DE69119312T2 - Analyt-Austauschreagenz zur Verwendung in spezifischen Bindungstests, -vorrichtungen und -sätzen - Google Patents
Analyt-Austauschreagenz zur Verwendung in spezifischen Bindungstests, -vorrichtungen und -sätzenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der diagnostischen Assays. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Analytsubstitutreagenzes in einem Bindungsassay, um einen nachweisbaren Komplex aus bindenden Gliedern auszubilden, wobei der nachweisbare Komplex mit der Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe korreliert.
- Verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen werden gemeinhin in Assays verwendet, um die Anwesenheit und/oder Konzentration von interessierenden Substanzen oder solchen von klinischer Bedeutung, die in biologischen Flüssigkeiten oder anderen Substanzen vorhanden sein können, zu bestimmen. Solche Substanzen werden gemeinhin als "Analyten" bezeichnet, und sie können Antikörper, Antigene und Haptene umfassen. Bei der Diagnose und der Behandlung von Krankheiten oder anderen Zuständen des menschlichen Körpers, kann die genaue und rechtzeitige Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer biologischen Probe einen tiefgreifenden Einfluß auf die Fähigkeit des Pflegepersonals nehmen, eine pathologische Störung zu behandeln und mit ihr umzugehen. Darüber hinaus erlaubt die Durchführung solcher Assays eine frühe und genaue Bestimmung von physiologischen Zuständen, wie etwa einer Schwangerschaft, die Beobachtung einer Arzneimitteltherapie und die Beurteilung der Abwesenheit, Anwesenheit und Menge von mißbräuchlich eingenommenen Drogen oder Toxinen.
- Typische Immunoassayverfahren verwenden die Mechanismen des Immunsystems höherer Organismen, bei denen Antikörper als Antwort auf die Anwesenheit von Antigenen hergestellt werden, die pathogen oder den Organismen fremd sind. Ein oder mehrere Antikörper werden als Antwort auf Antigene hergestellt, und sie sind zur Reaktion mit einem besonderen Antigen fähig, wodurch ein hochspezifischer Reaktionsmechanismus geschaffen wird, der in vitro verwendet werden kann, um die Anwesenheit oder Konzentration dieses besonderen Antigens in einer biologischen Probe zu bestimmen.
- Heterogene Immunoassayverfahren umfassen typischerweise die Verwendung eines Festphasenmaterials, an das das Reaktionsprodukt gebunden wird. Das Reaktionsprodukt wird von überschüssiger Probe, überschüssigen Assayreagenzien und anderen Substanzen abgetrennt, indem die feste Phase aus der Reaktionsmischung entfernt wird. Eine Sorte von Festphasenimmunoassay ist ein Sandwichimmunoassay, das einen anti-Analytenantikörper (Fangreagenz) umfaßt, der an das unlösliche Festphasenmaterial gebunden ist, wie dies von Schuurs et al. In den U.S. Patenten mit den Nummern 3 791 932 und 4 016 043 beschrieben ist. Ein zweiter anti-Analytenantikörper ist mit einem nachweisbaren Agens markiert, wodurch ein Indikatorreagenz ausgebildet wird, zum Beispiel kann die nachweisbare Markierung ein Enzym sein, das mit einem Enzymsubstrat unter Ausbildung eines nachweisbaren Produktes reagiert. Wenn der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, dann bilden die beiden Antikörper einen Immunkomplex mit dem Analyten (d. h. ein Antikörper/Analyt/Antikörpersandwich), und die Menge an Indikatorreagenz, das mit der festen Phase assoziiert ist, ist direkt zu der Menge an Analyt in der Testprobe proportional. Wenn das Enzymsubstrat zugegeben wird, reagiert es mit dem Enzymbestandteil des Indikatorreagenzes, wobei es die Anwesenheit oder Menge des Analyten, der mit der festen Phase assoziiert ist, anzeigt.
- Eine andere Sorte von Festphasenimmunoassay-Konfiguration ist das Konkurrenzassay. Auf eine dem Sandwichassay ähnliche Weise kann das Konkurrenzassay einen anti-Analytantikörper umfassen, der an die unlösliche feste Phase gebunden ist, jedoch kann ein markierter Analyt an Stelle eines markierten zweiten Antikörpers als Indikatorreagenz verwendet werden. Bei dem Konkurrenzassay konkurriert das Indikatorreagenz mit dem Analyten aus der Testprobe um die Bindung des Fangreagenzes auf der festen Phase. Die Menge des eingefangenen Indikatorreagenzes ist zu der Menge an Analyt, die in der Testprobe vorhanden ist, umgekehrt proportional. Smith (U.S. Patent Nr. 4 401 764) beschreibt ein alternatives Konkurrenzassayvormat, das einen gemischten Bindungskomplex verwendet, der Analyt oder markierten Analyt zu binden vermag, bei dem aber der Analyt und der markierte Analyt nicht gleichzeitig den Komplex binden können. Clagett (U.S. Patent Nr. 4 746 631) beschreibt ein Immunoassayverfahren, das eine Reaktionskammer verwendet, in der ein Analyt/Ligand/Markerkonjugat von der Reaktionsoberf läche bei Anwesenheit von Analyt in der Testprobe verdrängt wird, und bei dem das verdrängte Analyt/Ligand/Markerkonjugat an einer zweiten Reaktionsstelle immobilisiert wird. Das Konjugat umfaßt Biotin, Rinderserumalbumin und synthetische Peptide als die Ligandkomponente des Konjugates und Enzyme, chemilumineszente Substanzen, Enzyminhibitoren und Radionukleotide als die Markierungskomponente des Konjugates. Li (U.S. Patent Nr. 4 661 444) beschriebt ein Konkurrenzimmunoassay, das ein Konjugat aus einem anti-Idiotyp-Antikörper und einem zweiten Antikörper verwendet, das für eine nachweisbare Markierung spezifisch ist, wobei die nachweisbare Antwort in umgekehrter Beziehung zu der Anwesenheit von Analyt in der Probe steht.
- Sowohl beim Sandwich- als auch beim Konkurrenzimmunoassay wird die Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe allgemein durch den Nachweis der Anwesenheit oder Menge der Markierung bestimmt, die mit der festen Phase assoziiert worden ist. Bei den Konkurrenzassay, ist die Menge an Markierung, die auf der festen Phase vorhanden ist, um so geringer, je mehr Analyt in der Testprobe vorhanden ist. Bei dem Sandwichassay ist die Menge an Markierung, die auf der festen Phase vorhanden ist, um so größer, je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist. Das Sandwichassay wird allgemein bevorzugt, besonders für die Sichtbarmachung niedriger Analytkonzentrationen, da das Erscheinen der Markierung auf der festen Phase einfacher nachgewiesen zu werden vermag.
- Das Sandwichassay unterliegt jedoch vielen einschränkenden Faktoren. Gewisse interessierende Analyten, wie einige Steroide, Hormone, Antibiotika und andere therapeutische Wirkstoffe haben ein niedriges Molekulargewicht und eine entsprechende Größe, die zu gering ist, um die gleichzeitige Bindungen von zwei Antikörpern an den Analyten und infolge dessen die Ausbildung eines Sandwichkomplexes zu erlauben. Die Verfahren zum Nachweis solcher Analyten verwenden typischerweise eine Konkurrenzassayanordnung, bei der der Analyt entweder mit einem Indikatorreagenz um die Bindung an ein Fangreagenz konkurriert, oder bei dem der Analyt das Indikatorreagenz von dem Fangreagenz verdrängt. Ein positives Ergebnis in einem Verdrängungsassay wird durch eine Abnahme der Menge an Markierung, die mit dem Festphasenmaterial assoziiert ist, angezeigt. Die visuelle Bestimmung eines positiven Assayergebnisses durch die Detektion einer abnehmenden Menge an Markierung ist schwieriger als die Detektion des Erscheines von Markierung auf der festen Phase, und die Schwierigkeit der Feststellung einer Abnahme in der Markierungsmenge kann zu einer zweideutigkeit bei der Interpretation des Assayergebnisses führen. Allen (EP 177 191) beschreibt ein Bindungsassay, das ein Konjugat eines Ligandenanalogons und ein zweites Reagenz, wie etwa Fluorescein, umfaßt, wobei das Konjugat mit dem Analyt (Ligand) um die Bindung an einen markierten spezifischen Bindungspartner für den Liganden konkurriert, und wobei das resultierende markierte Konjugat dann von der Reaktionsmischung mittels einer festen Phase abgetrennt wird, die einen Bindungspartner für das zweite Reagenz trägt. Dieses Bindungsassayformat verbindet die Verwendung einer Konkurrenzbindungstechnik und einer Reverssandwich- Konfiguration, d. h. die Bindung von Konjugat an das markierte bindende Glied vor der Abtrennung des Konjugates aus der Mischung durch die Bindung des Konjugates an die feste Phase. Das Assayergebnis wird jedoch wie bei einem herkömmlichen Konkurrenzassay bestimmt, bei dem die Menge an an die feste Phase gebundener Markierung umgekehrt proportional zu der Menge an Analyt in der Testprobe ist. Chieregatt et al. (GB 2 084 317) beschreibt ein ähnliches Assayformat, daß einen indirekt markierten Bindungspartner verwendet, der für den Analyten spezifisch ist. Mochida et al. (U.S. Patent Nr. 4 185 084) beschreibt ebenfalls die Verwendung eines Doppel- Antigenkonjugats, das mit einem Antigenanalyten um die Bindung an einen immobilisierten Antikörper konkurriert, und das dann markiert wird; dieses Verfahren führt ebenfalls zum Nachweis von Markierung auf einer festen Phase, wobei die Menge an Markierung zu der Menge an Analyt in der Testprobe umgekehrt proportional ist. Sadeh et al. (U.S. Patent Nr. 4 243 749) beschreibt ein ähnliches Enzymimmunoassay bei dem ein Haptenkonjugat mit dem Analyten um die Bindung an einen Antikörper konkurriert, der auf einer festen Phase immobilisiert ist.
- Die vorliegende Erfindung liefert ein Analytsubstitutreagenz (ASR), Assayverfahren, Vorrichtungen und Testkits zur Durchführung von Bindungsassays, die besonders nützlich zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Analyten von geringer molekularer Größe sind. Das ASR ist zur Reaktion mit geeigneten Assayreagenzbindungsgliedern fähig, und es kann dadurch nachweisbare ASR-Komplexe oder freies ASR in zur Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyt proportionalen Mengen ausbilden. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das ASR den Analyten bei der Bildung von nachweisbaren Komplexen ersetzen. Bei anderen Ausführungsformen kann das ASR verwendet werden, um nachweisbare Komplexe auszubilden, die der interessierende Analyt aufgrund von Größe, sterischer Hinderung oder epitopischen Beschränkungen nicht ausbilden könnte.
- In noch anderen Ausführungsformen ersetzt das ASR den Analyten bei der Bildung eines nachweisbaren Bindungsgliedkomplexes, wobei die Anwesenheit des nachweisbaren Komplexes auf einer festen Phase zu der Anwesenheit von Analyt in der Testprobe direkt proportional ist. Solch ein vorteilhaftes direktes Ergebnis, wird durch die konkurrierende Verwendung eines analytspezifischen Bindungsgliedes erzielt, das mit dem Analyt und dem ASR umgesetzt wird, wobei sich miteinander konkurrierend Analyt/bindendes Glied-Komplexe und ASR/bindendes Glied-Komplexe ausbilden. Die Menge an unkomplexiertem ASR, die dann verbleibt, ist zu der Menge an Analyt in der Testprobe dann direkt proportional. Das unkompleaxlerte ASR dient als Substitut für den Analyten bei der Ausbildung eines nachweisbaren Sandwichassaykomplexes.
