis", Clin.Chem.30/9, 1499-1501, 1984 beschrieben und werden als sogenanntes "kinetisches Hook-screening" bezeichnet. Bei diesem Verfahren werden mehrere Proben gleichzeitig mit markiertem und gebundenem Antikörper inkubiert, und die Reaktionsgeschwindigkeit für alle Proben wird gleichzeitig bestimmt. Bei Proben mit Hook-Effekt sinkt die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Inkubationszeit signifikant; aufgrund der schnelleren Bindung bei Proben ohne Hook-Effekt ist damit eine Unterscheidung möglich. Das Verfahren ist jedoch apparativ relativ aufwendig und schwierig zu standardisieren.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Vorteile der Zwei-Schritt-Technik in Bezug auf die Eindeutigkeit der Messergebnisse mit den Vorteilen der simultanen Inkubation der Ein-Schritt-Technik sowie einer einfachen Handhabung zu verbinden.

Dies wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei dem Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe, dieser Probe ein Reagens mit definierter Analyt-Konzentration zugesetzt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmenden Probe Analyt oder ein Derivat des Analyten in mindestens einer solchen Menge zugesetzt wird, daß der Äquivalenzpunkt erreicht und damit ein maximales Signal in der Konzentrations-Signal-Kurve, die durch Titration mit dem Analyten charakterisiert wurde, erzielt wird.

Durch diese Maßnahme wird der ansteigende Teil der Hook-Kurve sozusagen ausgeblendet und man mißt, falls der zu bestimmende Analyt ein Antigen ist, im Antigenüberschußbereich, bzw. falls der zu bestimmende Analyt ein Antikörper ist, im Antikörperüberschußbereich. Auf diese Weise ist die Eindeutigkeit des Messignals immer sichergestellt.

Das erfindungsgemäße Testsystem bietet damit die Möglichkeit einen Test für hohe Analytkonzentrationen in der Probe gezielt unempfindlicher zu machen, d. h. die untere Nachweisgrenze (absolute Empfindlichkeit) wird erhöht, vorzugsweise um den Faktor 10-50, und die Probenverdünnung in gleichem Maße reduziert.

Die Voraussetzung für die exakte Einstellung des jeweiligen Analyten im Probenpuffer für ein gegebenes immunologisches Testsystem ist die einmalige Charakterisierung der "High Dose Hook"-Kurve durch Titration mit dem Analyten. Die Konzentration des Analyten im Probenpuffer wird mit Hilfe dieser Titrationskurve so gewählt, daß bei Einsatz des Analyt- oder Analyt-Derivat-enthaltenden Reagens der Äquivalenzpunkt und damit ein maximales Signal im Testsystem erreicht wird.

Beispielsweise wird im Fall des Nachweises von HSA in extrahierten Stuhlproben der Probe, den Kalibratoren und den Kontrollen HSA (=Analyt) in einer Konzentration zwischen 0,3 bis 1µg/ml, vorzugsweise 0,4 µg HSA/ml zugesetzt.

Lp(a) in Seren wird beispielsweise durch Zusatz von Lp(a)- haltigem Reagens, enthaltend Lp(a) in einer Konzentration zwischen 4 und 40 µg/ml, vorzugsweise 7µg/ml, bestimmt.

Das Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ist bevorzugter­ weise ein immunologisches Testsystem und kann als homogener oder als heterogener Assay durchgeführt werden.

Bei der zu bestimmenden Probe handelt es sich vorzugsweise um ein biologisches Material oder um eine Chemikalie. Die Probe liegt in der flüssigen Phase vor oder muß gegebenenfalls, beispielsweise durch eine Extraktion, in die flüssige Phase übergeführt werden. Das biologische Material kann beispielsweise Blut, Plasma, eine Plasmafraktion, Harn, Stuhl, Liquor oder eine andere Körperflüssigkeit, Gewebe- oder Organextrakt oder eine sonstige analythaltige Lösung sein.

Der zu bestimmende Analyt ist beispielsweise ein Protein, Peptid, Polysaccharid, eine Nukleinsäure, eine lipidhaltige Verbindung, ein rekombinantes Material oder ein anderes Molekül mit antigenen Eigenschaften. Vorzugsweise wird Albumin oder Lipoprotein (a) bestimmt.

