DE69223510T2

DE69223510T2 - Verfahren und reagenzien zur ausführung von ioneneinfang-digoxin-assays

Info

Publication number: DE69223510T2
Application number: DE69223510T
Authority: DE
Inventors: Yi-Her Jou; Steven Kline; Stephen Stroupe
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1991-05-30
Filing date: 1992-04-10
Publication date: 1998-06-18
Anticipated expiration: 2012-04-11
Also published as: DE69223510D1; EP0586574A4; EP0586574A1; WO1992021975A1; ATE161104T1; ES2112320T3; EP0586574B1; JPH06508214A; CA2110296A1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Bindungsassayverfahren.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Verschiedene analytische Verfahren und Vorrichtungen werden üblicherweise bei Assays verwendet, um die Anwesenheit und/oder Konzentration von interessierenden oder klinisch bedeutungsvollen Substanzen zu bestimmen, die in biologischen Flüssigkeiten oder anderen Materialien vorhanden sein können. Solche Substanzen werden gemeinhin als "Analyten" bezeichnet und können Antikörper, Antigene, Wirkstoffe, Hormone, usw. umfassen.
Die Immunoassayverfahren ziehen einen Vorteil aus dem Mechanismus des Immunsystems höherer Organismen, bei dem Antikörper in Antwort auf die Anwesenheit von Antigenen produziert werden, die pathogen oder für die Organismen fremd sind. Diese Antikörper und Antigene, d. h. Immunreaktanten, sind zur Bindung aneinander fähig, wobei sie einen hochspezifischen Reaktionsmechanismus schaffen, der in vitro verwendet werden kann, um die Anwesenheit oder Konzentration dieses besonderen Antigens in einer biologischen Probe zu bestimmen.
Es sind viele Immunoassayverfahren bekannt, die auf Immunreaktanten zurückgreifen, bei denen wenigstens einer der Immun-reaktanten mit einer nachweisbaren Komponente markiert ist, so daß er analytisch identifizierbar ist. Beispielsweise kann das "Sandwich-" oder "Zwei-Zentren-" Verfahren die Ausbildung eines ternären Komplexes zwischen einem Antigen und zwei Antikörpern umfassen. Ein nützliches Verfahren zum Nachweis der Komplexbildung bei einer solchen Verfahrensweise ist die Bereitstellung eines markierten Antikörpers und eines unmarkierten Antikörpers, der an einen Festphasenträger gebunden ist, so daß der Komplex einfach isoliert werden kann. Bei diesem Beispiel ist die Menge an markiertem Antikörper, der an der festen Phase haftet, direkt zur Menge an Analyt in der Testprobe proportional.
Ein alternatives Verfahren ist der "Kompetitivassay". Bei einem Beispiel für einen Kompetitivassay verwendet der Einfangmechanismus wieder einen Antikörper, der an eine unlösliche feste Phase gebunden ist, jedoch verwendet er einen markierten Analyten (anstelle eines markierten Antikörpers), der mit dem in der Testpröbe vorhandenen Analyt um die Bindung an den immobilisierten Antikörper konkurriert. Auf ähnliche Weise kann ein immobilisierter Analyt mit dem interessierenden Analyt um einen markierten Antikörper konkurrieren. Bei diesen Kompetitivassays ist die Menge an eingefangenem markierten Reagenz zu der Menge an in der Probe vorhandenem Analyt umgekehrt proportional.
Trotz ihrer großen Nützlichkeit treten Nachteile bei solchen Assayverfahren auf. Zunächst kann die heterogene Reaktionsmischung aus flüssiger Testprobe und löslichen und unlöslichen Assayreagenzien die Reaktionskinetik verzögern. Im Vergleich mit einer Flüssigphasenreaktion, in der alle Reagenzien löslich sind, d. h. mit einer homogenen Reaktionsmischung kann die heterogene Reaktionsmischung längere Inkubationszeiten bis zur Erreichung des Gleichgewichtes in der Reaktionsmischung zwischen dem unlöslichen Festphasensystem, dem freien Analyten in der Testprobe, den löslichen markierten Reagenzien und dem neu ausgebildeten unlöslichen Komplex benötigen. Zweitens können die herkömmlichen Verfahren der Anbindung von Bindungsgliedern an die feste Phase, wie etwa die Adsorption von Antikörper an der festen Phase eine feste Phase erzeugen, die leicht Substanzen bindet, die nicht der Analyt sind. Dies wird als nicht spezifische Bindung bezeichnet und kann den Nachweis eines positiven Ergebnisses stören. Drittens können bei den herkömmlichen Immobilisierungsverfahren getrennte Ansätze von hergestellten Festphasenreagenzien schwankende Mengen an immobilisiertem Bindungsglied enthalten.
Unter Bezugnahme auf die Herstellung von Festphasenvorrichtungen zur Verwendung bei Bindungsassays gibt es eine Anzahl von Assayvorrichtungen und -verfahren, bei denen die Anwesenheit eines Analyten durch die Bindung des Analyten an ein markiertes Reagenz und/oder an ein komplementäres Bindungsglied angezeigt wird, das auf einer festen Phase, wie etwa einem Tauchstäbchen, einem Teststreifen, einem Durchflußbausch, Papier, einer Fasermatrix oder einem anderen Festphasenmaterial immobilisiert ist. Eine solche spezifische Bindungsreaktion führt zu einer Aufteilung des markierten Reagenzes in das, das auf der festen Phase immobilisiert ist, und in das, das frei verbleibt. Typischerweise wird die Anwesenheit oder die Menge an Analyt in einer Testprobe mittels des Ausmaßes angezeigt, zu dem das markierte Reagenz auf der Festphase immobilisiert wird.
Die Verwendung von porösen Teststreifen bei der Durchführung von spezifischen Bindungsassays ist ebenfalls gut bekannt. Bei einem Sandwichassayverfahren wird eine Testprobe auf einen Teil des Teststreifens aufgegeben und durch den Teststreifen hindurch aufgrund der Kapillarwirkung wandern lassen. Der nachzuweisende oder zu messende Analyt tritt durch das Teststreifenmaterial entweder als Bestandteil der flüssigen Testprobe oder mit Hilfe eines Elutions- oder Chromatographielösungsmittels hindurch, das dem Streifen getrennt zugesetzt zu werden vermag. Der Analyt wird dadurch in eine Nachweiszone auf dem Teststreifen transportiert, wo ein analytspezifisches Bindungsglied immobilisiert ist. Das Ausmaß, in dem der Analyt in der Nachweiszone gebunden wird, kann mit Hilfe eines markierten analytspezifischen Bindungsgliedes bestimmt werden, das im Teststreifen eingebaut sein kann, oder das dem Streifen getrennt zugesetzt werden kann.
Beispiele für Vorrichtungen, die auf diesen Prinzipien beruhen, umfassen solche, die in den folgenden Patenten und Patentanmeldungen beschrieben sind. Deutsch et al. beschreiben eine quantitative chromato-graphische Teststreifenvorrichtung in den U.S. Patenten Nr. 4,094,647, 4,235,601 und 4,361,537. Die Vorrichtung umfaßt ein Material, das zum Transport einer Lösung aufgrund von Kapillarwirkung befähigt ist. Unterschiedliche Felder oder Bereiche auf dem Streifen enthalten die Reagenzien, die zur Durchführung eines Bindungsassays und zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals benötigt werden, wenn der Analyt zu diesen Bereichen hin oder durch diese hindurch transportiert wird. Die Vorrichtung ist für chemische Assays wie auch für Bindungsassays geeignet, die durch die Bindungsreaktion zwischen einem Antigen und einem komplementären Antikörper gekennzeichnet sind.
Viele Varianten von der Vorrichtung von Deutsch et al. sind nachfolgend offenbart worden. Beispielsweise offenbart Tom et al. (U.S. Patent Nr. 4,366,241) einen saugfähigen Träger mit einer Immunosorptionszone, die ein immobilisiertes spezifisch bindendes Glied enthält. Die Testprobe wird auf die Immunosorptionszone aufgegeben, und das Assayergebnis wird an der Immunosorptionszone abgelesen.
Weng et al (U.S. Patente Nr. 4,740,468 und 4,879,215) offenbaren ebenfalls eine Teststreifenvorrichtung und Verfahren zur Durchführung eines Bindungsassays. Die Vorrichtung wird mit einer Testlösung verwendet, die die Testprobe enthält, von der vermutet wird, daß sie den interessierenden Analyten enthält, und mit einem markierten spezifisch bindenden Glied, das an den Analyten bindet. Die Assays umfassen sowohl ein immobilisiertes zweites Bindungsglied, das an das markierte Bindungsglied bindet, und ein immobilisiertes Analyt-Analogon, das ungebundenes markiertes Bindungsglied aus dem Assaysystem entfernt. Greenquist et al. (U.S. Patente Nr. 4,806,311 und 4,806,312) beschreibt eine geschichtete Assayvorrichtung zur Durchführung von Bindungsassays ähnlich solchen von Weng et al., bei denen ein erstes immobilisiertes Reagenz, wie etwa ein Analyt-Analogon verwendet wird, um ungebundene Materialien aus der Reaktionsmischung vor dem Durchgang der Reaktionsmischung zu einer nachfolgenden Nachweisschicht hin zu entfernen.
Rosenstein (EP-A-0 284 232) und Campbell et al (U.S. Patent Nr. 4,703,017) beschreiben Assayverfahren und Vorrichtungen zur Durchführung spezifischer Bindungsassays, wobei die bevorzugte nachweisbare Markierung eine farbige Partikel ist, die aus einem Liposom besteht, das einen Farbstoff enthält. Bahar et al. (U.S. Patent Nr. 4 868 108) beschreibt ein Assayverfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung eines spezifischen Bindungsassays, wobei die Vorrichtung einen Mehrbereichsträger umfaßt, durch den die Testprobe transportiert wird, und ein Enzym/Substrat- Nachweismittel. Eisinger et al. (U.S. Patent Nr. 4,943,522) beschreibt ein Assayverfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung spezifischer Bindungsassays, die eine großporige Mehrbereichs-'lateral flow'-Membran verwenden, durch die die Testprobe aufgrund von Kapillarwirkung transportiert wird.
Ullman et al (EP-A-0 271 204) ähnelt den zuvor beschriebenen Weng et al. Patenten (U.S. Patenten Nr. 4,740,468 und 4,879,215). Ullmann et al. beschreibt die Herstellung einer Testlösung, die ein Analyt-Analogon und eine Testprobe enthält, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Die Testlösung wird mit einem saugfähigen Material in Kontakt gebracht, das zwei sequenzielle Bindungszentren aufweist: das erste Bindungszentrum, das ein Glied eines spezifischen Bindungspaares enthält, das zur Bindung des Analyten und des Analyten-Analogons befähigt ist, und das zweite Bindungszentrum, das zur Bindung des Analyten-Analogons befähigt ist, das nicht am ersten Bindungszentrum gebunden worden ist.
Cerny E. (WO 86/03839) beschreibt einen Bindungsassay, bei dem eine Testlösung, die die Testprobe und eine markierte Testsubstanz enthält, durch eine feste Phase unter Bereitstellung eines meßbaren Diffusionsmusters diffundiert. Das resultierende Diffusionsmuster weist einen Durchmesser auf, der größer ist als der Durchmesser des Diffusionsmusters von markierter Testsubstanz alleine.
Zuk et al. (U.S. Patent Nr. 4,956,275) beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten mittels einer Sensorvorrichtung. Ein analytbezogenes Signal wird an zwei oder mehr Stellen der Assayvorrichtung mittels der Sensorvorrichtung gemessen, und die mathematische Beziehung zwischen den Messungen liefert einen Wert (z.B. einen Unterschied, ein Verhältnis, eine Steigung usw.), der mit einem Standard, der eine bekannte Analytmenge enthält, verglichen wird.
Hochstrasser (U.S. Patent 4,059,407) offenbart eine Tauchstabvorrichtung, die in eine biologische Flüssigkeit eingetaucht werden kann, für eine halb-quantitative Messung des Analyten in der Flüssigkeit. Die halb-quantitative Messung des Analyten wird durchgefüht, indem eine Reihe von Reagenzenthaltenden Bäuschen verwendet wird, wobei jeder Bausch in der Reihe in Anwesenheit einer zunehmenden Analytmenge eine nachweisbare Farbe produziert (d.h. ein positives Ergebnis). Ebenfalls von Interesse auf dem Gebiet der Tauchstabvorrichtungen sind die U.S. Patente Nr. 3 802 842, 3 915 639 und 4 869 309.