- Das ASR umfaßt eine erste Komponente, die ein Analyt, ein Analytanalogon oder ein anderer Ligand ist, der wenigstens ein Epitop mit dem Analyten gemeinsam hat, wodurch das ASR zur Bindung an ein analytspezifisches bindendes Glied befähigt wird, und eine zweite Komponente, die ein Ligand ist, der selektiv mit einem ligandspezifischen bindenden Glied reagiert, die aber nicht gegenüber dem analytspezfischen bindenden Glied reaktiv ist (und das ligandspezifische bindende Glied ist auch nicht gegenüber dem analytspezifischen bindenden Glied reaktiv).
- Das Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Testprobe umfaßt das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit folgenden Reagenzien: einem ASR; einem ersten spezifisch bindenden Glied, das zur Bindung an ein Epitop befähigt ist, welches der Analyt aus der Testprobe und die Analytkomponente des ASR gemeinsam haben; einem Fangreagenz, das ein zweites spezifisch bindendes Glied umfaßt, das für die Ligandenkomponente des ASR spezifisch ist; und einem Indikatorreagenz, das ein drittes bindendes Gied umfaßt, das für die Analytkomponente des ASR spezifisch ist und eine Markierung, die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signales befähigt ist. Bei einem solchen Assay können das erste und das dritte spezifisch bindende Gied gleich sein. Alternativ kann das zweite spezifisch bindende Gied des Fangreagenzes für die Analytkomponente des ASR spezifisch sein, und das dritte spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes kann für die Ligandkomponente des ASR spezifisch sein. Die Testprobe kann mit den Assayreagenzien nacheinander einzeln oder in Kombination in Berührung gebracht werden. Das Assayverfahren kann ebenfalls das In-Kontakt-Bringen der Markierung des Indikatorreagenzes mit wenigstens einer zusätzlichen signalerzeugenden Substanz umfassen, die zur Reaktion mit der Markierung unter Ausbildung des nachweisbaren Signals fähig ist.
- Bei dem Assay konkurrieren das ASR und der Analyt der Testprobe um die Bindung an das erste spezifisch bindende Glied, wobei das freie oder ungebundene ASR zur Vervollständigung der Bildung eines Sandwichkomplexes mit den Fang- und Indikatorreagenzien dient. Die Markierung, die mit dem Komplex assoziiert ist oder die Menge an Indikatorreagenz, die nicht mit dem Komplex assoziiert, ist, wird dann nachgewiesen, um die Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe zu bestimmen.
- Abwandlungen der vorliegenden Erfindung umfassen Ausführungsformen, bei denen das erste spezifische Bindungsglied und das ASR als Tablette,, Kapsel, Pulver oder Flüssigreagenz- Konfiguration vorhanden sind, zu der die Testprobe hinzugegeben wird, Ausführungsformen in Form einer Vorrichtung, bei denen das Einfangreagenz auf einer festen Phase immobilisiert wird, so daß der resultierende Sandwichkomplex auf dem Festphasenmaterial immobllisiert wird, Ausführungsformen, bei denen das Assayverfahren den Schritt der Immobilisierung des Fangreagenzes auf einer festen Phase umfaßt, Ausführungsformen, wobei das Assayverfahren die Zugabe wenigstens eines spezifisch bindenden Hilfgliedes zur Vervollständigung der Assayreaktion, des Sandwichkomplexes, oder der Immobilisierung des Fangreagenzes umfaßt, und Ausführungsformen, bei denen mehrere Analyten auf dem Festphasenmaterial unter Verwendung mehrerer ASRs untersucht werden. Typischerweise dient das immobilisierte Fangreagenz als Detektionsstelle für den Sandwichkomplex in Assayvorrichtungen. Es werden jedoch Vorrichtungen in betracht gezogen, bei denen der Nachweis des Indikatorreagenzes an einer Stelle stattfindet, die von der Stelle, an der das Fangreagenz immobilisiert ist verschieden ist, oder die zusätzlich vorhanden ist.
- Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfaßt die Verwendung eines vorgebildeten Bindungskomplexes, der das ASR, ein Fangreagenz und ein Indikatorreagenz umfaßt. Bei der Zugabe der Testprobe nimmt man an, daß der Analyt der Testprobe das ASR an der Indikatorreagenzbindung ersetzt, was zu einer nachweisbaren Verdrängung des Indikatorreagenzes aus dem Komplex führt.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Testkits für die Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Testprobe. Die Kits umfassen ein ASR und andere Reagenzien, die für das gewünschte Bindungsassay notwendig sind. Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung Assayvorrichtungen, insbesondere solche, die die Herstellung von selbst-durchführenden Assays erlauben, d. h. die feste Phase kann eine ausreichende Anzahl von Bereichen oder Schichten umfassen, die die Assayreagenzien in einer Anordnung enthalten, die derart ist, daß sich das Assay im wesentlichen bei Zugabe von Testprobe von selbst durchführt.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Zugabe eines Tensids zu dem Indikatorreagenz entweder während der Herstellung des Indikatorreagenzes oder vor der Verwendung des Indikatorreagenzes in einem Assay. Die Zugabe eines Tensids, verbessert die Leistung des Indikatorreagenzes wesentlich, und sie kann sogar Indikatorreagenzien wiederbeleben, die inaktiv erscheinen, oder deren Aktivität nachgelassen hat.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt Assayverfahren und Testkits für die Durchführung von Festphasenassays, die ein ASR verwenden, das zur Ausbildung eines nachweisbaren Bindungsgliedkomplexes befähigt ist, welcher der Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprbobe entspricht. Das ASR umfaßt eine erste Komponente, die wenigstens ein Epitop mit dem interessierenden Analyten gemeinsam hat, wodurch der ersten Komponente erlaubt wird, an ein analytspezifisches bindendes Glied zu binden, und eine zweite Komponente, die ein Ligand ist, der selektiv mit einem ligandspezifischen bindenden Glied wechselwirkt, die aber nicht gegenüber dem analytspezifischen bindenden Glied reaktiv ist.
- Die folgenden Ausdrücke werden hierin in Übereinstimmung mit der bekannten Technik der Bindungsassays verwendet.
- Der Ausdruck "spezifisch bindendes Glied" bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, d. h. zwei verschiedene Moleküle, bei denen eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich zu spezifisch bindenden Paaren aus Antigen und Antikörper umfassen andere spezifisch bindende Paare beispielsweise ohne Einschränkung Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lektine, komplementäre Nukleotidsequenzen, komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme, eine Peptidsequenz und einen Antikörper, der für die Sequenz oder für das ganze Protein spezifisch ist, Polymere Säuren und Basen, Farbstoffe und Proteinbinder, Peptide und spezifischen Proteinbinder (zum Beispiel Ribonuklease-S-Peptid und Ribonuklease-S-Protein), und dergleichen. Darüber hinaus können spezifisch bindende Paare Glieder umfassen, die Analoga des ursprünglichen spezifisch bindenden Giedes sind, zum Beispiel ein Analyt-Analogon. Wenn das spezifisch bindende Glied ein Immunreaktant ist, kann es zum Beispiel ein Antikörper, Antigen, Hapten oder Komplex desselben sein, und wenn ein Antikörper verwendet wird, kann er ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein rekombinantes Protein oder Antikörper, eine Mischung oder ein Fragment, oder deren Mischungen oder Fragmente, als auch eine Mischung eines Antikörpers und andere spezifisch bindende Glieder sein. Die Einzelheiten der Herstellung solcher Antikörper und ihre Eignung zur Verwendung als spezifisch bindende Glieder, sind dem Fachman gut bekannt.
- Der Ausdruck "Analyt", bezieht sich auf die Verbindung oder Zusammensetzung, die nachgewiesen oder gemessen werden soll, die wenigstens ein Epitop oder eine Bindungsstelle aufweist. Der Analyt kann jedwede Substanz sein, für die ein natürlich vorkommendes analytspezifisches bindendes Glied existiert, oder für die ein analytspezifisches bindendes Glied hergestellt werden kann. Die Analyten umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Drogen (einschließlich denen, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, wie auch denen die für illegale Zwecke verabreicht werden) , und Metaboliten von oder Antikörper gegen jede der oben genannten Substanzen. Der Ausdruck "Analyt", umfaßt ebenfalls alle antigenische Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen derselben, welche bei Immunoassays von Interesse sind. Die Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung, können ebenfalls ausgelegt werden, um interessierende Analyten in Nahrungsmittelprodukten und Analyten, die eine Bedeutung für die Umwelt haben, zu bestimmen.
- Der Ausdruck "Analyt-Analogon", bezieht sich auf eine Substanz, die mit dem analytspezifischen Bindungsglied kreuzreagiert, obwohl sie dies zu einem höheren oder geringeren Ausmaß als der Analyt selbst vermag. Das Analyt-Analogon kann einen abgewandelten Analyten, wie auch einen fragmentierten oder synthetischen Anteil des Analytmoleküls umfassen oder einen im wesentlichen unterschiedlichen Liganden, sofern das Analyt- Analogon wenigstens eine epitopische Stelle mit dem interessierenden Analyten gemeinsam hat. Ein Belspiel für ein Analyt-Analogon ist eine synthetische Peptidsequenz, die wenigstens ein Epitop des Vollmolekülanalyten wiederholt, so daß das Analyt-Analogon an das analytspezifische bindende Glied binden kann.
- Der Ausdruck "Ligand", bezeichnet jedwede Substanz, für die ein ligandspezifisches bindendes Glied natürlicherweise existiert oder hergestellt werden kann, die aber eine Substanz ist, die nicht typischerweise in einer Testprobe aufgefunden wird, oder wenigstens ist sie nicht in einer Menge vorhanden, die erkennenswertermaßen, mit der Bindung des ASR oder dem Nachweis oder der Messung des interessierenden Analyten interferieren würde. Ahnlich ist das ligandspezifische bindende Glied keine Substanz, die typischerweise in einer Testprobe gefunden wird.
- Der Ausdruck "spezifisch bindendes Hilfsglied" bezeichnet ein spezifisches bindendes Glied, das in dem Assay zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern des Fangreagenzes und des Indikatorreagenzes verwendet wird. Ein oder mehrere spezifisch bindende Glieder können in einem Assay verwendet werden. Zum Beispiel kann ein spezifisch bindendes Hilfsglied verwendet werden, um die Ausbildung eines bindenden Komplexes zwischen der Analytkomponente des ASR und dem Indikatorreagenz zu vervollständigen. Alternativ kann ein spezifisch bindendes Hilfsglied verwendet werden, um das Fangreagenz auf einer festen Phase über eine Bindungsreaktion zu immobilisieren, die bei der Vervollständigung des Sandwichkomplexes behilflich ist. Daher kann ein spezifisch bindendes Hilfsglied einfach verwendet werden, um ein Assayreagenz direkt oder indirekt an die ASR, eine feste Phase oder eine Markierung anzubinden.
- Der Ausdruck "Testprobe", bezieht sich typischerweise auf ein natürlich vorkommendes oder künstlich gebildetes flüssiges Testmedium, von dem angenommen wird, daß es den interessierenden Analyten enthält. Die Testprobe ist allgemein eine biologische Flüssigkeit oder eine Verdünnung davon. Biologische Flüssigkeiten, in denen ein Analyt bestimmt zu werden vermag, umfassen Serum, Vollblut, Plasma, Urin, Speichel, Fruchtwasser und Rückenmarksflüssigkeiten und dergleichen, und sie umfassen solche Flüssigkeiten nach der Behandlung durch Extraktion, Verdünnung oder andere Probenbehandlungslösungen. Die Testprobe kann ebenfalls ein festes Material (z. B. Haar, Gewebe usw.) umfassen, das verändert worden ist, so daß es ein flüssiges Testmedium ausbildet.
