JPH04232860A - 結合アッセイ法、該方法に用いる試薬およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般に診断アッセイの分
野に関する。さらに詳しくは、検出可能な結合成分複合
体を生成させるために（該検出可能な複合体は試料中の
分析対象物の存在または量と相関する）結合アッセイに
おいて分析対象物置換（ａｎａｌｙｔｅ−ｓｕｂｓｔｉ
ｔｕｔｅ）試薬（以下、ＡＳＲともいう）を使用するこ
とに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】生物
学的流体または他の物質中に存在する興味のもたれるま
たは臨床的に重要な物質の存在および／または濃度を決
定するためのアッセイにおいて種々の分析法および装置
が一般に用いられている。そのような物質は一般に「分
析対象物」と呼ばれており、抗体、抗原およびハプテン
などが含まれる。人体の疾患または他の病的状態の診断
および治療において、生物学的試料中の分析対象物の存
在または量を正確かつ折り良く決定することは、病的異
常を治療および管理するヘルスケアの専門家の能力に甚
大な影響を及ぼす。加えて、そのようなアッセイを行う
ことにより、妊娠などの生理状態の早期かつ正確な決定
、薬物治療のモニタリング、および乱用薬物または毒素
の不在、存在または量の評価が可能となる。

【０００３】典型的なイムノアッセイ法では、生体に対
して病原性であるかまたは異物である抗原の存在に応答
して抗体が産生されるという高等生物における免疫系の
機構を利用する。特定の抗原に対して該抗原と反応し得
る１または２以上の抗体が産生され、その結果、高度に
特異的な反応機構が得られる。この反応機構は、生物学
的試料中の該抗原の存在または濃度を決定するためにイ
ンビトロで使用することができる。

【０００４】不均一イムノアッセイ法では、一般に固相
物質の使用が含まれ、該固相物質に反応生成物が結合す
る。反応混合物から該固相物質を除去することにより、
反応生成物を過剰の試料、アッセイ試薬および他の物質
から分離する。固相イムノアッセイ法の一つの型は、シ
ュールズ（Ｓｃｈｕｕｒｓ）らの米国特許第３，７９１
，９３２号および同第４，０１６，０４３号に開示され
ているような、不溶性の固相物質に結合した抗分析対象
物抗体（捕捉試薬）の使用を含むサンドイッチイムノア
ッセイである。第二の抗分析対象物抗体は検出可能な剤
で標識されていて指示試薬を形成する。たとえば、検出
可能な標識は、酵素基質と反応して検出可能な生成物を
生成する酵素であってよい。試料中に分析対象物が存在
しておれば、上記２つの抗体は分析対象物と免疫複合体
（すなわち、抗体／分析対象物／抗体サンドイッチ）を
形成し、固相に結合した分析対象物の量は試料中の分析
対象物の量に正比例する。酵素基質を加えると、該酵素
基質は指示試薬の酵素成分と反応して固相に結合した分
析対象物の存在または量をシグナルで示す。

【０００５】固相イムノアッセイ法の他の型は競合アッ
セイ法である。サンドイッチアッセイと同様に競合アッ
セイでも不溶性固相に結合した抗分析対象物抗体の使用
を含むが、標識第二抗体の代わりに標識分析対象物を指
示試薬として用いる。競合アッセイにおいては、指示試
薬は固相上の捕捉試薬への結合に対して試料の分析対象
物と競合する。捕捉された指示試薬の量は、試料中に存
在する分析対象物の量に反比例する。スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）（米国特許第４，４０１，７６４号）は、分析対象
物または標識分析対象物に結合し得る混合結合複合体（
しかしながら、分析対象物および標識分析対象物は該複
合体に同時に結合することはできない）を使用する別の
競合アッセイ法を記載している。

【０００６】クラゲット（Ｃｌａｇｅｔｔ）（米国特許
第４，７４６，６３１号）は、分析対象物／リガンド／
マーカー結合体が試料分析対象物の存在下で反応表面か
ら置換され、置換された分析対象物／リガンド／マーカ
ー結合体が第二の反応部位に固定化される、反応チャン
バを用いたイムノアッセイ法を記載している。この結合
体は、リガンド成分としてビオチン、ウシ血清アルブミ
ンおよび合成ペプチドを、マーカー成分として酵素、化
学発光物質、酵素インヒビターおよび放射性ヌクレオチ
ドを含んでいる。リ（Ｌｉ）（米国特許第４，６６１，
４４４号）は、抗イディオタイプ抗体と第二抗体（検出
可能な標識に特異的）の結合体を用い、検出可能な標識
が試料中の分析対象物の存在と逆の相関を有する競合イ
ムノアッセイ法を記載している。

