DE4037724A1 - Vorrichtungen fuer immunoassays und deren materialien - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine immunchemische Assayvorrichtung
gemäß Anspruch 1, einen immunchemisch aktiven Marker gemäß
Anspruch 21, ein Verfahren zur Herstellung des immunchemisch
aktiven Markers gemäß Anspruch 44, sowie eine immunchemische
Testvorrichtung gemäß Anspruch 52.
Es wurden bereits verschiedene Methoden zum Nachweis eines
Analyten (die zu analysierende Substanz) in einer Probe
einer biologischen Flüssigkeit mittels Anwendung der Immun
chemie beschrieben. Bei der sogenannten "Sandwich-Methode"
bindet beispielsweise ein Zielanalyt (z. B. ein Antigen)
zwischen einen markierten Antikörper und einen Antikörper,
der an einem festen Träger immobilisiert ist. Der Nachweis
im Assay erfolgt dadurch, daß die Anwesenheit und die Menge
des Komplexes aus gebundenem Antigen und markiertem Antikör
per ermittelt werden kann. Bei der Konkurrenzmethode eines
Immunoassays (competition immunoassay) wird ein Antikörper,
der an eine feste Oberfläche gebunden ist, mit einer Probe,
die sowohl eine unbekannte Menge des zu analysierenden Anti
gens als auch markiertes Antigen desselben Typs enthält, in
Kontakt gebracht. Anschließend wird die Menge des markierten
Antigens, das an die feste Oberfläche gebunden hat,
bestimmt, womit indirekt die Menge des zu analysierenden
Antigens in der Probe ermittelt werden kann.
Da mit obigen und anderen Methoden, die unten noch disku
tiert werden, sowohl Antikörper als auch Antigene nachgewie
sen werden können, spricht man allgemein von immunchemischen
Ligand-Rezeptor-Assays oder einfacher Immunoassays.
Vorrichtungen für Festphasen-Immunoassays, ob vom Sandwich-
oder Konkurrenztyp, ermöglichen einen empfindlichen Nachweis
eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit wie Blut
oder Urin. Vorrichtungen für Festphasen-Immunoassays bein
halten einen festen Träger, an den entweder der Ligand oder
der Rezeptor des Ligand-Rezeptorpaars, üblicherweise ein
Antikörper, Antigen oder Hapten, gebunden wird. Die festen
Träger waren früher in Form von Platten, Rohren oder Perlen
aus Polystyrol, die vom Gebiet der Radioimmunoassays oder
Enzymimmunoassays her bekannt waren, ausgebildet. In den
letzten Jahren wurde eine Vielzahl von porösen Materialien
wie Nylon, Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Glasfasern und
andere poröse Polymere als Festphasen eingesetzt.
Es wurden bereits viele verschiedene Komplett-Kits für Immu
noassays beschrieben, die poröse Materialien als Festphasen
träger für immunchemische Komponenten wie Antigene, Haptene
oder Antikörper verwenden. Diese Kits sind für gewöhnlich so
konzipiert, daß sie auf Basis des Eintauchens, des Durch
flusses oder auf Basis der Migration arbeiten (dipstick
immunoassay, flowthrough immunoassay, migratory immuno
assays).
In den allgemeineren Formen von Tauchstabassays (typische
Beispiele sind Kits für Heimtests auf Schwangerschaft und
für Tests zum Nachweis eines Eisprungs) sind die immunolo
gisch aktiven Komponenten - wie z. B. Antikörper - an eine
feste Phase gebunden. Die Testanordnung wird zur Inkubation
in eine Probe "eingetaucht", die vermutlich einen unbekann
ten Antigen-Analyten enthält. Gleichzeitig, oder aber nach
einer Inkubationszeit, werden enzymmarkierte Antikörper hin
zugegeben. Als nächstes wird das gesamte System gewaschen
und dann in eine zweite Lösung gegeben, die ein Substrat für
das Enzym enthält. Falls der Enzymmarker vorhanden ist, bil
det er aus dem Substrat ein farbiges Produkt, das entweder
auf die feste Phase als Feststoff ausfällt oder einen sicht
baren Farbwechsel in der Substratlösung erzeugt. Baxter et
al., EP-A 01 25 118 offenbaren einen solchen Tauchstabim
munoassay vom Sandwichtyp. Kali et al., EP-A 02 82 192
offenbaren ein Eintauchstäbchen für die Anwendung in Assays
vom Konkurrenztyp.
Vorrichtungen für Durchflußimmunoassays wurden entwickelt,
um langandauernde Inkubationsschritte und lästige Wasch
schritte, wie sie bei Tauchstabassays auftreten, zu vermei
den. Valkirs et al., U.S. Patent Nr. 46 32 901, offenbaren
eine Vorrichtung, die Antikörper (spezifisch für einen Ziel
antigen-Analyten) enthält, die an eine poröse Membran oder
an einen porösen Filter gebunden sind, zu welchen eine flüs
sige Probe gegeben wird. Während die Flüssigkeit durch die
Membran fließt, bindet der Zielanalyt an den Antikörper. Der
Zugabe der Probe folgt eine Zugabe von markierten Antikör
pern. Der sichtbare Nachweis markierter Antikörper zeigt die
Anwesenheit von Zielantigen-Analyten in der Probe auf.
Korom et al., EP-A 02 99 359, offenbaren eine Variante für
die Durchfluß-Vorrichtung, bei der sich die markierten Anti
körper auf einer Membran befinden, die als Reagenzliefer
system fungiert.
Die Notwendigkeit von vielen Zugabeschritten und von Wasch
schritten bei Vorrichtungen für Tauchstabimmunoassays und
Durchflußimmunoassays erhöhen die Wahrscheinlichkeit, daß
wenig ausgebildetes Personal und Laien fehlerhafte Tester
gebnisse erhalten werden.
In Assays vom Migrationstyp wird eine Membran mit den Rea
genzien getränkt, die für die Durchführung des Assays unab
dingbar sind. Dabei ist eine Analyt-Nachweiszone vorgesehen,
auf der der markierte Analyt gebunden ist und der Assay ge
lesen wird. Siehe hierzu z. B. Tom et al., U.S. Patent Nr.
47 70 853 und Zuk, EP-A 01 43 574.
Die Empfindlichkeit eines Assays vom Migrationstyp wird
jedoch häufig durch die Anwesenheit oder die Bildung von
unerwünschten, festen Substanzen in der Probe verringert,
die den Fluß der markierten Analyten zu der Detektionszone
blockieren. Die Assay-Empfindlichkeit verringert sich auch,
wenn ein Assay vom Migrationstyp mit zuviel flüssiger Probe
überschwemmt wird.
Assays vom Migrationstyp beinhalten für gewöhnlich Reagen
zien, die an farbige Marker gebunden sind und damit einen
sichtbaren Nachweis ohne Zugabe weiterer Substanzen ermögli
chen. Siehe hierzu z. B. Bernstein U.S. Patent Nr.
47 70 853, May et al. WO 88/08 534 und Ching et al. EP-
A 02 99 428.
Derartige Marker sind unter anderem Goldsol-Partikel, wie
sie von Leuvering in U.S. Patent Nr. 43 13 734 beschrieben
wurden, Farbstoffsol-Partikel, wie sie von Gribnau et al. in
U.S. Patent Nr. 43 73 932 und May et al. WO 88/08 534
beschrieben wurden, angefärbtes Latex, wie es von May,
WO 88/98 534, Snyder EP-A 02 80 559 und 02 81 327 beschrieben
wurde, und Farbstoffe, die von Liposomen umhüllt sind, wie
von Campbell et al. U.S. Patent Nr. 47 03 017 beschrieben.
Diese farbigen Markierungssubstanzen sind im allgemeinen
durch die für den entsprechenden Fall geeigneten Immobilisa
tionsmethoden beschränkt. Darüber hinaus benötigen sie eine
ziemlich große Menge an Ligandmolekülen und können teure
Reagenzien notwendig machen, die dann die Kosten erhöhen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, vorteil
hafte Möglichkeiten zur Durchführung von Immunoassays zur
Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch
eine Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit eines Analyten
in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit gelöst, wobei
immunchemische Ligand-Rezeptor-Reaktionen und speziell
ausgewählte, speziell behandelte und speziell angeordnete
Filtermaterialien verwendet werden.
Genauer gesagt, die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die
Merkmale der Ansprüche 1, 21, 44 bzw. 52.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus
den Unteransprüchen.
Weitere Einzelheiten, Aspekte und Vorteile der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung
unter Bezugnahme auf die Zeichnung.
Es zeigt:
Fig. 1 einen Querschnitt durch eine typische einseitig
gerichtete Assayvorrichtung;
Fig. 2 einen Querschnitt durch eine zweite Ausführungsform
einer einseitig gerichteten Assayvorrichtung;
Fig. 3 einen Querschnitt durch eine typische zweiseitig
gerichtete Vorrichtung;
Fig. 4 eine perspektivische Darstellung einer Assayvorrich
tung, wie in Fig. 2 abgebildet (dargestellt in
gestrichtelten Phantomlinien), wobei die Vorrichtung
in eine Plastikhülle mit einer einzigen Öffnung ein
geschlossen ist;
Fig. 5 eine Draufsicht auf eine mehrseitig gerichtete
Assayvorrichtung; und
Fig. 6 eine perspektivische Darstellung einer Assayvorrich
tung, wie in Fig. 2 abgebildet (dargestellt in
gestrichelten Phantomlinien), wobei die Vorrichtung
in eine Plastikhülle mit zwei Öffnungen eingeschlos
sen ist.
In Bezugnahme auf Fig. 1 sind auf einem Grundgerüst 20 ein
Reservepolster 10, ein Filterelement 12 und eine Membran mit
Dochtwirkung 16 angeordnet, die eine immobilisierte Substanz
enthält, die auf einer Testanzeigezone 18 begrenzt ist. Das
Reservepolster 10 weist genügend Porösität und Volumen auf,
um eine flüssige Probe, mit der der Assay durchgeführt wer
den soll, aufzunehmen und zu speichern. Das Filterelement 12
ist angrenzend an und benachbart zu einer im Verhältnis zum
Volumen des Polsters 10 ziemlich kleinen Oberfläche des
Reservepolsters 10 angeordnet, um den Durchfluß der flüssi
gen Probe beim Austritt aus dem Reservepolster 10 in das
Filterelement 12 hinein zu dosieren.
Auf der definierten Zone 18 der Membran mit Dochtwirkung 16
befindet sich eine immobilisierte Substanz, die jeden spezi
fischen Ligand-Rezeptor-Komplex in der Probe binden kann,
wenn sie durch das Filterelement 12 fließt.
Bei dieser Ausführungsform wird ein Reagenz, das einen spe
zifischen Ligand-Rezeptor-Komplex bilden kann, zur Probe
gegeben, wo es reagiert, um den Komplex zu bilden (in der
Annahme, daß die Probe den passenden Analyten enthält); dar
aufhin wird die Probe mit dem Reservepolster 10 in Kontakt
gebracht. Anschließend fließt die Probe durch das Filterele
ment 12, wo alle unerwünschten Komponenten, die in der Probe
vorhanden sein könnten, abgefangen werden, und weiter in die
Membran mit Dochtwirkung 16. Falls sich der markierte Analyt
in der Probe befindet, bindet er an die Testanzeigezone 18
und erzeugt damit ein mit dem Auge sichtbar nachweisbares
Signal.
