DE60024521T2

DE60024521T2 - Homogenes Enzym-Immunoassay- Verfahren mit zweitem Antikörper

Info

Publication number: DE60024521T2
Application number: DE2000624521
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Asaka-shi Shinoki; Osamu Asaka-shi Seshimoto
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: DE60024521D1; EP1054258B1; EP1054258A1; JP2000310638A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur quantitativen Bestimmung eines in einer Probe vorliegenden Spurenbestandteils, in dem eine Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper verwendet wird. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen homogenen Enzym-Immunoassay zur quantitativen Bestimmung eines Analyt-Antigens (Ligand) in der Probe durch die Verwendung eines Enzym-markierten Antigens.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Analysen der Bestandteile, die vom lebenden Körper oder von Chemikalien abstammen, die in den Körperflüssigkeiten enthalten sind, wie Blut oder Urin, sind zur Diagnose des Zustands von Krankheiten oder zur Beurteilung des Heilungsverlaufs nützlich und somit stellen sie bedeutsame Teile auf dem Gebiet des klinischen Tests dar. Der sogenannte Enzym-Immunoassay ist im Stand der Technik als eine Methode zur Analyse derartiger Bestandteile (Liganden) bekannt, die allgemein in einer geringen Menge in den Körperflüssigkeiten vorliegen. Der Enzym-Immunoassay kann in ein heterogenes System, für das eine B/F (Gebunden/Frei)-Trennung bewirkt werden muss, und ein homogenes System, in dem eine B/F (Gebunden/Frei)-Trennung nicht notwendig ist, klassifiziert werden. Unterdessen steht B für das markierende Material in einem Komplex, der durch Binden des spezifischen Antikörpers (oder des spezifischen Antigens) an den Liganden gebildet worden ist, und F steht für das freie markierende Material, das nicht an den Liganden gebunden ist.
In dem heterogenen System wird der gebundene Antigen-Antikörper (B), der durch Reaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper gebildet worden ist, vom freien Antikörper und Antigen (F) durch beliebige geeignete Maßnahmen abgetrennt und nachfolgend wird die Aktivität des markierenden Enzyms in dem gebundenen Antigen-Antikörper bestimmt. Obwohl man erwartet, dass das heterogene System prinzipiell eine hohe Empfindlichkeit aufweist, da das gebundene (B) vom freien Antikörper und Antigen (F) abgetrennt wird, besteht ein Problem darin, dass mühsame Arbeitsschritte zur B/F-Trennung benötigt werden und somit eine relativ lange Zeit zur Bestimmung notwendig ist.
Andererseits basiert die Reaktion in dem homogenen System auf dem Phänomen, dass die enzymatische Aktivität des markierenden Enzyms durch gewisse Störungen beeinträchtigt wird, die durch das Binden eines Antikörpers an das Antigen (den Liganden) verursacht werden, und die Inhibierung aufgrund der Antigen-Antikörper-Bindung wird im Allgemeinen verwendet. Allgemein wird das Antigen mit einem Enzym markiert, so dass die Schwächung in der enzymatischen Aktivität entweder durch eine sterische Hinderung, die beim Binden des Enzyms, das an einen Antikörper, ein im Allgemeinen großes Molekül, gebunden wird, mit dem Substrat auferlegt wird, oder durch eine Änderung in der dreidimensionalen Struktur des Enzyms bestimmt wird. Beispielsweise ist EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) als ein derartiges System gut bekannt. Der Ligand wird mit dem Enzym-markierten Liganden beim Binden des Antikörpers konkurrieren. Wenn eine große Menge des Liganden vorliegt, so bleibt freier, Enzym-markierter Ligand, der nicht mit dem Antikörper verbunden ist, in einer großen Menge zurück und somit bleibt die enzymatische Aktivität des markierenden Enzyms erhalten. Wenn die Menge des Liganden gering ist, bindet der Enzym-markierte Ligand an den Antikörper und die enzymatische Aktivität nimmt dann ab. Daher steigt die enzymatische Aktivität des markierenden Enzyms proportional zur Menge des Antigens (des Liganden) in der Probe.
Die Arbeitsschritte in dem homogenen System sind damit relativ vereinfacht, da eine komplizierte B/F-Trennung nicht erforderlich ist. Jedoch ist die Verringerung in der enzymatischen Aktivität des Enzyms, die durch das Binden des Antikörpers bewirkt wird, nicht immer ausreichend. In einem derartigen Fall ist der wert der enzymatischen Aktivität (Hintergrundwert) nicht niedrig genug, wenn kein Antigen (Ligand) anwesend ist, und somit kann kein ausreichendes S/N-Verhältnis gewährleistet werden.
Um die Empfindlichkeit der Bestimmung eines Antigens in einer Probe andererseits zu erhöhen, d.h., die Grenze zur Bestimmung des Antigens zu senken, genügt es, die Menge des Antikörpers zu verringern. Wenn jedoch die Menge des Antikörpers verringert wird, nimmt auch die Menge des Antikörpers, die an das Enzym-markierte Antigen gebunden ist, ab und als ein Ergebnis nimmt der Inhibitoreffekt gegenüber dem markierenden Enzym ab. Dieses Ergebnis bedeutet einen Anstieg des Hintergrundwerts, was zu einer Verringerung des S/N-Verhältnisses führt.
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf die voranstehend genannten Umstände erzielt worden und eine Aufgabe davon liegt in der Bereitstellung eines homogenen Enzym-Immunoassay-Verfahrens, das das Gewährleisten eines hinreichenden S/N-Verhältnisses mit einem niedrigen Hintergrundwert ermöglicht. Des Weiteren liegt eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines homogenen Enzym-Immunoassay-Verfahrens, das es ermöglicht, ein S/N-Verhältnis zu erhalten, das nicht niedriger, vielmehr höher ist als das vor der Verringerung der Menge eines Antikörpers Beobachtete, sogar dann, wenn die Menge an Antikörper relativ zu einem Antigen verringert wird, um die Empfindlichkeit zu steigern.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung eines homogenen Enzym-Immunoassay-Verfahrens zur quantitativen Analyse eines Liganden erzielt, das Folgendes umfasst: Umsetzen des Liganden mit einem Enzymmarkierten Liganden, einem Antikörper gegen den Liganden und einem zweiten Antikörper gegen den genannten Antikörper und dann Bestimmen einer Änderung in der enzymatischen Aktivität eines Markierungsenzyms des genannten Enzymmarkierten Liganden in dem Reaktionsgemisch.