Grubb et al. (U.S. Patent Nr. 4 168 146) beschreibt die Verwendung eines porösen Teststreifenmaterials, an das ein Antigen-spezifischer Antikörper mittels kovalenter Bindung an den Streifen immobilisiert ist. Der Teststreifen wird in eine Lösung getaucht, von der vermutet wird, daß sie ein Antigen enthält, und es tritt Kapillarwanderung der Lösung den Teststreifen hinauf ein. Wenn das Antigen den Teststreifen hinaufläuft, bindet es an den immobilisierten Antigenspezifischen Antikörper. Die Anwesenheit von Antigen wird dann bestimmt, indem der Streifen mit einem zweiten Antigenspezifischen Antikörper befeuchtet wird, an den eine fluoreszente oder eine Enzymmarkierung kovalent gebunden ist. Eine quantitative Analyse kann durchgeführt werden, indem die Länge des Streifens, die gebundenes Antigen enthält, gemessen wird. Varianten eines solchen Teststreifens sind im U.S. Patent Nr. 4,435,504 offenbart, das ein Zwei-Enzym-Indikatorsystem verwendet und im U.S. Patent Nr. 4,594,327, das die Zugabe eines Bindungsagens zu Vollblutproben offenbart, wodurch die Aggregation der roten Blutkörperchen in dem Bereich des Streifens in der Nähe der Luftflüssigkeitgrenzfläche bewirkt wird, sowie im U.S. Patent Nr. 4,757,004 das ein Mittel zur Einstellung der Form der wandernden Flüssigkeitsfront, die entlang dem Teststreifen wandert, offenbart. Das Assayprinzip ist des weiteren in Zuk et al. Enzyme Immunochromatography - A Quantitative Immunoassay Requiring No Instrumentation, Olinical Chemistry, 31(7): 1144-1150, 1985 beschrieben.
Weitere Beispiele von diagnostischen Vorrichtungen vom Streifentyp umfassen folgende: Swanson et al. (EP 088 636) beschreibt eine Vorrichtung für die quantitative Bestimmung eines Analyten, die ein flüssigkeitsdurchlässiges festes Medium umfaßt, das eine vorbestimmte Anzahl von hintereinanderangeordneten Reaktionszonen enthält. Die Reaktionszonen umfassen ein Reagenz, das zur Reaktion mit dem Analyten unter Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, wobei die Menge an Analyt in der Testprobe umso größer ist, je größer die Anzahl an Zonen ist, die ein nachweisbares Signal hervorrufen. Freisen et al (U.S. Patent Nr. 4,0861,711) beschreibt eine blattartige diagnostische Vorrichtung, die mehrere funktionelle Sektoren enthält, durch die die Probe hindurchtreten muß. Wenigstens einer der Sektoren umfaßt ein immobilisiertes Reagenz, das eine biologische Affinität für den Analyten oder für einen Analytkomplex aufweist.
Gordon et al. (U.S. Patent Nr. 4,956,302) beschreibt eine Teststreifenvarrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Analyt die Testprobe und/oder das Laufmittel in einer einzigen Richtung durch die Vorrichtung wandern, wodurch sie nacheinander mit Reagenz-enthaltenden Zonen oder Nachweiszonen in Kontakt gelangen. Gordon et al. (U.S. Patent Nr. 4,960,691) beschreibt eine Vorrichtung, die ein oder mehr gebunde Laufbahnen für die direkte Wanderung des Analyten, der Testprobe und/oder des Laufmittels durch die Reagenz-enthaltenden Zonen und Nachweiszonen in einer vorbestimmten Reihenfolge aufweist.
Eine Vielzahl von Bindungsverfahren ist eingesetzt worden, um einen Analyten aus einer Testlösung zu entfernen. Bolz et al. (U.S. Patent Nr.4,020,151) beschreibt ein Festphasenassay für die quantitative Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in einer Testprobe. Das Probenantigen oder der Antikorper wird direkt auf einer festen Trägeroberfläche adsorbiert, wie etwa auf einem Anionenaustauscherharz, und der Träger wird dann einem markierten spezifisch bindenden Glied ausgesetzt, das gegenüber dem Probenantigen oder dem Antikörper immunologisch reaktiv ist.
Schick et al. (U.S. Patent Nr. 4,145,406) beschreibt die Verwendung eines Ionenaustauschadsorbenzes, um Protein nichtspezifisch zu binden. Marshall et al. (U.S. Patent Nr. 4,211,763) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion, das ein Anionenaustauscherharz zur Bindung von Protein und zur Bildung eines Agglomerats umfaßt. Tabb et al. (U.S. Patent Nr. 4,362,697) beschreibt eine Testvorrichtung, die die Verwendung eines Copolymers von Vinylpyrrolidon als Verstärkersubstanz umfaßt. Giegel et al. (U.S. Patent Nr. 4,517,288) beschreibt ein Verfahren zur Durchführung eines Ligandenassays, der der Adsorption oder immunologischen Bindung eines Analyt-spezifischen Bindungsgliedes an ein poröses Medium bedarf, gefolgt von der Aufgabe des Analyten auf das poröse Medium.
Weitere Assayverfahren umfassen die Verwendung von spezifisch bindenen Hilfsgliedern. Tanswell et al. (U.S. Patent Nr. 4,642,930) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines polyvalenten Anüigens, in dem das Antigen mit drei Rezeptoren inkubiert wird; einem ersten und einem dritten Rezeptor, die an das Antigen binden, und mit einem zweiten Rezeptor, der an einen festen Träger gebunden ist, und der spezifisch an den ersten Rezeptor bindet. Valkirs et al. (U.S. Patent Nr. 4,727,019) beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für Ligandenrezeptorassays, wie Tanswell et al., wobei ein Antirezeptor (beispielsweise Avidin) auf einem porösen Glied immobilisiert ist und an einen Rezeptor (beispielsweise einen Analyt-spezifischen Antikörper, der an Biotin gebunden ist) bindet, der seinerseits an den Zielliganden gebunden ist. Wolters et al. (U.S. Patent Nr. 4,343,896) beschreibt die Verwendung von spezifisch bindenden Hilfsgliedern zur Herstellung oder Vervollständigung von nachweisbaren Komplexen, d.h. die Verwendung eines dritten Antikörpers bei einem Bindungsassay zur Vervollständigung des nachweisbaren Analyt- Bindungsglied-komplexes. W. Georghegan (U.S. Patent Nr. 4,880,751) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Immunadsorptionsmatrix, in dem der F(c)-Anteil eines ausgewählten IGG-Moleküls an einer geladenen Oberfläche adsorbiert wird. Parikh et al. (U.S. Patent Nr. 4,298,685) beschreibt die Verwendung eines Konjugates von Biotin und eines Anti-Analyt-Antikörpers zusammen mit einem inerten Träger, der immobilisiertes Avidin trägt. Die spezifische Bindung der Avidin- und Biotinkomponenten erlaubt die Immobilisierung des Antikörpers auf dem inerten Träger.
Alternative Auftrennungsverfahren umfassen die Verwendung einer magnetischen festen Phase, von Polymerisationsverfahren und die Ausbildung von Analytkomplexen, die Eigenschaften aufweisen, die sich von denjenigen des nicht-komplexierten Analyten unterscheiden. Ullmann et al. (U.S. Patent Nr. 4,935,147) beschreibt ein Verfahren zur Abtrennung von geladenen suspendierten nicht-magnetischen Partikeln aus einem flüssigen Medium mittels In-Kontakt-Bringen der Partikel mit geladenen magnetischen Partikeln und einem chemischen Reagenz. Das chemische Reagenz bildet nicht spezifische Bindungen zwischen den magnetischen und nicht-magnetischen Partikeln unter Erzeugung eines magnetischen Koaggregats aus. Ein magnetischer Feldgradient wird an den Reaktionsbehälter angelegt, um das Koaggregat in einem Teil des Behälters zu konzentrieren, und das flüssige Medium wird dann abdekantiert.
Longoria et al. (U.S. Patent Nr. 4,948,726) beschreibt ein Assayverfahren, das die Reaktion von Antigen- und Antikörpermolekülen unter Ausbildung eines Antigen/Antikörperkomplexes umfaßt, der alleinig eine Ionenladung aufweist, die sich von den Ionenladungen einzelner Moleküle unterscheidet. Eine Filterpapiermatrix wird dann aufgrund ihrer einzigartigen Affinität für den Antigen/Antikörperkomplex ausgewählt. Milburn et al. (U.S. Patent Nr. 4,959,303) beschreibt einen Assay, in dem Antigen aus einer Testprobe und ein für das Antigen spezifischer Antikörper unter Bedingungen inkubiert werden, die für die Bindung des Antikörpers an den Träger ausreichen, wenn das Antigen an den Antikörper gebunden ist.
Vandekerckhove (U.S. Patent Nr. 4,839,231) beschreibt ein proteinimmobilisierungsverfahren in zwei Schritten, das die anfängliche Abtrennung oder Isolation von Zielproteinen in einem Gel, wie etwa einem Polyamidelektrophoresegel, umfaßt, gefolgt von der Überführung der isolierten Proteine auf die Oberfläche eines beschichteten Trägers zur Immobilisierung. Der beschichtete Träger wird hergestellt, indem ein chemisch inertes Trägermaterial (wobei das Material negativ geladene Gruppen trägt) mit einer Lösung von entweder Polyvinylpyridin oder Polybren (wobei das Polymer positiv geladene Gruppen trägt) in Kontakt gebracht wird. Die Kapazität des positiv geladenen Polymers zur Ausbildung ionischer Bindungen mit den negativ geladenen Gruppen des Trägermaterials führt zur Ausbildung eines unlöslichen Polymerfilms auf dem Träger.
Monji et al. (U.S. Patent Nr. 4,780,409) beschreibt einen Reaktanden, der an ein temperaturempfindliches oder salzempfindhohes Polymer konjugiert ist, das aus einer Testlösung ausfällt, wenn die Temperatur oder die Salzkonzentration dieser Lösung auf einen geeigneten Pegel eingestellt wird. Marshall (U.S. Patent Nr. 4,530,900) beschreibt einen Reaktanden, der an ein lösliches Polymer konjugiert ist, wobei das Polymer für die Entfernung aus der Lösung unlöslich gemacht wird und physikalisch aus der Testlösung mittels Filtration oder Zentrifugation entfernt wird. Marshall offenbart zwei Mittel, mittels derer das Reaktant-Polymerkonjugat unlöslich gemacht wird: das Absenken des pH's der Lösung oder die Zugabe von Salz wie bei Monji et al. Marshall beschreibt weiter, daß das unlöslich gemachte Konjugat dann ausgefällt und aus der Testlösung entfernt wird und zuletzt in Form einer zweiten Lösung vor dem Analytnachweis erneut löslich gemacht wird.
Hiltibran et al. (EP-A-0 406 473) beschreibt Beispiele von kompetitiven Digoxin-Ioneneinfangassays, bei denen die faserige feste Phase mittels Beschichtung derselben mit einer polymeren quaternären Verbindung positiv geladen wurde.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neue Kompetitivassayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Digoxin in einer Testprobe zur Verfügung. Bei einer Ausführungsform umfaßt der Assay ein Einfangreagenz, das ein erstes Bindungsglied enthält, das an eine polymere anionische Substanz konjugiert ist, ein Indikatorreagenz, das Digoxin oder ein Digoxinanalogon mit einer nachweisbaren Markierung enthält, und ein Festphasenmaterial, das ein Reaktionszentrum enthält, das aus einer polymeren katonischen Substanz mit einem Stickstoffgehalt von wenigstens etwa zehn Prozent, unter Auschluß der Gegenionen besteht. Das Einfangreagenz und der Indikator sind zur Ausbildung eines Komplexes mit dem Analyten bei einem Kompetetivassay oder bei einem indirekten Assay ausgewählt, wobei ein nachweisbarer Komplex proportional zur Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe ausgebildet wird. Typischerweise wird dann das Indikatorreagenz, das mit der festen Phase assoziiert ist, nachgewiesen, um die Anwesenheit oder Menge von Analyt in der Testprobe zu bestimmen. Alternativ kann das Indikatorreagenz nachgewiesen werden, das ungebunden verbleibt.
Bei einer weiteren Assayausführungsform kann das Einfangreagenz Digoxin oder ein Digoxinanalogon enthalten, das an eine polymere anionische Substanz konjugiert ist, und das Indikatorreagenz kann ein Bindungsglied und eine nachweisbare Markierung enthalten. In noch einer weiteren Assayausführungsform kann ein geeignetes spezifisch bindendes Hilfsglied mit dem ersten bindenden Glied und der Testprobe umgesetzt werden, wodurch ein Indikatorreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex oder ein Einfangreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex ausgebildet wird, bevor der Kontakt zur festen Phase hergestellt wird.
Das spezifisch bindende Glied des Einfangreagenzes kann ein Hapten oder ein Makromolekül sein. Das geladene Einfangreagenz erlaubt homogene Assayreaktionen, bei denen die Reaktionskomplexe aus der Reaktionsmischung entfernt werden können, indem die Mischung mit einer entgegengesetzt geladenen festen Phase in Kontakt gebracht wird.
Bei den Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt a) die Verwendung der Flüssigphasenkinetik die erleichterte Ausbildung eines Komplexes aus der homogenen Mischung von Analyt und Assayreagenz-spezifischeen bindenden Gliedern und es steigert b) das Ioneneinfangverfahren die potentielle Anzahl von Komplexen, die auf einen festen Träger immobilisiert werden können. Wenn man von den Vorteilen der Flüssigphasenkinetik absieht, liefert die vorliegende Erfindung ebenfalls ein effizientes Verfahren zur Immobilisierung von Bindungsgliedern auf einer festen Phase über ein Verfahren, das von Absorption, Adsorption oder kovalenter Bindung verschieden ist.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können gemäß unterschiedlichen Kompetitivimmunoassayformaten durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf immunreaktive Assays beschränkt. Andere Kompetitivassays unter Verwendung von spezifischen Bindungsreaktionen zwischen dem Analyt und den Assayreagenzien können durchgeführt werden.