In der Ausführungform, wie in Fig. 2 gezeigt, befindet sich
auf dem Grundgerüst 20 ein zweites Filterelement 14, zusätz
lich zum Reservepolster 10, zum Filterelement 12 und zur
Membran mit Dochtwirkung 16. Das Reservepolster 10 weist
genügend Porosität und Volumen auf, um eine flüssige Probe,
mit der der Assay durchgeführt werden soll, aufzunehmen und
zu halten. Das erste Filterelement 12 ist angrenzend an und
benachbart zu einer im Verhältnis zum Volumen des Polsters
10 ziemlich kleinen Oberfläche des Reservepolsters 10 ange
ordnet, um den Durchfluß der flüssigen Probe beim Austritt
aus dem Reservepolster 10 in das erste Filterelement 12 hin
ein zu dosieren. Bei dieser Ausführungsform ist das erste
Filterelement 12 gleichmäßig mit einem Reagenz getränkt, das
einen spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex bilden kann. Wäh
rend die flüssige Probe aus dem Reservepolster 10 austritt,
kommt sie mit dem Reagenz in Kontakt, womit das erste Fil
terelement 12 getränkt ist; damit findet auf dem ersten Fil
terelement 12 die Reaktion statt, bei der ein spezifischer
Ligand-Rezeptor-Komplex oder spezifische Ligand-Rezeptor-
Komplexe gebildet werden (in der Annahme, daß die Probe den
passenden Analyten oder die passenden Analyten enthält). Die
Verwendung des ersten Filterelements als Reagenzliefersystem
ermöglicht es, auf eine separate Reagenzzugabe zu verzich
ten.
Das zweite Filterelement 14, das an das erste Filterelement
12 angrenzt und von Reservepolster 10 entfernt angeordnet
ist, ist in der Lage, jegliche spezifische Ligand-Rezeptor-
Komplexe, die in der flüssigen Probe enthalten sind oder
gebildet wurden, durchzulassen, aber darin enthaltene
größere Substanzen am Durchfluß zu hindern, welche in der
ursprünglichen Probe bereits enthalten waren oder später
gebildet wurden, z. B. im ersten Filterelement.
Die Membran mit Dochtwirkung 16 grenzt an das zweite Filter
element 14 an und ist vom ersten Filterelement 12 entfernt
angeordnet. Die Membran mit Dochtwirkung 16 weist genügend
Porosität und Volumen auf, um einen Großteil der Probe zu
absorbieren, die nach dem Durchfluß durch das erste Filter
element 12 und durch das zweite Filterelement 14 auf das
Reservepolster 10 gelangt ist.
Auf der definierten Zone 18 der Membran mit Dochtwirkung 16
befindet sich eine immobilisierte Substanz, die jeglichen
spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex zu binden vermag, der
in der Probe gebildet worden ist bzw. in der Probe enthalten
war, die durch das erste Filterelement 12 und das zweite
Filterelement 14 geflossen ist.
Im Gebrauch wird eine flüssige Probe auf das Reservepolster
10 der in Fig. 2 dargestellten Vorrichtung gegeben. Die
Probe fließt durch das erste Filterelement 12, wo der Ziel
analyt an die markierten Reagenzien bindet, falls der Ziel
analyt sich in der Probe befindet. Die Probe fließt weiter
durch das zweite Filterelement 14, wo jegliche unerwünschte
Komponenten, die sich in der Probe befinden können, abgefan
gen werden, und schließlich auf die Membran mit Dochtwirkung
16. Ist der markierte Analyt vorhanden, bindet er an die
Testanzeigezone 18 und bildet ein mit dem Auge sichtbar
nachweisbares Signal.
Des weiteren können "Immunstatus-Assays" durchgeführt wer
den, indem auf das zweite Filterelement 14 der in Fig. 2
dargestellten Vorrichtung eine Probe gegeben wird. Auf das
Reservepolster 10 wird dann eine Pufferlösung gegeben und
die Lösung wandert durch das erste Filterelement 12, wo wie
der markierte Reagenzien gebildet werden. Die Lösung und die
Reagenzien wandern durch das zweite Filterelement 14, wo der
Zielanalyt - falls vorhanden - an die markierten Reagenzien
bindet, und dann weiter auf die Membran mit Dochtwirkung 16.
Der markierte Analyt - falls vorhanden - bindet dann an die
Testanzeigezone 18 und erzeugt ein mit dem Auge sichtbar
nachweisbares Signal.
In Bezugnahme auf Fig. 3 befinden sich auf dem Grundgerüst
120 ein gemeinsames Reservepolster 110, erste Filterelemente
112A und 112B, zweite Filterelemente 114A und 114B und Mem
branen mit Dochtwirkung 116A und 116B, die auf den definier
ten Testanzeigezonen 118A und 118B immobilisierte Substanzen
tragen. Das gemeinsame Reservepolster 110 weist genügend
Porosität und Volumen auf, um eine flüssige Probe, mit der
der Assay durchgeführt werden soll, aufzunehmen und zu spei
chern. Die ersten Filterelemente 112A und 112B sind angren
zend an und benachbart zu einer im Verhältnis zum Volumen
des Posters 110 ziemlich kleinen Oberfläche des gemeinsamen
Reservepolsters 110 angeordnet, um den Durchfluß der flüssi
gen Probe vom Reservepolster 110 zu den ersten Filterelemen
ten 112A und 112B zu dosieren. Die ersten Filterelemente
112A und 112B sind gleichmäßig mit einem Reagenz getränkt,
das einen spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex bilden kann.
Die zweiten Filterelemente 114A und 114B grenzen jeweils an
die ersten Filterelemente 112A und 112B an, sind vom gemein
samen Reservepolster 110 entfernt angeordnet und sind in der
Lage, jeden spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex, der in der
flüssigen Probe gebildet wurde, durchzulassen, aber größere
Substanzen, die sich in der Probe befinden, am Durchfluß zu
hindern. Die Membranen mit Dochtwirkung 116A und 116B weisen
genügend Porosität und Volumen auf, um einen Großteil der
Probe vom gemeinsamen Reservepolster 110 zu absorbieren. Die
immobilisierte Substanz auf den Zonen 118A und 118B kann
jeden gebildeten, spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex bin
den.
Im Gebrauch wird eine flüssige Probe auf das gemeinsame
Reservepolster 110 gegeben; die Probe wandert durch die
ersten Filterelemente 112A und 112B, wo die Zielanalyten -
falls in der Probe vorhanden - an die markierten Reagenzien
binden, womit sie getränkt sind, wandert durch die zweiten
Filterelemente 114A und 114B, wo jegliche unerwünschten Sub
stanzen der flüssigen Probe abgefangen werden, und wandert
weiter auf die Membranen mit Dochtwirkung 116A und 116B.
Falls markierte Zielanalyten vorhanden sind, binden sie an
die Testanzeigezonen 118A und 118B. Damit erlaubt die Aus
führungsform der Fig. 3 einen gleichzeitigen und unabhängi
gen Assay für zwei Analyten oder erlaubt zwei parallele
Assays für denselben Analyten, wobei in jedem Fall nur eine
einzige Probe benötigt wird.
In Bezugnahme auf Fig. 4 ist eine Assayvorrichtung, wie sie
in Fig. 2 dargestellt ist, von einem Gehäuse 222 umgeben.
Das Gehäuse 222 weist eine Öffnung 224 auf, die sich direkt
über dem Reservepolster 210 befindet und weist außerdem ein
Klarsichtfenster 226 auf, das sich direkt über der Testan
zeigezone 218 und der Testkontrollanzeigezone 228 befindet.
Das Fenster 226 kann eine einfache Öffnung sein, kann aber
auch aus einem durchsichtigen Material bestehen, das die
Zonen 218 und 228 schützt, aber zugleich Einsicht gewährt.
Die flüssige Probe wird durch die Öffnung 224 gegeben und
vom Reservepolster 210 absorbiert. Sie wandert dann durch
das erste Filterelement 212, das geeignete, markierte Rea
genzien enthält, wandert durch das zweite Filterelement 214,
wo alle unerwünschten Substanzen aus der Probe zurückgehal
ten werden und schließlich auf die Membran mit Dochtwirkung
216, wo der markierte Analyt - falls vorhanden - an die
Testanzeigezone 218 bindet. Die ungebundenen, markierten
Reagenzien binden an die Testkontrollanzeigezone 228. Beide
Anzeigezonen 218 und 228 können durch das Fenster 226
betrachtet werden.
In Bezugnahme auf Fig. 5 wird Grundgerüst 320, das aus
feuchtigkeitsunempfindlichem Material wie Kunststoff herge
stellt ist, durch Unterteiler 322 in eine Vielzahl von glei
chen Segmenten 311A, 311B, 311C, 311D, 311E und 311F einge
teilt. Jedes Segment enthält ein erstes Filterelement 312,
ein zweites Filterelement 314 und eine Membran mit Dochtwir
kung 316, wobei alle auf dem Grundgerüst 320 zwischen den
Unterteilern 322 angeordnet sind. Dasselbe oder verschiedene
Reagenzien können auf jedes erste Filterelement 312 aufge
tragen werden, was entweder Parallelassays in Bezug auf den
selben Analyten, oder eine Vielzahl von verschiedenen Assays
in Bezug auf dieselbe Probe erlaubt. Jede Membran mit Docht
wirkung 316 enthält eine immobilisierte Substanz, die auf
die definierte Testanzeigezone 318 aufgebracht wird und zum
Reagenz im ersten Filterelement paßt, das mit dessen ent
sprechender Membran mit Dochtwirkung verbunden ist. Das
gemeinsame Reservepolster 310, auf dem sich die Probe befin
det, ist in Bezug auf die Segmente im Zentrum angeordnet.
Im Gebrauch fließt eine auf dem Reservepolster 310 befindli
che flüssige Probe gleichzeitig durch das erste Filterele
ment 312, wo der Zielanalyt - falls vorhanden - an markierte
Antikörper bindet. Die Probe fließt dann durch das zweite
Filterelement 314 und auf die Membranen mit Dochtwirkung
316, wo markierte Zielanalyten - falls vorhanden - an die
entsprechende immobilisierte Substanz auf der Testanzeige
zone 318 binden, womit ein mit dem Auge sichtbar nachweisba
res Signal erzeugt wird.
Die Ausführungsform aus Fig. 6 kann für "Immunostatus-
Assays" verwendet werden. Eine Fig. 2 entsprechende Assay
vorrichtung ist in eine Hülle 522 eingeschlossen. Die Hülle
522 weist eine erste Öffnung 524 auf, die sich direkt über
dem Reservepolster 510 befindet, weist eine zweite Öffnung
530 auf, die sich direkt über dem zweiten Filterelement
befindet, und weist ein Klarsichtfenster 526 auf, das sich
direkt über der Testanzeigezone 518 und der Testkontrollan
zeigezone 528 befindet.
Das Fenster 526 kann eine einfache Öffnung, kann aber auch
aus einem Material sein, das die Zonen 518 und 528 schützt,
aber dennoch Einblick gewährt. Im Gebrauch wird eine Probe
(z. B. ein Serum) direkt durch die zweite Öffnung 530 auf
das zweite Filterelement 514 gegeben. Auf das Reservepolster
510 wird dann durch die erste Öffnung 524 eine Pufferlösung
gegeben; die Lösung fließt durch das erste Filterelement
512, wo markierte Reagenzien gebildet werden. Die Lösung und
die Reagenzien wandern durch das zweite Filterelement 513,
wo Zielanalyten - falls vorhanden - an die markierten
Reagenzien binden, und schließlich auf die Membran mit
Dochtwirkung 516. Falls der markierte Analyt vorhanden ist,
bindet er dort an die Testanzeigezone 516 und erzeugt ein
mit dem Auge sichtbar nachweisbares Signal. Die ungebun
denen, markierten Reagenzien binden an die Testkontrollan
zeigezone 528. Beide Anzeigezonen 518 und 528 können durch
das Fenster 526 betrachtet werden.