In der vorliegenden Erfindung wird die sterische Hinderung durch Binden des Enzym-markierten Liganden (des Antigens) an den Antikörper und nachfolgendes sukzessives Binden des zweiten Antikörpers verstärkt.
Die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms in dem Reaktionssystem kann durch Zugabe eines Substrats zu dem Reaktionsgemisch bestimmt werden. Wenn es nötig ist, ist es möglich, eine Farbentwicklungsreagentien-Zusammensetzung zu dem enzymatischen Reaktionsprodukt zuzugeben, wodurch eine Farbentwicklung proportional zur enzymatischen Aktivität verursacht wird, um dann eine kolorimetrische Analyse durchzuführen.
Ein in Wasser unlösliches Substrat kann als das Enzymsubstrat verwendet werden. Alternativ dazu kann die enzymatische Aktivität durch ein Trockenanalyseelement bestimmt werden, das mit einer Substratschicht ausgestattet ist, die ein wasserunlösliches Substrat enthält. Das wasserunlösliche Substrat ist im Allgemeinen ein Makromolekül mit einem hohen Molekulargewicht. Wenn eine hoch molekulargewichtige Substanz eine gebundene Struktur (eine vernetzte Struktur) zwischen einigen der hochpolymeren Ketten besitzt, ist es unmöglich, diese zu trennen. Das wasserun lösliche Substrat quillt daher in einem Lösungsmittel, ist jedoch nicht darin löslich. Ein derartiges unlösliches Substrat reagiert mit einem Enzym an der Oberfläche seiner Partikel. Die enzymatische Reaktion findet nämlich an der Fest-Flüssig-Grenzfläche statt, was den Einfluss der sterischen Hinderung gegenüber dem Enzym steigert. In der vorliegenden Erfindung wird, damit sich die sterische Hinderung leichter auswirken kann, ein Antikörper mit einem Enzym-markierten Antigen umgesetzt, das Reaktionsgemisch wird mit einem zweiten Antikörper umgesetzt und daran gebunden und nachfolgend wird die enzymatische Aktivität vorzugsweise unter Verwendung eines unlöslichen Substrats gemessen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Kalibrierungskurven, die als ein Ergebnis der Analyse in Beispiel 6 gezeichnet worden sind. In der Zeichnung kennzeichnet das Symbol
den Fall, in dem ein Enzym-markiertes Antigen und ein Antikörper mit einem Antigen umgesetzt wurden (das Vergleichsbeispiel), während das Symbol -O- den Fall kennzeichnet, in dem das Enzym-markierte Antigen, ein erster Antikörper und ein zweiter Antikörper mit einem Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung umgesetzt wurden.
Die 2 zeigt Kalibrierungskurven, die als ein Ergebnis der Analyse in Beispiel 8 gezeichnet worden ist. In der Zeichnung kennzeichnet das Symbol
den Fall, in dem ein Enzym-markiertes Antigen und ein Antikörper mit einem Antigen umgesetzt wurden (das Vergleichsbeispiel), während das Symbol -O- den Fall kennzeichnet, in dem das Enzym-markierte Antigen, der erste Antikörper und der zweite Antikörper mit einem Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung umgesetzt wurden.
Die 3 zeigt Kalibrierungskurven, die als Ergebnis der Analyse in Beispiel 12 gezeichnet worden sind. In der Zeichnung kennzeichnet das Symbol
den Fall, in dem ein Enzym-markiertes Antigen und ein Antikörper mit einem Antigen umgesetzt wurden (das Vergleichsbeispiel), während das Symbol -O- den Fall kennzeichnet, in dem das Enzym-markierte Antigen, der erste Antikörper (die Hälfte der Menge im Vergleichsbeispiel) und der zweite Antikörper mit einem Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung umgesetzt wurden.
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Analyt (zu analysierende Substanz)
Die durch die vorliegende Erfindung zu analysierende Substanz (im Folgenden auch einfacher Weise als „Analyt" bezeichnet) ist ein Ligand, der eine antigene Determinante aufweist und in der Probe enthalten ist, d.h. ein Antigen. Die Probe, die den Analyten enthält, ist keinen Beschränkungen unterworfen und viele Arten einer Probe können durch diese Erfindung analysiert werden. Typische Proben beinhalten Blut (Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Lymphflüssigkeiten und Urin.
Ein beliebiger Ligand, einschließlich einer nieder-molekulargewichtigen Substanz zu einer hoch-molekulargewichtigen Substanz, können durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Analyseelements analysiert werden, soweit jeder Ligand Antigenität besitzt und ein Antikörper dagegen verfügbar ist. Im Übrigen bedeutet der Ausdruck „der Ligand weist Antigenität auf", dass er dazu in der Lage ist, mit einem entsprechenden Antikörper zu reagieren, und dass es nur erforderlich ist, dass der Ligand ein Epitop (eine antigene Determinante) besitzt. Sogar eine Substanz ohne eigene Immunogenität kann als ein zu analysierender Ligand (ein zu analysierendes Antigen) in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern er dazu in der Lage ist, einen entsprechenden Antikörper durch Immunisieren als ein Hapten herzustellen.
In dem Fall, dass der zu analysierende Ligand ein Antigen mit einem hohen Molekulargewicht ist, das eine Störung oder Inhibierung der enzymatischen Aktivität zeigt, wenn es mit einem Enzym markiert ist, reicht es aus, eine andere nieder-molekulargewichtige Substanz mit einer antigenen Determinante, die mit der des Liganden gemein ist, auszuwählen und das Konjugat einer derartigen Substanz und des Markierungsenzyms als ein Enzym-markiertes Antigen zu verwenden, wie es im Folgenden speziell beschrieben wird.