- Typischerweise verwenden die Bindungsassays der vorliegenden Erfindung ein Indikatorreagenz, um die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Testprobe anzuzeigen, und ein Fangreagenz, das direkt oder indirekt einem Festphasenmaterial verankert ist, um den Bindungsreaktionskomplex von der Testprobe und den Assayreagenzien zur erleichterten Beobachtung abzutrennen. Zusätzliche Substanzen können in Abhängigkeit von dem gewünschten Assayverfahren verwendet werden.
- Das Indikatorreagenz umfaßt typischerweise eine Markierung und ein spezifisch bindendes Glied. Das Indikatorreagenz ist zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt, das mit der Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe korreliert werden kann. Im allgemeinen wird das Indikatorreagenz nach der Immobilisierung auf einem Festphasenmaterial nachgewiesen oder gemessen, jedoch kann auch freies oder ungebundenes Indikatorreagenz ebenfalls nachgewiesen oder gemessen werden, um das Ergebnis eines Assays zu bestimmen. Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes kann ein Glied jedweden spezifischen Bindungspaares wie oben beschrieben sein. Die Markierung des Indikatorreagenzes ist eine Substanz, die zur Erzeugung eines Signals befähigt ist, das visuell oder instrumentell nachweisbar ist.
- Geeignete Markierungen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen Chromogene, Katalysatoren, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Isotope, direkte visuelle Markierungen, umfassend kolloidale metallische und nicht-metallische Partikel, Farbstoffpartikel, Enzyme oder Substrate oder organische Polymerlatexpartikel, Liposome oder andere Vesikel, die signalerzeugende Substanzen enthalten und dergleichen.
- Eine große Anzahl von Enzymen, die zur Verwendung als Markierung geeignet sind, sind im U.S. Patent Nr. 4 275 149, Spalten 19-23 offenbart, daß hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung mit aufgenommen wird. Zum Beispiel ist ein Enzym/Substrat-System, das ein Signal erzeugt, das bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, das Enzym alkalische Phosphatase, wobei das verwendete Substrat, Nitroblautetrazolium-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat oder ein Derivat oder Analogon davon ist.
- Bei einem alternativen signalerzeugenden System kann die Markierung eine fluoreszente Verbindung sein, wenn keine enzymatische Einwirkung auf die Markierung notwendig ist, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Fluoreszente Moleküle, wie etwa Fluorescein, Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate und Analoga sind zur Verwendung als Markierungen bei dieser Reaktion geeignet.
- Bei bevorzugten Assayverfahren wird eine visuell nachweisbare farbige Partikel als Markierung verwendet, wobei eine direkte farbige Anzeige der Anwesenheit oder Konzentration des Analyten in der Testprobe zur Verfügung gestellt wird, ohne daß die Zugabe zusätzlicher signalerzeugender Reagenzien notwendig ist. Die Materialien, die als farbige Partikel verwendet werden, umfassen kolloidale Metalle, wie etwa Gold und Farbstoffpartikel, wie dies in den U.S. Patenten mit den Nr. 4 313 734 und 4 373 932 offenbart ist, die hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen werden. Die Herstellung und die Verwendung nicht-metallischer Kolloide, wie etwa kolloidaler Selenpartikel, sind in EP 0 295 368 des gleichen Anmelders, die am 11. Januar 1989 veröffentlicht wurde, offenbart. Die Verwendung von Markierungen aus kolloidalen Partikeln in der Immunchromatographie, ist in EP 0 299 428 des gleichen Anmelders offenbart, die am 18. Januar 1989 veröffentlicht wurde. Organische Polymerlatexpartikel zur Verwendung als Markierungen sind in der EP 0 360 088 offenbart, die am 28. März 1990 veröffentlicht wurde.
- Die Auswahl einer besonderen Markierung ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich, so lange die ausgewählte Markierung zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals entweder von sich aus oder zusammen mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen befähigt ist. Eine Vielzahl verschiedener Indikatorreagenzien kann ausgebildet werden, indem entweder die Markierung oder das spezifische bindende Glied verändert wird.
- Das Fangreagenz der vorliegenden Erfindung ist ein spezifisch bindendes Glied, das typischerweise an einem Festphasenmaterial verankert ist. Allgemein dient das immobilisierte Fangreagenz der Immobilisierung des Assayreaktionsproduktes zum Nachweis und/oder der Messung desselben auf dem Festphasenmaterial. Das Fangreagenz kann jedwede Substanz sein, die zur spezifischen Bindung mit einer anderen befähigt ist. Das Fangreagenz umfaßt bindende Glieder, die zur Bindung an die Analytkomponente des ASR, des Ligandkomponente der ASR oder an ein spezifisch bindendes Hilfsglied befähigt sind.
- Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls ein Fangreagenz umfassen, das nicht anfänglich an einer festen Phase verankert ist. Sobald die Komplexausbildung zwischen den Assayreagenzien stattfindet, kann die feste Phase als Trennungsmechanismus verwendet werden: Die Reaktionsmischung wird mit dem Festphasenmaterial in Kontakt gebracht, und der/die neu ausgebildeten Sandwichkomplex(e), werden von dem Festphasenmaterial zurückgehalten. Es können alternative Verfahren verwendet werden, um diesen Trennungsschritt durchzuführen, wie etwa die Verwendung einer festen Phase, die ihrerseits das Fangreagenz bindet; das Anbinden der festen Phase an ein bindendes Glied, das für das Fangreagenz spezifisch ist; oder das Anbinden der festen Phase an ein reaktives Agens, wie etwa eine geladene Substanz, die eine entgegengesetzt geladene Substanz, die an das Fangreagenz gebunden worden ist, anzieht und bindet, wie es in der EP 0 326 100, veröffentlicht am 2. August 1989, des gleichen Anmelders offenbart ist.
- Ausfällungs- oder Agglutinationsassays werden ebenfalls zur Verwendung des ASR und des neuartigen Assayformates der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
- Die Assayvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann viele Konfigurationen aufweisen, von denen viele von dem für die feste Phase ausgewählten Material abhängig sind. Oft ist das Festphasenmaterial jedwedes geeignete chromatographische saugfähige, poröse oder kapillare Material. Bei der vorliegenden Erfindung kann das Festphasenmaterial ein Glasfaser-, Zellulose- oder Nylonkissen zur Verwendung in einer Duchflußassayvorrichtung umfassen, die ein oder mehrere Schichten aufweist, die ein oder mehrere der Assayreagenzien enthalten; sie kann ein Tauchstäbchen für ein Eintauch- und Ableseassay umfassen; einen Teststreifen für chromatographische (z. B. Papier- oder Glasfaser) oder dünnschicht chromatographische (z. B. Nitrozellulose) Verfahren, bei dem eines oder mehrere Reagenzien, in abgetrennten, oder nichtüberlappenden Bereichen eines einzelnen Streifens eines Festphasenmaterials enthalten sind; oder das Festphasenmaterial kann ein absorbierendes oder Filmmaterial umfassen, da dem Fachmann gut bekannt ist. Das Festphasenmaterial kann ebenfalls ohne Einschränkung Polyacrylamidperlen, Polystyrolperlen oder Röhrchen, magnetische Perlen, eine Mikrotiterplatte oder ein Reagenzglas aus Glas oder Plastik oder andere feste Materialien umfassen, wie etwa einen Bogen, ein Blatt oder ein Blättchen, das eine glatte Oberfläche, Vertiefungen oder Kanäle aufweist.
- Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch abgewandelt sind, können als Festphasenmaterial verwendet werden, einschließlich Polysacchariden, z. B. Zellulosematerialien, einschließlich Papier, Zellulose und Zellulosederivat, wie etwa Zelluloseacetate und Nitrozellulose, Silica, Glasfaser, anorganische Materialien, wie deaktiviertes Alumina, Diatomeenerde oder andere anorganische fein verteilte Materialien, die einheitlich in einer porösen polymeren Matrix verteilt sind, wobei die Polymere etwa Vinylchlorid, Vinylchloridpropylencopolymer und Vinylchloridvinylacetat- Copolymer, Stoff, sowohl natürlich vorkommender (Baumwolle) und synthetischer (z. B. Nylon) sind, poröse Gele, wie etwa Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine, Polymerfilme, wie etwa Polyacrylamid, magnetische Partikel, Mikrotiterplatten, Polystyrolröhrchen, proteinbindenden Membranen, Agarose, Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.); Trisacryl (Pointet-Girard, France) ; Siliziumpartikel, poröse Fasermaterialien und dergleichen. Das Festphasenmaterial sollte eine vernünftige inherente Festigkeit aufweisen, oder aber die Festigkeit kann mittels eines getrennten Trägermaterials erzeugt werden.
- Das Fangreagenz der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf ein spezifisch bindendes Glied beschränkt, das direkt oder indirekt an ein unlösliches Festphasenmaterial gebunden ist. Bei einem Agglutinationsassay kann z. B. das spezifisch bindende Glied des Fangreagenzes an ein lösliches Trägermaterial wie etwa Rinderserumalbumin gebunden sein.
- Obwohl es für die vorliegende Erfindung nicht kritisch ist, kann das Fangreagenz ebenfalls auf Partikel, z. B. "Perlen" oder "Mikropartikel" aufgezogen sein, die durch ein zusätzliches Festphasengrundmaterial filtriert oder zurückgehalten und immobilisiert werden können. Mit "zurückgehalten und immobilisiert", ist gemeint, daß die Partikel, sobald sie auf das Festphasenmaterial gelangen, nicht zu wesentlicher Bewegung zu Positionen anderswo innerhalb des Materials befähigt sind.
- Die Partikel können vom Fachmann aus jedweder Sorte von partikelförmigem Material ausgewählt werden, wie etwa aus solchem, das aus Polystyrol, Polymethylacrylat, Polyacrylamid, Polypropylen, Latex, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien besteht.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Zugabe eines Tensids zu dem Indikatorreagenz. Bei einigen Beispielen kann die Aktivität des Indikatorreagenzes während der Lagerung abnehmen. Die Zugabe eines Tensides zu dem Indikatorreagenzverdünnungspuffer verbessert die Leistung des Indikatorreagenzes wesentlich und kann sogar die Indikatorreagenzien wiederbeleben, die inaktiv erscheinen oder die eine stark verminderte Aktivität aufweisen. Als Ergebnis der verbesserten Leistung des tensidbehandelten Indikatorreagenzes, kann die Menge an Indikatorreagenz, die zur Durchführung eines Assays notwendig ist, manchmal vermindert werden.