Bei allen Ausführungsformen grenzen die Filterelemente und
Polster aneinander, bzw. überlappen sich, um die Flußrich
tung der Probe über die Berührungsstellen vorzubestimmen. Es
hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Membran mit
Dochtwirkung ein großes Fläche-Dicke-Verhältnis aufweist,
wogegen das Filterelement, das daran angrenzt, ein verhält
nismäßig kleines Fläche-Dicke-Verhältnis aufweisen sollte.
Es ist daher von Vorteil, das angrenzende Filterelement mit
der Membran mit Dochtwirkung zu überlappen, damit eine aus
reichende Berührung gewährleistet ist.
Man kann eine - im Vergleich zu älteren Assays vom Migra
tionstyp - Erhöhung der Empfindlichkeit erreichen, indem
wenigstens ein Filterelement vor der Testanzeigezone ange
ordnet wird. Das Filter, das vorzugsweise so behandelt
wurde, daß jegliche anhaftende Hydrophobizität verringert
wird, fängt unerwünschte Komponenten aus der flüssigen Probe
ab und läßt den markierten Analyten ungehindert durch
fließen. Daher bindet eine verhältnismäßig große Menge Ana
lyt an die Testanzeigezone, wodurch sicherere Testergebnisse
erhalten werden.
Darüber hinaus kann das zweite Filterelement als ein kontrol
liertes System zur Lyse von Zellen fungieren, indem eine
Membran mit entsprechender Struktur und Porengröße ausge
wählt wird. So ist es beispielsweise in einem "Immunostatus-
Assay" für eine Probe aus Vollblut von Vorteil, ein zweites
Filterelement zu wählen, das die Unversehrtheit der Voll
blutzellen gewährleistet, während Serum durch sie hindurch
fließt. Dies verhindert, daß sich die Verfärbung, die bei
Blutzellenlyse auftritt, auf die Testanzeigezone ausbreitet.
Wenn die Vorrichtung dazu benutzt wird, einen "Immunstatus-
Assay" durchzuführen, kann dieses zusätzliche Filterelement
auch dazu dienen, die Probe direkt aufzunehmen. Im allgemei
nen werden solche Assays mit Proben aus Vollblut oder Serum
durchgeführt, die direkt auf das Filter gegeben werden.
Anschließend wird eine Pufferlösung auf das Reservepolster
aufgetragen. Typische Pufferlösungen sind unter anderem eine
Phosphatpufferlösung, physiologische Kochsalz Lösung, Tris-
HCl und Wasser. Beispiele für Antikörper, die auf diese
Weise nachgewiesen werden können, sind unter anderem solche,
die in Zusammenhang mit AIDS, Röteln, Hepatitis und
Lymphozyt-Erkrankungen stehen.
Eine andere Fehlerquelle, die die Testempfindlichkeit ver
schlechtert, nämlich das Überschwemmen mit Probe, wird auch
dadurch vermieden, daß sich das Reservepolster auf der Vor
richtung befindet. Das Reservepolster kann nämlich einen
Großteil der Probe speichern, die dann durch die Vorrichtung
hindurch dosiert wird, was ein Ergebnis der wirksamen Berüh
rungsstellen zwischen den folgenden Zonen ist. Dieser Aspekt
der Erfindung macht sie beispielsweise besonders für Laien
geeignet, die die Vorrichtung einfach in einen Urinstrom
halten können, ohne eine bestimmte Menge der Probe, die der
Vorrichtung verabreicht werden soll, abmessen zu müssen.
Das Reservepolster, das erste Filterelement, das zweite Fil
terelement und die Membran mit Dochtwirkung können aus allen
möglichen Filtermaterialien hergestellt werden. Typische
Filtermaterialien für Reservepolster sind unter anderem
Materialien, die niedermolekulare Proteine zu binden vermö
gen, wie z. B. Zellulose, Polyester, Polyurethane und Fiber
glas mit einer Porengröße von 0,45-60 µm. Typische Mate
rialien für das erste Filterelement sind unter anderem Zel
lulosematerialien (z. B. Whatman Papier ET31) oder Fiberglas
mit einer Porengröße von 0,45-60 µm. Typische Materialien
für das zweite Filterelement sind hydrophile Materialien,
die unter anderem Polyurethane, Polyacetat, Zellulose,
Fiberglas und Nylon mit einer Porengröße von 0,45-60 µm
sein können, sind aber nicht darauf beschränkt. Typische
Materialien für die Membran mit Dochtwirkung sind unter
anderem Nylon, Zellulose, ein Polysulfon, Polyvinyliden
difluorid, Zelluloseacetat, ein Polyurethan, Fiberglas und
Nitrozellulose.
Die gesamte Anordnung aus Polstern und Membranen ist auf
einem festen Material befestigt, das als Unterlage dient und
ermöglicht, daß die Vorrichtung ein Ganzes ist. Diese Unter
lage kann aus einer dünnen Platte aus Glas oder Kunststoff
sein, die auf eine passende Größe zugeschnitten wird, damit
alle Testbestandteile darauf Platz haben, während sie auch
dem Assay-Anwender Annehmlichkeit bietet.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
erlaubt den Nachweis von vielen Analyten in einer einzigen
flüssigen Probe, indem sich auf der Vorrichtung mehr als ein
Typ von markierten Reagenzien und dieselbe Zahl an verschie
denen, immobilisierten Reagenzien befinden. Die Vorrichtung
kann unidirektional betrieben werden, indem eine Vielzahl
markierter Reagenzien, womit ein erstes Filterelement
getränkt wird, und eine Vielzahl entsprechender, immobili
sierter Substanzen verwendet wird, die auf mehreren Testan
zeigezonen auf der Membran mit Dochtwirkung definiert sind.
Bei der bidirektionalen oder multidirektionalen Ausführungs
form sind mehr als ein Satz an Komponenten, wie das erste
Filterelement, das zweite Filterelement und die Membran mit
Dochtwirkung, mit einer gemeinsamen Reservoir-Vorrichtung
verbunden.
Die Reagenzien auf dem ersten Filterelement sind in jedem
Fall auf das Element hinauf oder in das Element hinein gege
ben und getrocknet oder gefriergetrocknet worden, um sie
über den Kontakt mit einer flüssigen Probe wieder zu akti
vieren. Andere Reagenzien, die die Spezifität oder die Menge
von gebildeten und gebundenen Ligand-Rezeptor-Komplexen
erhöhen können und damit die Empfindlichkeit der Testvor
richtung steigern können, können sich auch auf dem Filter
polster oder aber auf dem ersten von zwei Filterpolstern,
die auch das Reagenz enthalten, befinden. Diese Hilfsreagen
zien sind unter anderem Puffer, Detergenzien und Antikoagu
lanzien.
Dadurch, daß eine zusätzliche Testanzeigezone, die an die
erste Zone angrenzt und entfernt vom zweiten Filterelement
angeordnet ist, auf der Membran mit Dochtwirkung zur Kon
trolle eingerichtet ist, stellt die Testvorrichtung ein
internes Kontrollorgan dar, das anzeigt, ob die flüssige
Probe durch die ganze Vorrichtung hindurch gewandert ist.
Die Testkontrollanzeigezonen enthalten im allgemeinen immo
bilisierte Antikörper (wie Anti-Immunoglobuline) für die
markierten Reagenzien, die zum Analyten hinzugegeben wurden,
oder aber auf das erste Filterelement gegeben wurden. In
Bezugnahme auf die Ausführungsform der Fig. 2 wandert bei
spielsweise eine flüssige Probe durch das erste Filterele
ment, wo sie das markierte Reagenz wieder aktiviert und es
zur Membran mit Dochtwirkung trägt. Das markierte Reagenz,
das nicht an den Zielanalyten gebunden hat, bindet an die
Testkontrollanzeigezone, wo es eine mit dem Auge sichtbar
nachweisbare Anzeige erzeugt, wann der Test beendet ist.
Die gesamte Testvorrichtung, ob sie nun unidirektional,
bidirektional oder multidirektional konstruiert ist, kann
von einem flüssigkeits-undurchlässigen Kunststoff umhüllt
sein. Diese Hülle hat normalerweise über dem Reservoirfilter
eine Öffnung, damit Probe aufgegeben werden kann. Die ganze
Hülle kann transparent sein, oder aber nur der Teil über der
Analyt-Nachweiszone ist durchsichtig, um das Assayergebnis
beobachten zu können. Die Vorrichtungen, die von Kunststoff
umhüllt sind, sind besonders geeignet und angenehm für die
Anwendung in Heimdiagnostik-Kits, aber es können auch andere
Materialien wie behandeltes Papier verwendet werden.
Zusätzlich kann die obere Oberfläche, die die Öffnung
umgibt, nach unten sich ausdehnend gebogen sein, so daß ein
schalengleiches Aufnahmegefäß gebildet wird, das an einem
Teil des Reservepolsters endet und fest mit ihm verbunden
ist. Dadurch kann die Menge an Probe, die in die Vorrichtung
gegeben wird, dosiert werden, und die Probe kann keine
Bestandteile der Vorrichtung umgehen.
Die vorliegende Erfindung kann in Assays sowohl vom Konkur
renztyp als auch vom Sandwichtyp eingesetzt werden. Bei
Assays vom Konkurrenztyp wird ein zusätzliches, markiertes
Antigen (das dasselbe wie das Zielantigen ist) entweder
getrennt oder als Teil des ersten Filterelements aufgetra
gen. Dieses markierte Antigen konkurriert mit dem Proben
antigen um die Bindung an die Nachweiszone.
Die Diagnostikvorrichtungen und Diagnostikmethoden, die in
der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, können bei
allen Ligand-Rezeptor-Reaktionen eingesetzt werden und sind
besonders für solche Reaktionen geeignet, die immunchemisch
aktive Komponenten wie Antikörper, Antigene und Haptene
beinhalten. In solchen Assays, bei denen der Nachweis von
Ligand-bindenden Molekülen, wie Antigene oder Haptene,
gewünscht wird, ist sowohl das markierte Reagenz als auch
die auf der Testanzeigezone immobilisierte Substanz ein
Molekül, das Liganden binden kann. Im spezielleren Fall,
wenn die Liganden Antigene sind, ist sowohl das markierte
Reagenz als auch das immobilisierte Reagenz ein Antikörper.
Die Antikörper können sowohl monoklonal als auch polyklonal
sein; deren Herstellungsverfahren sind Stand der Technik.
Bevorzugterweise verwendet man auf dem ersten Filterelement
markierte monoklonale Antikörper und auf der Testanzeigezone
polyklonale Antikörper, um maximale Anbindung zu erreichen
Es kann jedoch jede Kombination aus monoklonalen und poly
klonalen Antikörpern verwendet werden. Im Falle von Heimkits
zum Test auf Schwangerschaft und zur Vorhersage eines
Eisprungs werden Antikörper gegen menschliches Choriogona
tropin bzw. gegen Gelbkörperbildungshormone hergestellt und
auf die Vorrichtung aufgebracht.