Definitionen

Die folgenden Definitionen gelangen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung.
Der Ausdruck "spezifisch bindendes Glied", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet das Glied eines spezifisch bindenden Paars, d.h. von zwei unterschiedlichen Molekülen, wobei eines der Molekijle über chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Die komplementären Glieder eines spezifisch bindenden Paares können ebenfalls Ligand und Rezeptor bezeichnet werden. Zusätzlich zum gutbekannten Beispiel von Antigen und Antikörper als spezifisch bindendem Paar sind alternative spezifisch bindende Paare beispielsweise folgende: Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen (einschließlich Sonden- und Einfangnucleinsäuresequenzen, die bei DNA-Hybridisierungsassays zum Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz verwendet werden), komplementäre Peptidsequenzen (einschließlich solcher, die mittels rekombinanter Verfahren hergestellt werden), Effektor- und Rezeptormoleküle, Hormone und Hormonbindungsproteine, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme und dergleichen. Darüber hinaus können spezifisch bindende Paare Glieder umfassen, die Analoga der ursprünglichen spezifisch bindenden Glieder sind. Beispielsweise kann ein Derivat oder Fragment des Analyten (ein Analyt-Analogon) verwendet werden, so lange er/es wenigstens ein Epitop mit dem Analyten gemeinsam hat. Immunreaktive spezifisch bindende Glieder umfassen Antigene, Haptene, Antikörper und deren Komplexe einschließlich solcher, die mittels rekombinanter DNA-Verfahren oder der Peptidsynthese ausgebildet werden. Ein Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein Schimären-Antikörper, ein rekombinantes Protein oder eine Mischung(en) oder Fragment(e) davon sein, wie auch eine Mischung von Antikörper und anderen spezifisch bindenden Gliedern. Die Einzelheiten der Herstellung solcher Antikörper und deren Eigung zur Verwendung als spezifisch bindende Glieder sind dem Fachmann gut bekannt.
Der Ausdruck "Hapten", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein partielles Antigen oder Nicht-Proteinbindungsglied, das zur Bindung an einen Antikörper befähigt ist, das jedoch nicht zur Ausbildung der Antikörper befähigt ist, sofern es nicht an ein Trägerprotein gebunden ist.
Der Ausdruck "Testprobe", wie hierin verwendet, bezeichnet geläufigerweise jedwede flüssige Probe. Die Testprobe kann aus jedweder geeigneten Quelle, wie etwa physiologischer Flüssigkeit, beispielsweise Blut, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Rückenarksflüssigkeit, Schweiß, Urin, Milch, Ascitesflüssigkeit, Schleim, Synovialflüssigkeit, peritonealflüssigkeit oder Fruchtwasser abgeleitet sein. Die flüssige Testprobe kann vor der Verwendung vorbehandelt werden, wie etwa bei der Herstellung von Plasma aus Blut und bei der Verdünnung viskoser Flüssigkeiten. Die Verfahren der Vorbehandlung können ebenfalls die Abtrennung, Filtration, Destillation, Konzentration und Inaktivierung störender Komponenten sowie die Zugabe von Reagenzien umfassen. Außer physiologischen Flüssigkeiten können andere flüssige Proben, wie etwa Wasser und Nahrungsmittelprodukte verwendet werden. Zusätzlich kann auch eine feste Testprobe verwendet werden, wenn sie unter Ausbildung eines flüssigen Mediums verändert worden ist.
Der Ausdruck "Analyt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Substanz, die in der Testprobe mittels der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden soll. In Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Brfindung ist Digoxin der nachzuweisende Analyt.
Der Ausdruck "Analyt-Analogon", wie er hierin verwendet wird bezeichnet eine Substanz, die mit einem spezifisch bindenden Glied für den Analyten (Digoxin) kreuzregiert, obwohl das Analyt-Analogon mit dem bindenden Glied in einem größeren oder geringeren Ausmaß zu reagieren vermag, als dies der Analyt selbst tut. Das Analyt-Analogon kann einen abgewandelten Analyten, wie auch einen fragmentierten oder synthetischen Teil des Analytmoleküls enthalten, so lange das Analyt-Analogon wenigstens eine epitopische Stelle mit dem interessierenden Analyten gemeinsam hat.
Der Ausdruck "Markierung", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedwede Substanz, die direkt oder indirekt an ein spezifisch bindendes Glied bihdet, und die zur Erzeugung eines Signals, das mittels visueller oder instrumenteller Mittel nachweisbar ist, befähigt ist. Verschiedene geeignete Markierungen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können Ohromogene, Katalysatoren, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Markierungen, direkte visuelle Markierungen einschließlich kolloidaler metallischer und nicht-metallischer Partikel, Farbpartikel, Enzyme oder Substrate oder organische Polymerlatexpartikel umfassen oder auch Liposome oder andere Vesikel, die signalerzeugende Substanzen enthalten.
Eine große Anzahl von Enzymen, die als Markierungen geeignet sind, sind im U.S. Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19-23 offenbart.
Beispielsweise umfaßt ein Enzym/Substrat-Signalerzeugungssystem, das bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, das Enzym alkalische Phosphatase und das Substrat Nitroblau- Tetrazolium-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat oder ein Derivat oder Analogon davon.
Bei einem alternativen Signalerzeugungssystem kann die Markierung eine fluoreszente Verbindung sein, wenn keine enzymatische Manipulation der Markierung notwendig ist, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Fluoreszente Moleküle, wie etwa Fluorescein, Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate und Analoga sind zur Verwendung als Markierungen bei diesem System geeignet.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine visuell sichtbare farbige Partikel als Markierungsbestandteil des Indikatorreagenzes verwendet werden, wobei eine direkte farbige Ablesung der Anwesenheit oder Konzentration des Analyten in der Probe ermöglicht wird, und zwar ohne den Bedarf an Zugabe von anderen signalerzeugenden Reagenzien. Materialien zur Verwendung als farbige Partikel sind kolloidale Metalle, wie etwa Gold und Farbpartikel, wie sie im U.S. Patent Nr. 4,313,734 und 4,373,932 offenbart sind.
Die Herstellung und die Verwendung von nicht-metallischen Kolbiden, wie etwa kolloidalen Selenpartikeln sind im U.S. Patent Nr. 4,954,452 offenbart.
Die Verwendung von kolloidalen Partikelmarkierungen in der Immunchromatographie ist in EP-A-0 299 428 offenbart.
Organische Polymerlatexpartikel zur Verwendung als Markierungen sind in EP-A-0 360 088 offenbart.
Der Ausdruck "signalerzeugender Bestandteil", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedwede Substanz, die zur Reaktion mit dem Analyten oder einem anderen Assayreagenz unter Erzeugung eines Reaktionsproduktes oder Signals in der Lage ist, das die Anwesenheit oder Menge von Analyt anzeigt, und das mit visuellen oder instrumentellen Mitteln nachweisbar ist. "Signalerzeugungssystem", wie hierin verwendet, bezeichnet die Gruppe von Assayreagenzien, die verwendet werden, um das gewünschte Reaktionsprodukt oder Signal zu erzeugen. Beispielsweise können eine oder mehrere signalerzeugende Komponenten verwendet werden, um mit einer Markierung zu reagieren und um das nachweisbare Signal zu erzeugen. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wird beispielsweise die Verstärkung des nachweisbaren Signals erhalten, indem das Enzym mit einem oder mehreren Substraten oder zusätzlichen Enzymen unter Erzeugung eines nachweisbaren Reaktionsproduktes umgesetzt wird.
Der Ausdruck "Indikatorreagenz", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein spezifisch bindendes Glied, das an eine Markierung gebunden ist oder das an eine Markierung gebunden wird. Das Indikatorreagenz erzeugt ein nachweisbares Signal auf einem Pegel, der der Menge an Analyt in der Testprobe entspricht. Allgemein wird das Indikatorreagenz nachgewiesen oder gemessen, nachdem es auf dem Festphasenmaterial eingefangen worden ist, jedoch kann ebenfalls das ungebundene Indikatorreagenz gemessen werden, um das Ergebnis des Assays zu bestimmen.
Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes vermag an das Einfangreagenz wie bei einem Kompetitivassay zu binden, oder an das spezifisch bindende Hilfsglied zur Vervollständigung des nachweisbaren Komplexes. Wie oben beschrieben, ermöglicht die Markierung dem Indikatorreagenz, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das zur Anwesenheit oder Menge an Analyt in der Testprobe in Beziehung steht. Das spezifisch bindende Glied als Bestandteil des Indikatorreagenzes ermöglicht die indirekte Bindung der Markierung an den Analyten, an ein spezifisch bindendes Hilfsglied oder an das Einfangreagenz. Die Auswahl einer besonderen Markierung ist nicht kritisch, jedoch ist die Markierung zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals entweder selbst wie etwa als visuell nachweisbares Signal befähigt, das von farbigen organischen Polymerlatexpartikeln hervorgerufen wird, oder zusammen mit ein oder mehreren zusätzlichen signalerzeugenden Komponenten, wie etwa einem Enzym/Substrat-Signaler zeugungssystem. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Indikatorreagenzien kann ausgebildet werden, indem entweder die Markierung oder das spezifisch bindende Glied verändert wird; es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die spezielle Auswahl dessen die Betrachtung des nachzuweisenden Analyten und des gewünschten Nachweismittels erfordert.
Wie oben ausgeführt, kann die Markierung während des Assayverlaufs an das spezifisch bindende Glied gebunden werden. Beispielsweise kann ein biotinylierter Anti-Analyt-Antikörper mit einem markierten Streptavidinmolekül umgesetzt werden. Jedwede geeignete Kombination von Bindungsgliedern und Markierungen kann verwendet werden.
Der Ausdruck "Einfangreagenz", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein nicht-markiertes spezifisch bindendes Glied, das an eine geladene Substanz gebunden ist. Die Anbindung der Komponenten ist im wesentlichen irreversibel und kann kovalente Mechanismen umfassen. Das spezifisch bindende Glied kann ein kleines Molekül, wie etwa ein Hapten oder ein kleines Peptid sein, solange die Anbindung an die geladene Substanz nicht das Bindungszentrum des Bindungsgliedes stdrt. Der Bindungsgliedbestandteil des Einfangreagenzes ist für das Indikatorreagenz oder den Analyten wie bei einem Kompetitivassay spezifisch, oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das seinerseits für den Analyten spezifisch ist.
Der geladene Substanzbestandteil des Einfangreagenzes umfaßt anionische Polymere. Beispielsweise umfassen anionische Polymere Polyglutaminsäure (PGA), anionisches Protein oder derivatisiertes Protein, wie etwa Albumin, anionische Polysaccharide, wie etwa Heparin oder Alginsäure, Polyasparaginsäure, Polyacrylsäure und Polyaminosäuren mit einem Netz negativer Ladungen bei einem pH, der für die spezifische Bindungsreaktion geeignet ist, (wie etwa ein pH im Bereich von 4 bis 10). Darüberhinaus kann das spezifische bindende Glied mit mehr als einem geladenen Polymeren verbunden sein, um die Netzladung zu erhöhen, die mit dem Einfangreagenz assoziiert ist.
Die hierin offenbarten Einfangreagenzien werden verwendet, um die Beobachtung des nachweisbaren Signals zu erleichtern, indem der Analyt und/oder die Indikatorreagenzien im wesentlichen von den anderen Assayreagenzien und den verbleibenden Testprobenbestandteilen abgetrennt werden. Bei einer besonders vorteilhaften Verwendung wird das Einfangreagenz mit der Testprobe und den Assayreagenzien in einer homogenen Reaktionsmischung umgesetzt. Nach der Ausbildung des gewünschten spezifischen Bindungsglied-Komplexes werden die Komplexe, die ein Einfangreagenz umfassen, aus der homogenen Reaktionsmischung entfernt, indem die homogene Reaktionsmischung mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, die in Bezug auf die Ladung des Einfangreagenzes entgegengesetzt ist. Ein negativ geladenes Einfangreagenz kann hergestellt werden, indem das ausgewählte spezifische Bindungsglied an ein oder mehrere polymere anionische Moleküle und deren konjugierte Basen konjugiert wird, die durch folgende allgemeine Formel dargestellt werden:
worin n ungefähr gleich 10 bis ungefähr 500 ist; z ungefähr gleich 1 bis ungefähr 6 ist; worin W aus H&spplus;, Na&spplus;, K&supmin;, Li&spplus;, Aminsalzen wie etwa H&spplus;NR&sub3; und aus Derivaten davon gewählt ist; und worin X jede beliebige reaktive Gruppe oder Funktion ist, die eine reaktive Gruppe aufweist, die die chemische Bindung des spezifisch bindenden Gliedes an das Polymer ermöglicht. "X" kann eine Amin-reaktive Gruppe oder Funktion, eine thiolreaktive Gruppe oder Funktion oder eine Thiolgruppe oder -funktion sein, die durch -A-SH dargestellt wird, worin A ein Spacerarm ist. Beispielsweise kann ein spezifisch bindendes Glied mit einer Aminogruppe an ein aktiviertes anionisches PGA-Molekül konjugiert sein, das eine Amin-reaktive Funktion aufweist. Die Amin-reaktiven Funktionen erlauben die Bindung des aktivierten Polymers an eine Aminogruppe auf einem spezifisch bindenden Glied und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die durch folgende Formeln dargestellt werden:
und die Additionssalze von NH
worin m gleich zwei oder drei ist, R¹ ein Schwefelstabilisator ist und R" eine aliphatische oder Arylgruppe ist. Die Schwefelstabilisatoren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, 2-Pyridyl, 4-Pyridyl und 5-Nitro-2-pyridylgruppen. "A" steht für einen Spacer von ungefähr ein bis ungefähr dreißig Atomen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Sauerstoffatomketten und deren Kombination wie etwa Polyether, Polymethylen und Polyamid, wie auch aromatische Spacer wie etwa Phenylthiocarbamyl.
Alternativ kann ein spezifisch bindendes Glied mit einer Thiolgruppe an ein aktiviertes Polymer konjugiert sein, das eine thiolreaktive Funktion aufweist. Die thiolreaktiven Funktionen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die durch folgende Formeln dargestellt werden:
worin A ein Spacer von ungefähr eins bis ungefähr dreißig Atomen wie oben beschrieben ist. Bei noch einer weiteren Alternative kann ein spezifisch bindendes Glied mit einer Thiol-reaktiven Gruppe an ein aktiviertes Polymer gebunden sein, das eine Thiolfunktion, wie etwa -A-SH, aufweist.
Typischerweise sind die negativ geladenen Einfangreagenzien der nachfolgenden Beispiele mittels Umsetzung des gewünschten spezifischen bindenden Gliedes mit einem aktivierten PGA-Molekül ausgebildet worden, das abgewandelte terminale Aminogruppen trägt. Kurz gesagt, umfaßt die Abwandlungsmethode folgendes: 1) Auflösen der PGA in einem Lösungsmittel (beispielsweise in einem mit Wasser mischbaren aprotischen Lösungsmittel wie etwa Dioxan, Dimethylformamid, 1 -Methyl-2-pyrrolidinon und Dimethylsulfoxid) 2) Zugabe eines protonenabsorbierenden Reagenzes (beispielsweise 4-Methylmorpholin) in der Menge von ungefähr einem Äquivalent pro titrierbarer Carbonsäuregruppe; 3) Zugabe eines ungefähr 2- bis ungefähr 100-fachen molaren Überschusses an Amin-reaktivem Abwandlungsreagenz (beispielsweise 1,4-Phenylendiisothiocyanat, gelöst in Dimethylformamid); 4) Umsetzung der Mischung und 5) Entfernung des unreagierten Amin-reaktiven Abwandlungsreagenzes. Geeignete protonenabsorbierende Reagenzien umfassen Alkalimetallhydroxide wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid und tertiäre Amine wie etwa 4- Methylmorpholin und Triethylamin.
Das polymere anionische Molekül oder das spezifisch bindende Glied umfaßt eine oder mehrere Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen, oder es/sie kann durch den Einbau von Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppen aktiviert werden, wodurch die chemische Kreuzvernetzung des spezifisch bindenden Glieds mit dem polymeren anionischen Molekül ermöglicht wird. "Aktivierte Spezies" bezeichnet spezifisch bindende Glieder und polymere anionische Moleküle, die über den Einbau eines Kreuzvernetzungsoder eines anderen Aktivierungsagenzes eine reaktive Gruppe enthalten. Die Amin-reaktiven Abwandlungs-reagenzien sind eine Unterklasse der Reagenzien, die zur "Aktivierung." eines spezifisch bindenden Gliedes oder eines polymeren anionischen Moleküls verwendet werden, d.h. zur Herstellung des spezifisch bindenden Gliedes oder des polymeren anionischen Moleküls für die chemische Kreuzvernetzung. Die aktivierenden Agenzien umfassen ebenfalls thioleinführende Agenzien, wie etwa Thiolane (wie 2-Iminothiolan), Succinimidylmercaptoacetate (wie etwa N- Succinimidyl-S-Acetylmercaptoacetat) und Disulfidverbindungen, die nachfolgend zum Thiol reduziert werden. Die Thioleinführungsreagenzien können verwendet werden, um spezifisch bindende Glieder und Festphasenmaterialien für deren nachfolgende Reaktion mit einer thiolreaktiven Gruppe zu aktivieren.
Die Amin-reaktiven Abwandlungsreagenzien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, bifunktionelle Kreuzvernetzungs- oder Kupplungsagenzien, wie etwa Succinanhydridanaloga, Iminothiolan-analoga, homobifunktionelle Reagenzien und heterobifunktionelle Reagenzien, die die chemische Kreuzvernetzung des spezifisch bindenden Gliedes und des polymeren anionischen Moleküls erlauben. Beispiele für homobifunktionelle Reagenzien können durch die Formel X-A-X dargestellt werden, worin X eine Amin-reaktive Gruppe und A ein Spacer von ungefähr ein bis dreißig Atomen ist. Beispiele für heterobifunktionelle Reagenzien können durch die Formel X-A-Y dargestellt werden, worin X eine Amin-reaktive Gruppe und Y eine thiolreaktive Funktion, eine Thiolfunktion oder ein Thiolvorläufer ist, und worin A ein Spacer yon ungefähr ein bis ungefähr dreißig Atomen ist, wie oben beschrieben. Proteinartige spezifisch bindende Glieder mit Cysteinresten an dem aktiven Zentrum des Proteins können durch die Addition eines Kupplungsagenzes eine verminderte Aktivität erhalten, und daher müssen die Cysteinreste im aktiven Zentrum geschützt werden, etwa mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, bevor das Protein mit dem Kupplungsagenz umgesetzt wird.
Der Ausdruck "Kupplungsagenz", wie er hierin verwendet wird, umfaßt bifunktionelle Kreuzvernetzungs- oder Kupplungsagenzien, d.h. Moleküle, die zwei reaktive Gruppen oder "Enden" enthalten, die über einen Spacer beabstandet sein können. Die reaktiven Enden können jedwede aus einer Vielzahl von Funktionalitäten sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Amin-reaktive Enden, wie etwa N-Hydroxysuccinimid-(NHS)-Aktivester, Imidoester, Aldehyde, Epoxide, Sulfonylhalide, Isocyanate, Isothiocyanate und Nitroarylhalide und thiolreaktive Enden, wie etwa Pyridyldisulfide, Maleinimide, Thiophthalimide und aktive Halogene. Die heterobifunktionellen Kreuzvernetzungsreagenzien haben zwei unterschiedliche reaktive Enden, beispielsweise ein Amin-reaktives Ende und ein Thiol-reaktives Ende, während homobifunktionelle Reagenzien zwei ähnliche reaktive Enden haben, beispielsweise Bismaleinimidohexan (BMH), das die Kreuzvernetzung von Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindungen erlaubt, und NHS-homobifunktionelle Kreuzvernetzer wie etwa Disuccinimidylsuberat (DSS) , wie auch dessen wasserlösliche Analoga, Sulfo-NHS-Ester (nach Pierce 1989 Handbook and General Catalog; Pierce, Rockford, IL).
Weitere handelsüblich erhältliche homobifunktionelle Kreuzvernetzungsreagenzien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Imidoester, wie etwa Dimethyladipimidatdihydrochlorid (DMA); Dimethylpimelimidatdihydrochlorid (DMP) und Dimethylsuberimidatdihydrochlorid (DMS). Die Iminothiolananaloga können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden.:
worin A ein Spacer von ungefähr 1 bis ungefähr 5 Atomen, beispielsweise 2-Iminothiolan (Traut's Reagenz) ist.
Handelsüblich erhältliche heterobifunktionelle Reagenzien, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Maleinimido- NHS-Aktivester-Kupplungsagenzien, wie etwa m-Maleinimidobenzoyl- N-hydroxysuccinimidester (MBS) ; Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC); Succinimidyl-4-(p- maleinimidophenyl)butyrat (SMPB) und deren Derivate einschließlich Sulfosuccinimidylderivaten wie etwa Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC); m-Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (sulfo- MBS) und Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat (sulfo-SMPB) (Pierce). Andere geeignete heterobifunktionelle Reagenzien umfassen handelsüblich erhältliche Halogen-NHS- Aktivester, Kupplungsagenzien wie etwa N-Succinimidylbromacetat und N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (SIAB) und die Sulfo-succinimidylderivate, wie etwa Sulfosuccinimidyl (4- jodacetyl)aminobenzoat (sulfo-SIAB) (Pierce). Eine weitere Gruppe von Kupplungsagenzien sind die heterobifunktionellen und thiolspaltbaren Agenzien, wie etwa N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat (SPDP) (Pierce).
Noch eine weitere Gruppe von Kupplungsagenzien umfaßt die heterobifunktionellen Kupplungsagenzien von vergrößerter Länge, die im U.S. Patent 5,002,883 beschrieben sind.
Die heterobifunktionellen Kupplungsagenzien vergrößerter Länge umfassen Maleinimido-NHS-Aktivesterreagenzien, worin der Spacer durch folgende Formel dargestellt wird: (Aminosäure)
worin die Aminosäure eine substituierte oder unsubstituierte Aminosäure ist, die drei bis zehn Kohlenstoffatome in gerader Kette aufweist; worin n gleich eins bis zehn ist; und worin R ein Alkyl, Cycloalkyl, Alkyl-Cycloalkyl oder ein aromatischer carboxylischer Ring ist. Der Ausdruck Alkyl-Cycloalkyl umfaßt Alkylgruppen, die an Cycloalkylringstrukturen gebunden sind, wobei die Alkylgruppe das Cycloalkyl an eine Maleinimid- oder Carbonylgruppe bindet. Der Ausdruck Alkyl umfaßt gerade oder verzweigte Alkylgruppen, vorzugsweise Niederalkylgruppen mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen.
Wenn ein Spacer vorhanden ist, kann der Spacer jedwede Molekülkette sein, die nicht-reaktiv, stabil und den Analyten oder anderen verwendeten spezifisch bindenden Gliedern gegenüber nicht-bindend ist. Die Länge des Spacers kann verändert werden und kann von der Größe eines einzelnen Atoms bis hin zu den Größen variieren, die im U.S. Patent 5,002,883 und EP-A-0 314 127 offenbart sind, oder gar größer.
Die Auswahl des aminreaktiven Abwandlungsreagenzes, des thioleinführenden Agenzes oder eines anderen Aktivierungsagenzes ist nicht kritisch, jedoch kennt der Fachmann geeignete oder bevorzugte Agenzien zur Verwendung zusammen mit dem besonderen polymeren anionischen Molekül und dem spezifischen Bindungsglied, die bei dem diagnostischen Assay verwendet werden. Daher ist offensichtlich, daß der Facbmann das Kupplungsagenz oder das Aktivierungsagens, welche er bei einem gegebenen Assay verwenden will, allgemein empirisch auswählt.
Geeignete thiolreaktive Funktionen der heterobifunktionellen Reagenzien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, solche die durch die folgenden Formeln dargestellt werden:
Geeignete Thiolvorläuferfunktionen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein solche, die durch die folgenden Formeln dargestellt werden:
Geeignete aminreaktive Funktionen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, solche die durch die folgenden Formeln dargestellt werden:
und die Additionssalze von
worin m gleich 2 oder 3 ist, R' ein Schwefelstabilisator ist, wie oben beschrieben, und worin R" eine aliphatische oder eine Arylgruppe ist.
Bei noch einem weiteren Verfahren zur Herstellung eines Einfangreagenzes kann ein spezifisch bindendes Glied, das eine aminreaktive Gruppe trägt, (beispielsweise ein aktiviertes spezifisch bindendes Glied) an eine terminale Aminogruppe des polymeren anionischen Moleküls konjugiert werden. Kurz gesagt umfaßt ein Beispiel des Konjugationsverfahren folgende Schritte: 1) Auflösung der PGA in einem Lösungsmittel (beispielsweise einem mit Wasser mischbaren aprotischen Lösungsmittel wie etwa Dioxan, Dimethylformamid, 1-Methyl-2-pyrrolidinon und Dimethylsulfoxid); 2) Zugabe eines protonenabsorbierenden Reagenzes (beispielsweise eines Alkalimetalhydroxides, wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid oder eines terziären Amins, wie etwa 4-Methylmorpholin oder Triethylamin) in einer Menge von ungefähr einem Äquivalent pro titrierbarer Garbonsäuregruppe; 3) Zugabe von ungefähr 2 bis ungefähr 100fachem molarem Überschuß an aminreaktivem spezifisch bindendem Glied (beispielsweise phosgenaktiviertem Phenylcyclidin oder Phenylcyclidin-4-chlorformat); 4) Umsetzen der Mischung und 5) Entfernung des unreagierten aminreaktiven spezifisch bindenden Gliedes. Beispiele für geeignete aminreaktive Gruppen auf spezifisch bindenden Gliedern umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, folgende:
und Additionssalze von
worin A ein Spacer von ungefähr ein bis ungefähr dreißig Atomen wie oben beschrieben ist, worin m gleich zwei oder drei ist, worin R' ein Schwefelstabilisator und R" eine aliphatische oder eine Arylgruppe ist.
Ein Beispiel für die Herstellung eines negativ geladenen Einfangreagenzes umfaßt die Reaktion zwischen einem spezifisch bindenden Glied (SBM, "specific binding member") mit einer Aminogruppe und einer aktivierten PGA, die eine aminreaktive Gruppe aufweist. Die resultierende Reaktion und das Reaktionsprodukt können wie folgt veranschaulicht werden:
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist Carboxymethylamylose (CMA) aufgrund seiner besonderen Leistungen bei verschiedenen Immunoassaykonfigurationen ein bevorzugtes anionisches Polymer zur Verwendung beim Einfangreagenz. Die verbesserte Leistung der Einfangreagenzien, die CMA enthalten, kann der höheren Affinität des CMA-Einfangreagenzes für die kationische feste Phase zugesprochen werden. Diese Eigenschaft ist insbesondere in einem zwei-Schritt-Assaysandwichformat vorteilhaft, bei dem ein Polyanion verwendet wird, um die nicht-spezifische Bindung des Indikatorreagenzes an die kationische Festphase zu blockieren.
Der Ausdruck "spezifisch bindendes Hilfsglied", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedwedes Glied eines spezifischen Bindungspaares, das in dem Assay zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern des Einfangreagenzes und des Indikatorreagenzes verwendet wird. Beispielsweise kann in einem Assay ein spezifisch bindendes Hilfsglied den Analyten an ein zweites spezifisch bindendes Glied binden, an das sich der Analyt selbst nicht anbinden würde.
Eines oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder können bei einem Assay verwendet werden.
Der Ausdruck "feste Phase", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedwedes Material, das unlöslich ist, oder das durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann, und das mit einer geladenen Substanz vorbehandelt werden kann und diese zurückhalten kann, welche im Hinblick auf die geladene Substanz des Einfangreagenzes entgegengesetzt geladen ist. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein anionische Substanz an ein spezifisch bindendes Glied unter Ausbildung des Einfangreagenzes gebunden, und eine kationische Substanz wird auf die feste Phase aufgebracht und von dieser zurückgehalten.
Natürliche, synthetische, oder synthetisch abgewandelte natürlich vorkommende Materialien können als kationische Substanz verwendet werden. Eine weite Vielzahl von eigentümlichen Polykationen ist verfügbar, einschließlich tertiären und quaternären Ammoniumverbindungen und Derivaten von Ammoniumverbindungen. Solche polykationischen Materialien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Merquat-100 Verbindung (ein kationisches Homopolymer von Dimethyldiallylammoniumchlorid; Calgon Corporation, Pittsburgh, PA).
Es wurde unerwarteterweise entdeckt, daß das kationische Homopolymer aus Dimethyldiallylammoniumchlorid und anderen polykationischen Substanzen mit einem Stickstoffgehalt von über ungefähr 10% (ausgenommen dem Gegenion) bei der Herstellung einer festen Phase, die während des Assayverfahrens gespült wird, besonders vorteilhaft ist. Die Verwendung einer solchen polykationischen Substanz zur Herstellung einer geeignet geladenen festen Phase führte zu einer festen Phase, die einer stärkeren Manipulation unterworfen werden konnte, ohne daß die Fähigkeit zur Anziehung und zur Zurückhaltung des entgegengesetzt geladenen Einfangreagenzes verloren ging.
Eine Assayvorrichtung, die auf der Ioneneinfangtechnik beruht, kann viele Konfigurationen aufweisen, von denen beträchtlich viele von dem Material abhängen, das als feste Phase ausgewählt worden ist. Bei den verschiedenen Ausführungsformen für die Vorrichtung kann die feste Phase Polymer- oder Glasperlen, Mikropartikel, magnetische Partikel, Röhren, Folien, Platten, Objektträger, Vertiefungen, Bänder, Reagenzgläser, geschichtete Filme oder dergleichen umfassen, oder auch jegliches andere Material, das eine geladene Substanz zurückzuhalten vermag.
Die vorliegende Erfindung umfaßt kompetitive Assays für Digoxin. Bei einem beispielhaften Kompetitivassay umfaßt das lösliche Einfangreagenz wiederum ein spezifisch bindendes Glied, das an eine geladene Substanz gebunden worden ist, wie etwa an ein anionisches Polymer. Das Einfangreagenz gelangt entweder sequenziell oder simultan mit der Testprobe und mit einem Indikatorreagenz in Kontakt, das ein zweites Bindungsglied umfaßt, welches mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert worden ist. Sowohl das Einfangreagenz als auch der Analyt können im Hinblick auf die Bindung an das Indikatorreagenz konkurrieren, (beispielsweise sind das Einfangreagenz und der Analyt Antigene, die um einen markierten Antikörper konkurrieren) oder das Indikatorreagenz und der Analyt können im Hinblick auf die Bindung an das Einfangreagenz konkurrieren (beispielsweise ist das Indikatorreagenz ein markiertes Antigen, das mit dem antigenischen Analyten um die Bindung an den Antikorperbestandteil des Einfangreagenzes konkurriert). Eine Kompetitivbindungs- oder Verdrängungsreaktion tritt in der homogenen Mischung ein und führt zur Bildung von Einfangreagenz/Analyt-Komplexen und Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplexen.
Die resultierenden Komplexe werden aus den überschüssigen Assayreagenzien und der Testprobe entfernt, indem die Reaktionsmischung mit der entgegengesetzt geladenen festen Phase in Kontakt gebracht wird. Die Einfangreagenzkomplexe werden auf der festen Phase über die Wechselwirkung der entgegengesetzt geladenen Polymere zurückgehalten. Die auf der festen Phase zurückgehaltenen Polymere können über die Markierung des Indikatorreagenzes nachgewiesen werden. Bei einem Kompetitivassay ist die Menge an Markierung, die mit der festen Phase assoziiert wird, zur Menge an Analyt in der Probe umgekehrt proportional. Das heißt, eine positive Testprobe erzeugt ein negatives Signal. Der Kompetitivassay wird vorteilhafterweise verwendet, um die Anwesenheit von Digoxin zu bestimmen, das ein kleines Analytmolekül ist, etwa so klein wie Peptide oder Haptene, die ein einzelnes Epitop aufweisen, mit dem sie an einen spezifisch bindenden Partner binden. Andere Kompetitivassays können eines oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder zur Bindung des Analyten an das Indikatorreagenz und/oder das Einfangreagenz umfassen.
Allgemein wird, sobald die Komplexbildung zwischen dem Analyten und den Assayreagenzien eintritt, die entgegengesetzt geladene feste Phase als Abtrennungsmechanismus verwendet: die homogene Reaktionsmischung wird mit der festen Phase in Kontakt gebracht, und die neu ausgebildeten Bindungskomplexe werden auf der festen Phase über die Wechselwirkung der entgegengesetzten Ladungen der festen Phase und des Einfangreagenzes zurückgehalten. Wenn der Anwender die Flüssigphasenkinetik vermeiden will, kann das Einfangreagenz auf der festen Phase unter Ausbildung einer Einfangstelle vorimmobilisiert werden.
Wenn der Komplex aus geladenem Einfangreagenz und Analyt (und/oder Indikatorreagenz) mit der entgegengesetzt geladenen festen Phase in Kontakt gebracht wird, regiert die ionische Anziehung der entgegengesetzt geladenen Spezies die Wirksamkeit der Abtrennung des Komplexes aus der Reaktionsmischung. Die ionische Anziehung kann so eingestellt werden, daß sie eine stärkere Anziehung als die immunologische Anziehung des Antikörpers für das Antigen liefert, insbesondere dann wenn mehrfache polykationische und polyanionische Spezies in das Einfangreagenz und die entgegengesetzt geladene feste Phase eingeschlossen sind. Ein weiterer Vorteil ist derjenige, daß die "Ioneneinfang-"Technik die nicht-spezifische Adsorption von störenden Substanzen auf der festen Phase auf ein Minimum reduziert, wodurch eine verbesserte Genauigkeit der Analyse angeboten wird. Die Ioneneinfangtechnik erlaubt so die Durchführung eines Assays mit einer hochspezifischen Abtrennungsmethode, einer minimalen nicht-spezifischen Bindung und einer hohen Sensitivität.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, daß die Zugabe eines nicht-spezifischen Bindungsblockerreagenzes zum Indikatorreagenz zu einem erhöhten Signal- Zu-Rauschen-Verhältnis führte. Es wurde unerwarteterweise entdeckt, daß der nicht-spezifische Bindungsblocker ein freies Polyanion sein konnte, selbst wenn das Einfangreagenz, das bei dem Assay verwendet wurde, eine polyanionische Substanz umfaßte, die an ein spezifisch bindendes Glied konjugiert war. Man hätte erwartet, daß die Anwesenheit eines freien oder ungebundenen Polyanions die Immobilisierung des Einfangreagenzes an der festen Phase verhindern oder wenigstens verschlechtern würde. Es wurde jedoch herausgefunden, daß der nicht-spezifische Blocker in Bezug auf die Hemmung der direkten nicht-spezifischen Bindung des Indikatorreagenzes an die feste Phase wirkungsvoller war als in Bezug auf die Verminderung der Anbindung des polyanionischen Einfangreagenzes an die polykationische feste Phase. Geeignete nicht-spezifische Bindungsblocker umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Dextransulfat, Heparin, Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose, Pentosanpolysulfat, Inositolhexasulfat und β-Cyclodextrinsulfat.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, daß die Menge an polyanionischem nicht-spezifischem Bindungsblocker, die zum Indikatorreagenz zugesetzt wurde, größer als die Menge an polyanionischer Substanz zu sein vermochte, die in dem Einfangreagenz enthalten ist. Es wurde herausgefunden, daß der freie polyanionische nicht-spezifische Bindungsblocker zum Indikatorreagenz in Mengen zugesetzt werden konnte, die 40.000 mal die Menge an polyanionischer Substanz überschritten, die im Einfangreagenz verwendet wurde. Allgemein beträgt die bevorzugte Menge von polyanionischem Blocker, der zum Indikatorreagenz zugesetzt wird, 40 bis 14,000 mal die Menge an polyanionischer Substanz, die im Einfangreagenz verwendet wird. Der bevorzugte nicht-spezifische Bindungsblocker wie auch die bevorzugte Menge an nicht-spezifischem Bindungsblocker können optimiert werden.
Darüber hinaus wurde entdeckt, daß der polyanionische nicht- spezifische Bindungsblocker zum Assay als getrenntes Reagenz zugesetzt werden konnte oder auch als freies Polyanion vom Einfangreagenz umfaßt werden konnte, wie auch vom "spezifisch bindendes Glied"-Reagenz, vom Pufferreagenz oder von einem anderen Reagenz, das bei dem Assay verwendet wird. Wenn beispielsweise das freie Polyanion vom Einfangreagenz umfaßt wird, kann es das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis verstärken, indem es die interferierenden Materialien neutralisiert, die sowohl in der Testprobe selbst als auch in den anderen Assayreagenzien enthalten sind, oder diejenigen, die während des Herstellungs-verfahrens für die Vorrichtung eingebracht worden sind. Die folgende Tabelle veranschaulicht einige bevorzugte Mengen an nicht-spezifischem Bindungsblocker für Digoxin, wobei das freie Polyanion im Einfangreagenz selbst enthalten ist.
Der bevorzugte nicht-spezifische Bindungsblocker, wie auch die Optimierung seiner Konzentration und der Umstand, ob er als Bestandteil eines anderen Assayreagenzes eingeführt wird, wird mittels empirischen Verfahren ausgewählt, die ohne übermäßigen experimentellen Aufwand vom Fachmann für Bindungsassays ermittelt werden können. Nur bei einem bekannten Fall, d. h. bei der Verwendung von 0.005% Dextransulfat im Einfangreagenz eines Kompetitivdigoxinassays, trat eine Inhibition der Bindung zwischen dem Einfangreagenz und der festen Phase aufgrund der Zugabe des nicht-spezifischen Bindungsblockers auf.