Wie er hierin verwendet wird, beinhaltet der Begriff „Enzym-markierter Ligand" begriffsmäßig nicht nur einen solchen, der durch Markieren eines Liganden (Analytantigen) mit einem Enzym erhalten worden ist, sondern auch einen solchen, der durch Markieren einer Substanz, die eine mit dem Liganden gemeinsame antigene Determinante aufweist, mit einem Enzym erhalten worden ist. Nicht nur derartige Verbindungen als Ligandderivate, die Analoga in Bezug auf die chemische Struktur sind, sondern auch eine derartige Verbindung, die ein Verhalten zeigt, das dem des Liganden in Bezug auf die Immunkompetenz gegenüber dem Antikörper ähnlich ist, können mit einem Enzym markiert werden und als Enzym-markierter Ligand verwendet werden.
Enzym-markierter Ligand
Der Enzym-markierte Ligand ist ein verbundenes Produkt eines Analytliganden (oder einer Ligand-artigen Substanz, die eine gemeinsame Determinante mit dem Liganden besitzt) mit einem Enzym. Wenn der Ligand eine Substanz mit einem niedrigen Molekulargewicht ist, z.B. Chemikalien, kann er direkt mit einem Enzym verbunden werden. In dem Fall, in dem der Ligand eine Substanz mit einem hohen Molekularge wicht ist, z.B. ein Protein, das die enzymatische Aktivität stört, wenn sie direkt in ihrer unmodifizierten Form an ein Enzym gebunden wird, kann das Protein fragmentiert werden und ein Fragment davon kann als eine Substanz, die mit einem Enzym zu markieren ist, verwendet werden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die antigene Determinante des fragmentierten Proteins, das ein niedrigeres Molekulargewicht hat, gemein mit der des intakten Proteins ist, das heißt des Liganden.
Die Methode zur Verknüpfung des Liganden mit einem Enzym kann unter Berücksichtigung der funktionellen Gruppen beider Substanzen ausgewählt werden. Verwendbare funktionelle Gruppen beinhalten z.B. Amino, Carboxyl, Hydroxyl, Thiol, Imidazol und Phenyl. Beispielsweise können Aminogruppen durch eine Anzahl an bekannten Methoden miteinander verknüpft werden, wie der Isocyanat-Methode, der Glutaraldehyd-Methode, der Difluorbenzol-Methode und der Benzochinon-Methode. Eine Aminogruppe kann mit einer Carboxylgruppe durch eine Methode, in der eine Carboxylgruppe in einen Succinimidester umgewandelt wird, oder durch andere Methoden einschließlich der Carbodiimid-Methode und der Woodward-Reagens-Methode verbunden werden. Die Periodsäure-Oxidations-Methode (Nakane-Methode), durch die eine Aminogruppe mit einer Zuckerkette vernetzt wird, ist ebenso anwendbar. Wenn eine Thiolgruppe verwendet wird, wird eine der Carboxylgruppen in einen Succinimidester umgewandelt und nachfolgend wird Cystein damit umgesetzt, um eine Thiolgruppe einzuführen. Nachfolgend werden beide Gruppen unter Verwendung eines funktionellen Verbindungsreagenses, das mit der Thiolgruppe reagiert, verbunden. Das Verfahren, in dem die Phenylgruppe verwendet wird, beinhaltet die Diazotierungs-Methode und die Alkylierungs-Methode.
Die Verknüpfungs-Methode ist nicht auf die voranstehend erwähnten Methoden beschränkt, und kann aus Methoden ausgewählt werden, wie es in „Method in Immunology and Immu nochemistry", Bd. 1, (C.A. Williams, M.W. Chase, Academic Press (1967)) oder „KOHSO MEN'EKI SOKUTEI-HO (Enzyme Immunoassay)", herausgegeben von Ishikawa, Kawai und Miyai, veröffentlicht von Igaku Shoin, 1978, beschrieben worden ist. Das Verknüpfungs-Verhältnis zwischen dem Liganden und dem Enzym ist nicht auf 1:1 beschränkt, es kann jedoch unter Berücksichtigung des Anwendungseinsatzes des Produkts auf ein gewünschtes Verhältnis abgeändert werden. Nach Abschluss der Verbindungsreaktion wird das Reaktionsprodukt durch die Gelfiltration oder die Ionenaustauschchromatographie gereinigt und kann durch den Lyophilisierungsprozess getrocknet werden, wie es gewünscht wird.
Anstelle des Liganden kann das Enzym mit einem Derivat des Liganden mit immunologischer Kreuzreaktivität bezüglich eines entsprechenden Antikörpers für den Liganden verbunden werden. Die Derivate des Liganden beinhalten nicht nur solche, die analoge chemische Strukturen aufweisen, sondern auch solche, die ein analoges Verhalten hinsichlich ihrer immunologischen Reaktivitäten zeigen. Wenn beispielsweise ein Antikörper gegen Theophyllin als Ligand immunologisch mit Coffein kreuzreagiert, kann ein Derivat von Coffein als ein Material für den Enzym-markierten Liganden verwendet werden.
Wenn der Ligand oder ein Derivat davon keine passende funktionelle Gruppe, die mit dem Enzym verbunden werden soll, besitzt, kann eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe in den Liganden oder das Derivat davon eingeführt werden. Eine derartige Gruppe kann durch einen Spacer eingeführt werden, um ihr Verbinden mit dem Enzym zu vereinfachen. Wenn beispielsweise der Ligand Theophyllin ist, kann die Carboxylgruppe eingeführt werden, um 8-Propylcarboxyltheophyllin zu erhalten, das mit dem Enzym verbunden wird.