Bei solchen Beispielen, bei denen der Nachweis von Ligand-
bindenden Molekülen wie von Antikörpern gewünscht wird, wird
markiertes Anti-Human-Immunoglobulin G aus Mäusen als
Reagenz eingesetzt, das, wie oben angeführt wurde, auf das
erste Filterelement gegeben werden kann, und das Antigen,
das spezifisch für den Zielantikörper ist, wird auf der
Testanzeigezone immobilisiert. Jedes natürliche oder synthe
tische Antigen kann eingesetzt werden, genauso wie
Polypeptidketten, die Antigenaktivität aufweisen. Beispiele
für Antigene, die auf der Vorrichtung immobilisiert werden
können, stehen unter anderem im Zusammenhang mit Röteln,
Lymphozyt-Erkrankungen, AIDS, Hepatitis, Toxoplasmose, dem
Zytomegalievirus und dem Epstein Barr Virus.
In Tests, wo in einer einzelnen Probe der gleichzeitige
Nachweis von mehr als einem Antikörper gewünscht wird, da
das gleiche markierte Anti-Human-Immunoglobulin (Reagenz)
alle menschlichen Antikörper, die in der Probe vorhanden
sind, erkennt und bindet, ist es nur notwendig, Antigene für
jeden Zielantikörper auf verschiedene Anzeigezonen auf der
Membran mit Dochtwirung zu geben.
Die auf der Vorrichtung eingesetzten Marker können entweder
direkt oder indirekt sein. Direkte Marker sind deshalb
bevorzugt, da sie keine zusätzlichen Schritte erforderlich
machen, um Testergebnisse sichtbar zu machen. Beispiele für
direkte Marker sind unter anderem Metallsole, Farbstoffsole,
Latexpartikel, Farbindikatoren, farbige Stoffe, die sich in
Liposomen befinden, und Nichtmetallsole wie ein Kohlenstoff
sol.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen immun
chemisch aktiven Marker, der besonders für die Anwendung in
der oben angeführten Vorrichtung geeignet ist, aber auch in
anderen immunchemischen Test verwendet werden kann, und im
besonderen einen immunchemisch aktiven Marker, bei dem ein
inmunologisch aktiver Ligand oder Ligand-bindende Moleküle
direkt oder indirekt auf die Oberfläche von feinen Kohlen
stoffstaubpartikeln gebunden werden.
Der immunologisch aktive Marker kann schematisch beschrieben
werden als C∼L oder C∼X : L, wobei C der feine Kohlenstoff
staubpartikel ist, "∼" eine adsorbtive Bindung repräsen
tiert, L eine Komponente ist, die eine Ligandeinheit oder
eine Ligand-bindende Einheit darstellt, X ein Bindungsagens
ist und ":" eine kovalente Bindung repräsentiert.
L kann aus lediglich der Ligandeinheit oder der Ligand-bin
denden Einheit bestehen, wobei sie in diesen Fällen direkt
auf den Kohlenstoff adsorbiert wird. Alternativ kann die
Ligandeinheit oder Ligand-bindende Einheit entweder kovalent
oder immunologisch (hier ausgedrückt durch "") an ein
Brückenglied gebunden sein. Zum Beispiel kann die Ligandein
heit oder Ligand-bindende Einheit kovalent an ein Kupplungs
agens - wie Glutaraldehyd - gebunden sein, das selber kova
lent an ein Proteinbrückenglied - wie Rinderserumalbumin
(BSA) - gebunden ist, das wiederum auf dem Kohlenstoff
adsorbiert ist. Gleichfalls kann Avidin oder Streptoavidin
über Biotin an das Ligandmolekül oder Ligand-bindende Mole
kül gebunden sein, und das Avidin oder Streptoavidin auf den
Kohlenstoffpartikeln adsorbiert sein. Alternativ wird ein
Primär-Antikörper, der als Ligandeinheit oder Ligand-
bindende Einheit dient, immunologisch an einen Sekundär-
Antikörper gebunden, und der Sekundär-Antikörper ist auf die
Kohlenstoffpartikel adsorbiert. Typische Strukturen der C∼L-
Ausführung beinhalten daher:
C∼(Ligand),
C∼(Ligand-bindendes Molekül),
C∼(Protein : X : Ligand),
C∼(Protein : X : Ligand-bindendes Molekül),
C∼(2 · Ak1)1 · Ak1)), und
C∼(Protein : X : 2 · Ak1)1 · Ak1)).
C∼(Ligand-bindendes Molekül),
C∼(Protein : X : Ligand),
C∼(Protein : X : Ligand-bindendes Molekül),
C∼(2 · Ak1)1 · Ak1)), und
C∼(Protein : X : 2 · Ak1)1 · Ak1)).
¹) Anmerkung des Übersetzers:
1 · Ak=Primär-Antikörper
2 · Ak=Sekundär-Antikörper
1 · Ak=Primär-Antikörper
2 · Ak=Sekundär-Antikörper
In einer zweiten Ausführungsform wird ein Brückenagens Y
sowohl auf den Kohlenstoffpartikel adsorbiert als auch kova
lent an die Ligandeinheit oder Ligand-bindende Einheit
gebunden, um einen Marker mit dem allgemeinen Formelausdruck
C∼Y : L. zu bilden. Das Brückenagens Y kann - wie unten voll
ständiger diskutiert wird - eine einzelne molekulare Spezies
Y′ sein oder kann eine Zusammensetzung sein, wie Brücken
agens : Protein : Brückenagens:
C∼Y′: (Ligand),
C∼Y′: (Ligand-bindendes Molekül),
C∼Y′: Protein : X : (Ligand), und
C∼Y′: Protein : X : (Ligand-bindendes Molekül).
C∼Y′: (Ligand-bindendes Molekül),
C∼Y′: Protein : X : (Ligand), und
C∼Y′: Protein : X : (Ligand-bindendes Molekül).
Es soll angemerkt werden, daß der prinzipielle Unterschied
zwischen den beiden Ausführungsformen der ist, daß in der
ersten Ausführungsform ein Ligand, ein Ligand-bindendes
Molekül oder Protein (wie ein Antikörper, Rinderserumalbumin
oder Avidin) auf Kohlenstoffpartikeln adsorbiert sind, woge
gen in der zweiten Ausführungsform eine Verbindung einer
speziellen Klasse organischer Verbindungen, das als Brücken
agens dient, auf den Kohlenstoffpartikeln adsorbiert ist und
kovalent an einen Liganden, an ein Ligand-bindendes Molekül
oder ein Protein gebunden ist.
Die oben erwähnten Kohlenstoffsole können durch eine Viel
zahl von Verfahren hergestellt werden. Der Ligand und die
Ligand-bindenden Moleküle können einfach zu einer Suspension
der Kohlenstoffpartikel gegeben werden, um Strukturen der
Art C∼(Ligand) und C∼(Ligand-bindendes Molekül) zu bilden.
In Beispielen, bei denen der Ligand oder das Ligand-bindende
Molekül indirekt gebunden sind, kann die gesamte Nicht-Koh
lenstoffpartikel-Struktur - wie (Protein : X : Ligand), (Pro
tein : X : Ligand-bindendes Molekül), (2 · Ab1 · Ab) oder (Pro
tein : X : 2 · Ab1 · Ab) - hergestellt und dann zu einer Suspension
der Kohlenstoffpartikel zur Adsorbtion gegeben werden.
Alternativ kann ein Endteil der Nicht-Kohlenstoffpartikel-
Struktur zuerst an die Kohlenstoffpartikel adsorbiert wer
den, und der Rest der Nicht-Kohlenstoffpartikel-Struktur
kann dann chemisch eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein
Protein - wie Rinderserumalbumin, Avidin oder Strepto
avidin - auf den Kohlenstoffpartikeln adsorbiert und dann an
den Liganden oder das Ligand-bindende Molekül gebunden wer
den, indem zum Beispiel Glutaraldehyd für Rinderserumalbumin
oder Biotin für Avidin oder Streptoavidin verwendet wird.
Auf ähnliche Weise kann ein 2Antikörper auf den
Kohlenstoffpartikeln adsorbiert werden und ein 1Antikörper
dann immunologisch angegliedert werden.
Brückenreagenzien Y′, die für kovalent-bindende Liganden und
Ligand-bindende Moleküle, wie Haptene, Antigene oder Anti
körper, oder für kovalent-bindende Proteinbrückengruppen
geeignet sind, sind unter anderem Immide, Azide, Isothio
cyanate, Imidoester und Dialdehyde wie z. B. Maleimid,
Succinimid, Phenylazid, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimido
ester, Phenylisothiocyanat, 4,4′-Diisothiocyanostilben-2,2′-
disulfonsäure, 4-N,N-Dimethylaminazobenzol-4′-Isothiocyanat,
Flourescein-Isothiocyanat, Rhodaminisothiocyanat oder ähnli
che.
Wie im Falle der ersten Ausführungsform kann die gesamte
Nicht-Kohlenstoffpartikel-Struktur, die durch Reaktion des
Liganden (oder des Ligand-bindenden Moleküls), eines jeden
Brückenproteins und eines jeden Brückenagens hergestellt
wird, auf der Oberfläche des feinen Kohlenstoffstaubparti
kels adsorbiert werden. Alternativ kann das Brückenreagenz
zuerst allein auf dem feinen Kohlenstoffstaubpartikel adsor
biert werden und dann kovalent an den Liganden, das Ligand-
bindende Molekül und/oder das Brückenprotein gebunden wer
den.
In jedem der obigen Verfahren ist es im allgemeinen wün
schenswert, einen Suspensions-Hilfsstoff, wie zum Beispiel
ein Polyalkylenglykol oder ein Polysaccharid, zur wäßrigen
Suspension der feinen Kohlenstoffstaubpartikel zu geben. Wie
unten ersichtlich wird, werden nach der Bindung des immuno
logisch aktiven Liganden oder des Ligand-bindenden Moleküls
an die feinen Kohlenstoffstaubpartikel ähnliche Substanzen
als Schutzagens hinzugefügt. Die Menge, die auf dieser Stufe
zugegeben wird, ist daher relativ klein, im allgemeinen nur
so groß, daß sie ausreicht, um in der Suspension der Kohlen
stoffpartikel wirksam zu werden.
Das Bindungsreagenz läßt man dann - entweder gleichzeitig
oder hintereinander - sowohl
- (i) mit dem immunologisch aktiven Liganden oder mit den Ligand-bindenden Molekülen kovalent reagieren, als auch
- (ii) auf feine Kohlenstoffstaubpartikeln adsorbieren.
Da es von dem speziellen Brückenreagenz abhängt, wird die
Bindungsreaktion im allgemeinen über mehrere Stunden bei pH-
Werten von ungefähr 7,0 bis ungefähr 9,5 durchgeführt.
Eine Vielzahl von im Handel erhältlichen feinen Kohlenstoff
staubpartikel-Materialien kann verwendet werden, wie z. B.
Monarch 1000, 120, oder 880, Vulcan XC72 oder XC72R, oder
Regal 250R oder 500R. Die Eignung jeder speziellen Quelle
kann leicht bestimmt werden, indem das Material in einem
Puffer homogenisiert und die optische Dichte gemessen wird.