Ioneneinfangassayvorrichtungen

Wie oben beschrieben, können Ioneneinfangassayvorrichtungen undurchlässige Festphasenmaterialien umfassen, wie etwa Glasobjektträger, magnetische Partikel, Reagenzgläser und Plastikvertiefungen. Es ist jedoch ebenfalls herausgefunden worden, daß der gesamte Ioneneinfangassay in einem porösen Festphasenmaterial durchgeführt werden kann. Die Ioneneinfangassayvorrichtungen können jedwedes geeignete absorbierende, adsorbierende, tränkbare, saugfähige, nicht-saugfähige, isotrope oder eine Kapillarität aufweisende Material (beispielsweise poröse Materialien) umfassen durch das eine Lösung oder ein Fluid, das den Analyten enthält, hindurchzutreten vermag. Die Lösung kann durch das poröse Material hindurchgezogen oder hindurchgeschoben werden, mittels Saugkraft, hydraulischen, pneumatischen, hygroskopischen, auf Schwerkraft beruhenden oder mittels Kapillarkräften oder mittels einer Kombination derselben.
Mögliche Assayvorrichtungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eine herkömmliche chromatographische Säule, einen länglichen Streifen porösen Materials, worin der Fluidfluß im wesentlichen linear ist, eine Folie, in der der Fluidfluß linear oder radial ist, einen Bausch porösen Materials oder eine Vorrichtung, die mehrfach geschichtete Folien oder Bäusche umfaßt. Die Vorrichtungen können die Herstellung von Teststreifen wie auch von Durchflußvorrichtungen umfassen. Zum Zwecke der Knappheit beschränken sich jedoch die naghfolgenden Beschreibungen auf Teststreifenvorrichtungen, obwohl die Beschreibung der Vorrichtungszone sowohl auf Vorrichtungen vom Streifentyp als auch vom geschichteten Durchflußtyp angewendet werden kann. Für den Fachmann ist es unmittelbar offensichtlich, daß die Assayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf Durchflußvorrichtungsformate anwendbar sind.
Ein poröses Festphasenmaterial, das vorteilhafterweise für die Herstellung eines Teststreifens verwendet werden kann, ist Nitrocellulose. Insbesondere wenn ein membranartiges Festphasenmaterial verwendet wird, können die Testprobe und das Indikatorreagenz vor der Auslösung des Fluidflusses durch die Festphase vermischt werden, um eine gesteuerte, reproduzierbare Bindungsreaktion zwischen dem Analyten und dem Indikatorreagenz zu erhalten. Alternativ kann die Testvorrichtung des weiteren einen Vorvermischungs-Aufgabebausch umfassen, der in Fluidfluß- Kontakt mit dem länglichen Streifen ist, und der wahlweise das Indikatorreagenz enthält. Das Material des Aufgabebausches sollte aufgrund seiner Fähigkeit zur Vorvermischung der Testprobe mit dem Indikatorreagenz ausgewählt werden. Wenn beispielsweise Nitrocellulose als feste Phase verwendet wird, sind ein hydrophiles Polyethylenmaterial oder ein Glasfaserfilterpapier geeignete Materialien für den Aufgabebausch. Wenn alternativ ein Festphasematerial wie etwa ein Glasfaserfilterpapier verwendet wird, kann das Indikatorreagenz reversibel auf dem länglichen Teststreifen selbst immobilisiert werden, entweder an der Probenaufgabenstelle oder an einer anderen Stelle stromabwärts der Aufgabestelle. Bei noch anderen Alternativvorrichtungen und -Verfahren kann das Indikatorreagenz zur Vorrichtung als separate Reagenzlösung entweder sequenziell oder simultan mit der Testprobe und/oder dem Einfangreagenz zugesetzt werden.
Bei alternativen Ausführungsformen kann eine Teststreifenoder eine Durchflußvorrichtung aus einem kontinuierlichen Stück porösen Materials gefertigt sein, das diffusive oder immobilisierte Reagenzien unter Ausbildung der verschiedenen Reagenz- und Nachweiszonen enthält. Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann ein Teststreifen aus mehr als einem Festphasenmaterial gefertigt sein, so daß die unterschiedlichen Materialien in Fluidflußkontakt miteinander stehen, um die Wanderung des Analyten von einem Material zum anderen zu erlauben. Die unterschiedlichen Materialien können unterschiedliche diffusive oder immobilisierte Assayreagenzien enthalten, wobei das einzelne Material in einen länglichen Streifen oder in eine Durchflußbauschvorrichtung eingebaut ist. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können zwei oder mehr Zonen der Vorrichtung überlappen. Beispielsweise kann die Probenaufgabezone ebenfalls ein diffusives Assayreagenz (beispielsweise ein Indikatorreagenz, ein Einfangreagenz usw.) enthalten, das mit dem Analyt unter Ausbildung eines Komplexes oder eines reaktiven Produktes reagiert, das seine Wanderung zu den anderen Zonen in oder auf der Vorrichtung fortsetzt. Bei einem weiteren Beispiel kann die Probenaufgabezone ein immobilisiertes Assayreagenz (beispielsweise ein Polymer, das in Bezug auf das Einfangreagenz entgegengesetzt geladen ist) enthalten, das das Einfangreagenz oder die Einfangreagenzkomplexe zum Nachweis immobilisiert. Auch hier ist für den Fachmann offensichtlich, daß die Anwendbarkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung auf eine Vielzahl von Vorrichtungsformaten, bei denen das Indikatorreagenz mittels direkter oder indirekter Bindung an ein Einfangreagenzkonjugat immobilisiert wird, welches seinerseits durch ein entgegegesetzt geladenes Festphasenmaterial immobilisiert wird, anwendbar sind.

BEISPIELE

Beispiel 5 veranschaulicht einen bevorzugten Weg zur Durchführung der Assayverfahren gemäß der Erfindung. Dieses Beispiel dient jedoch allein der Veranschaulichung und ist nicht als den Schutzumfang der Erfindung auszulegen, der allein durch die Ansprüche definiert wird. Die Beispiele 2-4 betreffen keine Assayverfahren gemaß der Erfindung.

Beispiel 1

Aktivierung von Poly-L-Glutaminsäure zur Bildung von anionischen Einfangreagenzien.

Der folgende Ablauf beschreibt die Chemie, die für die Massenherstellung von Antidigoxin-Antikörper-PGA-Konjugaten zur Ausbildung von negativ geladenen Einfangreagenzien verwendet wird.

a. Uberführung des PGA-Natriumsalzes in die freie Säureform.

Das Natriumsalz von PGA (100mg; 7,35 x 10&supmin;&sup6; Mol, mittleres MG 13600; Sigma) wurde über Nacht mit einer hydrierten Form eines Kationenaustauscherharzes (50 Äquivalente/Glutamatrest; AG50W- X8; Bio-Rad) gerührt. Das Harz war zuvor in destilliertem Wasser gequollen und in destilliertem Wasser gewaschen worden und zuletzt in destilliertem Wasser (20ml/79 Trockengewicht der Perlen) resuspendiert. Der Überstand wurde entfernt und gefriergetrocknet, wobei man eine 90%ige Ausbeute an freier Säureform von PGA (PGAFA) als weißes Pulver (80mg, mittleres MG 11620) erhielt. Die freie Säureform wurde verwendet, um die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln herzustellen.

b. Herstellung von ITC-PGAFA.

Die PGAFA wurde in Lösungsmittel (DMF bei zehn Milligramm/Milliliter) gelöst. Ein protonenabsorbierendes Reagenz (4-Methylmorpholin) wurde zur Lösung in einer Menge von ungefähr einem Äquivalent pro titrierbarer freier Carbonsäure zugesetzt. Als nächstes wurde ein ungefähr 100facher molarer Überschuß an aminreaktivem Abwandlungsreagenz (1,4- Phenylendiisothiocyanat [DITC] in ausreichend DMF zu seiner Auflösung) zu der Lösung zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde an einem Rotavapor fast bis zur Trockne abgezogen und Methylenchlorid (25ml) wurde zugesetzt, um die ITC-PGAFA auszufällen. Das ausgeflockte Präzipitat wurde zentrifugiert, und das Methylenchlorid und das nicht umgesetzte DITC wurden entfernt. Das Ausfällungs/Zentrifugations-Verfahren wurde wiederholt, bis im wesentlichen kein nachweisbares DITC mehr zurückblieb. Das DITC wurde mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicaplatten nachgewiesen, die in Methylenchlorid entwickelt wurden; ITC-PGAFA verbleibt am Ursprung, DITC wandert mit der Lösungsmittelfront. Der verbleibende Feststoff wurde im Vakuum getrocknet, wobei man ITC-PGAFA als gelbes Pulver erhielt.

c. Kupplung von ITC-PGAFA an anti-Digoxin Antikörper unter Erzeugung der Einfangreagenzien.