【０００７】サンドイッチイムノアッセイおよび競合イ
ムノアッセイのいずれも、試料中の分析対象物の存在ま
たは量は、一般に固相に結合した標識の存在または量を
検出することにより決定される。競合アッセイでは、試
料中に存在する分析対象物が多くなればなるほど固相上
に存在する標識の量は少なくなる。サンドイッチアッセ
イでは、試料中に存在する分析対象物が多くなればなる
ほど固相上に存在する標識の量も多くなる。とりわけ低
濃度の分析対象物の視覚化のためにはサンドイッチアッ
セイが一般に好ましい。というのは、固相上の標識の出
現を一層容易に検出することができるからである。

【０００８】しかしながら、サンドイッチアッセイは幾
つかの限定要因を有する。すなわち、ある種のステロイ
ド、ホルモン、抗生物質および他の治療薬などのある種
の分析対象物は低分子量であり、２つの抗体が同時に結
合してサンドイッチ複合体を生成するには対応サイズが
小さすぎる。そのような分析対象物を検出する方法では
一般に競合アッセイ態様が採用され、分析対象物は捕捉
試薬への結合に対して指示試薬と競合するか、または分
析対象物は捕捉試薬から指示試薬を置換させる。置換ア
ッセイにおける陽性結果は、固相物質に結合した標識の
量の減少により示される。標識の減少量を検出すること
による陽性アッセイ結果の視覚的決定は、固相上の標識
の出現の検出よりも困難であり、標識量の減少を識別す
ることの困難性はアッセイ結果の解釈の曖昧さにつなが
る。

【０００９】アレン（Ａｌｌｅｎ）（ＥＰ１７７，１９
１号）は、リガンド類似体と第二試薬（フルオレセイン
など）の結合体の使用を含む結合アッセイ法を記載して
おり、該方法において該結合体は分析対象物（リガンド
）に特異的な標識結合パートナーへの結合に対して該分
析対象物（リガンド）と競合し、ついで該第二試薬に特
異的な結合パートナーを有する固相手段により該生成し
た標識結合体を反応混合物から分離させる。この結合ア
ッセイ法は競合結合法と逆サンドイッチアッセイ法を組
み合わせたものである、すなわち、結合体を固相に結合
させることにより結合体を混合物から分離する前に結合
体を標識結合成分に結合させる。しかしながら、アッセ
イ結果は、固相に結合した標識の量が試料中の分析対象
物の量に反比例する通常の競合アッセイと同様にして決
定される。

【００１０】シーレガット（Ｃｈｉｅｒｅｇａｔｔ）ら
（ＧＢ２，０８４，３１７号）は、分析対象物に特異的
な間接的に標識した結合パートナーを用いた類似のアッ
セイ法を記載している。モチダ（Ｍｏｃｈｉｄａ）ら（
米国特許第４，１８５，０８４号）もまた、二重抗原結
合体の使用を記載しており、該結合体は固定化抗体への
結合に対して抗原分析対象物と競合し、ついで該結合体
を標識する。この方法でもまた固相上の標識を検出し、
標識の量は試料中の分析対象物の量に反比例する。サデ
ー（Ｓａｄｅｈ）ら（米国特許第４，２４３，７４９号
）は、固相上に固定化した抗体への結合に対してハプテ
ン結合体が分析対象物と競合する類似のエンザイムイム
ノアッセイを記載している。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、分析対象物置
換試薬（ＡＳＲ）、結合アッセイを行うためのアッセイ
法、装置および試験キットを提供するものであり、これ
らは小さな分子サイズの分析対象物の存在または量を決
定するのに特に有用である。ＡＳＲは適当なアッセイ試
薬結合成分と反応することができ、その結果、検出可能
なＡＳＲ複合体、または試料中の分析対象物の量に比例
する量の遊離のＡＳＲを生成する。本発明の一つの態様
においては、ＡＳＲは検出可能な複合体の生成において
分析対象物を置換する。他の態様においては、ＡＳＲは
、サイズ、立体障害またはエピトープの制限のために分
析対象物が生成することのできない、検出可能な複合体
を生成するのに用いられる。