Der feine Kohlenstoffstaubpartikel mit dem Liganden oder dem
Ligand-bindenden Molekül - die kovalent oder passiv gebunden
sind - wird bevorzugt mit einem Polyalkylenglykol oder einem
Polysaccharid-Schutzagens behandelt, um die Hydrophobizität
zu minimieren und die Fähigkeit zur Dispersion zu maximie
ren. Geeignete Materialien für einen derartigen Überzug sind
Polyethylenglykole, die ein Molekulargewicht von ungefähr
100 bis ungefähr 20 000 - bevorzugt von ungefähr 5000 bis
ungefähr 12 000 - aufweisen, und Schutz-Polysaccharide wie
Dextran, die ein Molekulargewicht von ungefähr 10 000 bis
ungefähr 500 000 - bevorzugt von ungefähr 10 000 bis ungefähr
50 000 - aufweisen. Dieser Überzug kann leicht dadurch
erreicht werden, daß der gebundene Kohlenstoffstaub mit
einer 0,5% bis 5% ä bezüglich Gewicht/Volumen - wäßrigen
Lösung des Polyethylenglykols oder Dextrans in Kontakt
gebracht wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird der immunologisch
aktive Marker mit wenigstens einem biologisch verträglichen
ionischen oder nicht-ionischen Tensid, wie mit einem lang
kettigen Alkyltrimethylammonium-Salz, Natriumdeoxicholat,
Tritons, Tweens, usw. in einem Konzentrationsbereich von
ungefähr 0,01 bis ungefähr 0,5% behandelt. Nach jeder sol
chen Behandlung, von denen es mehrere mit demselben oder mit
verschiedenen Typen von Detergenzien geben kann, wird der
immunologisch aktive Marker gewaschen, um überschüssiges
Detergenz zu entfernen.
Der erhaltene immunologisch aktive Marker kann dann in ein
wäßriges Medium suspendiert werden. Solche wäßrigen Suspen
sionen des immunologisch aktiven Markers sind besonders
geeignet zur Herstellung von Immunoassayvorrichtungen,
sowohl von solchen der vorliegenden Erfindung als auch von
solchen anderer Aufbauarten. Die wäßrige Suspension beinhal
tet bevorzugt wenigstens einen Puffer, um einen pKs zu
erhalten, bei dem der markierte immunologisch aktive Ligand
oder das Ligand-bindende Molekül stabil ist; zum Beispiel
innerhalb des Bereichs von ungefähr 6 bis ungefähr 9 und
bevorzugt von ungefähr 6,5 bis ungefähr 8,5.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung
weiter verdeutlichen.
Die Empfindlichkeiten werden in den folgenden Beispielen
bestimmt, indem Standardlösungen hergestellt werden, die
menschliches Choriogonatropin in Konzentrationen von
25 mIU/ml, 50 mIU/ml, 75 mIU/ml und 100 mIU/ml enthalten.
Die Proben (0,15 bis 0,20 ml) des Standards werden auf die
Testvorrichtung gegeben und die Empfindlichkeit bestimmt,
indem die Fähigkeit der Vorrichtung genutzt wird, eine gege
bene Konzenration an menschlichem Choriogonatropin nachzu
weisen.
Goldsolpartikel werden in 750 ml destilliertem Wasser aufge
löst, das dann zum Sieden gebracht wird. Hydrogoldsäure (70
bis 75 mg) wird zugegeben und das Sieden wird fünf Minuten
fortgesetzt. Natriumcitrat (80 mg), das in 10 ml destillier
tem Wasser aufgelöst ist, wird in die Goldlösung gegossen
und die Lösung weitere fünf Minuten gekocht. Nachdem man die
Lösung auf Raumtemperatur abkühlen ließ, wird deren pH-Wert
an einen Bereich angepaßt, der nahe dem isoelektrischen
Punkt (bestimmt durch Gel-Elektrophorese) des monoklonalen
Antikörpers ist, der gegen menschliches Choriogonatropin-
Hormon hergestellt wurde. 20 mg des monoklonalen Antikörpers
werden zur Lösung gegeben, die zwei Stunden bei Raumtempera
tur gerührt wird. 750 mg Rinderserumalbumin werden zugegeben
und die Lösung wird ununterbrochen ungefähr 12 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Das Addukt aus kolloidalem Gold und
monoklonalem Antikörper wird durch 20minütige Zentrifugation
bei 10 000 Upm (Umdrehungen pro Minute) in einem GSA-Rotor
erhalten, indem der Überstand verworfen wird und das erhal
tene Pellet in 30 ml einprozentigem Rinderserumalbumin in
einer Phosphatpufferlösung (pH 7,4) suspendiert wird. Die
Suspension wird dann bei 16 000 Upm 15 Minuten lang in einem
Sorvall SS-34-Rotor zentrifugiert. Wieder wird der Überstand
verworfen und das Pellet in 15 ml einprozentigem Rinder
serumalbumin suspendiert. Nach einer kurzen Beschallung wird
die Suspension durch ein 0,2 µm Filter gefiltert.
Ein Muster einer voraktivierten Nylonmembran (Pall Immuno
dyn) mit einer Porengröße von 5 µm wird auf eine Größe von
180 mm × 25 mm geschnitten und als die Membran mit Docht
wirkung an den unteren Rand einer dünnen Plastikplatte
(100 mm × 180 mm) befestigt. Eine Testanzeigezone mit immo
bilisierten Antikörpern wird auf der Membran bestimmt, indem
36 µl einer Lösung aus 3 mg/ml Anti-Human-Choriogonatropin-
Antikörper aus Schafen in 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer
(pH 7,6) und 5prozentiger Saccharose auf eine Linie gesprüht
werden, die ungefähr 1,5 cm vom unteren Rand entfernt ist,
indem ein Camag Linomat IV verwendet wird. Nach dem Besprü
hen wird die Membran 30 Minuten lang bei 37°C getrocknet und
dann mit einer Lösung aus 2prozentiger, fettfreier, trocke
ner Milch (Carnation) und 2prozentiger Saccharose in
0,1molarem Natriumphosphatpuffer behandelt. Die Membran wird
dann mit 2prozentiger Saccharose in 0,1molarem Natriumphos
phat gewaschen und wird dann bei Raumtemperatur ungefähr 12
Stunden zur weiteren Trocknung stehengelassen. Das Grundge
rüst und die Membran mit Dochtwirkung können in einem
Exsikkator bis zur weiteren Behandlung aufbewahrt werden.
Zwei Zellulosemembranen (Whatman ET31) werden mit einer
Lösung aus 0,1molarem Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 0,1%
Rinderserumalbumin, 0,5% fettfreier, trockener Milch, 2%
Saccharose und 0,05% Natriumazid vorbehandelt und dann 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Das zweite Filterlement und ein Reservepolster werden herge
stellt, indem zwei vorbehandelte Zellulosemembranen in einem
Vakuumexsikkator eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet
werden.
Das erste Filterelement wird hergestellt, indem ein recht
eckiges Stück einer Zellulosemembran (Schleicher & Schuell),
das 5 mm × 180 mm mißt, bei Raumtemperatur 30 Minuten lang
in einer Lösung aus Addukt aus kolloidalem Gold und monoklo
nalem Anti-Human-Choriogonatropin-Antikörper in einer
0,1molaren Natriumphosphatpuffer (pH 7,6) und 5% Saccharose
inkubiert wird. Die Membran wird dann auf eine Glasplatte
gegeben, bei 36°C unter konstantem Vakuum in einem Gefrier
trockner wärmegetrocknet und trocken in einem Exsikkator bis
zur Verwendung aufbewahrt.
Das erste Filterelement wird angrenzend an das zweite Fil
terelement und das zweite Filterelement wird auf dem Pla
stikgrundgerüst angrenzend an die Membran mit Dochtwirkung
befestigt. Schließlich wird das Reservepolster angrenzend an
das erste Filterelement befestigt. Die Plastikplatte wird
dann in eine Vielzahl von Streifen von 100 mm Länge und 7,5 mm
Breite geschnitten, so daß jeder eine lineare Anordnung
aus Reservepolster, erstem Filterelement, zweitem Fil
terelement und Membran mit Dochtwirkung aufweist.
Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1B) wird durchgeführt,
außer daß das Material, das für die Membran mit Dochtwirkung
verwendet wird, eine Zellulosemembran (Schleicher & Schuell)
ist, die eine Porengröße von 12 µm aufweist. Nach dem Lini
ensprühen mit Antikörpern wird die Membran 24 Stunden in
einen Exsikkator gegeben, um maximale Antikörper-Membran-
Bindung zu gewährleisten. Die Membran wird dann in einem
Puffer zur Inhibierung aus 1% Rinderserumalbumin, 0,5%
fettfreier, trockener Milch, 5% Trehalose, 0,05% Tween 20
und 0,05% Natriumazid in 0,1molarem Boratpuffer mit einem
pH-Bereich von 8,5 bis 9,0 inkubiert. Die inhibierte Membran
wird wieder in einem Vakuumexsikkator eine Stunde lang ge
trocknet und in einem gewöhnlichen Exsikkator bis zur Ver
wendung in der Testvorrichtung aufbewahrt.
Ein Streifen wird entsprechend dem Verfahren in Beispiel 1B)
hergestellt.
Wenn ein Urinstrom auf das Reservepolster gegeben wird, be
ginnt nach ungefähr 3 Minuten ein nachweisbares Signal auf
der Assay-Anzeigezone zu erscheinen. Die Testempfindlichkeit
ist ungefähr 50 mIU/ml.
Ein Streifen wird entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1B
hergestellt, wobei das erste Filterelement und das Reserve
polster weggelassen werden. Der Streifen wird in ein Röhr
chen mit 100 µl weiblichem Urin gegeben, der 10 µl Konjugat
aus kolloidalem Gold und monoklonalem Anti-Human-Choriogona
tropin-Antikörper aufweist, das in Übereinstimmung mit Bei
spiel 1 hergestellt wurde. Während die Flüssigkeit den
Streifen entlangwandert, erscheint nach ungefähr 2 Minuten
ein nachweisbares Signal auf der Testanzeigezone, das stär
ker wird, wenn die Flüssigkeit das Ende des Streifens (unge
fähr 4 Minuten) erreicht hat. Die Empfindlichkeit dieses
Testverfahrens für vorhandenes menschliches Choriogonatropin
ist 25 mIU/ml.
Ein Teststreifen wird im wesentlichen in Übereinstimmung mit
dem Verfahren in Beispiel 1B hergestellt, außer daß das
erste Filterelement mit Anti-Human-Choriogonatropin-Antikör
per behandelt wird, der wie folgt markiert wird. Eine
10prozentige Suspension (0,1 ml) aus im Handel erhältlichen
farbigen Polystyrol-Latexpartikeln, die in ihrer Größe von
0,1 bis 0,3 µm reichen, wird dreimal mit destilliertem Was
ser durch Mikro-Zentrifugation (microfuge centrifugation)
gewaschen. Das Endpellet wird in 2 ml aus 0,1molarem
Glycinhydrochloridpuffer suspendiert, der 1 mg Rinderserum
albumin enthält. Nach ungefähr 12 Stunden Inkubation bei
Raumtemperatur auf einer Rüttelvorrichtung wird die Latex
suspension dreimal mit 0,1molarem Natriumphosphatpuffer (pH
6,8) gewaschen, um überschüssiges Rinderserumalbumin zu ent
fernen. Die erhaltene Suspension wird mit demselben Phos
phatpuffer auf 2 ml verdünnt, und 25% Glutaraldehyd wird
hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1% zu erreichen.
Die Probe wird drei Stunden lang bei Raumtemperatur inku
biert und noch dreimal mit demselben Puffer gewaschen. 100 µg
Anti-Human-Choriogonatropin-Antikörper werden zu 2 ml der
Latexsuspension gegeben und weitere drei Stunden bei Raum
temperatur inkubiert. Glycin wird dann hinzugegeben, um eine
Endkonzentration von 2% zu erreichen. Nach einer weiteren
Stunde Inkubation wird die Latexsuspension dreimal mit dem
selben Puffer gewaschen und in denselben Puffer, der 2%
Rinderserumalbumin enthält, suspendiert. Die Suspension wird
kurz beschallt und dann bei 4°C bis zur Verwendung aufbe
wahrt.