Das ITC-PGAFA (bei einem 1- bis ungefähr 20-fachen molaren Überschuß in Bezug auf den Antikörper) wurde in 0,2M Natriumphosphatpuffer von pH 8,5 gelöst, wobei das Volumen so gering als möglich gehalten wurde. Der pH wurde nötigenfalls auf 8,5 eingestellt. Der Antikörper wurde zu dieser Lösung zugesetzt und über Nacht bei 37º C inkubiert. Die Präparate wurden dann unter Verwendung von HPLC sowohl an einer analytischen TSK 400 Bio-Rad Säule (7,5 x 300mm bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1ml/min) für die 1-2 Milligramm-Proteinpräparate oder einer TSK 4000 Beckmann Säule (31,5 x 300mm bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5ml/min) für die 2-10 Milligramm- Proteinpräparate fraktioniert. Der Laufmittelpuffer enthielt 0,1M Natriumphosphat und 0,3M NaCl bei pH 6,8. Die Fraktionen wurden getestet und geeignet vereinigt. Der Aminosäuregehalt wurde für diejenigen Fraktionen bestimmt, die Antikörper enthielten, so daß die Kupplungsausbeute bestimmt werden konnte. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Kupplungsausbeuten von ITC-PGAFA mit anti-Digoxin Antikörper
Spalte 1 von Tabelle 1 führt die Proteinmenge auf, die bei den Reaktionen zur Ausbildung des Einfangreagenzes verwendet wird. Spalte 2 führt die molaren Überschüsse an aktiviertem ITC- PGAFA auf, die mit dem Protein nach Spalte 1 umgesetzt wurden. Spalte 3 liefert die Anzahl von PGA-Ketten, die durch die Reaktion pro Antikörper angebunden wurden, berechnet durch Aminosäureanalyse, beruhend auf einem mittleren MG von 40000 und 305 sich wiederholenden Glutamatresten. Spalte 4 liefert eine Berechnung für den Prozentsatz der Ausbeute an PGA- Kettensubstitution, beruhend auf dem molaren Überschuß von aktivierter PGA, die bei der Reaktion eingesetzt wurde.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft ein Assayverfahren, das eine feste Phase verwendet, die eine polymere kationische Substanz umfaßt, die einen Stickstoffgehalt von weniger als 10% aufweist, und das daher kein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft. Jedoch veranschaulicht dieses Beispiel ein Assayformat, das bei der Erfindung eingesetzt wird.

Digoxin-Ioneneinfangkompetitivassay: Antigeneinfangformat

a. Herstellung eines Digoxin-IGG-PGA Einfangreagenzes.

Das Digoxin-IGG-PGA Einfangreagenz wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem in Beispiel lc beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei die folgenden verfahrenstechnischen Abwandlungen vorgenommen wurden. Die ITC-PGA (Smg; 1,25 x 10&supmin;&sup7; Mol; in 1,0ml 0,1M Natriumphosphat bei pH 8,5) wurde zu einer gepufferten Lösung von Kaninchen-IGG-Digoxin (lmg; 6,25 x 10&supmin;&sup9; Mol; in 1,4493 ml von 0,1M Natriumphosphat und 0,3M NaCl bei pH 8,5) unter Ausbildung des Einfangreagenzes zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei 37º C gerührt und inkubiert. Das Präparat wurde dann unter Verwendung von HPLC an einer Biosil 400 (Bio- Rad 300mm x 7,5 Gelfiltrationssäule) fraktioniert und bei einem Milliliter/Minute mit einem 0,1M Natriumphosphat und 0,3M NaCl bei pH 6,8 eluiert. Das Digoxin-IGG-PGA Einfangreagenz, das zur Bindung des anti-Digoxin Antikörpers befähigt war, wurde dann in einem Assaypuffer, der 25mM Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 1% Fischgelatine bei pH 7,2 enthielt, auf 3µg/ml verdünnt.

b. Herstellung der festen Phase.

Einer Fasermatrix wurde mit einer polymeren quaternären Verbindung beschichtet, um eine feste Phase mit einer positiven Ladung zur Verfügung zu stellen. Celquat L-200 Polymerverbindung, ein wasserlösliches Cellulosederivat (Diallyldimethylammoniumchloridhydroxyethylcellulosepolymer, von der National Starch and Chemical Corporation, Bridgewater, NJ, 08807) wurde verwendet. Eine 0,5%ige wässerige Lösung von Celquat L-200 Polymerverbindungen (50µl), enthaltend 10mM NaCl (50µl) wurde auf das Festphasenmaterial aufgegeben.

c. Herstellung des Indikatorreagenzes.

Das Indikatorreagenz bestand aus einem Konjugat aus alkalischer Phosphatase und Mäuse-anti-Digoxin-Antikörper (Immunosearch; Emeryville, California 94608). Das Indikatorreagenz wurde in einem Assaypuffer, der 25mm Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mm ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 1% Fischgelatine bei pH 7,2 enthielt, auf 33,3 ng/ml verdünnt.

d. Immunoassayvorschrift.

Das Indikatorreagenz (200µl) wurde mit einer Reihe von Proben (200µl), die bekannte Digoxinmengen (0,5; 1,0; 2,5; 5,0 und 50, ng/ml in normal-Humanserum enthielten) vermischt. Die Mischungen wurden 15 Minuten bei 37º C inkubiert. Das Digoxin-IGG-PGA Einfangreagenz (200µl) wurde zugesetzt und die Reaktionsmischungen wurden 15 Minuten lang inkubiert. Ein aliquoter Anteil einer jeden Reaktionsmischung (200µl) wurde auf das Festphasenmaterial aufgegeben, gefolgt von einem Waschschritt. Ein Enzymsubstrat (70µl; 1,2mm 4- Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100mM AMP, 1,0mM MgCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 4,0mM Tetramisol bei pH 10,3) wurde zugesetzt, und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 2 aufgezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß mit dem Anstieg des Digoxins in der Testprobenkonzentration eine entsprechende Abnahme bei der Bildung des Einfangreagenz/Indikator-Reagenzkomplexes eintrat, und daß deshalb die Menge an nachweisbarer Markierung, die mit der festen Phase assoziiert war, abnahm. TABELLE 2 Digoxin-Ioneneinfang-Kompetitiv-Assay: Antigen-Einfangformat Einfangreagenz: Digoxin-IGG-PGA Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markierter anti- Digoxin Antikörper

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft ein Assayverfahren, das eine feste Phase verwendet, die eine polymere kationische Substanz umfaßt, die einen Stickstoffgehalt von weniger als 10% aufweist, und daher betrifft dieses Beispiel kein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Jedoch zeigt das Beispiel ein Assayformat auf, das bei der Erfindung verwendet wird.
Digoxin-Ioneneinfang-Kompetitivassay: Antikörper-Einfangformat.

a. Herstellung des Indikatorreagenzes.

Das Indikatorreagenz bestand aus einem Konjugat von alkalischer Phosphatase und Digoxin (Immunosearch) . Das Indikatorreagenz wurde in einem Assaypuffer, der 25mM Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 1% Fischgelatine bei pH 7,2 enthielt, auf 1/100 verdünnt.

b. Immunoassayvorschrift

Das anti-Digoxin-PGA-Einfangreagenz (200ul, im wesentlichen in Übereinstimmung mit der in Beispiel 1c beschriebenen Vorschrift hergestellt), wurde mit einer Reihe von Proben (jeweils 200µl vermischt), die bekannte Digoxinmengen enthielten, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Mischungen wurden 15 Minuten bei 37º C inkubiert. Das Indikatorreagenz (200µl) wurde zugesetzt und die Reaktionsmischungen wurden 15 Minuten lang inkubiert. Ein aliquoter Anteil einer jeden Reaktionsmischung (200µl) wurde auf die feste Phase aufgegeben (hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben), gefolgt von einem Waschschritt. Ein Enzymsubstrat (70µl, wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde zugesetzt, und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in der Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß bei einem Anstieg des Digoxins in der Testprobe ein entsprechender Abfall der Ausbildung an Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplex eintrat, und daß deshalb die Menge an nachweisbarer Markierung, die mit der festen Phase assoziiert war, abnahm. TABELLE 3 Digoxin-Ioneneinfang-Kompetitiv-Assay: Antikörper-Einfangformat Einfangreagenz: anti-Digoxin Antikörper-PGA Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markiertes Digoxin

Beispiel 4

Dieses Beispiel betrifft kein Assayverfahren zum Nachweis von Digoxin und daher betrifft es kein Verfahren gemäß der Erfindung. Jedoch enthält es Information, die zum Verständnis der Erfindung nützlich ist.

Ionen-Einfangdurchflußvorrichtung für einen Zwei-Schritt hCG- Assay

a. Herstellung der festen Phase.

Testprobenaufgabebäusche (Glasfasermatrizen) wurden mit schwankenden Konzentrationen einer wässerigen Lösung von Merquat-100 polymerer Ammoniumverbindung, 100mM Tris, 100mM Natriumchlorid, 0,1% Fischgelatine, 0,1% Saccharose und 0,1% Natriumazid behandelt. Die Aufgabebäusche wurden trocknen lassen, und die Bäusche wurden auf einer Schicht Absorptionsmaterial übereinandergelegt. Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren zur Herstellung einer Durchflußfestphasenvorrichtung angewendet, die mit Cellquat L- 200 Polymerverbindung behandelt worden war. Alternative Vorrichtungen wurden hergestellt, indem der Aufgabebausch mit Merquat-100 polymerer quaternärer Ammoniumverbindung (einem kationischen Homopolymer von Dimethyldiallylammoniumchlorid, 0,5% in Wasser) kurz vor der Verwendung behandelt wurde.

b. Herstellung des Indikatorreagenzes.

Das Indikatorreagenz war ein Konjugat aus Ziegen-anti-β-hCG- Antikörper und alkalischer Phosphatase, verdünnt in 1% Brij -35 Polyoxyethylen-(23)-laurylether (Sigma), 100mM Tris, 500mM NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 0,5% Magertrockenmilch bei pH 7,2. Das Indikatorreagenz wurde durch einen 0,22µm Filter vor der Verwendung filtriert.
Bei einem alternativen Indikatorreagenzpräparat wurde Dextransulfat (MG 5000) oder Heparin als nicht-spezifischer Bindungsblocker eingeschlossen. Der Blocker wurde verwendet, um das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis durch Hemmung der Bindung des markierten Antikörpers an nicht-Analyten zu verstärken.

c. Herstellung des Einfangreagenzes.

Ein monoklonaler-anti-β-hCG-Antikörper-PGA-Einfangreagenz wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren hergestellt, das im Beispiel 1c oben beschrieben ist. Jeweils fünf Milliliter der Kupplungsreagenzmischung wurden an einer Gelfiltrationschromatographiesäule (2,4 x 54cm, bei einer Flußgeschwindigkeit von 0,4ml/Minute). fraktioniert. Der Laufmittelpuffer enthielt 0,1M Natriumphosphat, 0,3M NaCl und 0,05% NaN&sub3; bei pH 8,5. Das polymere Anion/Antikörperkonjugat wurde mit 25mM Tris, 100mM NaCl, 1mm MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3;, 10%ig normal-Mäuseserum und 1% Fischgelatine bei pH 7,2 verdünnt. Das Einfangreagenz wurde vor der Verwendung durch ein 0,22µm Filter filtriert.