- Die Menge und Sorte an Tensid, die verwendet wird, kann in Abhängigkeit von dem spezifisch bindenden Glied, der Markierung und dem Kupplungsverfahren, das zur Ausbildung des Indikatorreagenzes verwendet wurde, schwanken. Die Wirkung des Tensides auf die Stabilität des spezifisch bindenden Gliedes oder auf die Aktivität der Markierung ist bei der Auswahl der geeigneten Sorte und Menge an Tensid wichtig. Vorzugsweise erhält die Tensidsorte und -menge die Stabilität des spezifisch bindenden Giedes und der Markierung, des Tensid es ist vorzugsweise mit den anderen Assayreagenzien kompatibel, und es beeinflußt nicht die gewünschten Bindungsreaktionen der Assayreagenzien. Darüber hinaus ist die Menge an Tensid, die zum Erhalt der Aktivität des Indikatorreagenzes notwendig ist, allgemein geringer, als die Menge, die zur Wiederbelebung eines inaktiven Indikatorreagenzes benötigt wird. Wenn alternativ die Langzeitstabilität des Indikatorreagenzes durch den Kontakt mit dem Tensit nachteilig beeinflußt wird, kann das Tensid zu dem Indikatorreagenz kurz vor dessen Verwendung in dem Assay zugesetzt werden. Nicht einschränkende Beispiele für Tenside, die verwendet werden können, und zwar einzeln oder in Kombination, umfassen Alkylpyranoside, Polyoxyethylensorbitane (Tweene), Polyoxyethylenether (z. B. Tritone , Röhm & Haas Co.), Polyglykolether (z. B. Tergitol , Union Carbide Corp.), Sorbitane (Spans), andere nicht-ionische Detergenzien, anionische Detergenzien (wie etwa Dodecylsulfatsalze), kationische Detergenzien, (wie etwa Alkylammoniumsalze) und zwitterionische Detergenzien (wie etwa Chaps).
- Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren Reagenzienkits zur Verfügung, die die ASRs und die Komponenten zur Durchführung der Assayverfahren der Erfindung umfassen. Die Kits können ungebundenes ASR oder ein ASR umfassen, das Teil eines vorgebildeten Komplexes ist, der desweiteren eines oder mehrere spezifisch bindende Glieder umfaßt.
- Das ASR weist wenigstens zwei Komponenten auf, wobei die erste der beiden mit dem interessierenden Analyten oder einem Analogon desselben identisch ist, während die zweite ein nicht verwandter Ligand oder ein Nichtanalyt ist. Daher kann die erste Komponente des ASR ein Analyt, wie etwa ein Wirkstoff oder ein Wirkstoffanalogon sein, und die zweite Komponente kann jedwede Substanz oder jedweder Ligand sein, der von dem Analyt verschieden ist, sofern die Substanz nicht typischerweise in freier Form in der Testprobe vorhanden ist oder sofern sie wenigstens nicht in einer Menge vorhanden ist, die mit der Assayreaktion interferiert. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß die Testprobe vor der Verwendung behandelt werden kann, um interferierende Liganden zu entfernen.
- Mit dem ASR der vorliegenden Erfindung wird das positive Auffinden eines Analyten, der ein einzelnes Epitop aufweist, das für die Bindung zugänglich ist, vorteilhafterweise durch das Auftauchen oder durch den Anstieg eines Signals angezeigt, d. h. das nachweisbare Signal steigt proportional mit der Konzentration des Analyten in der Testprobe an. Dies wird erreicht, weil das ASR als multiepitopisches Substitut für den Analyten dient, wobei die Ausbildung eines nachweisbaren bindenden Komplexes direkt proportional zur Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe erlaubt wird. Das ASR liefert wenigstens zwei Bindungsstellen, so daß wenigstens zwei zusätzliche bindenden Glieder, z. B. ein Fangreagenz und ein Indikatorreagenz, an das ASR unter Ausbildung eines Immunkomplexes binden können, der die Anwesenheit oder Menge von Analyt in der Probe anzeigt.
- Obwohl das ASR zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines großen Bereiches von Analyten, einschließlich hochmolekulargewichtigen Analyten (4 000 bis 2 000 000) nützlich ist, ist es besonders gut für die Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Analyten von niedrigem Molekulargewicht, wie etwa Analyten innerhalb des Molekulargewichtsbereiches von 50 bis 4.000 geeignet. Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Bestimmung der Anwesenheit oder Mehge von Analyten vorteilhaft, die Molekulargewichte im Bereich von 100 bis 2 000 aufweisen, einschließlich Steroiden, Vitaminen, Prostaglandinen, antiasthmatischen Wirkstoffen, antiarrhythmischen Wirkstoffen, antineoplastischen Wirkstoffen, antikonvulsiven Wirkstoffen, Antibiotika, antiarthritischen Wirdstoffen, antidepressiven Wirkstoffen und von Wirkstoffen, die mißbraucht werden können, wie etwa Kokain, Morphin, Heroin, Amphetamin, Methamphetamin, Cannabinolen und dergleichen.
- Das Problem, dem bei herkömmlichen Assays für viele dieser niedermolekulargewichtigen Analyten begegnet wird, ist das jenige, daß die Analyten zu klein sind, um die Bindung zweier bindender Gieder an einen Analyten zum gleichen Zeitpunkt zu erlauben. Das Sandwichassayformat benötigt die Anwesenheit von wenigstens zwei bindenden Stellen oder Epitopen auf dem Analytmolekül, wobei ausreichend Distanz zwischen diesen beiden Bindungsstellen vorhanden sein muß, um den beiden bindenden Gliedern zu erlauben, gleichzeitig an den Analyten zu binden, ohne einander räumlich zu behindern.
- Das niedrige Molekulargewicht ist jedoch nicht der einzige Parameter zur Bestimmung, welche Analyten für solche Analysen durch die vorliegende Erfindung besonders geeignet sind. Z. B. kann ein kompaktes Molekül tatsächlich schwerer als ein nicht kompaktes Molekül sein, obwohl beide die gleiche Länge bezüglich ihrer längstens Ausdehnung aufweisen. Darüber hinaus kann der Analyt zwei Epitope aufweisen, die für die Bindung der Antikörper geeignet sind, aber es kann sein, daß die Epitope nicht an den beiden Stellen des Analytmoleküles angeordnet sind, die eine ausreichende Entfernung voneinander aufweisen um die Bindung ohne räumliche Behinderung zu erlauben. Oder aber gewisse Analyten, wie etwa Haptene, können nur eine einzige zugängliche Bindungsstelle aufweisen. Daher ist die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf niedermolekulargewichtige Analyten beschränkt, obwohl das Molekulargewicht in der Beschreibung als anschauliche Größe für die Molekülsorten verwendet wird, die vorteilhafterweise mittels der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden.
- Bei der vorliegenden Erfindung ist der erste Bestandteil des ASR ein Analyt oder ein Analytanalogon, der/das wenigstens ein Epitop mit dem bei dem Assay interessierenden Analyten gemeinsam hat. Z. B. kann das Analytanalogon von dem korrespondierenden Analyten mittels der Entfernung eines reaktiven Wasserstoffatoms (z. B. eines Wasserstoffatomes, das an einen Hydroxysauerstoff gebunden ist) oder eines reaktiven Amins (primär oder sekundär) abgeleitet werden, oder aber durch die Bildung eines Aminoderivates des Analyten, wobei eine Immunogruppe ein oder mehrere Atome ersetzt, die ursprünglich an der Bindungsstelle der Ligandkomponente des ASR in dem Analyt vorhanden waren. Andere reaktive Gruppen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Carbonsäuren, Nitrile, Halogene und dergleichen. Substanzen, die anschauliche Beispiele für Analyten sind, die bei Entfernung eines reaktiven Wasserstoffes Analytanaloga ausbilden, umfassen Procainamid, Thyroxin und Chinidin. Analyten, deren Aminoderivate als Analytanaloga nützlich sind, umfassen Theophyllin, Valproinsäure, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Disopyramid, Digoxin, Chloramphenicol, Salicylat, Acetaminophen, Carbamazepin, Desipramin und Nortriptylin. Zusätzlich kann der Analyt strukturell durch den Zusatz oder die Löschung einer oder mehrerer funktioneller Komponenten oder Bindungsstellen abgewandelt werden, wobei ein Analytanalogon ausgebildet wird, wie etwa eine anteilige Peptid- oder Nukleotidsequenz, die eine kleinere Sequenz als die gesamte Analytsequenz ist, die aber die notwendigen epitopischen Stellen zur Bindung an ein analytspezifisches bindendes Glied beibehält. Z. B. kann das Analytanalogon eine synthetische Peptidsequenz sein, die wenigstens ein Epitop mit dem Analyten gemeinsam hat.
- Die zweite oder Ligandkomponente des ASR umfaßt allgemein, ohne darauf beschränkt zu sein, Avidin, Biotin, Fluorescein, ein Fluoresceinderivat, Rhodamin oder ein Rhodaminderivat. Die Fluoresceinverbindungen können folgendes umfassen: Fluoceszeinamin, Fluoresceinthioisocyanat, Carboxyfluorescein, α-Jodazetamidofluorescein, (2,3,-Dichlor- 1,3,5-triazin-2-ylamino)fluorescein (DTAF), (4-Chlor-6-methoxy- 1,2,5-triazin-2-ylamino)fluorescein, und Aminomethylfluorescein. Wenn Biotin als die Ligandkomponente des ASR verwendet wird, kann sein komplementäres spezifisch bindendes Glied Avidin oder ein Antibiotin-Antikörper sein. Wenn die Ligandenkomponente des ASR Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat ist, ist das bevorzugte spezifisch bindende Glied für den Liganden ein Antifluorescein-Antikörper. Fluorescein ist zur Verwendung als Ligandkomponente des ASR besonders vorteilhaft, weil Antikörper gegen Fluorescein leicht erhältlich sind. Es wird jedoch in Betracht gezogen, daß die Ligandkomponente des ASR in beliebiger Weise jedwedes spezifisch bindende Glied wie oben beschrieben sein Kann, das nicht mit dem Assayreagenz und der Analytbindung interferiert. Daher kann die Ligandkomponente ein anderes Antigen, ein Antikörper, eine Peptidsequenz, eine Nukleotidsequenz usw. sein, die nicht mit dem Analyt oder dem analytspezifischen bindenden Glied verwandt ist.
- Bei der vorliegenden Erfindung können die beiden Komponenten des ASR irreversibel aneinander gebunden sein. Verschiedene molekulare Brücken oder Verbindergruppen können ebenfalls verwendet werden, um die Analytkomponente an die Ligandkomponente anzubinden. Z. B. kann die verbindende Gruppe zwischen einem Analytanalogon und einem Fluoresceinderivat bis zu sienen Heteroatome und insgesammt 0-20 Kohlenstoffatome und Heteroatome umfassen, die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet sind, und die bis zu 2 Ringstrukturen enthalten. Die Betrachtungen, die zur Auswahl des Typus des Verbindungsmechanismus angestellt werden müssen, der zur Ausbildung des ASR verwendet wird, sind diejenigen, daß die Bindung des Liganden an den Analyten oder an das Analytanalogon nicht mit der Fähigkeit beider Komponenten interferieren darf, an ihre jeweiligen spezifisch bindenden Partner zu binden, und daß der Verbindungsmechanismus nicht mit der Fähigkeit des ASR interferieren darf, einen Komplex aus bindenden Gliedern auszubilden.
- In einer Assayvorrichtung oder einem Kit kann das ASR anfänglich als Reagenz zur Verfügung gestellt sein, das reversibel an ein erstes spezifisch bindendes Glied gebunden ist, wobei der Analyt aus der Testprobe das ASR aufgrund der konkurrierenden Bindung des Analyten an das erste spezifisch bindende Glied verdrängt. Typischerweise sind sowohl das ASR als auch das erste spezifisch bindende Glied vorhanden, ohne daß sie vor dem Assayverfahren geköppelt oder gebunden sind. Der ASR/erstes spezifisch bindendes Glied-Komplex oder die Mischung kann eine Vielzahl von Konfigurationen einnehmen, wie etwa ein gefriergetrocknetes Pulver, eine Tablette, eine Kapsel oder ein flüssiges Reagenz.