Ein Streifen wird entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1B
hergestellt, wobei das erste Filterelement und das Reserve
polster weggelassen werden. Der Teststreifen wird dann in
ein Teströhrchen gegeben, das in 100 µl weiblichem Urin 5 µl
Anti-Human-Choriogonatropin-Antikörper enthält, die in Über
einstimmung mit dem Verfahren in Beispiel 5 markiert sind.
Während die Flüssigkeit den Streifen entlangwandert,
erscheint nach ungefähr 2 Minuten ein nachweisbares Signal
auf der Testanzeigezone, wobei das Signal intensiver wird,
wenn die Flüssigkeit das Ende des Streifens erreicht hat
(ungefähr 4 Minuten). Die Empfindlichkeit dieses Assay-Ver
fahrens für menschliches Choriogonatropin beträgt 25 mIU/ml.
10 mg Vulcan XC72 Kohlenstoffpartikeln werden in 2 ml eines
20 mM Trishydrochloridpuffers (pH 6,8) homogenisiert, der 40 mM
Natriumchlorid und 2% Dextran 9400 enhält. Nach 2 Stun
den Inkubation bei Raumtemperatur wird eine Lösung aus 5 mg
Fluorescein-Isothiocyanat in 1 ml Trishydrochloridpuffer zur
Lösung hinzugefügt. Die Mischung wird kurz beschallt und
ungefähr 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der
Inkubation werden 20 ml an 0,1molarem Natriumphosphatpuffer
(pH 7,6) in 0,1molarem Natriumchlorid zur Kohlenstofflösung
hinzugefügt, die dann bei 4°C bei 15 000 Upm zentrifugiert
wird. Dieser Schritt wird dreimal wiederholt und das resul
tierende Pellet in 20 ml Phosphatpuffer suspendiert. Nach
kurzer Beschallung werden 3 mg eines monoklonalen Antikör
pers gegen menschliches Choriogonatropin zur Suspension
gegeben und die Mischung 6 Stunden bei Raumtemperatur inku
biert. Das Gemisch wird dann dreimal bei 15 000 Upm zentrifu
giert, um nicht-reagierte Antikörper zu entfernen. Das End
pellet wird in 20 ml 0,1molarem Hepes-Puffer (pH 7,5) sus
pendiert, der 1% Rinderserumalbumin, 5% Saccharose,
0,1molarem Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält.
Cetyltrimethylammoniumbromid wird hinzugefügt, bis eine End
konzentration von 0,025% erreicht ist. Dies läßt man 30
Minuten inkubieren und wird dann bei 15 000 Upm zentrifu
giert. Das resultierende Pellet wird in 20 ml 0,1molarem
Hepes Puffer (pH 7,5) suspendiert, der 1% Rinderserum
albumin, 5% Saccharose, 0,1 M Natriumchlorid und 0,05%
Natriumazid enthält, kurz beschallt, mit Natriumdeoxylat auf
eine Endkonzentration von 0,1% verdünnt, anschließend 30
Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und wieder zentri
fugiert. Das Pellet wird wieder in 20 ml 0,1molarem Hepes
Puffer (pH 7,5) suspendiert, der 1% Rinderserumalbumin, 5%
Saccharose, 0,1 M Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid
enthält, und kurz beschallt.
Dieses Kohlenstoffsol wird anstelle von kolloidalem Gold auf
das erste Filterelement der Teststreifen gegeben, die ent
sprechend dem Beispiel 1B hergestellt sind, wobei das Reser
vepolster weggelassen wird. Die Teststreifen werden ungefähr
eine Stunde lang in einem Vakuumtrockner getrocknet und bis
zur Verwendung in einem Exsikkator bei Raumtemperatur aufbe
wahrt. Um Tests zum Nachweis von menschlichem Choriogona
tropin oder Gelbkörperbildungshormon durchzuführen, werden
100 µl einer Urinprobe in ein Kulturröhrchen dispensiert und
der Streifen wird dann in das Röhrchen gegeben. Über den
Kontakt mit der Urinprobe werden die Konjugate aus Kohlen
stoffpartikel und Antikörper sofort gelöst und wandern auf
die Membran mit Dochtwirung zu. Ein positiver Test ent
spricht einer intensiven Farbe der Kohlenstoffrußpartikel,
die auf der Anzeige konzentriert sind. Die Nachweisgrenze
beträgt sowohl für Tests zum Nachweis von menschlichem
Choriogonatropin als auch von Gelbkörperbildungshormon unge
fähr 25 mIU/ml.
Ein Streifen wird entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1B
hergestellt, wobei das erste Filterelement und das Reserve
polster weggelassen werden. Der Teststreifen wird dann in
ein Teströhrchen gegeben, das den Kohlenstoffsol-markierten
Antikörper (5 µl) und eine Urinprobe mit menschlichem
Choriogonatropin (100 µl) enthält, welche gründlich gemischt
werden. Nach ungefähr einer Minute beginnt ein nachweisbares
Signal zu erscheinen. Die Empfindlichkeit dieses Assays
wurde zu ungefähr 25 mIU/ml bestimmt.
Kohlenstoffsolreagenzien, die monoklonale Antikörper gegen
menschliches Choriogonatropin oder gegen Gelbkörperbildungs
hormon (5 µl pro Röhrchen) tragen, werden gefriergetrocknet.
Das Röhrchen kann bis zum Einsatz in einem Exsikkator bei
Raumtemperatur aufbewahrt werden.
Um Assays zum Nachweis von menschlichem Choriogonatropin
oder Gelbkörperbildungshormon durchzuführen, werden 100 µl
einer Urinprobe in einem Kulturröhrchen dispergiert, das das
getrocknete oder gefriergetrocknete Kohlenstoffsol enthält.
Das Kohlenstoffreagenz geht sofort nach Kontakt mit einer
Urinprobe in Lösung. Ein Teststreifen, der wie in Beispiel
1B, aber ohne das erste Filterelement und ohne das Reserve
polster hergestellt wurde, und auf den eine Linie aus Anti-
Human-Choriogonatropin-Antikörper aus Schafen (3 µg pro
Streifen) als Anzeige gesprüht wurde, wird dann in das Röhr
chen gegeben. Wenn die wandernde Probenmischung die Anzeige
erreicht, beginnt eine schwarze Bande zu erscheinen, falls
die Urinprobe menschliches Choriogonatropin oder Gelb
körperbildungshormon enthielt. Die Empfindlichkeit der
Tests, die das getrocknete oder gefriergetrocknete Kohlen
stoffreagenz verwenden, ist in beiden Fällen ungefähr
25 mIU/ml. Das getrocknete oder gefriergetrocknete Kohlenstoff
reagenz bleibt aktiv und zeigt dieselbe Empfindlichkeit,
nachdem es über ein Jahr bei Raumtemperatur gelagert wurde.
Eine Testvorrichtung wurde entsprechend dem Beispiel 1B her
gestellt, wobei das erste Filterelement und das Reservepol
ster weggelassen wurden und 1 mg/ml Anti-Tyroxin-Antikörper
für das Liniensprühen auf der Membran mit Dochtwirung ver
wendet wurden.
Durch die Zugabe zu einer Mischung aus 5 µl Tyroxin-tragen
dem Kohlenstoffsol (siehe Beispiel 21) und 100 µl Serum
(Assay vom Konkurrenztyp) beginnt die Kontrollbande nach
ungefähr zwei Minuten zu erscheinen. Bei einem Tyroxinniveau
(unmarkiert) in der Serumprobe, das höher als ungefähr
60 ng/ml ist, tritt keine Bandenbildung auf (eine schwache
Bande erscheint bei 59 ng/ml). Demgegenüber sind weniger als
10 ng/ml an Tyroxin erforderlich, um in Abwesenheit von
Tyroxin in der Serumprobe eine Bande zu produzieren, die
genauso intensiv wie die Kontrollbande ist.
Eine Testvorrichtung wurde entsprechend dem Beispiel 1B her
gestellt, wobei das erste Filterelement und das Reservepol
ster weggelassen wurde und 2 mg/ml eines im Handel erhältli
chen Lymphozyt-Erkrankung-Antigens (OEM Concepts) für das
Liniensprühen auf der Membran mit Dochtwirkung verwendet
wurde.
Wenn das Reservoir-Ende der Vorrichtung in eine Mischung aus
100 µl menschlichem Serum und 5 µl Kohlenstoffpartikel, die
mit einem Konjugat aus Fluorescein-Isothiocyanat und Anti-
Human-Immunoglobulin G aus Ziegen (siehe Beispiel 21) mar
kiert sind, getaucht wird, erscheint nach ungefähr 4 Minuten
ein nachweisbares Signal, falls die Probe seropositiv ist.
Eine Testvorrichtung wird entsprechend Beispiel 11 herge
stellt. 10 µl menschliches Serum werden auf das zweite Fil
terelement getupft. Die Vorrichtung wird in ein Röhrchen
gegeben, das 100 µl einer Suspension aus Kohlenstoffparti
keln (5 µl) in 20 mM Ethylendiamintetraacetat enthält, wobei
die Kohlenstoffpartikeln mit einem Konjugat aus Fluorescein-
Isothiocyanat und Anti-Human-Immunoglobulin G aus Ziegen
(siehe Beispiel 21) markiert sind. Ein nachweisbares Signal
erscheint nach 5 Minuten, falls die Probe seropositiv ist.
Eine Testvorrichtung wird entsprechend Beispiel 11 herge
stellt, außer daß 2 mg/ml Röteln-Antigen (Viral Antigens,
Inc.) zum Liniensprühen auf der Membran mit Dochtwirkung
verwendet werden.
Wenn das Reservepolster mit 100 µl menschlichem Serum und 5 µl
Kohlenstoffpartikeln in Kontakt gebracht wird, die mit
einem Konjugat aus Fluorescein-Isothiocyanat und Anti-Human-
Immunoglobulin G aus Ziegen (siehe Beispiel 21) markiert
sind, erscheint nach ungefähr 2 Minuten ein nachweisbares
Signal, falls die Probe seropositiv ist.
Eine Testvorrichtung wird entsprechend Beispiel 13 herge
stellt. 10 µl des Serums werden auf das zweite Filterelement
getupft und die Vorrichtung wird in ein Röhrchen gegeben,
das 100 µl einer Suspension aus Kohlenstoffpartikeln in 20 mM
Ethylendiamintetraacetat enthält, wobei die Kohlenstoff
partikel mit einem Konjugat aus Fluorescein-Isothiocyanat
und Anti-Human-Immunoglobulin G aus Ziegen (siehe Beispiel
21) markiert sind. Nach ungefähr 3 Minuten erscheint ein
nachweisbares Signal, falls die Probe seropositiv ist.
Eine Testvorrichtung wird entsprechend Beispiel 11 herge
stellt und eine zusätzliche Linie mit Röteln-Antigen wird
ungefähr 7 mm von der Linie mit Lymphozyt-Erkrankung-Antigen
entfernt und parallel dazu gesprüht.
Eine Röteln-seropositive Probe (10 µl) wird auf das zweite
Filterelement getupft. Die Vorrichtung wird in ein Röhrchen
gegeben, das 100 µl einer Suspension aus Kohlenstoffparti
keln (10 µl) in 20 mM Ethylendiamintetraacetat enthält, wobei
die Kohlenstoffpartikel mit einem Konjugat aus Fluorescein-
Isothiocyanat und Anti-Human-Immunoglobulin G aus Ziegen
(siehe Beispiel 21) markiert sind.
Nach ungefähr 5 Minuten erscheint entlang der Linie mit
Röteln-Antigen ein nachweisbares Signal.