Für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe kann zur Einstellung eines ternären Komplexes der Analyt selbst, aber auch ein Derivat des Analyten verwendet werden. Das Derivat des Analyten ist besonders ein immunreaktives Derivat, beispielsweise handelt es sich bei dem Derivat um ein Dimeres oder Polymeres eines oder mehrerer Epitope des Analyten.

Im speziellen kann als Derivat ein homologes oder heterologes Epitopdimer verwendet werden. Dieses Epitopdimer wird von den im Testsystem eingesetzten, vorzugsweise monospezifischen Antikörpern erkannt, und wenigstens ein Epitop des Dimeren weist eine Homologie zum Analyten auf.

Ist der Analyt ein Antigen, umfassend wenigstens zwei Epitope, die im folgenden mit Epitop 1 und Epitop 2 bezeichnet werden, so umfaßt das homologe Epitopdimer zur Einstellung des ternären Komplexes ebenfalls Epitop 1 und 2. Die Epitope sind gegebenenfalls über einen Linker gebunden. Epitop 1 und 2 können auch identisch sein. Der immobilisierte Antikörper ist dann gegen das eine Epitop gerichtet und der markierte Antikörper gegen das andere Epitop.

Bei heterologen Epitopdimeren ist nur ein Epitop zum Analyten homolog. Der immobilisierte Antikörper ist dann ebenfalls gegen dieses Epitop gerichtet, während der markierte Antikörper ein anderes Epitop erkennt, welches keine Homologie zum Epitop des Analyten aufweist, sondern der zweiten Komponente des Epitopdimeren entspricht.

|←Anti-Epitop-1-Antikörper (immobilisiert) + Epitop-1-Epitop 2 + Anti-Epitop-2-Antikörper (markiert) ⇔
|←Anti-Epitop-1-Antikörper (immobilisiert) - Epitop-1-Epitop-2- Antikörper (immobilisiert)

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Haptene bestimmbar, welche üblicherweise nur in einem kompetitiven Testsystem bestimmbar sind. Voraussetzung für deren Bestimmung ist die Einstellung des maximalen Messignals über einen ternären Komplex unter Verwendung entsprechender Analyt-Derivate, beispielsweise unter Verwendung von Dihaptenen. Als Dihaptene kommen vorzugsweise homologe oder heterologe Dihaptene in Frage. Homologe Dihaptene bestehen aus zwei miteinander, vorzugsweise über einen Linker verbundene gleichartige Haptene, die in ihrer Struktur dem zu bestimmenden Hapten in der Probe gleichen. So kann beispielsweise zur Bestimmung von L-Thyroxin ein L-Thyroxin- Linker-L-Thyroxin-Dihapten verwendet werden.

Heterologe Dihaptene bestehen dagegen aus zwei unterschiedlichen Haptenen, von denen nur eine Haptenfunktion jener der Probe entspricht. Zur Bestimmung von L-Thyroxin kann beispielsweise ein L-Thyroxin-Linker-Tyramin-Dihapten verwendet werden.

Um homologe Komplexbindungen in einem Ein-Schritt-Testsystem zu unterbinden, werden bevorzugterweise heterologe Dihaptene verwendet. Der immobilisierte Antikörper ist dann gegen die Haptenfunktion gerichtet, und der Konjugatantikörper (der markierte Antikörper) gegen die vom Hapten unterschiedliche Struktur.

|←Anti-Hapten-1-Antikörper (immobilisiert) + Hapten-1-Hapten 2 + Anti-Hapten-2-Antikörper (markiert) ⇔
|←Anti-Hapten-1-Antikörper (immobilisiert) - Hapten-1-Hapten-2- Antikörper (markiert)

Wie bereits an anderer Stelle beschrieben, wird auch in diesem Fall durch Zugabe von Probenhapten die Bildung des ternären Komplexes gestört und als Folge davon eine Signalabnahme gemessen.

Geeignete Chemikalien, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt werden können, sind beispielsweise Phenobarbital, Digitoxin, Amphetamine, Opiate, Phencyclidine und andere Drogen, Medikamente (z. B. Theophyllin, Nifedipin, Propanolol, Beta-Blocker) und Antibiotika. Generell sind alle Chemikalien bestimmbar, die haptene oder antigene Eigenschaften aufweisen.