- Das ASR kann in einer Vielzahl von Bindungsassaykonfigurationen verwendet werden, und die folgenden Verfahren zur Verwendung der vorliegenden Erfindung dienen als Beschreibung, aber nicht als Einschränkung der Erfindung. Typischerweise sind die Assays "direkte" Assays, insofern, als daß die spezifisch bindenden Glieder des Indikators und der Fangreagenzien direkt mit dem ASR unter Ausbildung eines bindenden Komplexes reagieren. "Indirekte" Assays werden ebenfalls zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, z. B. ein Assay, bei dem das spezifisch bindende Glied des Indikators für ein spezifisch bindendes Hilfsglied spezifisch ist, welches seinerseits für das ASR spezifisch ist.
- Zusätzlich können die Assays auf eine Vielzahl von Weisen durchgeführt werden. Testprobe, ASR, erstes spezifisch bindendes Glied und Fangreagenz, können gleichzeitig in dem Assay kombiniert werden, oder sie können einzeln zugesetzt und inkubiert oder in Kombinationen in einer Vielzahl von Abfolgen, in denen die Bindung eines Reagenzes die Bindung des anderen nicht verhindert oder hemmt, zugesetzt und inkubiert werden. Das Indikatorreagenz kann gleichzeitig zusammen mit den anderen Reagenzien und der Testprobe zugesetzt werden, aber typischerweise wird das Indikatorreagenz nachdem die anderen Reagenzien abreagiert sind zugesetzt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die Reihenfolge, in der die Reagenzien zusammengegeben werden, wie sie in den folgenden allgemeinen und eingehenden Beispielen beschrieben ist, nicht als Einschränkung für das Assayverfahren auf diese besondere Reihenfolge ausgelegt werden darf. Es ist jedoch vorzuziehen, das ASR und das erste spezifisch bindende Glied nicht vor der Zugabe der Testprobe umzusetzen, weil die Verdrängung des ASR von dem ersten spezifischen Glied durch den Analyt aus der Probe mehr Zeit benötigen kann, als dies die konkurrierende Bindung zwischen dem ASR und dem Analyten um das erste spezifisch bindende Glied tut.
- Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden vorbestimmte Mengen an ASR und eines ersten spezifisch bindenden Gliedes (z. B. an anti-Analytantikörper) mit einer Testprobe in Kontakt gebracht. Wenn der interessierende Analyt in der Probe vorhanden ist, konkurriert der Analyt mit dem ASR um die Bindung an das erste spezifisch bindende Glied, oder der Analyt verdrängt das ASR aus dem ersten spezifisch bindenden Glied. Als Ergebnis ist die verbleibende Menge oder das "freie" ASR zur Menge an Analyt in der Testprobe proportional.
- Die Mischung wird dann mit einem Fangreagenz, z. B. einem zweiten spezifisch bindenden Glied wie etwa einem anti- Ligandantikörper, der auf einen Festphasenmaterial immobilisiert ist, in Kontakt gebracht. Einiges oder das ganze freie ASR wird auf der festen Phase über das Fangreagenz immobilisiert, das an die Ligandkomponente des ASR bindet. Das immobilisierte ASR kann dann durch Zugabe eines Indikatorreagenzes nachgewiesen werden, das ein drittes spezifisch bindendes Glied umfaßt, das an eine Markierung konjugiert ist, wobei das dritte spezifisch bindende Glied zur Bindung an die Analytkomponente des ASR fähig ist, wobei ein nachweisbarer oder meßbarer Fangreagenz/ASR/Indikatorreagenz-Komplex auf der festen Phase ausgebildet wird. Das dritte spezifisch bindende Glied kann mit dem ersten spezifisch bindenden Glied identisch sein, und daher kann in diesem Beispiel das Indikatorreagenz ein zweiter anti- Analytantikörper sein, der an eine Markierung konjugiert ist. Die Markierung ist zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals entweder allein oder durch Wechselwirkung mit zusätzlichen Gliedern eines signalerzeugenden Systems fähig.
- Da die Menge an immobilisiertem ASR zu der Menge an Analyt in der Testprobe direkt proportional ist, ist die Menge an immobilisiertern Indikatorreagenz direkt zu der Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe proportional; das nachweisbare Signal oder die Geschwindigkeit der Signalerzeugung wächst, sowie die Menge an Analyt in der Probe zunimmt.
- Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Fangreagenz ein analytspezifisches Bindungsglied auf dem Festphasenmaterlal sein, und das Indikatorreagenz kann ein markiertes ligandspezifisches bindendes Glied sein. Andere Varianten umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein: die Verwendung von Mehrschichtfestphasenvorrichtungen, bei denen eines oder mehrere der notwendigen Assayreagenzien diffusiv (d. h., sie sind zur Wanderung durch die feste Phase befähigt), oder nicht-diffusiv (d. h. innerhalb oder auf der festen Phase immobilisiert) in oder auf einer oder mehreren der Schichten eingebaut sind; die Verwendung von Teststreifenmaterialien für kapillare, absorbierende oder chromatographische Assays, bei denen eines oder mehrere der notwendigen Assayreagenzien diffusiv oder nicht-diffusiv in oder auf dem Teststreifen in einem oder mehreren Bereichen oder an einer oder mehreren Stellen eingebaut ist oder sind; und die Ausbildung von Fangreagenz/ASR/Indikatorreagenz-Komplexen in Lösung, wobei der Komplex entweder in Lösung nachgewiesen wird, oder aber nachdem der Komplex von der Lösung mittels einer festen Phase abgetrennt wurde. Wie dem Fachmann bekannt, kann das Festphasenmaterial so ausgelegt werden, daß es eine ausreichende Anzahl von Bereichen oder Schichten umfaßt, die die Reagenzien enthalten, die für das Assay notwendig sind, so daß das Assay im wesentlichen selbstdurchführend ist, sobald eine Testprobe zugegeben wurde.
- Obwohl das ASR der vorliegenden Erfindung insbesondere in den Fällen vorteilhaft ist, in denen der Analyt monovalent oder zu klein ist, um die gleichzeitige Bindung zweier spezifisch bindender Glieder zu erlauben, ist dessen Verwendung ebenfalls bei Assays auf größere Analyten nützlich. Z. B. macht es die vorliegende Erfindung überflüssig, daß ein Assay zwei Antikörper umfassen muß, die zur Bindung an den gleichen Analyten befähigt sind, ohne miteinander zu interferieren. Stattdessen wird nur ein anti-Analytantikörper gebraucht, um an die Analytkomponente des ASR zu binden, und der zweite Antikörper oder das zweite spezifisch bindende Glied muß nur zur Bindung der Ligandkomponente des ASR befähigt sein, um die Ausbildung des Bindungsreaktionskomplexes zu vervollständigen. Dieser Lösungsansatz verhindert die Probleme der Antikörpererkennung von überlappenden Epitopen und erleichtert dadurch die Verwendung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern in Sandwichassays. Darüber hinaus kann das gleiche ligandspezifische bindende Glied als allgemeines Reagenz in vielen verschiedenen Assays verwendet werden, weil das gleiche spezifisch bindende Glied als die Ligandkomponente vieler unterschiedlicher Analyt/Ligandkombinationen verwendet werden kann. Daher kann ein einzelnes Indikatorreagenz (z. B. ein markierter anti-Ligandantikörper) oder ein einzelnes Festphasensystem, das ein Festphasenmaterial und ein immobilisiertes Fangreagenz umfaßt (z. B. immobilisierten anti- Ligandantikörper) ohne Abwandlung in vielen verschiedenen Assays verwendet werden, wodurch die Einfachheit der Assaydurchführung erhöht und die Kosten der Vorrichtungsherstellung vermindert werden.
- Zusätzlich kann ein Assay durchgeführt werden, bei dem ein Sandwichkomplex aus Fangreagenz/ASR/Indikatorreagenz vorgebildet wird, und kein erstes spezifisch bindendes Glied verwendet wird. Dieser vorgebildete Komplex kann ebenfalls an einem Festphasenmaterial vorverankert sein. Dieses Verfahren wird als Revers-Assay bezeichnet, bei dem der Analyt (wenn er in der Testprobe vorhanden ist) an das Indikatorreagenz bindet und es von der festen Phase verdrängt, wodurch das Signal, das im Zusammenhang mit der festen Phase an der Stelle des immobilisierten Fangreagenzes auftritt, abnimmt. Dieses Verfahren erlaubt ebenfalls die Durchführung eines Multianalytenassays, das getrennte Ergebnisse für jeden Analyten liefert, unter Verwendung eines "allgemeinen" Fangreagenzes, wie etwa eines anti-Fluoresceinantikörpers, der sich an drei verschiedenen Stellen auf der festen Phase befindet. Z. B. kann ein unterschiedlicher Sandwichkomplex an jeder Stelle mit dem allgemeinen Fangreagenz und (1) einem Fluorescein/Tetrahydrocannabinol-ASR und einem markierten anti- Tetrahydrocannabinolantikörper-Indikatorreagenz, (2) einem Fluorescein/Kokain-ASR und einem markierten anti- Kokainantikörper-Indikatorreagenz und (3) einem Fluorescein/Opiat-ASR und einem markierten anti- Opiatantikörperreagenz vorgeformt sein. Eine Testprobe, die ein, zwei oder alle Analyten enthält, kann mit der festen Phase in Kontakt gebracht werden, wodurch die jeweiligen Indikatoren verdrängt werden, und wodurch die Anwesenheit eines oder mehrerer Analyten durch die Abnahme der Signalproduktion an einer oder mehreren Stellen angezeigt wird.
- Multianalytassays können ebenfalls durchgeführt werden, indem geeignete Ligandkomponenten und Analytkomponenten verwendet werden, wobei ein unterschiedliches ASR zum Ersatz für jeden unterschiedlichen Analyten in dem Assay verwendet wird, z. B. (1) ein Fluorescein/Kokain-ASR, (2) ein Rhodamin/Tetrahydrocannabinol-ASR und (3) ein Aminomethylfluorescein/Opiat-ASR. Ein Multianalytenassay, das getrennte Ergebnisse für jeden Analyten liefert, kann so auf einer einzelnen festen Phase durchgeführt werden, wobei die geeigneten Fang- und Indikatorreagenzien verwendet werden.
- Es werden ebenfalls Assays in Betracht gezogen, bei denen ein Komplex aus erstem spezifischen Bindungsglied/ASR/Indikatorreagenz vorgeformt ist, und wobei dieser mit der Testprobe umgesetzt wird, wobei der Analyt den ASR/Indikatorreagenz-Subkomplex für die nachfolgende Reaktion mit einem Fangreagenz verdrängt. In einer Durchfluß- oder Teststreifenassayvorrichtung kann z. B. das erste spezifisch bindende Glied/ASR/Indikatorreagenz an einer ersten Reaktionsstelle immobilisiert sein, und das Fangreagenz kann an einer zweiten Reaktionsstelle stromabwärts der ersten Reaktionsstelle immobilisiert sein.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen Verfahren zur Herstellung des ASR der vorliegenden Erfindung wie auch Verfahren zur Durchführung der Assayverfahren. Die Beispiele dienen jedoch nur der Veranschaulichung, und sie sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken, der allein durch die Ansprüche definiert ist. Es ist offensichtlich, daß der Fachmann viele andere Assays entwerfen kann, einschließlich halbquantitativen und quantitativen Assays, auf die die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können.
- Das folgende Verfahren wurde verwendet, um ein Immunogen herzustellen, aus dem sowohl die Analytkomponente des ASR als auch der anti-Kokainantikörper (d. h. das analytspezifische bindende Glied) hergestellt wurden.