Das Verfahren aus Beispiel 15 wird durchgeführt, außer daß
eine Röteln- und Lymphozyt-Erkrankung-seropositive Probe (20 µl)
auf die Membran getupft wird. Nach ungefähr 5 Minuten
beginnen zwei nachweisbare Signale zu erscheinen.
Die Eignung verschiedener Kohlenstoffmaterialien zur Her
stellung der Kohlenstoffsole und der Kohlenstoffpuffer zum
selben Zweck kann leicht durch folgende Techniken bestimmt
werden.
A. Mischungen aus 5 mg verschiedener Kohlenstoffruße
(Monarch 1000, Monarch 880, Monarch 120, Regal 250R,
Regal 500R, Vulcan XC72R und Vulcan XC72, die alle von
Cabot erhältlich sind) und 100 µl aus 2% Polyethylen
glykol (6000 bis 8000) werden 5 Minuten gemahlen und mit
Phosphatsalinepuffer, der 2 mg eines monoklonalen Anti
körpers gegen menschliches Choriogonatropin enthält, auf
10 ml verdünnt. Nach einer kurzen Beschallung zur
Dispersion der Kohlenstoffpartikel in der monoklonalen
Antikörperlösung, werden die Mischungen 6 Stunden lang
bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Am Ende der
Inkubation wird die Probe dreimal durch Zentrifugation
gewaschen, um jegliche überschüssigen Antikörper zu ent
fernen. Jede Zentrifugation wird 20 Minuten lang bei
15 000 UpM durchgeführt, wobei 10 ml einer Phosphatpuf
ferlösung verwendet werden. Das Endpellet wird in 10 ml
einer 3% Phosphatpufferlösung suspendiert und kurz
beschallt, um vollständige Dispersion der Kohlenstoff
partikel zu gewährleisten.
Für einen Test zum Nachweis von menschlichem Choriogona
tropin werden 20 µl des Kohlenstoffsols und 200 µl einer
Urinprobe dispergiert und in einem Kulturröhrchen (10 × 75 mm)
gründlich gemischt. Die Mischung läßt man dann in
einen Streifen aus Whatman Papier (31ET) wandern, der
5 mm in der Breite und 100 mm in der Höhe mißt, mit
Anti-Human-Choriogonatropin-Antikörper aus Schafen ent
lang einer Linie besprüht ist, und der mit 1%
Rinderserumalbumin in einer Phosphatpufferlösung (pH
7,4) inhibiert ist.
Vulcan XC72 ergibt dabei das beste Signal-Rausch-Ver
hältnis bei 200 mIU/ml an menschlichem Choriogonatropin.
Ähnliche Ergebnisse werden mit Vulcan XC72R erreicht,
nur ist das positive Signal etwas schwächer.
B. 5 mg derselben Kohlenstoffrußarten werden durch Homoge
nisierung in 2 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 6,8)
suspendiert, der 40 mM Natriumchlorid und 2% (w/v) Dex
tran 9400 enthält. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raum
temperatur wird 1 ml einer 3prozentigen Lösung aus Rin
derserumalbumin zur homogenisierten Kohlenstoffsuspen
sion gegeben. Die Mischung wird kurz beschallt und unge
fähr 12 Stunden lang bei Raumtemperatur weiter inku
biert. Am Ende der Inkubation werden 5 µl der Mischung
in eine Küvette dispensiert, die 1 ml destilliertes Was
ser enthält. Bei jeder Probe wird die Extinktion bei
700 nm gemessen. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Kohlenstoffruß-Quelle | |
Optische Dichte bei 700 nm | |
Monarch 1000 | |
0,2333 | |
Monarch 880 | 0,3129 |
Vulcan XC72R | 0,6878 |
Vulcan XC72 | 0,7428 |
Monarch 120 | 0,6225 |
Regal 250R | 0,3567 |
Regal 500R | 0,4372 |
C. Vulcan XC72 Kohlenstoffruß wird in mehrere Pufferlösun
gen suspendiert, die verschiedene pH-Werte aufweisen. 5 mg
Vulcan XC72 Kohlenstoffpartikel werden in 2 ml
verschiedener Pufferlösungen homogenisiert, die 2%
Dextran 9400 enthalten, und 2 Stunden lang bei Raumtem
peratur inkubiert. Nach der Inkubation werden 5 µl eines
jeden Homogenats zu 1 ml destilliertem Wasser gegeben. 1 ml
von 3% Rinderserumalbumin im selben Puffer wird zur
Mischung hinzugefügt, die dann beschallt wird und unge
fähr 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wird. Am
Ende der Inkubation werden 5 µl der Mischung in 1 ml
destilliertem Wasser suspendiert und die Extinktion bei
700 nm gemessen. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Wie oben ersichtlich, sind Pufferlösungen, die pH-Werte von
ungefähr 6,8 bis 8,0 aufweisen, besonders geeignet für die
Dispersion von Kohlenstoffpartikeln.
Zu einer Mischung aus 1 mg Anti-Human-Choriogonatropin-Anti
körper in 1=ml 0,3 M Boratpuffer (pH 9,0) wird unter Rühren
50 µg Fluorescein-Isothiocyanat gegeben. Das Rühren wird
eine Stunde lang weiter fortgesetzt und die Mischung wird
dann auf eine Sephadex-G-25-Säule gegeben, um nicht-reagier
tes Isothiocyanat und andere unerwünschte Materialien zu
entfernen. Das Verhältnis aus Antikörper : Isothiocyanat ist
ungefähr 1 : 3. Zu einer wäßrigen Suspension aus 1 mg Koh
lenstoffruß (Vulcan 72) werden 0,5 mg des Antikörperkonju
gats gegeben. Die Mischung wird beschallt, ungefähr 12 Stun
den bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal der Zentrifuga
tion unterworfen. Das Endpellet, das in einem Puffer suspen
diert wird, wie er in Beispiel 12 beschrieben ist, kann bis
zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt werden.
Ähnliche Produkte können erhalten werden, indem Anti-Gelb
körperbildungshormon, Anti-Human-Immunoglobulin G aus Ziegen
und Immunoglobulin-M-Antikörper verwendet werden.
Zu 10 ml einer wäßrigen Suspension aus 5 mg Kohlenstoffruß
(Vulcan 72) werden 200 µl Anti-Maus-Antiserum aus Ziegen ge
geben. Die Mischung wird beschallt und ungefähr 12 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert. Dazu wird dann 1 mg Anti-
Human-Choriogonatropin-Antikörper gegeben, diese Mischung 2
Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal der
Zentrifugation unterworfen. Das Endpellet, das in einem Puf
fer suspendiert wird, wie er in Beispiel 12 beschrieben ist,
kann bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt werden.
Zu einer Suspension aus 5 mg Kohlenstoffruß in 10 ml Phos
phatpufferlösung (PBS) werden 2 mg Avidin gegeben. Nach
zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur werden 5 ml an
3% Rinderserumalbumin in PBS hinzugefügt. Nach zweistündi
gem Stehenlassen werden 0,5 mg biotinylisiertes Anti-Human-
Choriogonatropin in 1% Rinderserumalbumin in PBS hinzuge
fügt. Nach einer weiteren einstündigen Inkubation wird die
Mischung dreimal der Zentrifugation unterworfen. Das Endpel
let, das in einem Puffer, wie er in Beispiel 12 beschrieben
ist, suspendiert und dann kurz beschallt wird, kann bis zur
Verwendung bei 4°C aufbewahrt werden.
10 mg Vulcan XC72 Kohlenstoffpartikel werden in 2 ml eines
20 mM Tris-Hydrochlorid-Puffers (pH 6,8) homogenisiert, der
40 mM Natriumchlorid und 2% Dextran 940 enthält. Nach zwei
stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird eine Lösung aus
5 mg Fluorescein-Isothiocyanat in 1 ml Tris-Hydrochlorid-
Puffer zur Lösung gegeben. Die Mischung wird kurz beschallt
und ungefähr 12 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation werden 20 ml eines 0,1 M Natriumphos
phatpuffers (pH 7,6) in 0,1 M Natriumchlorid zur Kohlen
stofflösung gegeben, die dann bei 4°C mit 15 000 Upm zentri
fugiert wird. Dieser Schritt wird dreimal wiederholt und das
resultierende Pellet in 20 ml Phosphatpuffer suspendiert.
2 mg Rinderserumalbunin werden zu 2 ml der Suspension von
oben gegeben, die Mischung 6 Stunden lang inkubiert und dann
dreimal der Zentrifugation unterworfen. Ein Überschuß an
Glutaraldehyd (1%) wird hinzugefügt und nach einer dreistün
digen Inkubation bei Raumtemperatur durch Zentrifugation
entfernt. Eine Lösung aus 10 µg Tyroxin in genügend Di
methylformamid wird hinzugefügt, diese Mischung 3 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal der Zentrifu
gation unterworfen. Das Endpellet, das in einem Puffer sus
pendiert wird, wie er in Beispiel 12 beschrieben ist, und
dann kurz beschallt wird, kann bis zur Verwendung bei 4°C
aufbewahrt werden.