Ist der Analyt ein zu bestimmendes Antigen, sind mindestens zwei Antikörper erforderlich. Ein Antikörper ist an der Fest­ phase immobilisiert, der andere Antikörper ist mit einem geeigneten Marker versehen. Die Antikörper gegen den zu bestimmenden Analyten können polyklonal oder monoklonal sein, sie können identisch oder unterschiedlich sein.

Zur Bestimmung von Antikörpern wird ein entsprechendes Antigen an der Festphase immobilisiert und ein markiertes Antigen verwendet, so beispielsweise ein Tetanus-Toxoidkonjugat zur Bestimmung von Anti-Tetanus-Antikörpern. An Stelle des immobilisierten Antigens kann zur Bestimmung von Antikörpern auch ein anti-Antikörper immobilisiert werden; an Stelle des markierten Antigens kann auch ein markierter capture-Antikörper verwendet werden.

Die immunologischen Reaktionen können prinzipiell simultan ablaufen. Die Gleichgewichtslage der Immunkomplexe kann aber durch eine sukzessive Inkubation ohne BF-Trennung zugunsten der immobilisierten binären und ternären Komplexe beeinflußt werden.

Antikörper, Antigene oder Rezeptorsysteme können direkt oder indirekt an einen festen Träger fixiert sein, beispielsweise durch Adsorption, direkte kovalente Kopplung oder indirekte Kopplung über ein weiteres bindendes Agens; im Falle der Kopplung eines Antikörpers an die Festphase kann dies bei­ spielsweise ein anti-Antikörper sein. Zur Bestimmung von Liganden wird ein entsprechender Rezeptor an der Festphase immobilisiert und ein markierter Rezeptor verwendet. Ein Beispiel für ein Liganden-Rezeptor-Paar ist der tPA-PAI-Komplex.

Die Art der Fixierung hängt insbesondere vom Material der festen Phase ab. An Materialien wie beispielsweise Nitrocellulose, Polystyrol oder Materialien mit ähnlichen chemischen Eigenschaften, findet vorwiegend Adsorption statt. Andere Materialien, wie beispielsweise Latex, Nylon und ähnliche, enthalten Gruppen, die eine kovalente Bindung ermöglichen.

Der feste Träger kann in unterschiedlichen Formen vorliegen, beispielsweise als Mikrotiterplatten oder als Streifen, als magnetisches Teilchen, in Kugelform oder in Form einer Vorrichtung mit schichtförmigem Aufbau.

Zur Detektion des gebildeten Komplexes wird ein geeigneter Marker verwendet, der an das spezifisch bindende Agens gekoppelt ist. Als Marker sind unterschiedliche Stoffe mit detektierbaren Eigenschaften verwendbar, beispielsweise chromogene, katalytisch wirkende, isotopische, enzymatische, lumineszierende oder fluoreszierende Stoffe. Auch neuere Markersysteme, wie beispielsweise β-Lactamase, Pyrophosphatase, Luciferase, Photoproteine, Pyridopyridazine, Europium Cryptate oder Metall-Carbonyl-Komplexe sind möglich.

Der Nachweis eines Analyten in einer Probe erfolgt vorzugsweise mittels eines Ein-Schritt-Enzym-Immunassays in Form eines 2-Seiten-Bindungsassays (Sandwich-Assays).

Die Erfindung stellt auch ein Set zur Durchführung des Ver­ fahrens zur Verfügung. Dieses Set umfaßt ein Immunreagens oder ein geeignetes Rezeptorsystem, den Analyten, ein Derivat des Analyten bzw. einen Liganden und ein für die Detektion geeignetes Mittel. Die Art des Immunreagens richtet sich nach dem zu bestimmenden Analyten: Ist der Analyt ein Antigen, so umfaßt das Immunreagens entsprechende Anti-Analyt-Antikörper, ist der Analyt hingegen ein Antikörper, so umfaßt das Immunreagens entsprechende Antigene. Der Analyt, das Derivat des Analyten bzw. der Ligand können entsprechend vorverdünnt sein, beispielsweise in einem Verhältnis von 1 : 20.

Ein geeignetes Liganden-Rezeptor-Paar ist beispielsweise ein Enzym-Inibitor-Komplex, wie z. B. der tPA-PAI-Komplex.