d. Immunoassayvorschrift

Das Einfangreagenz (80µl) wurde mit einem gleichen Volumen an Testprobe vermischt, die eine bekannte Menge an hCG in normal- Humanserum enthielt. Die Mischung wurde bei ungefähr 31-32º C zirka zwölf Minuten lang inkubiert. Die spezifische Bindungsreaktion führte zur Ausbildung eines Einfangreagenz/Analyt-Komplexes.
Jede Reaktionsmischung (80µl) wurde dann auf eine Durchflußvorrichtung aufgegeben, gefolgt von einem Waschschritt mit Tris-gepufferter Salzlösung (75µl). Das Indikatorreagenz (Soul) wurde dann auf die Festphasenvorrichtung aufgebracht und zwölf Minuten lang inkubiert. Die Vorrichtung wurde dann zweimal gewaschen.
Ein Enzymsubstrat (70µl, 1,2mm 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100mM AMP, 0,01% EDTA, 0,1% NaN&sub3; und 4,0mM Tetramisol bei pH 10,3) wurde zugesetzt, und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen. Die Ergebnisse des Assays sind in den Tabellen 4-6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, daß mit dem Anstieg der hCG Testprobenkonzentration ein entsprechender Anstieg in der Ausbildung des Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Komplexes einherging, und daß daher die Menge an nachweisbarer Markierung, die mit der festen Phase assoziiert war, zunahm. Die Ergebnisse zeigen, daß das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis durch den Einschluß eines nicht-spezifischen Bindungsblockers in das Indikatorreagenz verbessert ist. Darüberhinaus zeigten die Ergebnisse, daß das kationische Homopolymer aus Dimethyldiallylammoniumchlorid ein bevorzugtes polymeres Kation für die Herstellung der festen Phase zur Verwendung bei Zwei-Schritt Assays war, in denen die Vorrichtung einem oder mehreren Waschschritten unterworfen wird; beispielsweise weist die Merquat -100 polymere Ammoniumverbindung einen Stickstoffgehalt von ungefähr 10% (ausgenommen das Gegenion) auf, wohingegen die Celquat H-100 Polymerverbindung (wasserlösliches Diallyldimethylammoniumchloridhydroxyethylcellulosepolymer, National Starch & Chemical Corporation, Bridgewater, NJ, 08807) einen Stickstoffgehalt von ungefähr 1% (ausgenommen dem Gegenion aufweist). TABELLE 4 hCG Ioneneinfang Zwei-Schritt-Sandwichassay Einfangreagenz: anti-β-hCG Antikörper-PGA (0,5µg/Test) Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markierter anti-β- hCG Antikörper (mit und ohne nicht-spezifischen Bindungsblocker) Feste Phase: mit einem kationischen Homopolyer von Dimethyldiallylammoniumchlorid unmittelbar vor der Verwendung beschichtet TABELLE 5 hCG Ionen-Einfang Zwei-Schritt Sandwich Assay Einfangreagenz: anti-β-hCG Antikörper-PGA (0,5µg/Test) Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markierter anti-β- hCG Antikörper (mit Blocker) Feste Phase: mit schwankender kationischer Polymerkonzentration TABELLE 6 hCG Ioneneinfang Zwei-Schritt Sandwichassay Einfangreagenz: anti-β-hCG Antikörper-PGA Indikatorreagenz: mit alkalischer Phosphatase markierter anti-β- hCG Antikörper Feste Phase: mit 0,125% Celquat H-100 polymerer Verbindung

Beispiel 5

Kompetitiver Digoxin Assay unter Anwendung von Ioneneinfangtechnik

a. Herstellung der festen Phase.

Testproben-Aufgabebäusche (Glasfasermatrix) wurden mit schwankenden Konzentrationen einer wässerigen Lösung von Merquat-100 polymerer Ammoniumverbindung, loornm Tris, 100mM Natriumchlorid, 0,1% Fischgelatine, 0,1% Saccharose und 0,1% Natriumazid überschichtet. Die Aufgabebäusche wurden trocknen lassen, und dann auf einer Schicht von Adsorptionsmaterial übereinandergelegt, um Durchflußvorrichtungen herzustellen.

b. Herstellung des Indikatorreagenzes.

Das Indikatorreagenz war ein Konjugat aus Digoxindialdehyd und alkalischer Phosphatase, verdünnt in 50mM Tris, 100mM NaCl, 1mM MgCl&sub2;, 0,1mM ZnCl&sub2;, 0,1% NaN&sub3; und 0,1% Rinderserumalbumin bei pH 7,5 verdünnt.

c. Herstellung des Einfangreagenzes.

Das erste Einfangreagenz, ein Ziegen-anti-Digoxin-Antikörper, der an 1,4-Phenylendiisothiocyanat gekuppelt war, das mit Poly- L-asparaginsäure (ITC-PAA) gekuppelt war, wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1c oben beschrieben ist. Poly-L-asparaginsäure wurde anstelle von Poly-L-glutaminsäure verwendet.
Ein zweites Einfangreagenz wurde aus Kaninchen-anti-Ziegen- IgG-Antikörper hergestellt, der an Poly-L-asparaginsäure unter Verwendung von EDCI im wesentlichen in Übereinstimmung mit der folgenden Kupplungsvorschrift hergestellt worden war:
Das Einfangreagenz wurde hergestellt, indem ein Kaninchen anti-Ziegen-IGG-Antikörper mit Carboxymethylamylose (CMA; Polysciences, Inc., Warrington, PA) gekuppelt wurde. Die Kupplung wurde unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimidreagenzes (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid; EDCI) durchgeführt.
Die Kupplungsmischung enthielt eine Antikörperlösung (2ml; 1mg/ml in MES-Puffer [25mM, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure] pH 5,5) und CMA (1,6ml, 10mg/ml in MES-Puffer). Zu der Lösung wurde unter Rühren eine frisch hergestellte EDCI Lösung (40µl, 100mg/ml in MES Puffer zugesetzt). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 40 Minuten lang gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25%iger Glyzinlösung (67µl) gelöscht und das Produkt wurde dann mittels Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer TSKGel G4000SW-Säule (2,15cm x 30cm), die mit einer TSKguard-Säule SW (2,15cm x 7,5cm; Anspec Co., Ann Arbor, Michigan) ausgestattet war, fraktioniert. Die Säule wurde mit PBS (0,1M Natriumphosphat, 0,3M NaCl und 0,05% Natriumazid bei pH 6,8) eluiert.
Ein Analyt-spezifisches bindendes Hilfsglied (Ziegen-anti- Digoxin Antikörper) wurde zusammen mit diesem Einfangreagenz verwendet, um den Analyten an die feste Phase zu binden. Bei einer Ausführungsform war das Einfangreagenz ein vorgeformter Komplex aus negativ geladenem anti-Ziegenantikörper und aus Ziegen-anti-Digoxin Antikörper. Sowohl das erste als auch das zweite Einfangreagenz wurden vor der Verwendung geeignet mit 50mM Tris, 50mM NaCl, 0,1% NaN&sub3; und 0,1% Rinderserumalbumin bei pH 7,5 verdünnt.

d. Immunoassayvorschrift.

Bei Assays, die das erste Einfangreagenz verwenden oder beim direkten Einfangsystem wurde das Einfangreagenz (60µl) mit der Testprobe (18µl) verdünnt, die eine bekannte Menge Digoxin enthielt. Die Reaktionsmischung wurde bei ungefähr 33-34º C 10 Minuten lang inkubiert. Die spezifische Bindungsreaktion führte zu der Ausbildung eines Einfangreagenz/Analyt-Komplexes. Das Indikatorreagenz (60µl) wurde dann zu der Reaktionsmischung zugesetzt, und die Mischung wurde ungefähr weitere 11 Minuten lang inkubiert. Die spezifische Bindungsreaktion führte zu der Ausbildung eines Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplexes proportional zur Menge an Analyt, der in der Testprobe vorhanden war. Ein Anteil einer jeden Reaktionsmischung (80µl) wurde dann auf die Festphase aufgegeben, gefolgt von zwei Waschschritten mit mit Tris gepufferter Salzlösung (75µl). Ein Enzymsubstrat (70µl, 1,2mM 4-Methylumbelliferylphosphat in einer Lösung von 100mM AMP, 0,01% EDTA, 0,1% NaN&sub3; und 4,0mM Tetramisol bei pH 10,3) wurde zugesetzt, und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen.
Bei einem indirekten Assay unter Verwendung des zweiten Einfangreagenzes wurden der vorgeformte Einfangreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied-Komplex (50µl), Indikatorreagenz (55µl) und die Digoxintestprobe (25µl) mit dem Probenverdünnungspuffer (91µl) zusammengegeben. Die Mischung wurde ungefähr neun Minuten lang inkubiert. Die spezifische Bindungsreaktion führte zur Ausbildung von Einfangreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex und von Einfangreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Indikatorreagenz- Komplex proportional zur Menge des in der Testprobe vorhandenen Analyten. Ein aliquoter Anteil der Reaktonsmischung (180µl) wurde dann auf die feste Phase aufgegeben, gefolgt von zwei Waschschritten mit mit Tris gepufferter Salzlösung (75µl). Das Enzymsubstrat (70µl) wurde zugesetzt und die resultierende Fluoreszenzrate wurde gemessen.
Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 7 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, daß sowie die Digoxinkonzentration in der Testprobe stieg, ebenfalls ein entsprechender Abfall bei der Bildung des Komplexes, der das Indikatorreagenz enthielt, eintrat. Daher nahm die Menge an nachweisbarer Markierung, die mit der festen Phase assoziiert war, mit dem Anstieg des Digoxins in der Testprobe ab. TABELLE 7 Digoxin-Ioneneinfang-Kompetitivassay

Claims

1. Kompetitiv-Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge an Digoxin in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen

(i) eines Fangreagenzes, das ein an eine polymere anionische Substanz konjugiertes bindendes Glied umfaßt, wobei das bindende Glied aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem anti-Digoxinantikörper und aus einem bindenden Glied gewählt ist, das für ein bindendes Hilfsglied spezifisch ist, das an Digoxin zu binden vermag,

(ii) eines Indikatorreagenzes, das Digoxin oder ein Digoxinanalogon und einen nachweisbaren Marker umfaßt, und

(iii) eines Festphasenmaterials, das eine Reaktionsstelle enthält, die eine polymere kationische Substanz mit einem Stickstoffgehalt von wenigstens ca. zehn Prozent unter Ausschluß der Gegenionen umfaßt;

b) In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit dem Fangreagenz und der Testprobe, wodurch das polymere Kation der festen Phase das polymere Anion des Fangreagenzes anzieht und sich an dieses anhängt, wodurch das Fangreagenz und dessen Komplexe immobilisiert werden;

c) In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit dem Indikatorreagenz, wodurch das Indikatorreagenz umgekehrt proportional zur Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyten an das immobilisierte Fangreagenz gebunden wird; und

d) Nachweisen des Indikatorreagenzes, das mit der festen Phase assoziiert ist, oder von ungebundenem Indikatorreagenz, um die Anwesenheit oder Menge von Analyt in der Testprobe zu bestimmen.

2. Kompetitiv-Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Digoxin in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen

b) In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit dem Fangreagenz, dem Indikatorreagenz und der Testprobe, wodurch das polymere Kation das polymere Anion des Fangreagenzes anzieht und sich an dieses anhängt, wodurch das Fangreagenz und dessen Komplexe immobilisiert werden, und wodurch das Indikatorreagenz umgekehrt proportional zur Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyten an das immobilisierte Fangreagenz gebunden wird; und

c) Nachweisen von gebundenem oder ungebundenem Indikatorreagenz zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Fangreagenz mit der Testprobe umgesetzt wird, wodurch ein Fangreagenz/Analyt-Komplex ausgebildet wird, bevor der Kontakt mit der festen Phase hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Indikatorreagenz mit dem Fangreagenz/Analyt-Komplex umgesetzt wird, bevor der Kontakt mit der festen Phase hergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Fangreagenz mit einem spezifisch bindenden Hilfsglied und der Testprobe umgesetzt wird, wodurch ein Fangreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex vor der Herstellung des Kontaktes mit der festen Phase ausgebildet wird.

6. Kompetitiv-Assayverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge an Digoxin in einer Testprobe, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen

(i) eines Fangreagenzes, das ein an eine polymere anionische Substanz konjugiertes Digoxin oder Digoxinanalogon umfaßt

(ii) eines Indikatorreagenzes, das ein bindendes Glied und einen nachweisbaren Marker umfaßt, wobei das bindende Glied aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem anti-Digoxinantikörper und aus einem bindenden Glied gewählt ist, das für ein bindendes Hilfsglied spezifisch ist, das an Digoxin zu binden vermag, und

b) Inkubieren des Fangreagenzes, des Indikatorreagenzes und der Testprobe, wodurch ein Fangreagenz/Indikatorreagenz-Komplex umgekehrt proportional zur Menge an in der Testprobe vorhandenem Analyten ausgebildet wird, und In-Kontakt-Bringen des Komplexes mit der festen Phase, wodurch das polymere Kation das polymere Anion des Fangreagenzes anzieht und sich an dieses anhängt, wodurch das Fangreagenz und dessen Komplexe immobilisiert werden, und

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Fangreagenz, das Indikatorreagenz und die Testprobe simultan inkubiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Indikatorreagenz mit einem spezifisch bindenden Hilfsglied und der Testprobe umgesetzt wird, wodurch ein Indikatorreagenz/spezifisch bindendes Hilfsglied/Analyt-Komplex vor der Herstellung des Kontaktes mit der festen Phase ausgebildet wird.