Claims (53)
1. Immunchemische Assayvorrichtung, enthaltend:
- a) ein Grundgerüst (20);
- b) eine Anordnung, die sich auf dem Grundgerüst (20)
befindet und umfaßt:
- i) ein Reservepolster (10), das genügend Poro sität und Volumen aufweist, um eine flüssige Probe, mit der der Assay durchgeführt werden soll, aufzunehmen und zu speichern;
- ii) eine Membran mit Dochtwirkung (16), die ent fernt vom Reservepolster angeordnet ist, wobei die Membran mit Dochtwirkung (16) genügend Porosität und Volumen aufweist, um einen wesentlichen Teil der Probe zu absor bieren, die in das Reservepolster (10) auf genommen wurde; und
- iii) wenigstens eine Filterzone, die die Membran
mit Dochtwirkung (16) und das Reservepolster
(10) verbindet und berührt, wobei die Fil
terzone:
- (1) eine Oberfläche des Reservepolsters (10) berührt, die in Bezug auf das Volumen des Reservepolsters ausreichend klein ist, um den Fluß der flüssigen Probe vom Reservepolster zur Filterzone zu dosie ren; und
- (2) in der Lage ist, den Fluß eines jeden spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplexes in der Probe vom Reservepolster (10) zur Membran mit Dochtwirkung (16) zu gestat ten, während sie den Fluß größerer Kom ponenten, die sich dann in der Probe be finden, verhindert; und
- c) wenigstens eine immobilisierte Substanz, die sich auf wenigstens einer Zone der Membran mit Dochtwir kung (16) befindet und die Assay-Anzeige (18) defi niert, wobei die immobilisierte Substanz in der Lage ist, einen spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex, den die Probe enthält, zu binden, um die Assay-Anzeige zu bilden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Grundgerüst (20) aus Kunststoff oder Glas ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Reservepolster (10) sich über das
Grundgerüst (20) ausdehnt.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß wenigstens ein Reagenz, das einen
spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplex erzeugen kann,
gleichmäßig in und auf wenigstens einem Teil der Fil
terzone sich befindet.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reagenz einen Marker trägt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Marker ein direkter Marker ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß der Marker ein Metallsol, ein Nicht-Metallsol, ein
Farbstoffsol oder ein Farbindikator ist oder aus
Latexpartikeln besteht.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß der Marker ein Kohlenstoffsol ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Marker ein indirekter Marker ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbeson
dere 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz und die
immobilisierte Substanz Ligand-bindende Moleküle sind.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbeson
dere 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens das
Reagenz oder die immobilisierte Substanz ein monoklona
ler Antikörper ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, insbeson
dere 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens das
Reagenz oder die immobilisierte Substanz ein polyklona
ler Antikörper ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die immobilisierte Substanz ein
Ligand ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die immobilisierte Substanz ein Antigen oder Hapten
ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß die Filterzone umfaßt:
- a) wenigstens ein erstes Filterelement (12), das auf dem Grundgerüst (20) so angeordnet ist, daß es an das Reservepolster (10) grenzt und eine Oberfläche des Reservepolsters (10) berührt, die in Bezug auf das Volumen des Reservepolsters (10) ausreichend klein ist, um den Fluß der flüssigen Probe vom Re servepolster (10) zum ersten Filterelement (12) zu dosieren; und
- b) ein zweites Filterelement (14), das auf dem Grundge rüst (20) so angeordnet ist, daß es an jedes erste Filterelement (12) grenzt und vom Reservepolster (10) entfernt steht, wobei das zweite Filterelement (14) in der Lage ist, das Durchfließen eines jeden spezifischen Ligand-Rezeptor-Komplexes in der Probe zu gestatten, aber das Durchfließen größerer Kom ponenten, die sich dann in der Probe befinden, zu verhindern.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß wenigstens ein Reagenz, das einen spezifischen Li
gand-Rezeptor-Komplex erzeugen kann, gleichmäßig in und
auf wenigstens einem Teil des ersten Filterelements
(12) sich befindet.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß sowohl das Reservepolster (10), als auch das erste
Filterelement (12), als auch das zweite Filterelement
(14), als auch die Membran mit Dochtwirkung (16) aus
mikroporösem Membranmaterial bestehen.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß jede mikroporöse Membran aus Nylon, Zellulosemate
rial, einem Polysulfon, Polyvinylidendifluorid oder aus
einem Polyester besteht.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, daß sich ein Additiv auf dem ersten
Filterelement (12) befindet, das in der Lage ist, die
Herstellung oder das Binden der spezifischen Ligand-
Rezeptor-Komplexe zu verstärken.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, gekenn
zeichnet durch eine feuchtigkeits-undurchlässige Hülle
(222), die die Vorrichtung umgibt, wobei die Hülle
beinhaltet:
- a) eine Öffnung (224) in der Hülle (222), deren umge bende, obere Oberfläche gebogen ist und sich nach unten ausdeht, so daß ein schalengleiches Aufnahme gefäß gebildet ist, das am Reservepolster (210) endet und fest mit einem Teil des Reservepolsters (210) verbunden ist, wobei die Öffnung (224) in der Lage ist, die flüssige Probe aufzunehmen und das Fließen der flüssigen Probe auf das Reservepolster (210) hinauf zu dosieren, und
- b) eine Vorrichtung, mit der die Assay-Anzeigezone (218), die auf der Zone angeordnet ist, mit dem Auge überprüft werden kann.
21. Immunchemisch aktiver Marker, gekennzeichnet durch
feine Kohlenstoffrußpartikeln, auf denen eine Kompo
nente adsorptiv immobilisiert ist, die entfernt vom
Adsorbtionsort mit einem immunologisch aktiven Liganden
oder Ligand-bindenden Molekül endet.
22. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die Komponente aus immunologisch
aktiven Haptenen, Antigenen, oder Antikörper besteht,
die auf der Oberfläche des Kohlenstoffrußes adsorbiert
sind.
23. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die Komponente den immunologisch
aktiven Liganden oder Ligand-bindende Moleküle beinhal
tet, die über ein Kupplungsreagenz kovalent verbunden
sind, und das Kupplungsreagenz auf der Oberfläche des
Kohlenstoffrußes adsorbiert ist.
24. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 23, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz ein Imid,
Azid, Isothiocyanat, ein Imidoester oder ein Dialdehyd
ist.
25. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 24, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz Maleimid,
Succinimid, Phenylazid, Glutaraldehyd oder N-Hydroxy
succinimidoester ist.
26. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 25, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz ein
Isothiocyanat ist.
27. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Isothiocyanat Phenylisothiocya
nat, 4, 4′-Diisothiocyanostilben-2,2′-disulfonsäure, 4-
N,N-Dimehtylaminoazobenzol-4′-isothiocyanat,
Fluorescein-Iosothiocyanat oder Rodaminisothiocyanat
ist.
28. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz Phenyl
isothiocyanat ist.
29. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz 4,4′-Di
isothiocyanostilben-2,2′-disulfonsäure ist.
30. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz 4-N,N-Dime
thylaminoazobenzol-4′-isothiocyanat ist.
31. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Isothiocyanat Fluorescein-
Isothiocyanat ist.
32. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz
Rodaminisothiocyanat ist.
33. Immunchemisch aktiver Marker nach einem der Ansprüche
21 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die feinen
Kohlenstoffrußpartikeln und die immobilisierte
Komponente, die auf den Kohlenstoffrußpartikeln adsorb
tiv immobilisiert ist, mit Polyethylenglykol überzogen
sind, das ein Molekulargewicht von ungefähr 200 bis
ungefähr 20 000 aufweist, oder mit Dextran bedeckt sind,
das ein Molekulargewicht von ungefähr 10 000 bis unge
fähr 500 000 aufweist.
34. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 33, dadurch
gekennzeichnet, daß das Dextran ein Molekulargewicht
von ungefähr 10 000 bis ungefähr 50 000 aufweist.
35. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 33, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polyethylenglykol ein Moleku
largewicht von ungefähr 5000 bis ungefähr 12 000 auf
weist.
36. Immunchemisch aktiver Marker nach einem der Ansprüche
21 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente
den immunochemisch aktiven Ligand oder Ligand-bindende
Moleküle beinhaltet, die an ein Protein gebunden sind,
und das Protein auf der Oberfläche des Kohlenstoffrußes
adsorbiert ist.
37. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 36, dadurch
gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Ligand
oder die Ligand-bindenden Moleküle an das Protein über
eine immunologische Bindung kovalent gebunden sind.
38. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 36, dadurch
gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Ligand
oder die Ligand-bindenden Moleküle an das Protein über
ein Kupplungsreagenz kovalent gebunden sind.
39. Immunchemisch aktiver Marker nach einem der Ansprüche
21 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente
den immunologisch aktiven Liganden oder die Ligand-bin
denden Moleküle beinhaltet, die an ein Protein gebunden
sind, wobei das Protein an ein Kupplungsreagenz kova
lent gebunden ist und das Kupplungsreagenz auf der
Oberfläche des Kohlenstoffrußes adsorbiert ist.
40. Immunchemisch aktiver Marker nach Anspruch 39, dadurch
gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Ligand
oder die Ligand-bindenden Moleküle an das Protein über
ein zweites Kupplungsreagenz kovalent gebunden sind.
41. Wäßrige Suspension eines immunchemisch aktiven Markers
nach einem der Ansprüche 21 bis 40.
42. Wäßrige Suspension nach Anspruch 41, gekennzeichnet
durch wenigstens einen Puffer, der einen pH aufweist,
bei dem der immobilisierte, immunologisch aktive Ligand
stabil ist, und der in den Bereich von ungefähr 6 bis 9
fällt.
43. Wäßrige Suspension nach Anspruch 42, gekennzeichnet
durch wenigstens einen Puffer, der einen pH von unge
fähr 6,5 bis 8,5 aufweist.
44. Verfahren zur Herstellung eines immunchemisch aktiven
Markers nach einem der Ansprüche 23 bis 40, gekenn
zeichnet durch das Binden des immunologisch aktiven
Liganden oder der Ligand-bindenden Moleküle an die fei
nen Kohlenstoffrußpartikeln, indem man ein Kupplungs
reagenz, gleichzeitig oder hintereinander,
- i) mit dem immunologisch aktiven Liganden oder den Ligand-bindenden Molekülen kovalent reagieren läßt und
- ii) auf den feinen Kohlenstoffrußpartikeln adsorbie ren läßt.
45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß
der immunchemisch aktive Marker mit einer wäßrigen Lö
sung eines Polyethylenglykols in Kontakt gebracht wird,
das ein Molekulargewicht von ungefähr 100 bis ungefähr
20 000 aufweist.
46. Verfahren nach Anspruch 44 und/oder 45, dadurch gekenn
zeichnet, daß die feinen Kohlenstoffrußpartikel mit
einer wäßrigen Lösung eines Dextrans in Kontakt
gebracht werden, das ein Molekulargewicht von ungefähr
10 000 bis ungefähr 500 000 aufweist.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch
gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Ligand
oder die Ligand-bindenden Moleküle an die feinen
Kohlenstoffrußpartikeln über ein Imid, Azid,
Isothiocyanat, Imidoester oder über einen Dialdehyd
gebunden sind.
48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß
der immunologisch aktive Ligand oder die Ligand-binden
den Moleküle an die feinen Kohlenstoffrußpartikeln über
ein Isothiocyanat gebunden sind.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 47, dadurch
gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Ligand
oder die Ligand-bindenden Moleküle an die feinen
Kohlenstoffrußpartikeln über Phenylisothiocyanat, 4,4′-
Diisothiocyanostilben-2,2′-disulfonsäure, 4-N,N-
Dimethylaminoazobenzol-4′-isothiocyanat, Fluorescein-
Isothiocyanat oder Rodaminisothiocyanat gebunden sind.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 49, dadurch
gekennzeichnet, daß der gebundene, immunologisch aktive
Ligand oder die gebundenen Ligand-bindenden Moleküle
und die feinen Kohlenstoffrußpartikeln in einem wäßri
gen Medium suspendiert sind, das auf einen pH gepuffert
ist, der in den Bereich von ungefähr 6 bis ungefähr 9
fällt, und bei dem der immobilisierte, immunologisch
aktive Ligand oder das immobilisierte, Ligand-bindende
Molekül stabil ist.
51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß
die wäßrige Suspension mit wenigstens einem biologisch
verträglichen, ionischen oder nicht-ionischen Tensid
behandelt ist.
52. Immunchemische Testvorrichtung, die eine Reaktion zwi
schen einem immunologisch aktiven Liganden oder Ligand
bindenden Molekülen und einem Analyten ausnützt, ge
kennzeichnet durch die Verwendung eines immunchemisch
aktiven Markers, der feine Kohlenstoffrußpartikeln auf
weist, auf denen eine Komponente adsorptiv immobili
siert ist, die entfernt vom Adsorptionsort mit einem
immunologisch aktiven Liganden oder Ligand-bindenden
Molekül der Reaktion endet.
53. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 52, gekenn
zeichnet durch eine feuchtigkeits-undurchlässige Hülle
(522), die die Vorrichtung umgibt, wobei die Hülle
(522) aufweist:
- a) eine erste Öffnung (524) in der Hülle (522), deren umgebende, obere Oberfläche gebogen ist und sich nach unten ausdehnt, so daß ein schalengleiches Auf nahmegefäß gebildet ist, das am Reservepolster (510) endet und fest mit einem Teil des Reservepolsters (510) verbunden ist, wobei die erste Öffnung (524) in der Lage ist, die Flüssigkeit aufzunehmen und das Fließen der Flüssigkeit auf das Reservepolster (510) hinauf zu dosieren,
- b) eine zweite Öffnung (530) in der Hülle (522), direkt über dem zweiten Filterelement (514), wobei mit der zweiten Öffnung (530) eine Probe direkt auf das zweite Filterelement (514) aufgegeben werden kann, und
- c) eine Vorrichtung, mit der die Assay-Anzeigezone (518), die auf der Zone angeordnet ist, mit dem Auge überprüft werden kann.
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