Die Fig. 1 und 2 dienen der näheren Erläuterung der Erfindung:

Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines ELISAs in Abhängigkeit von der Humanalbuminkonzentration zur Bestimmung des Aquivalenzpunktes (Beispiel 1d).

Fig. 2 gibt einen Funktionstest zur Bestimmung von Humanalbumin wieder (Beispiel 1e).

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher erläutern, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 a) Beladung von Mikrotiterplatten mit Anti-Humanalbumin

4 mg eines Lyophilisats polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Humanalbumin (Fa. Dako) wurden in 1 ml bildet. Wasser gelöst. 1 ml dieser Lösung wurde mit 1000 ml Puffer, bestehend aus 0,50 mol/l Tris und mit 1 mol/l Salzsäure auf pH 7,4 eingestellt, verdünnt und 30 Min. bei Raumtemperatur (20-26°C) gerührt.

In jede Testvertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol (Hersteller Greiser) wurden 0,2 ml der verdünnten Antikörperlösung gefüllt und über Nacht (20 bis 24 h) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Testvertiefungen vollständig entleert.

Für die Blockierung gegebenenfalls unbeschichteter Polystyroloberflächen wurden die Testvertiefungen für 30 Min. bei Raumtemperatur mit 0,220 ml einer wäßrigen Nachbeschichtungslösung mit einer 1%igen Gelatinelösung behandelt. Danach wurden die Testvertiefungen wieder vollständig entleert und die nachstehenden Funktionstests durchgeführt.

b) Herstellung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Humanalbumin

Zu 20 mg Meerrettich-Peroxidase in 3,5 ml 1 mmol/l Natriumacetatpuffer pH 4,5, wurden 11,5 mg Natriumperjodat gegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Reaktionsansatz über Nacht bei 4°C gegen 1 mmol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,5, dialysiert.

20 mg Anti-Humanalbumin (Firma Dako) wurden in 2 ml 0,1 mol/l Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5, gelöst.

Zur Konjugation wurde die Anti-Humanalbumin-Lösung unter Rühren mit der aktivierten Meerrettich-Peroxidase-Lösung versetzt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Reinigung des Anti-Humanalbumin-Meerrettich-Peroxidase- Kunjugats erfolgte über eine mit 0,01 mol/l Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, äquilibrierten Superose 12 (PHARMACIA). Die Konjugat- enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und über ein Filtersystem (YM30 AMICON) auf 1 mg/ml konzentriert.

c) Herstellung der Kalibratoren und Kontrollen

Für die Herstellung der Kalibratoren wurde ein Humanalbuminstandard (Immuno AG) in den Konzentrationen 0, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 µg/ml in einem 0,2 mol/l Tris/HCl- Puffer, pH 7,4, gelöst.

d) Herstellung des Antigen-Reagens

Die nach Schritt a) mit Anti-Humanalbumin beschichtete Mikrotiterplatte wurde in einem Ein-Schritt-ELISA eingesetzt. Dabei wurde eine konstante Menge Anti-Humanalbumin- konjugierte Meerrettich-Peroxidase so eingesetzt, daß das maximale Signal die Absorption von 2,0 nicht überschreitet. Zur Ermittlung des Aquivalenzpunktes wurde dem Testansatz Humanalbumin (Immuno AG) im Konzentrationsbereich zwischen 0 und 5 µg/ml zugesetzt. Hierbei ergaben sich die in Fig. 1 dargestellten Meßwerte. Der Äquivalenzpunkt liegt demnach bei 0,4 µg Humanserumalbumin pro ml.

Für die Verdünnung der im Test verwendeten Kalibratoren, Kontrollen und Proben wurde ein Reagans, bestehend aus 0,050 mol/l Tris, pH 7,4, eingestellt mit 1 mol/l Salzsäure und einem Zusatz von 0,4 µg Humanalbumin pro ml verwendet.

e) Funktionstest über die Bestimmung von Humanalbumin

Die nach a) hergestellten Anti-Humanalbumin-beschichteten Mikrotiterplatten wurden für die Funktionsbestimmung eingesetzt. In den Testvertiefungen wurde 0,1 ml Anti- Humanalbumin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (hergestellt nach b)) vorgelegt. Jeweils ein Teil der Humanalbumin-Kalibratoren (hergestellt nach c)) wurde mit 20 Teilen Humanalbumin-haltigem Reagens (hergestellt nach d)) verdünnt und 0,1 ml dieser Lösung in die Testvertiefungen pipettiert.

Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Reaktionsansatz abgesaugt und die Testvertiefungen mit Waschpuffer dreimal gewaschen. Die Meerrettich- Peroxidase-Aktivität des an die Mikrotiterplatte gebundenen Antikörper-Antigen-Antikörper-Enzym-Komplexes wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin bestimmt. Die Enzymreaktion wurde nach 30 Min. durch Zugabe von 2 mol/l Schwefelsäure gestoppt und das Messignal bei 450 nm gemessen. Hierbei ergab sich die in Fig. 2 dargestellte Bezugskurve.

Beispiel 2

"Okkultes", also makroskopisch nicht sichtbares Blut im Stuhl ist u. a. ein Indiz für Blutungsquellen im Gastrointestinaltrakt. Neben vergleichsweise harmlosen Erkrankungen, wie Entzündungen des Dickdarms, Entzündungen der Magenschleimhaut oder Darmpolypen, kann ein kolorektales Karzinom der Grund für die okkulte Blutung sein. Da die Heilungschancen bei frühzeitig erkanntem kolorektalen Karzinom sehr gut sind, ist ein zuverlässiger Okkultblut-Nachweis erforderlich. Das im Blut enthaltene Hämoglobin und/oder Albumin wird im allgemeinen auf chemische oder immunologische Weise nachgewiesen. Da Albumin eine höhere Stabilität im Stuhl aufweist als Hämoglobin, ist gerade der Nachweis von Albumin spezifischer und weist eine höhere Sensitivität auf, als etwa ein Nachweis, der auf der Pseudoperoxidase-Aktivität des Hämoglobins beruht.

a) Probenentnahme und Extraktion der Stuhlproben

Stuhlproben wurden mit Spezialröhrchen entnommen, in Extraktionspuffer, bestehend aus 0,2M Tris/HCl, pH 7,4, mit 0,005% Merthiolat aufgenommen (1 ml Stuhlprobe in 2 ml Puffer) und suspendiert.

Diese Suspension wurde anschließend 10 Minuten in einer Laborzentrifuge bei 4000 g abzentrifugiert und der Überstand einer zweiten Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 12000 g unterworfen. Der Überstand aus dieser zweiten Zentrifugation wurde für die ELISA-Messung verwendet. Diese Messung erfolgte innerhalb von 2 Stunden nach Herstellung des Extraktes.

b) Durchführung der Bestimmung von HSA in extrahierten Stuhlproben

Die nach Beispiel 1 hergestellten Testkomponenten wurden vor Testbeginn alle auf Raumtemperatur gebracht. Probe, Kontrollen und Kalibratoren wurden mit dem analythaltigen Reagens 1+20 verdünnt.

100 µl Konjugatlösung wurden in die mit anti-humanem Albumin beschichteten Testvertiefungen vorpipettiert und jeweils 100 µl verdünnte Kalibratoren, verdünnte Kontrollen und verdünnte extrahierte Stuhlproben zügig dazupipettiert. Die Teststreifen wurden mit Folie abgedeckt und die Inkubation der Komponenten erfolgte bei Raumtemperatur für 60 Minuten.

Während der Inkubation wird humanes Albumin aus den extrahierten Stuhlproben, Kalibratoren und Kontrollen an die Festphase gebunden und gleichzeitig durch das anti-human- Albumin-POD-Konjugat markiert. Unspezifische Probenbestandteile werden durch dreimaliges Waschen mit je 250 µl detergenshaltigem Tris/HCl Puffer, pH 7,4, entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Substratreaktion. Hierfür wurden 200 µl Substratlösung in die Testvertiefungen pipettiert, diese wiederum mit Folie abgedeckt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