【００１２】さらに別の態様においては、ＡＳＲは検出
可能な結合成分複合体の生成において分析対象物を置換
し、その際、固相上の検出可能な複合体の存在量は試料
中の分析対象物の存在量に正比例する。そのような有利
な直接的結果は、分析対象物と反応する分析対象物特異
的結合成分とＡＳＲを同時に使用して、分析対象物／結
合成分複合体およびＡＳＲ／結合成分複合体を競合的に
生成させることにより達成することができる。複合体を
生成しなかった残留ＡＳＲは、試料中の分析対象物の量
に正比例する。それゆえ、複合体を生成しなかったＡＳ
Ｒは、検出可能なサンドイッチアッセイ複合体の生成に
おける分析対象物の代理として機能する。

【００１３】ＡＳＲは、分析対象物、分析対象物類似体
または分析対象物と共通する少なくとも一つのエピトー
プを有する他のリガンドであってＡＳＲを分析対象物特
異的結合成分に結合させる第一成分、およびリガンド特
異的結合成分とは選択的に反応するが分析対象物特異的
結合成分とは反応しない（リガンド特異的結合成分も分
析対象物特異的結合成分と反応しない）リガンドである
第二成分とからなる。

【００１４】本発明による試料中の分析対象物の存在ま
たは量を決定するための方法は、試料を下記試薬と接触
させることを含む：ＡＳＲ；試料分析対象物およびＡＳ
Ｒの分析対象物成分が共通して有するエピトープに結合
し得る第一特異的結合成分；ＡＳＲのリガンド成分に特
異的な第二特異的結合成分からなる捕捉試薬；およびＡ
ＳＲの分析対象物成分に特異的な第三特異的結合成分か
らなる指示試薬。そのようなアッセイにおいては、第一
特異的結合成分と第三特異的結合成分とは同じであって
よい。別の態様においては、捕捉試薬の第二特異的結合
成分はＡＳＲの分析対象物成分に特異的であってよく、
指示試薬の第三特異的結合成分はＡＳＲのリガンド成分
に特異的であってよい。試料は、上記試薬と順番に、単
独で、または組み合わせて接触させてよい。本発明のア
ッセイ法にはまた、検出可能なシグナルを生成させるた
めに、指示試薬の標識を該標識と反応し得る少なくとも
一つの別のシグナル生成物質と接触させることも含まれ
ていてよい。

【００１５】本発明のアッセイにおいて、ＡＳＲと試料
の分析対象物とは第一特異的結合成分への結合に対して
競合し、遊離すなわち未結合ＡＳＲと捕捉試薬および指
示試薬とからサンドイッチ複合体を生成させる。ついで
、複合体に結合している標識、または該複合体と結合し
ていない指示試薬の量を検出して試料中の分析対象物の
存在または量を決定する。

【００１６】本発明の種々の態様としては、第一特異的
結合成分およびＡＳＲを錠剤、カプセル、粉末または液
体試薬形態として存在させ、これに試料を加えるもの；
アッセイの結果得られるサンドイッチ複合体が固相物質
上に固定化されるように捕捉試薬を固相物質上に固定化
した装置態様；アッセイ法が捕捉試薬を固相物質上に固
定化する工程を含む態様；アッセイ法が、アッセイ反応
、サンドイッチ複合体または捕捉試薬の固定化を完成さ
せるために少なくとも一つの補助特異的結合成分を加え
ることを含む態様；および複数のＡＳＲを用いて固相物
質上で複数の分析対象物をアッセイする態様などが挙げ
られる。一般に、固定化された捕捉試薬は、アッセイ装
置においてサンドイッチ複合体の検出部位として機能す
る。しかしながら、固定化捕捉試薬部位とは別の部位ま
たは固定化捕捉試薬部位に加えて他の部位で指示試薬の
検出を行う装置も考えることができる。

【００１７】本発明の他の態様としては、ＡＳＲ、捕捉
試薬および指示試薬からなる前以て生成させた結合複合
体の使用が挙げられる。試料を加えると、試料の分析対
象物は指示試薬結合におけるＡＳＲを置換し、その結果
、該複合体から指示試薬の検出可能な置換をもたらすと
思われる。