Antikörper
Ein spezifischer Antikörper gegen den zu analysierenden Liganden wird als der Antikörper verwendet. Wenn ein Derivat des Liganden zur Herstellung des Enzym-markierten Liganden verwendet wird, wird ein Antikörper, der mit der antigenen Determinante reagiert, die der Ligand und das Derivat davon gemeinsam besitzen, verwendet. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper sein, der durch das herkömmliche Verfahren erhalten worden ist. Vorzugsweise kann ein monoklonaler Antikörper verwendet werden, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Darüber hinaus kann der Antikörper ein Fragment von F(ab')₂, Fab', Fab sein. Es ist jedoch nicht in besonderem Maße notwendig, ein derartiges Fragment zu verwenden. Es ist eher vorteilhaft, den intakten Antikörper (IgG) zu verwenden, der keinen derartigen fragmentierten Antikörper darstellt, um die sterische Hinderung bezüglich des Enzym-markierten Liganden zu erhöhen. Da IgG zusätzlich dazu einen Fc-Bereich enthält, ist die Verwendung von IgG als erster Antikörper eher vorzuziehen, was es ermöglicht, einen Anti-Fc-Antikörper als zweiten Antikörper einzusetzen.
Zweiter Antikörper
Der zweite Antikörper ist ein Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt und an diesen bindet, und kann ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein. Wenn der erste Antikörper aus einer Maus erhalten wird, kann ein Anti-Maus-IgG-Antikörper als zweiter Antikörper verwendet werden. Ein derartiger zweiter Antikörper beinhaltet einen polyklonalen Antikörper, der durch Immunisieren eines Tiers (Ziege, Schaf, Kaninchen oder dergleichen), das von der Maus verschieden ist, mit dem ersten Antikörper erhalten worden ist. Wenn der erste Antikörper ein intakter Maus-IgG ist, kann ein im Handel erhälticher Anti-Maus-Fc-Antikörper als zweiter Antikörper verwendet werden.
Markierungsenzym
Das Enzym zur Bildung des Enzym-Ligand-Komplexes kann unter Berücksichtigung der Kombination mit dem Substrat, das in der nachfolgenden enzymatischen Reaktion verwendet wird, und eines Detektionssystems des enzymatischen Detektionsprodukts ausgewählt werden. Da die Reaktivität des Enzyms mit dem Substrat in der vorliegenden Erfindung durch die sterische Hinderung unterdrückt wird, was zur Bildung eines Enzym-Antigen-Antikörper-zweiter-Antikörper-Komplexes führt, ist es bevorzugt, eine Kombination des Enzyms und des Substrats auszuwählen, deren Beeinflussung durch die sterische Hinderung leicht bestückt wird.
Kurz gesagt ist ein Substrat mit einem relativ hohen Molekulargewicht bevorzugt, um eine höhere Empfindlichkeit zu erzielen. Beispielsweise wird ein Substrat mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als etwa 20.000, vorzugsweise nicht weniger als etwa 100.000, in der vorliegenden Erfindung verwendet. Beispiele derartiger Substrate beinhalten eine Stärke als das Substrat für ein Amylaseenzym; eine Cellulose als das Substrat für ein Cellulaseenzym; Proteine, wie Gelatine und Hämocyanin, als die Substrate für Protease; sowie verschiedene Öle und Fette als die Substrate für Lipase. Detaillierte Berichte bezüglich der Auswahl der Enzyme und Substrate sind in den ungeprüften japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 108756/1985 (entsprechend der US-PS 4,692,404 und der EP-A-0 144 176), 171461/1985 (entsprechend der US-PS 4,757,001 und der EP-A-0 152 305) sowie 171460/1985 (entsprechend der US-PS 4,757,001 und der EP-A-0 152 305) offenbart. Unter diesen ist Amylase, die mit Stärke als das Substrat verwendet wird, bevorzugt. Es ist besonders bevorzugt, dass das Substrat ein in Wasser unlösliches Substrat ist, weil die sterische Hinderung durch die Gegenwart der Enzm-Antikörper-Antigne-Matrixstruktur merklich in Erscheinung tritt. Beispiele eines derartigen Enzyms beinhalten eine Hydrolase, die ein diffusionsfähiges Oligomer aus einem nicht-diffusionsfähigen (wasserunlöslichen) Substrat bildet, das aus Polymeren besteht, wobei eine Glucosidase ein spezielles Beispiel ist. Beispiele von Glucosidasen beinhalten endoaktive Glucosidasen, wie α-Amylase, β-Amylase und Dextranase.
Wasserunlösliches Substrat
Wenn eine α-Amylase als das Markierungsenzym verwendet wird, können Carboxy-methylierte Stärke, Stärke, Amylose, Amylopectin oder dergleichen als das Substrat verwendet werden. Hinsichtlich der Verbesserung der Empfindlichkeit ist es besonders bevorzugt, wasserunlösliche Stärke zu verwenden, weil die enzymatische Reaktion an den Oberflächen der Substratpartikel stattfindet, die Reaktion findet nämlich an der Fest-Flüssig-Grenzfläche statt, was den Einfluss der sterischen Hinderung auf die enzymatische Aktivität durch das Auftreten einer Antigen-Antikörper-Bindung steigert. Alternativ dazu kann eine wasserunlösliche Farbstoff-Stärke verwendet werden und der an die lösliche Amylose, die das Zersetzungsprodukt der enzymatischen Reaktion ist, gebundene Farbstoff wird nachfolgend detektiert. Ein Beispiel eines im Handel erhältlichen wasserunlöslichen blauen Stärkepolymers ist ein Neoamylase-Test-„Dai-ichi" (hergestellt von Diichi Pure Chemicals, Co., Ltd.).
Assay-Verfahren
Das Analytantigen, das Enzym-markierte Antigen, der Antikörper und der zweite Antikörper werden in beliebiger Reihenfolge vermischt. Im Allgemeinen lässt man nach dem Vermischen des in der wässrigen Flüssigkeitsprobe enthaltenen Antigens mit dem Enzym markierten Antigen den Antikörper (ersten Antikörper) damit in der Lösung in Kontakt treten und setzt nachfolgend den zweiten Antikörper zu. Jedoch kann der erste Antikörper schließlich zugegeben werden, nachdem das Analytantigen und der Enzym-markierte Antikörper mit dem zweiten Antikörper im Voraus vermischt worden sind. In diesen Fällen beginnt die kompetitive Immunreaktion durch die Zugabe des ersten Antikörpers abzulaufen.