- Kokainhydrochlorid (2,0g) wurde in destilliertem Wasser (100ml) gelöst und konzentrierte Chlorwasserstoffsäure (8,0ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 19 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach der Kühlung auf Raumtemperatur wurde die Benzoesäure ausgefällt und filtriert. Das Filtrat wurde mit Chloroform gewaschen, um jegliche verbleibende Benzoesäure zu entfernen. Die wässerige Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand (Ecgoninhydrochlorid) wurde durch 17- stündiges Kochen am Rückfluß in methanolischem Chlorwasserstoff (150ml) verestert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und man erhielt Ecgoninmethylester als Öl.
- 4-(Chlormethyl)benzoesäure (2,3g) wurde in Methylenchlorid suspendiert (50ml) und Oxalylchlorid (2,0ml) wurde zugesetzt, gefolgt von Dimethylformamid (zwei Tropfen). Nach zweistündigem Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Trockenes Benzol wurde zugesetzt und im Vakuum entfernt. Trockenes Benzol (20ml) wurde erneut zugesetzt, und die Mischung wurde zu Ecgoninmethylester (1,0g) zugesetzt. Nach 19-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde Methylenchlorid (300ml) zugesetzt, und die Mischung wurde 2 x mit Chlorwasserstoffsäure (1N, 100ml) extrahiert. Die vereinigten wässerigen Lösungen wurden mit Kaliumcarbonat auf pH 9 basisch gemacht und 2 x mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Reines 4-(Chlormethyl)kokain wurde über eine Silicagelsäule erhalten, die mit dem geeigneten Verhältnis an Methanol und Chloroform eluiert wurde.
- Das 4-(Chlormethyl)kokain (0,6g) wurde in p-Dioxan (25ml) und in konzentriertem Ammoniumhydroxid (25ml) gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und man erhielt 4'- (Aminomethyl)kokain. Der Rückstand wurde im p-Dioxan (15ml) aufgelöst und destilliertes Wasser (15ml) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 21 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und man erhielt 4- (Aminomethyl)benzoylecgonin als braunes Öl. Der Rückstand wurde in p-Dioxan (4,0ml) gelöst, und di-tert-Butyldicarbonat (0,3g) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und das 4-[(t- Butoxycarbonylamino)methyl]benzoylecgonin wurde an einer Silicagelsäule gereinigt, die mit der geeigneten Mischung von Chloroform und Methanol eluiert wurde. Das gereinigte Produkt wurde in Methylenchlorid (5,0ml) gelöst und Trifluoressigsäure (5,0ml) wurde zugesetzt, und es wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und man erhielt reines 4-(Aminomethyl)benzoylecgonin-bis- (trifluoressigsäure)salz.
- Eine 25%ige wässerige Glutaraldehydlösung wurde mit entfärbender Aktivkohle ungefähr fünf Minuten lang vermischt und anschließend durch ein 0,2 Mikron Filter filtriert. Ein aliquoter Anteil (0,65ml) dieser Lösung wurde zu einer jeden von vier Flaschen zugesetzt, die wässeriges Rinderserumalbumin (13ml, 3,89mg/ml) enhielten, und es wurde sofort durch langsame Rotation 18 Stunden lang vermischt. Die vier Lösungen wurden vereinigt und in einem Dialyseschlauch aus Zellulose (MG 12 000- 14 000) gegen 0,06M Carbonatpuffer pH 9,5 bei Raumtemperatur 18 Stunden lang dialysiert. Nach dem Entfernen der Lösung aus dem Dialyserohr, wurde die Proteinkonzentration als 3,68mg/ml betragend ermittelt.
- Das 4-(Aminomethyl)Benzoylecgonin-bis(trifluoressigsäure)salz (228mg) [oben] wurde in Phosphatpuffer (11,4ml) gelöst, der 0,15M NaCl bei pH 7,5 enthielt. Ein aliquoter Anteil (4ml) dieser Lösung wurde zu Rinderserumalbuminglutaraldehydderivat (25ml, 3, 68mg/ml) unter Rühren zugesetzt. Das Rühren der Mischung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang fortgeführt. Die Mischung wurde in einem Zellulosedialyseschlauch (MG 12 000-14 000) gegen 0,1M tris(Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) bei Raumtemperatur 18 Stunden lang dialysiert, das 0,15M NaCl enthielt (TRIS- Puffersalzlösung [TBS], pH 8,0). Die Lösung aus dem Dialyseschlauch wurde an einer mit Sephadex gepackten Säule gereinigt und mit 0,15M NaCl eluiert, wobei man das gereinigte Immunogen erhielt.
- Siebzehn Milligramm des 4-(Aminomethyl)benzoylecgonin- bis(trifluoressigsäure)salzes, das, wie in Beispiel 1a oben beschrieben, hergestellt worden war, und 5-(4,6-Dichlor-1,3,5- triazin-2-ylamino)fluorescein (24mg) wurden in Methanol (2,0ml) und in Triethylamin (0,1ml) gelöst. Nach 16-stündigem Rühren der Mischung bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das resultierende ASR, ein Kokain- analogon/Fluoresceinligand-Komplex wurde an Silicagelplatten gereinigt, die mit der geeigneten Mischung von Chloroform und Methanol eluiert wurden. Das ASR wurde dann auf 62nM in TBS (20mM, pH 7,4) verdünnt.
- Der Kokainantikörper wurde gezüchtet, wobei die dem Fachmann bekannten Verfahren verwendet wurden und ferner das Immunogen nach Beispiel 1a, das oben beschrieben ist. Der Antikörper wurde mit den folgenden Reaktionen gereinigt:
- Das Kokain-Schafserum (160ml) wurde auf 0ºC gekühlt. Ammoniumsulfat (160ml, zu 50% gesättigt) in 20mM Phosphatpuffer (pH 8,0) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde bei 0ºC zehn Minuten lang leicht gerührt. Die Lösung wurde bei 10 000g 15 Minuten bei 0ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, und der verdichtete Niederschlag wurde in Ammoniumsulfat (25% Sättigung) in 20mM Phosphatpuffer (pH 8,0) bei 0ºC resuspendiert. Die Lösung wurde bei 10 000g erneut zehn Minuten lang bei 0ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde abgegossen. Der Feststoff wurde resuspendiert und zentrifugiert, bis der Feststoff weiß war. Zuletzt wurde der weiße Feststoff in 20mM Phosphatpuffer (pH 8,0) aufgelöst, wobei man 211 Milliliter Protein (15mg/ml) erhielt.
- Ein Teil der Proteinlösung (90ml) wurde mit 10mM Phosphatpuffer (pH 8,0) verdünnt, bis der Leitwert der Lösung geringer oder gleich demjenigen des Puffers alleine war. Dann wurde (Diethylamino)ethylzellulose (DEAE, 560g) [die mit 10mM Phosphatpuffer (pH 8,0) voreingestellt worden war] zugesetzt, und die Aufschlämmung wurde alle zehn Minuten vermischt. Nach einer Stunde wurde die DEAE-Zellulose filtriert und mit drei halben Volumina an 10mM Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen. Die Filtrate wurden vereinigt und auf 345 Milliliter Protein (3,3mg/ml) aufkonzentriert.
- Der anit-Kokainantikörper wurde dann gemäß folgenden Reaktionen an alkalische Phosphatase konjugiert.
- Alkalische Phosphatase (0,313ml, 10mg/ml) wurde mit einem Reaktionspuffer (0,65ml) [1,5 Liter H&sub2;O, 14,8g Triethanolamin, 0,480g Magnesiumchlorid und Zinkchloridlösung (20ml einer Lösung von 14g/100ml destilliertem Wasser), mit 6n NaOH eingestellt auf pH 7,3 und Glutaraldehyd (0,007ml) vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur ungefähr 15 Minuten lang gerührt. Anti- Kokainantikörper (0,442ml, 5,41mg/ml) wurde zu der Mischung zugesetzt, die leicht zwei bis drei Minuten lang gerührt wurde und dann bei Raumtemperatur weitere 15 Minuten stehen gelassen wurde, wobei sich das Antikörper/Enzymkonjugat aubildete.
- Gleiche Volumina an TRIS-Löschpuffer (zwei Liter H&sub2;O, 72,6g TRIS, 35,04g NaCl, 1,22g Magnesiumchlorid und 60 Milliliter einer Zinkchloridlösung [14g/100ml destilliertem Wasser], 6N NaOH) eingestellt auf pH 7,3 und die Konjugatreaktionsmischung wurden dann vereinigt und fünf bis zehn Minuten lang gerührt. Das Indikatorreagenz wurde dann entfernt und mit Konjugatpuffer (ein Liter H&sub2;O, 6g TBS, 6g NaCl, 0,2g Magnesiumchlorid und 0,01g Zinkchlorid, pH 8,0) verdünnt, wobei man eine 1:10 Konzentration erhielt.
- Das Substrat für das Indikatorreagenz war Nitroblautetrazoliumchlorid/5-Brom-4-chlor-3-indolylphsophat (NBT/BCIP; NBT 0,15g und BCIP 0,5g in einem Liter H&sub2;O mit 9,0g Aminomethylpropanol und 0,2g Magnesiumchlorid).
- Rinderserumalbumin (100mg) wurde in destilliertem Wasser (2,0ml) gelöst, und die Mischung wurde mit 1N NaOH auf pH 9 eingestellt. Fluoresceinisothiocyanat (FITC 100mg) in Dimethylformamld (1,0ml) wurde tropfenweise unter Rühren zugesetzt, während der pH durch die Zugabe von 1N NaOH auf 9 gehalten wurde. Nachdem das ganze FITC zugesetzt worden war, wurde die Mischung bei Raumtemperatur zwei Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde dann in einem Zellulosedialyserohr (MG 12 000- 14 000) gegen 10mM Phosphatpuffer (1,0Liter, pH 7) zwei Stunden lang dialysiert. Der Dialyseschlauch wurde dann gegen zwei Austauschlösungen 0,9%igen wässerigen Natriumchlorids (4,0Liter) jedesmal 19 Stunden lang dialysiert, und dann gegen drei Austauschlösungen von 10%igem Dimethylsulfoxid in 0,9%igem wässerigem Natriumchlorid, und zwar jedes Mal 24 Stunden lang. Die Endlösung zeigte keine Spur von Fluorescein in der Dialyselösung. Die resultierende Immunogenlösung wurde dann aus dem Dialyserohr entfernt und gefriergetrocknet, um einen orangen Feststoff zu ergeben. Das Immunogen wurde gemäß Standardverfahren verwendet, um ein Kaninchen- Fluoresceinantikörper-Fangreagenz zu erzeugen. Der Antikörper wurde gemäß dem Verfahren gereinigt, das im Beispiel 1c oben beschrieben ist.
- Dieses Material umfaßte den gereinigten anti- Fluoresceinantikörper, (d. h. das ligandenspezifische bindende Glied) nach Beispiel 1d (100µl einer 4,5mg/ml Lösung) der kovalent an Carboxy-derivatisierte Latex-Mikropartikel gebunden war (Seradyne, Indianapolis, Indiana). Die Antikörper wurden an die Mikropartikel gemäß dem folgenden Verfahren gekuppelt.
- Der gereinigte Antikörper (8,6mg), Mikropartikel (260mg), Wasser (20ml) und 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (100mM MES, 0,05ml) wurden vereinigt, und der pH der Lösung wurde eingestellt (pH 6,3 unter Verwendung von 3N HCl oder 3N NaOH). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (1mg/ml EDAC, 0,1ml) wurde dann zugesetzt, und die Lösung wurde 3-3,5 Stunden bei 15-30ºC leicht gerührt. Um die Reaktion anzuhalten, wurde die Mischung bei 2400-4000g 10 bis 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und verworfen.