【００１８】本発明はさらに、試料中の分析対象物の存
在または量を決定するための試験キットに関する。本発
明のキットは、ＡＳＲおよび所望の結合アッセイに必要
な他の試薬からなる。さらに、本発明は、アッセイ装置
、とりわけ自動（ｓｅｌｆ−ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）ア
ッセイを行うことが可能な装置を含む。すなわち、固相
が、アッセイ試薬を含有する充分な数のゾーンまたは層
を含み、試料の添加によりアッセイを実質的に自動的に
行うようにする。

【００１９】本発明のさらに他の態様は、指示試薬の製
造の間かまたは指示試薬をアッセイに使用する前に指示
試薬に界面活性剤を添加することである。界面活性剤を
添加すると指示試薬の性能が有意に改善され、不活性に
なったと思われる指示試薬または活性の減少した指示試
薬の活性を回復することさえできる。以下、本発明をさ
らに詳しく説明する。本発明は、ＡＳＲを用いた固相ア
ッセイを行うためのアッセイ法および試験キットに関す
る。ＡＳＲは検出可能な結合成分複合体を形成すること
ができ、この複合体が試料中の分析対象物の存在または
量に対応する。ＡＳＲは分析対象物と共通する少なくと
も一つのエピトープを有する第一成分（該エピトープを
有するするため、該第一成分は分析対象物特異的結合成
分と結合することができる）、およびリガンド特異的結
合成分とは選択的に反応するが分析対象物特異的結合成
分とは反応しないリガンドである第二成分からなる。下
記用語は、結合アッセイに関する公知技術に従って本明
細書において用いられる。

【００２０】「特異的結合成分」とは、特異的結合ペア
、すなわち、２つの異なる分子において該分子の一つが
化学的手段または物理的手段により第二の分子に特異的
に結合するものの一方をいう。抗原と抗体の特異的結合
ペアに加えて、他の特異的結合ペアとしては、たとえば
、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌ
クレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター分
子とレセプター分子、酵素補助因子と酵素、酵素インヒ
ビターと酵素、ペプチド配列と該配列または全タンパク
質に特異的な抗体、ポリマー酸と塩基、染料とタンパク
質結合剤、ペプチドと特異的タンパク質結合剤（たとえ
ば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−タンパク質およびリボヌク
レアーゼＳ−タンパク質）などが挙げられるが、これら
に限られるものではない。さらに、特異的結合ペアには
、元々の特異的結合成分の類似体、たとえば分析対象物
類似体である成分も含まれる。特異的結合成分が免疫反
応物である場合は、たとえば抗体、抗原、ハプテン、ま
たはそれらの複合体であってよいし、また抗体を使用す
る場合は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、
組換えタンパク質または抗体、それら断片の混合物、並
びに抗体と他の特異的結合成分の混合物であってよい。 そのような抗体の調製の詳細およびそのような抗体が特
異的結合成分として使用するのに適していることは当業
者にはよく知られている。

【００２１】本明細書において「分析対象物」とは、検
出または測定しようとする化合物または組成物（少なく
とも一つのエピトープまたは結合部位を有する）をいう
。 分析対象物は、該分析対象物に対する特異的結合成分が
天然に存在するか、または該分析対象物に対する特異的
結合成分を調製することのできる物質であればいかなる
ものであってもよい。分析対象物としては、毒素、有機
化合物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ホル
モン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療目的で投与さ
れるものおよび不法目的で投与されるものを含む）、こ
れら物質の代謝物またはこれら物質に対する抗体などが
挙げられるが、これらに限られるものではない。「分析
対象物」にはまた、イムノアッセイにおいて興味のもた
れる抗原性物質、ハプテン、抗体、およびそれらの組合
せも含まれる。本発明の試薬および方法はまた、食品お
よび環境分析対象物を決定するために設計することもで
きる。