Nach der Zugabe des ersten Antikörpers zum Analytantigen können das Enzym-markierte Antigen und der zweite Antikörper nacheinander zugesetzt werden. In diesem Fall tritt eine sogenannte sequentielle immunologische Reaktion auf, in der sich der erste Antikörper, der nicht an das Analytantigen gebunden hat, mit dem Enzym-markierten Antigen verbindet.
Alternativ dazu wird der erste Antikörper zuerst mit dem Enzym-markierten Antigen in Kontakt gebracht und dann werden das Analytantigen und der zweite Antikörper zugesetzt. In diesem Fall wird das Enzym-markierte Antigen aus dem im Voraus gebildeten Komplex des Antikörpers und des Enzymmarkierten Antigens proportional zur zugesetzten Menge des Analytantigens freigesetzt (sogenante Substitutions-Freisetzungs-Reaktion).
In jeder der voranstehend aufgeführten Immunoreaktionen ist es bevorzugt, dass die Temperatur der Lösung im Bereich von 20°C bis 45°C liegt und der pH-Wert der Lösung im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,5 liegt. Ein Puffer, wie ein Phosphatpuffer oder ein Acetatpuffer, kann dazu verwendet werden, den pH-Wert der Lösung bei einem konstanten Niveau zu halten. Die Zeit, in der man den Antikörper mit dem Enzym-markierten Antigen in Kontakt treten lässt, kann bestimmt werden, um einen Abschluss der Reaktion zu gewährleisten, und liegt beispielsweise im Bereich von 20 bis 30 Minuten, wenn die Temperatur der Lösung 37°C beträgt. Die Zeit für die darauf folgende Reaktion mit dem zweiten Antikörper kann ebenso bestimmt werden, um einen Abschluss der Reaktion zu gewährleisten, und liegt beispielsweise im Bereich von 5 Minuten bis 10 Minuten, wenn die Temperatur der Lösung 37°C beträgt.
Nach einer Reihe der voranstehend beschriebenen Immunreaktionen wird der Lösung ein Substrat für das Enzym zugesetzt und die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms wird gemessen. Das Vorliegen eines Analyt-Antigens in der Probe kann als Zunahme der enzymatischen Aktivität (präziser als die Zurückerlangung der unterdrückten enzymatischen Aktivität) bestimmt werden. Durch vorheriges Erzeugen einer Kalibrierungskurve, die unter Verwendung von Lösungen gezeichnet wird, die jeweils eine bekannte Menge des Analytantigens enthalten, kann das in der Probe enthaltene Analytantigen quantitativ analysiert werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird nur eine Reihe von Immunoreaktionen in einem Lösungssystem durchgeführt und dann kann die enzymatische Aktivität des Reaktionsgemisches unter Verwendung eines trockenen Systems analysiert werden. Im Detail wird ein Trockenanalyseelement mit einer Substratschicht, die das Substrat für das Markierungsenzym enthält, hergestellt und das Reaktionsgemisch wird nach Abschluss der Immunreaktionen auf das Trockenanalyseelement aufgetragen oder punktförmig aufgebracht, um die enzymatische Aktivität zu messen. Ein derartiges Trockenanalyseelement beschichtet eine Schichtstruktur, die der in den nicht-geprüften japanischen Patentveröffentlichungen Nrn. 295466/1991, 128655/1992 und dergleichen beschriebenen ähnlich ist.
Wenn das Markierungsenzym beispielsweise α-Amylase ist, wird eine Substratschicht, die Carboxy-methylierte Stärke als ein unlösliches Substrat enthält, als oberste Schicht des Trockenanalyseelements angeordnet. In einer unter der Substratschicht angeordneten Reagensschicht wird ein Fragmentierungs- oder Verdauungsenzym (z.B. Glucoamylase) zur weiteren Zersetzung eines Oligomers, das ein Zersetzungsprodukt der enzymatischen Reaktion der Carboxy-methylierten Stärke ist, in das entsprechende Monomere (Glucose) eingearbeitet. Die Glucose kann optisch durch eine Detektionsreagentien-Zusammensetzung detektiert werden, die auch in der Reagensschicht enthalten ist. Als eine derartige Detektionsreagentien-Zusammensetzung kann eine Kombination aus Glucoseoxidase, Peroxidase und Leukofarbstoff eingesetzt werden.
Beispiel 1
Herstellung einer Phenobarbital-Thiol-Verbindung
100 mg Phenobarbital-Valeriansäure wurden in 1,6 ml DMF gelöst. 34,6 mg N-Hydroxysuccinimid und 56,7 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt, wodurch ein aktiviertes Phenobarbital hergestellt wurde. Das Gemisch wurde anschließend zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Zu 123 μl einer 50 mg/ml Mercaptoethylamin-Hydrochlorid-Lösung in DMF wurden 201 μl 50 mg/ml Tributylamin-Lösung in DMF gegeben. Daraufhin wurden 500 μl der aktivierten Phenobarbital-Lösung (Überstand), der wie voranstehend beschrieben hergestellt wurde, dazugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2,5 Stunden lang gerührt, wodurch eine Phenobarbital-Thiol-Verbindung hergestellt wurde.
Beispiel 2
Herstellung von GMB-Amylase
Zu 500 μl einer 10 mg/ml-Lösung von Bacillus subtilis-Amylase (in 0,1 M Glycerophosphat-Puffer, pH 7,0) wurden 50 μl einer 40 mg/ml-Lösung von ortho-Phenanthrolin in DMF zugegeben und nachfolgend wurden 500 μl einer 100 mg/ml-Lösung löslicher Stärke (0,1 M Glycerophosphat, pH 7,0) zugesetzt. Es wurden 50 μl einer 25 mg/ml-Lösung von GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimid) in DMF zugegeben und das-Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25-Säule aufgetragen, die vorher mit einem 0,1 M Glycerophosphat-Puffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und die durchlaufende Fraktion wurde gesammelt, wodurch N-(γ-Maleimidobutyryloxy)amidierte Amylase (GMB-Amylase) erhalten wurde.