- Die Mikropartikel wurden dann in einem Volumen von 0,1% Tween-20-Lösung (ungefähr gleich 0,1 x der Ansatzgröße) suspendiert. Die Zentrifugations- und Suspensionsschritte wurden dann wiederholt. Die Mikropartikel wurden dann erneut in Puffer suspendiert (Konjugatpuffer plus 0,1% Tween-20) und erneut zentrifugiert. Das zuletzt erhaltene Mikropartikelpräparat wurde dann verdünnt, und 60 Mikroliter des Präparates wurden auf einen Glasfaserbausch aufgebracht. Der Bausch wurde dann mit 6%iger Fischgelatinelösung überschichtet und getrocknet.
- Das erste spezifisch bindende Glied (gereinigter anti- Kokainantikörper, 30µl, 2,74mg/ml, in 10mM TBS) und das ASR, Kokain-Analogon/Fluoresceinligand nach Beispiel 1b (100µl) wurden jeweils zu Urinproben (400µl) hinzugegeben, die bekannte Mengen an Kokainanalyt enthielten. Die Analytkomponente des ASR und der Analyt in der Testprobe konkurrierten um die anti- Kokainantikörperbindungsstellen, so daß umso mehr freies ASR in der Mischung verblieb, je größer die Menge des Wirkstoffes in der Probe war.
- Die Mischung wurde unmittelbar auf ein Festphasenmaterial nach Beispiel 1e gegossen, auf der das Ligand-spezifische Fangreagenz (anti-Fluoresceinantikörper) immobilisiert worden war, wodurch einer ASR Probe erlaubt wurde, an den anti- Fluoresceinantikörper auf der festen Phase zu binden. Die feste Phase wurde dann gewaschen (mit einer Lösung aus Guanidinhydrochlorid und Tween-20).
- Das Indikatorreagenz nach Beispiel 1c (200µl) wurde mit dem Festphasenmaterial in Kontakt gebracht, wodurch dem Indikator erlaubt wurde, die Analytkomponente des immobilisierten ASR's zu binden, so daß das ASR sandwichartig zwischen dem Indikatorreagenz und dem Fangreagenz auf dem Festphasenmaterial eingeschlossen wurde. Wenn der Analyt in der Testprobe abwesend war, wurde das ASR bereits zwischen dem ersten spezifischen Bindungsglied und dem Fangreagenz sandwichartig eingeschlossen, und das Indikatorreagenz, das keinen Bindungsort vorfand, floß durch das Festphasenmaterial hindurch. Das Festphasenmaterial wurde erneut gewaschen, um nicht abreagiertes Indikatorreagenz zu entfernen.
- Drei Tropfen Enzymsubstrat (NBT/BCIP) wurden auf die feste Phase aufgegeben. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Assays an, die an Testproben durchgeführt wurden, die unterschiedliche Kokainkonzentrationen aufwiesen. Ein Negativzeichen (-) zeigt keine Farbentwicklung an, ein Positivzeichen (+) zeigt Farbentwicklung an, und ein doppeltes Positivzeichen (++) zeigt eine starke Farbentwicklung an. Wenn eine Schwellenwertmenge an Kokain in der Probe vorhanden war, wurde das Substrat mit dem Indikatorreagenz, das auf der festen Phase immobilisiert worden war, umgesetzt, und es wurde ein Signal erzeugt. Wenn weniger als eine Schwellenwertmenge an Kokain in der Testprobe vorhanden war, dann befand sich kein Indikatorreagenz auf der festen Phase, mit dem das Substrat hätte reagieren können. Tabelle 1 Kokainimmunoassayergebnisse
- - = keine Farbe; + = Farbe; ++ ;= starke Farbe; n/p = nicht ausgeführt
- Das folgende Verfahren wurde verwendet, um ein Immunogen herzustellen, mit dem der anti-Opiatantikörper hergestellt wurde.
- Morphin-3-β-D-glucuronid (100,4mg) wurde in destilliertem Wasser (12ml) gelöst, wobei drei Tropfen 1,0M Natriumhydroxid zugesetzt wurden. Natriumperborat (36mg) wurde zugesetzt, und der pH wurde auf 3,0 eingestellt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang gerührt. Ethylenglykol (0,016ml) wurde zugesetzt, und das Rühren wurde eine Stunde lang fortgeführt. Thyroglobulin (50,6mg) wurde zugesetzt, und der pH wurde auf 8,0 eingestellt und nach einer weiteren Stunde wurde ein Äquivalent Natriumcyanoborhydrid zugesetzt. Nach dem Rühren über Nacht wurde die Lösung gegen physiologische Kochsalzlösung zwei Stunden lang dialysiert. Das Immunogen wurde gemäß Standardverfahren verwendet, um Schaf anti-Opiatantikörper zu erzeugen, die im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Beispiel 1c oben gereinigt wurden.
- Morphin (86mg) wurde in absolutem Ethanol (1,3ml) durch Behandlung mit Kaliumethoxid in Ethanol (0,345ml einer 1,0M Lösung) gelöst. Ethylbromacetat (57,6mg) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre sieben Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde mit Chloroform/Methanol (2:1) eluiert und durch Chromatographie an einer Silicagel-Dickschichtplatte gereinigt, wobei man 39mg des Morphin-3-(Ethoxycarbonylmethyl)ethers erhielt.
- Der Morphin-3-(ethoxycarbonylmethyl)ether (39mg) wurde in Ethanol (15ml) und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (0,009ml) über zehn Milligramm 10%ig Palladium auf Kohle bei einem Wasserstoffanfangsdruck von 40psi hydriert. Nach zwei Stunden wurde das Produkt mittels Filtration isoliert, und die Entfernung des Lösungsmittels ergab 49 Milligramm 7,8- Dihydromorphin-3-(ethoxycarbonylmethyl)ether.
- Der 7,8-Dihydromorphin-3-(ethoxycarbonylmethyl)ether (49mg) wurde in Methanol (1,0ml) gelöst und frisch destilliertes 1,2-Diaminoethan (0,20ml) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter Sickstoffatmosphäre 16 Stunden lang rühren lassen. Nach der Entfernung der flüchtigen Materialien im Vakuum verblieben 58mg 7,8-Dihydro-morphin-3-[(2- aminoethyl)aminocarbonylmethyl]etherhydrochlorid.
- Das 7,8-Dihydromorphin-3-[(2-aminomethyl)aminocarbonylmethyl]etherhydrochlorid (19mg) wurde in Methanol (0,75ml) gelöst und 6-[4,6-Dichlor-1,3,5-triazin-2-ylamino]fluorescein (27,9mg) wurde zugesetzt. Nach 30-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit Dimethylformamid (0,20ml) verdünnt und auf eine Dickschicht-Silicagelchromatographieplatte aufgestrichen. Die Entwicklung mit Chloroform/Methanol/Essigsäure erzeugte das gereinigte Morphin/Fluoreszein ASR. Das ASR wurde dann auf 200mM in TBS (20mM, pH 7,4) verdünnt.
- Der anti-Opiatantikörper wurde an alkalische Phase gemäß folgenden Reaktionen konjugiert.
- Alkalische Phosphatase (1,25ml, 10mg/ml) wurde mit Reaktionspuffer (2,6ml) und mit Glutaraldehyd (0,026ml) vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur ungefähr 15 Minuten lang gerührt. Gereinigter Opiatantikörper (1,31ml, 0,759mg/ml) wurde zu der Mischung zugesetzt, die leicht zwei bis drei Minuten gerührt wurde und dann bei Raumtemperatur weitere 15 Minuten stehen gelassen wurde, wobei sich das Antikörper/Enzymkonjugat ausbildete.
- Gleiche Volumina an TRIS Löschpuffer und an Konjugatreaktionsmischung wurden dann vereinigt und fünf bis zehn Minuten lang gerührt. Das Indikatorreagenz wurde dann entfernt und mit Puffer (dem Konjugatpuffer nach Beispiel 1c plus 2%ig Twenn-20 verdünnt), wobei eine 1:10 Konzentration erhalten wurde. Das Substrat für das Indikatorreagenz war NBT/BCIP wie in Beispiel 1c oben.
- Das Fangreagenz war ein anti-Fluoreszeinantikörper, der im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Beispiel 1d oben hergestellt worden war.
- Die analytische Vorrichtung aus Festphasenmaterial wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Belspiel 1e oben hergestellt.
- Ein erstes spezifisch bindendes Glied aus gereinigtem anti-Morphinantikörper (75µl, 3,3mg/ml in 10mM TBS) und das Morphin/Fluorescein ASR nach Beispiel 2b (100µl) wurden jeweils zu Urinproben (500µl) zugesestzt, die bekannte Mengen Morphin enthielten. Das ASR und der Analyt in der Testprobe konkurrierten um das erste spezifisch bindende Glied, so daß umso mehr freies ASR in der Mischung verblieb, je größer die Menge an Wirkstoff in der Probe war.
- Die Mischung wurde sofort durch ein Vorfilter und auf das Festphasenmaterial nach Beispiel 2e gegossen, auf dem das ligandenspezifische Fangreagenz immobilisiert worden war, wodurch einer ASR-Probe erlaubt wurde, an das ligandspezifische Fangreagenz auf der festen Phase zu binden. Der Vorfilter wurde entfernt, und die feste Phase wurde mit einer Lösung von Guanidinhydrochlorid und Tween-20 gewaschen.
- Das Indikatorreagenz von Beispiel 2c (200µl) wurde mit dem Festphasenmaterial in Kontakt gebracht, was dem Indikatorreagenz erlaubte, an die Analytkomponente des immobilisierten ASR's zu binden, so daß das ASR sandwichartig zwischen dem Indikatorreagenz und dem Fangreagenz auf dem Festphasenmaterial eingeschlossen wurde. Wenn kein Wirkstoff vorhanden war, war das ASR bereits sandwichartig zwischen dem ersten spezifisch bindenden Glied und dem Fangreagenz eingeschlossen worden, und das Indikatorreagenz, für das es keine Stelle zur Bindung gab, floß durch das Festphasenmaterial hindurch. Das Festphasenmaterial wurde (mit einer Lösung von Guanidinhydrochlorid und Triton X-100) gewaschen, um nicht abreagiertes Indikatorreagenz zu entfernen.
- Drei Tropfen des Entzymsubstrats (NBT/BCIP) wurden auf die feste Phase aufgebracht. Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Assays, die an Testproben durchgeführt wurden, die unterschiedliche Morphinkonzentrationen aufwiesen. Wenn eine Schwellenwertmenge an Morphin in der Testprobe vorhanden war, reagierte das Substrat mit dem Indikatorreagenz, das auf der festen Phase immobilisiert war, und es wurde ein Signal erzeugt. Wenn weniger als die Schwellenwertmenge an Morphin in der Probe vorhanden war, gab es kein Indikatorreagenz auf der festen Phase, mit dem das Substrat hätte reagieren können. Tabelle 2 Morphinimmunoassay-Ergebnisse
- - = keine Farbe; ++ = starke Farbe
- Die Reagenzien der Beispiele 2a bis 2d wurden bei diesem Immunoassay verwendet.
- Bei diesem Beispiel wurde das anti-Fluorescein Antikörper-Fangreagenz nach Beispiel 2d kovalent an eine feste Phase aus Polystyrolperlen (0,25 Inch) gebunden. Die Antikörper wurden gemäß dem folgenden Verfahren an die Perlen gekoppelt.