In der Substratreaktion oxidiert die Peroxidase des Konjugats das Chromogen mit dem Substrat H202 zu einer blaugefärbten Substanz. Durch Zupipettieren von 50 µl Stopplösung (1,9 mol/l Schwefelsäure) in die Testvertiefungen wird diese Reaktion gestoppt und ein Farbumschlag nach gelb erreicht. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die optische Dichte in einem ELISA-Reader gemessen. Die Farbintensität der Substratreaktion ist der Albumin-Konzentration in der Probe indirekt proportional. Über eine Bezugskurve wird die Albumin-Konzentration in der Probe quantitativ bestimmt.

c) Durchführung des konventionellen ELISA

Die Verdünnung der Kalibratoren, Kontrollen und extrahierten Stuhlproben erfolgt mit einem Reagans, welches keinen Analyten enthält, in einem Verhältnis von 1+250. Alle anderen Reaktionsschritte erfolgen wie in dem erfindungsgemäßen Test. Bei der Auswertung ist zu beachten, daß die Farbintensität der Substratreaktion der Albumin-Konzentration in der Probe direkt proportional ist (Sevier et al, Clin.Chem. 27, 1797, 1981).

Die folgende Tabelle faßt alle Kenndaten und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum konventionellen Verfahren am Beispiel der Bestimmung von Albumin in extrahierten Stuhlproben zusammen:

Tabelle 1

Das beschriebene Verfahren erhöht im Vergleich zum konventionellen Verfahren die Präzision der Bestimmung eines Analyten. Die Präzisionsanalyse zeigt bei der Messung des Analyten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Standardabweichung in der Serie von 1,5 µg HSA/ml und einen Variationskoeffizienten von VK = 3,3% mit n = 20. Bei Einsatz des konventionellen Verfahrens und Messung des Analyten im aufsteigenden Abschnitt der Kurve beträgt die Standardabweichung in der Serie 2,5 µg HSA/ml und man erhält einen Variationskoeffizienten von VK = 8,2% mit n = 20.

Der absolute Meßbereich wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zu höheren Konzentrationen verschoben und expandiert.

Die Steigung der Kurve ist im aufsteigenden Abschnitt größer als im absteigenden Abschnitt. Bei vergleichbarer Analytkonzentration ist somit bei Vorliegen zweier Meßwerte die Differenz der optischen Dichtewerte im absteigenden Teil geringer. Die Konsequenz ist, daß die Störempfindlichkeit durch HSA, das von anderen Quellen als von der Probe stammt, (Crosskontamination) des Testsystems durch Kontamination im absteigenden Abschnitt der Kurve herabgesetzt wird.

Claims (15)

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmenden Probe Analyt oder ein Derivat des Analyten in mindestens einer solchen Konzentration zugesetzt wird, daß ein maximales Signal in der Konzentrations-Signal-Kurve, die durch Titration mit dem Analyten charakterisiert wurde, erreicht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung unter Verwendung eines immunologischen Testsystems durchgeführt wird, wobei eine der Testsubstanzen markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein homogenes oder heterogenes Testsystem handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Detektion des Signals isotopische, nicht- isotopische, enzymatische, lumineszierende oder fluoreszierende Marker verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß poly- und/oder monoklonale Antikörper gegen den zu bestimmenden Analyten verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung von mindestens zwei Antikörpern sich diese voneinander unterscheiden können, aber gegen denselben Analyten gerichtet sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologischen Reaktionen simultan oder sukzessiv ablaufen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den zu bestimmenden Liganden ein geeignetes Rezeptorsystem verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zu bestimmenden Probe um ein biologisches Material handelt, das in flüssiger Phase vorliegt oder durch ein entsprechendes Verfahren in eine flüssige Phase gebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zu bestimmenden Probe um eine Chemikalie handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt Albumin oder Lipoprotein (a) ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Analyt ein Hapten ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat des Analyten ein Dimeres oder Polymeres eines oder mehrerer Epitope des Analyten ist.

14. Set zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 umfassend

• a) ein für den Analyten geeignetes Immunreagens oder einen für den Analyten geeigneten Rezeptor,
• b) einen Analyten oder ein Derivat des Analyten in einer für die Einstellung des Äquivalenzpunktes geeigneten Menge, und
• c) ein für die Detektion des Komplexes aus Analyt-Immunreagens oder Analyt-Rezeptor geeignetes Mittel.

15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunreagens ein monoklonaler oder polyklonaler Anti-Analyt-Antikörper oder ein Antigen ist.