Beispiel 3
Herstellung einer Verbindung zwischen α-Amylase und Phenobarbital
Zu 600 μl einer GMB-Amylase-Fraktion, die in Beispiel 2 hergestellt worden war, wurden 70 μl Phenobarbital-Thiol-Verbindungslösung, die in Beispiel 1 hergestellt worden war, gegeben. Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25-Säule aufgetragen, die vorher mit einem 0,1 M Glycerophosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und die durchlaufende Fraktion wurde gesammelt, wodurch eine Verbindung zwischen α-Amylase und Phenobarbital erhalten wurde.
Beispiel 4
Herstellung eines Immunoassay-Elements für α-Amylase

Auf eine farblose und transparente Polyethylenterephthalat (PET)-Folie (Träger), die mit einer Gelatinegrundierung beschichtet war und eine Dicke von 180 μm aufwies, wurde eine Reagentienlösung, die ein Vernetzungsreagens enthielt, aufgeschichtet und nachfolgend getrocknet, wodurch eine Reagentienschicht gebildet wurde, so dass die jeweiligen Komponenten die im Folgenden dargestellte Belegung aufwiesen.

Alkalisch behandelte Gelatine	14,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (das durchschnittlich 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten enthielt)	0,2 g/m²
Glucoseoxidase	5000 U/m²
Peroxidase	15.000 U/m²
Glucoamylase	5000 U/m²
2-(4-Hydrdoxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5-phenethylimidazol (Leukofarbstoff)-Acetat	0,38 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan	0,1 g/m²

Über der resultierenden Reagentienschicht wurde eine Haftschicht gebildet, indem die folgenden Reagentien aufgetragen wurden und nachfolgend getrocknet wurden, so dass sie die folgenden Belegungen aufwiesen.

Alkalisch behandelte Gelatine 14,5 g/m²

Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 0,1 g/m²
Daraufhin wurde eine wässrige Lösung, die die folgenden Reagentien enthielt, auf die Oberfläche der resultierenden Haftschicht aufgeschichtet, so dass diese die folgende Belegung aufwies. Die Gelatineschicht wurde gequollen und ein Webtuch, das durch Zusammenknüpfen von PET-Spinngarn mit 36 Gauge, was 50 Denier entspricht, hergestellt worden war und eine Dicke von etwa 250 μm aufwies, wurde unter einem einheitlichen und leichten Druck darauf laminiert, wodurch eine poröse Verteilungsschicht gebildet wurde.

Nonylphenoxypolyethoxyethanol (das durchschnittlich 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten enthielt) 0,15 g/m²

Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]methan 0,4 g/m²
Danach wurde eine Substratschicht gebildet, indem ein Substrat aufgetragen wurde und nachfolgend getrocknet wurde, so dass sie die folgende Belegung aufwies, wodurch ein mehrschichtiges Analyseelement zur quantitativen Analyse von α-Amylase hergestellt wurde.

Carboxy-methylierte Stärke 5 g/m²

Nonylphenoxypolyethoxyethanol (das durchschnittlich 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten enthielt) 0,2 g/m²
Das auf diese Weise hergestellte Analyseelement wurde in eine rechtwinklige Spitze mit einer Größe von 15 mm × 15 mm geschnitten und die Spitze wurde in einen Objektträgerrahmen, der in der nicht-geprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 63452/1982 beschrieben worden war, eingebracht, um einen mehrschichtigen Trockenobjektträger für die Analyse von α-Amylase herzustellen.
Beispiel 5
Ein Reaktionsgemisch, das 0,02 mg/ml Verbindung zwischen α-Amylase/Phenobarbital, die in Beispiel 3 erhalten worden war, 0,05 mg/ml Anti-Phenobarbital-Antikörper (monoklonal) als einen ersten Antikörper, 1 mg/ml Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper (Produkt von Jackson Immunoresearch) und 50 mM MES-Puffer (pH 6,5) enthielt, wurde hergestellt und 20 Minuten lang bei 37° inkubiert, um eine Immunreaktion zu bewirken. Nach Abschluss der Immunreaktion wurden 10 μl der resultierenden Lösung auf den α-Amylase-Analyseobjektträger, der in Beispiel 4 hergestellt worden war, aufgetüpfelt. Der Objektträger wurde bei 37°C gehalten und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer zentralen Wellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite aus gemessen. Die Differenz der optischen Dichte (ΔOD_6-4) zwischen den optischen Dichten des reflektierten Lichts, die nach Ablauf von 4 Minuten bzw. 6 Minuten vom Zeitpunkt des Auftüpfelns gemessen worden waren, wurde bestimmt und der Wert wurde einer enzymatischen Aktivität zugeordnet.
Als Vergleichsbeispiel wurde ein Arbeitsgang als eine Referenz durchgeführt, der dem Beispiel ähnlich war mit der Ausnahme, dass der zweite Antikörper nicht zu dem Reaktionsgemisch gegeben wurde. Als Kontrolle wurde die enzymatische Aktivität in einer ähnlichen Art und Weise zu der des Beispiels mit der Ausnahme gemessen, dass weder der erste noch der zweite Antikörper dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurde. Die Enzyminhibierungsrate wurde in dem Beispiel und dem Vergleichsbeispiel bestimmt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde, während die Inhibierungsrate für das Markierungsenzym α-Amylase bei Verwendung des ersten Antikörpers allein 68% betrug, die Inhibierungsrate durch Zugabe des zweiten Antikörpers merklich auf 94% verbessert.