- Die Perlen wurden gewogen und über Nacht bei Raumtemperatur in einer 15%igen Propanollösung gewaschen. Die Perlen wurden dann drei mal in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen. Die Antikörper (25µl) und PBS (24,75ml) wurden zu den Perlen zugesetzt, und die Kombination wurde über Nacht bei Raumtemperatur gemischt. Die Formel war so berechnet, daß ungefähr 30 Mikrogramm des Antikörpers pro Milliliter Beschichtungslösung vorhanden waren.
- Die Perlen wurden erneut drei mal in PBS gewaschen. Die Perlen wurden dann eine Stunde lang bei 40ºC in einer Mischung aus 0,1% Triton X-100 in PBS inkubiert. Nach der Inkubation wurden in Perlen drei mal in PBS gewaschen. Die Perlen wurden dann eine Stunde bei 40ºC in einer Mischung aus 3% Rinderserumalbumin in PBS inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Perlen erneut drei mal in PBS gewaschen. Die Perlen wurden dann zwanzig Minuten lang bei Raumtemperatur in einer 5%igen Saccharosemischung in PBS inkubiert. Die Perlen wurden dann aus der Flüssigkeit entfernt und über Nacht getrocknet.
- Zwei Probelösungen (je 200µl) wurden getestet, eine Null ng/ml Morphinsulfatlösung und eine 1 000ng/ml Morphin sulfatlösung. Ein erstes spezifisch bindendes Glied, der ant- Opiatantikörper (600µl, Beispiel 2a), wurde zu jeder Lösung in einem Reagenzglas hinzugegeben und es wurde leicht gemischt. Das Morphin/Fluorescein-ASR (200µl, Beispiel 2b) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt und vermischt. Eine Perle, die das immobilisierte ligandspezifische Fangreagenz trug, wie sie in Beispiel 3a hergestellt worden war, wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die Lösung wurde dann abgegossen, und die Perlen wurden drei mal gewaschen. Das analytspezifische Indikatorreagenz (200µ, Beispiel 2c) wurde zu jedem Röhrchen zugesetzt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Indikatorreagenz wurde dann abgegossen, und die Perlen wurden erneut drei mal gewaschen. Die Perlen wurden in frische Röhrchen überführt, und fünf Tropfen NBT/BCIP Substrat wurden jedem Röhrchen zugesetzt. Innerhalb einer Minute begann sich die Farbe auf der Oberfläche der Perle in dem 1 000ng/ml Röhrchen auszubilden. Das Röhrchen mit Null ng/ml blieb farblos.
- Die nachfolgenden Assays wurden unter Verwendung des Morphinassay-Indikatorreagenzes durchgeführt, das im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem in Beispiel 2c beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, außer daß die Pufferlösung kein Tensid enthielt. Statt dessen wurde das Tensid (Tween 20) getrennt zu dem Indikatorreagenz zugesetzt, um eine ungefähr 4-prozentige (Gewicht pro Volumen, w/v)4 Konzentration (w/v) zu erzielen (d. h. ungefähr zwei Tropfen Tensid pro einen Milliliter Indikatorreagenz). Das Assay verwendete entweder ein Tensid-behandeltes oder ein unbehandeltes Indikatorreagenz und das Assay wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Versuchsvorschrift durchgeführt, die in Beispiel 2f beschrieben ist, unter Verwendung einer Durchflußfestphase. Das Indikatorreagenz war vor der Zugabe des Tensids im wesentlichen inaktiv geworden. Die Morphintestproben umfaßten eine vorbestimmte Menge an Morphin in Humanurin. Die Assayergebnisse sind in Tabelle 3 aufgezeigt. Tabelle 3 Assayergebnisse, die Morphinindikatorreagenz mit oder ohne Tensid vergleichen
- - = keine Farbe, + = schwache Farbentwicklung, ++ = starke Farbentwicklung
- Wie in Tabelle 3 gezeigt, wies die Null-Morphintestprobe keine Farbentwicklung mit keinem der Indikatorreagenzien auf.
- Die das Morphin enthaltende Testprobe erzeugte nur eine schwache Farbentwicklung nach einer Minute, wenn das Indikatorreagenz ohne Tensid verwendet wurde. Die Verwendung des Indikatorreagenzes mit Tensid führte jedoch zu einer sehr starken Farbentwicklung, die nur 15 Minuten benötigte, um sich zu entwickeln.
- Tabelle 4 zeigt einen Vergleich der Hintergrundfarbentwicklung gegenüber der Farbentwicklung bei Assays, die Indikatorreagenzpräparate verwendeten, welche unterschiedliche Tensidkonzentrationen enthielten. Das Indikatorreagenz, das zur Herstellung dieser Präparate verwendet worden war, war vor der Zugabe von Tensid inaktiv erschienen. Die Assays wurden im wesentlichen in Übereinstimmung mit der Versuchsvorschrift durchgeführt, die in Beispiel 2f beschrieben ist. Die Morphintestprobe umfaßt Morphin in Humanurin (1 000ng/ml). Tabelle 4 Assayergebnisse unter Verwendung unterschiedlicher Mengen an Tensid im Indikatorreagenz
- - = keine Farbe, + = schwache Farbentwlcklung, ++ = starke Farbe
- Die Ergebnisse, die in Tabelle 4 aufgeführt sind, zeigten, daß die starke Hintergrundfarbe auf dem Glasfaserbasch auftragt, wenn geringere Menge an Tensid verwendet wurden. Jedoch führte die Zugabe von ungefähr 4%iger Tween-20- Konzentration zum Indikatorreagenz zu keiner Hintergrundfarbentwicklung. Es ist jedoch zu beachten, daß die Menge an Tensid, die zur Reaktivierung eines Indikatorreagenzes notwendig ist, größer als die Menge sein kann, die zum Erhalt der Aktivität des Indikatorreagenzes nötig ist.
- Die Verwendung des Analyt-Substitut-Reagenzes erlaubt die Durchführung einer Kombination von Konkurrenz/Sandwichassay, und sie ist offensichtlich auf jedwedes Bindungsassay anwendbar. Sie ist besonders vorteilhaft zur Verwendung bei Assays, bei denen der Analyt monovalent ist, aber sie kann verwendet werden, wo immer ein Sandwich- oder ein immunometrisches Assayergebnis erwünscht ist. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß er andere Assayverfahren (indirekte Assays, Inhibitionsassay usw.) entwerfen kann, wie auch Assays für polyvalente Analyten, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann.
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines
Analyten in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:
(a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe nacheinander oder
gleichzeitig mit
(i) einem Analytsubstitutreagenz, das eine
Analytkomponente umfaßt, die an eine Ligandkomponente angeheftet
ist,
wobei die Analytkomponente wenigstens ein Epitop mit
dem interessierenden Analyten gemeinsam hat, wodurch die
Analytkomponente an ein analytspezifisches bindendes Glied
bindet, und
wobei die Ligandkomponente an ein ligandspezifisches
bindendes Glied bindet, wobei sie aber nicht gegenüber einem
analytspezifischen bindenden Glied reaktiv ist, und
(ii) einem ersten spezifisch bindenden Glied, das zur
Bindung an ein Epitop befähigt ist, das sowohl auf dem Analyten
in der Testprobe als auch auf der Analytkomponente vorhanden
ist,
wodurch eine Mischung aus Analyt/erstem spezifisch bindenden
Glied-Komplex, Analytsubstitutreagenz/erstem spezifisch
bindenden Glied-Komplex und ungebundenem Analytsubstitutreagenz
ausgebildet wird;
(b) In-Kontakt-Bringen der Mischung nacheinander oder
gleichzeitig mit
(i) einem Fangreagenz, das ein zweites bindendes Glied
umfaßt, das für das Analytsubstitutreagenz spezifisch ist, und
(ii) einem Indikatorreagenz, das eine Markierung umfaßt,
die zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals fähig ist, die an
ein drittes spezifisch bindendes Glied konjugiert ist, wobei das
dritte spezifisch bindende Glied das ungebundene
Analytsubstitutreagenz direkt oder indirekt bindet,
wobei das Fangreagenz und das Indikatorreagenz einen
nachweisbaren Komplex mit dem Analytsubstitutreagenz ausbilden;
und
(c) Nachweisen der Markierung, die mit dem Komplex assoziiert
ist, oder der Menge des Indikatorreagenzes, das nicht mit dem
Komplex assoziiert ist, um die Anwesenheit oder Menge an Analyt
in der Testprobe zu bestimmen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fangreagenz für die
Ligandkomponente des Analytsubstitutreagenzes spezifisch ist,
und wobei das Indikatorreagenz für die Analytkomponente des
Analytsubstitutreagenzes spezifisch ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das
Analytsubstitutreagenz an das erste spezifisch bindende Glied
als ein Analytsubstitutreagenz/erstes spezifisch bindendes
Glied-Komplex vorgebunden ist, und wobei das
Analytsubstitutreagenz aus dem Analytsubstitutreagenz/erstes
spezifisch bindendes Glied-Komplex verdrängt wird, wenn Analyt
in der Testprobe vorhanden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fangreagenz für die
Analytkomponente des Analytsubstitutreagenzes spezifisch ist,
und wobei das Indikatorreagenz für die Ligandkomponente des
Analytsubstltutreagenzes spezifisch ist, und wobei der Analyt
nicht gleichzeitig an mehr als ein spezifisch bindendes Glied
bindet.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4,
wobei das Fangreagenz direkt oder indirekt auf einem
Festphasenmaterial immobilisiert wird, wodurch der Komplex auf
dem Festphasenmaterial immobilisiert wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5,
das desweiteren die Zugabe von wenigstens einem spezifisch
bindenden Hilfsglied umfaßt, um das Indikatorreagenz indirekt an
das Analytsubstitutreagenz zu binden, oder um das Fangreagenz
indirekt an eine feste Phase zu binden.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6,
wobei mehr als ein Analyt untersucht wird, wobei das Verfahren
eine Mehrzahl von Analytsubstitutreagenzien verwendet, die alle
entweder
eine verschiedene Analytkomponente und eine gemeinsame
Ligandkomponente aufweisen, wobei das Fangreagenz für die
Ligandkomponente des Analytsubstitutreagenzes spezifisch ist,
oder
eine verschiedene Analytkomponente und eine verschiedene
Ligandkomponente, und wobei das Fangreagenz für die
Ligandkomponente des Analytsubstitutreagenzes spezifisch ist.
8. Durchfluß- oder Teststreifenassayvorrichtung zur
Bestimmung der Anwesenheit oder Menge an interessierendem Analyt
in einer Testprobe, die folgendes umfaßt:
(a) einen ersten spezifisch bindendes
Glied/Analytsubstitutreagenz/Indikatorreagenz-Komplex, der an
einer ersten Reaktionsstelle auf dem Teststreifen immobilisiert
ist, wobei
das Analytsubstitutreagenz eine Analytkomponente umfaßt,
die an eine Ligandkomponente angeheftet ist,
die Analytkomponente wenigstens ein Epitop mit dem
interessierenden Analyten gemeinsam hat, wobei die
Analytkomponente an das erste spezifisch bindende Glied gebunden
ist, das ein analytspezifisches bindendes Glied ist, und
die Ligandkomponente zur Bindung an ein
Ligandspezifisches bindendes Glied fähig ist, aber nicht zur Bindung
an ein analytspezifisches Bindungsglied fähig ist, und
(b) eine zweite Reaktionsstelle stromabwärts von der
ersten Reaktionsstelle, die ein immobilisiertes Fangreagenz
aufweist, das ein zweites bindendes Glied umfaßt, das für das
Analytsubstitutreagenz spezifisch ist.
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