Tabelle 1
Beispiel 6
50 μl 50 mM MES-Pufferlösung (pH 6,5), die eine bekannte Menge an Phenobarbital enthielt, wurden zu 50 μl der Verbindung zwischen α-Amylase und Phenobarbital (0,04 mg/ml), die in Beispiel 3 erhalten worden war, gegeben und nachfolgend wurden weiterhin 50 μl Maus-Anti-Phenobarbital-Antikörper (0,1 mg/ml; monoklonal) zugegeben. Nachfolgend wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden 10 μl der resultierenden Lösung auf den α-Amylase-Analyseobjektträger, der in Beispiel 4 hergestellt worden war, getüpfelt. Der Objektträger wurde bei 37°C gehalten und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite aus gemessen. Der Unterschied in der optischen Dichte (ΔOD_6-4) zwischen den optischen Dichten des reflektierten Lichts, die nach Ablauf von 4 Minuten bzw. 6 Minuten nach dem Auftüpfeln gemessen worden waren, wurde bestimmt. Eine Kalibrierkurve des Vergleichsbeispiels wurde auf Basis des Ergebnisses der Bestimmung hergestellt.
Als Beispiel 6 wurde eine ähnliche Vorgehensweise mit der Ausnahme durchgeführt, dass ein Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper (Produkt von Jackson Immunoresearch) in die Lösung der Verbindung zwischen α-Amylase/Phenobarbital (0,04 mg/ml) des voranstehend beschriebenen Vergleichsbeispiels gegeben wurde.
Jede der Kalibrierkurven ist in 1 gezeigt. Wie in 1 gezeigt ist, wurde der Hintergrundwert auf der Seite geringer Antigenkonzentration durch die Zugabe des zweiten Antikörpers (Anti-Fc-Antikörper) merklich verringert. Zusätzlich dazu war auf Seite hoher Antigenkonzentration die Wiederherstellung der Markierungsenzymaktivität ähnlich zu der im Vergleichsbeispiel (Anti-Fc-Antikörper (–)), wobei der zweite Antikörper nicht verwendet wurde. Somit war in dem vorliegenden Beispiel, in dem der zweite Antikörper verwendet wurde, das S/N-Verhältnis merklich verbessert (1; -O-). Darüber hinaus beeinträchtigte die Zugabe des zweiten Antikörpers weder die Detektionsgrenze noch erniedrigte sie die Empfindlichkeit.
Beispiel 7
Ähnlich zu Beispiel 4 wurde ein mehrschichtiges Analyseelemente mit einer Webtuchschicht hergestellt. Auf die Webtuchschicht, die sowohl als eine Substratschicht als auch als eine Verteilungsschicht fungierte, wurde eine wässrige Lösung eines Maus-Anti-Phenobarbital-Antikörpers (monoklonal) aufgeschichtet, so dass sie eine Belegung von 51,6 mg/m² aufwies, und nachfolgend getrocknet, wodurch ein mehrschichtiger Immunoassay-Objektträger 2 erzeugt wurde, der den ersten Antikörper zur Analyse von Phenobarbital enthielt.
Beispiel 8
50 μl 50 mM MES-Pufferlösung (pH 6,5), die eine bekannte Menge an Phenobarbital enthielt, wurden zu 50 μl der Lösung der Verbindung zwischen α-Amylase und Phenobarbital (0,04 mg/ml), die in Beispiel 3 erhalten worden war, gegeben und nachfolgend wurden des Weiteren 50 μl einer Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörperlösung (1 mg/ml, Produkt von Jackson Immunoresearch) zugesetzt. Nachfolgend wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Daraufhin wurden 10 μl der resultierenden Lösung auf den in Beispiel 7 hergestellten Antikörper-enthaltenden Objektträger 2 getüpfelt. Der Objektträger wurde bei 37°C gehalten und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite aus gemessen. Der Unterschied in der optischen Dichte (ΔOD_6-4) zwischen den optischen Dichten des reflektierten Lichts, das nach Ablauf von 4 Minuten bzw. 6 Minu ten nach dem Auftüpfeln gemessen worden war, wurde bestimmt. Eine Kalibrierungskurve wurde auf Basis des Ergebnisses der Bestimmung hergestellt.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine Vorgehensweise, die zu der des Beispiels ähnlich war, mit der Ausnahme durchgeführt, dass ein Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper nicht zur MES-Pufferlösung gegeben wurde. Eine Kalibrierungskurve wurde auf Basis des Ergebnisses der Bestimmung hergestellt.
Jede der erhaltenen Kalibrierungskurven ist in 2 gezeigt. Wie in 2 gezeigt ist, wurde sogar dann eine Verbesserung des S/N-Verhältnisses (2, -O-) durch Zugabe des zweiten Antikörpers (Anti-Fc-Antikörper) beobachtet, wenn der Trockenobjektträger, der den ersten Antikörper enthielt, verwendet wurde. Darüberhinaus beeinträchtigte die Zugabe des zweiten Antikörpers weder die Detektionsgrenze noch erniedrigte sie die Empfindlichkeit.
Beispiel 9
Herstellung einer Phenytoin-Thiol-Verbindung
102 mg Phenytoin-Valeriansäure wurden in 1,6 ml DMF gelöst. 34,6 mg N-Hydroxysuccinimid und 57,6 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids wurden zugegeben und das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 4°C gerührt, wodurch ein aktiviertes Phenytoin erhalten wurde. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Zu 123 μl einer 50 mg/ml Mercaptoethylamin-Hydrochlorid-Lösung in DMF wurden 201 μl einer 50 mg/ml Tributylaminlösung in DMF gegeben. Daraufhin wurden dem Gemisch 500 μl der aktivierten Phenytoinlösung (Überstand), die wie oben hergestellt worden war, zugesetzt und das Gemisch wurde 2, 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wodurch eine Phenytoin-Thiol-Verbindung hergestellt wurde.
Beispiel 10
Herstellung von GMB-Amylase
Zu 500 μl einer 10 mg/ml Bacillus subtilis-Amylaselösung in 0,1 M Glycerophosphat (pH 7,0), wurden 50 μl einer 40 mg/ml ortho-Phenanthrolinlösung in DMF gegeben und nachfolgend wurden 500 μl einer 100 mg/ml Lösung löslicher Stärke (in 0,1 M Glycerophosphat, pH 7,0) zugegeben. 50 μl einer 25 mg/ml Lösung von GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimid) in DMF wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration durch eine Sephadex G-25-Säule unterzogen, die vorher mit einem 0,1 M Glycerophosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und die durchlaufende Fraktion wurde gesammelt, wodurch N-(γ-Maleimidobutyryloxy)amidierte Amylase (GMB-Amylase) erhalten wurde.
Beispiel 11
Herstellung einer Verbindung zwischen α-Amylase und Phenytoin
70 μl der in Beispiel 9 erhaltenen Phenytoin-Thiol-Verbindungslösung wurden zu 600 μl der in Beispiel 10 hergestellten GMB-Amylaselösung gegeben. Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex G-25-Säule aufgetragen, die vorher mit einem 0,1 M Glycerophosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und die durchlaufende Fraktion wurde gesammelt, um eine Verbindung zwischen α-Amylase und Phenytoin zu erhalten:
Beispiel 12
50 μl einer 50 mM MES-Pufferlösung (pH 6,5), die eine bekannte Menge an Phenytoin enthielt, wurde zu 50 μl einer Lösung gegeben, die die in Beispiel 1 erhaltene Verbindung zwischen α-Amylase und Phenytoin (0,04 mg/ml) und einen Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper (1 mg/ml; Produkt von Jackson Immunoresearch) als zweiten Antikörper enthielt. Daraufhin wurden 50 μl einer 0,011 mg/ml Lösung eines monoklonalen Maus-Anti-Phenytoin-Antikörpers als erster Antikörper zugegeben und daraufhin wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Danach wurden 10 μl der resultierenden Lösung auf den in Beispiel 4 hergestellten α-Amylase-Analyse-Objektträger getüpfelt. Der Objektträger wurde bei 37°C gehalten und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite aus gemessen. Der Unterschied in der optischen Dichte (ΔOD_6-4) des reflektierten Lichts, das nach Ablauf von 4 Minuten bzw. 6 Minuten gemessen worden war, wurde bestimmt. Eine Kalibrierungskurve wurde auf Basis des Ergebnisses der Bestimmung erzeugt.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine ähnliche Vorgehensweise mit der Ausnahme durchgeführt, dass der Ziege-Anti-Maus-IgG-(Fc)-Antikörper als zweiter Antikörper nicht verwendet wurde und die Konzentration des als erster Antikörper zugesetzten monoklonalen Maus-Anti-Phenytoin-Antikörpers auf 0,022 mg/ml abgeändert wurde, was die doppelte Konzentration der in dem voranstehend beschriebenen Beispiel war. Eine Kalibrierungskurve wurde auf Basis des Ergebnisses der Bestimmung erzeugt.
Jede der Kalibrierungskurven ist in 3 gezeigt. Wie in 3 gezeigt ist, war der Wert (Hintergrundwert) auf Seiten geringer Antigenkonzentration hoch und das S/N-Verhältnis betrug im Vergleichsbeispiel etwa 2, in dem der zweite Antikörper nicht verwendet wurde (3,
).
Im Gegensatz dazu wurde bei Verwendung des zweiten Antikörpers eine beachtliche Unterdrückung der Enzymaktivität beobachtet und der Hintergrundwert wurde auf Seiten geringer Antigenkonzentration in ausreichendem Maße abgesenkt. Das S/N-Verhältnis wurde auf etwa 10 erhöht (3, -O-). Da die Menge des in dem Beispiel verwendeten ersten Antikörpers auf die Hälfte zu der im Vergleichsbeispiel verringert wurde, verschob sich die Detektionsgrenze zusätzlich dazu von etwa 0,08 μg/ml im Vergleichsbeispiel auf etwa 0,02 μg/ml im erfindungsgemäßen Beispiel, was etwa ein Viertel des Ersteren ist. Im erfindungsgemäßen Beispiel war die Empfindlichkeit nämlich etwa 4 mal so hoch wie im Vergleichsbeispiel und eine bemerkenswerte Verbesserung des S/N-Verhältnisses wurde im Vergleich zu dem in Vergleichsbeispiel beobachtet.
Wie voranstehend detailliert beschrieben worden ist, wird in der vorliegenden Erfindung ein Ligand (Analytantigen) einer Immunreaktion zwischen dem Liganden, einem Enzymmarkierten Liganden, einem ersten Antikörper gegen den Liganden und einem zweiten Antikörper gegen den ersten Antikörper unterworfen und dann wird die Änderung der enzymatischen Aktivität des Markierungsenzyms in dem Reaktionsgemisch bestimmt. Durch die Verwendung des zusätzlichen zweiten Antikörpers kann ein ausreichendes S/N-Verhältnis zusammen mit einem niedrigen Hintergrundwert gewährleistet werden, obgleich ein derartig ausreichendes S/N-Verhältnis kaum erhalten werden kann, wenn der erste Antikörper allein als Antikörper zugesetzt wird. Sogar wenn die Menge des Antikörpers relativ zum Antigen verringert wird, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, wird zusätzlich dazu das S/N-Verhältnis nicht erniedrigt und das beobachtete S/N-verhältnis ist eher höher als vor der Verringerung der Menge an Antikörper.

Claims

Homogenes Enzym-Immunoassay-Verfahren zum quantitativen Analysieren eines Liganden, umfassend: Umsetzen des Liganden mit einem Enzym-markierten Liganden, einem Antikörper gegen den Liganden und einem zweiten Antikörper gegen den genannten Antikörper und dann Messen der Änderung der enzymatischen Aktivität eines Markierungsenzyms des Enzym-markierten Liganden, um die Menge des Liganden zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms im Reaktionsgemisch von einem wasserunlöslichen Substrat bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die enzymatische Aktivität des Markierungsenzyms im Reaktionsgemisch durch ein Trockenanalyseelement, das mit einer Substratschicht ausgestattet ist, welche das wasserunlösliche Substrat enthält, bestimmt wird.