【００２２】本明細書において「分析対象物類似体」と
は、分析対象物自体に比べて程度に高低はあるが、分析
対象物特異的結合成分と交差反応をする物質をいう。分
析対象物類似体としては、分析対象物類似体が分析対象
物と共通する少なくとも一つのエピトープを有する限り
において、修飾した分析対象物並びに分析対象物分子の
断片部分もしくは合成部分または実質的に異なるリガン
ドが挙げられる。分析対象物類似体の一つの例は、分析
対象物類似体が分析対象物特異的結合成分と結合するこ
とができるように全分子の分析対象物の少なくとも一つ
のエピトープが重複した合成ペプチド配列である。

【００２３】本明細書において「リガンド」とは、リガ
ンド特異的結合成分が天然に存在するかまたは調製する
ことのできる物質をいうが、試料中には一般に認められ
ない物質であるか、または試料中に存在していたとして
も、少なくともＡＳＲの結合または分析対象物の検出も
しくは測定の妨害が認めらる量では存在しない物質であ
る。同様に、リガンド特異的結合成分は、試料中に一般
に認められない物質である。

【００２４】本明細書において「補助特異的結合成分」
とは、捕捉試薬および指示試薬の特異的結合成分の他に
アッセイで用いる特異的結合成分をいう。１または２以
上の補助特異的結合成分をアッセイに用いることができ
る。たとえば、補助特異的結合成分は、ＡＳＲの分析対
象物成分と指示試薬との結合複合体の生成を完成させる
ために用いることができる。別の態様として、補助特異
的結合成分は、サンドイッチ複合体の完成の補助となる
結合反応により捕捉試薬を固相物質に固定化するのに用
いることができる。それゆえ、補助特異的結合成分は、
アッセイ試薬をＡＳＲ、固相または標識に直接または間
接に結合させるのに容易に用いることができる。

【００２５】本明細書において「試料」とは、分析対象
物を含有すると思われる天然に存在するまたは人工的に
生成した液体試験媒体をいう。一般に、試料は生物学的
流体またはその希釈液である。分析対象物を決定するこ
とのできる生物学的流体としては、血清、全血、血漿、
尿、唾液、羊水および脳脊髄液などが挙げられ、抽出、
希釈または他の試料処理溶液で処理した後の流体も含ま
れる。試料にはまた、液体試験媒体を生成するように修
飾した固体物質（たとえば、髪の毛や組織など）も含ま
れる。

【００２６】試薬および物質 　　一般に、本発明の結合アッセイでは、試料中の分析
対象物の存在または量を示すための指示試薬、および観
察を容易にするために結合反応複合体を試料およびアッ
セイ試薬から分離するための、固相に直接または間接に
結合させた捕捉試薬を使用する。所望のアッセイ法に従
って他の物質も使用する。

【００２７】指示試薬 　　指示試薬には、一般に標識および特異的結合成分が
含まれる。指示試薬は、試料中の分析対象物の存在また
は量に相関した検出可能なシグナルを生成することがで
きる。一般に、指示試薬は固相物質に固定化した後に検
出または測定するが、遊離または未結合の指示試薬を検
出または測定してアッセイ結果を決定することもできる
。 指示試薬の特異的結合成分は、上記特異的結合ペアのい
ずれの成分であってもよい。指示試薬の標識は、視覚手
段または器具的手段により検出し得るシグナルを生成す
ることのできる物質である。

【００２８】本発明に使用するのに適した標識としては
、色原体；触媒；蛍光化合物；化学発光化合物；放射性
同位元素；コロイド金属粒子、コロイド非金属粒子、染
料粒子、酵素または基質、または有機ポリマーラテック
ス粒子を含む直接視覚標識；シグナル生成物質を含有す
るリポソームまたは他のベシクルなどが挙げられる。

【００２９】標識として使用するのに適した非常に多く
の酵素が、米国特許第４，２７５，１４９号明細書のカ
ラム１９〜２３に記載されている（該文献を参照のため
本明細書に引用する）。たとえば、本発明に有用な酵素
／基質シグナル生成系は、酵素アルカリホスファターゼ
であり、その場合に使用する基質はニトロブルーテトラ
ゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェートまたはその誘導体または類似体である。別の
シグナル生成系においては、標識は蛍光化合物であり、
この場合、検出可能なシグナルを生成させるために標識
を酵素的に操作する必要はない。この反応において標識
として使用するには、フルオレセイン、フィコビリタン
パク、ローダミンおよびその誘導体および類似体などの
蛍光分子が適している。

【００３０】好ましいアッセイ法においては、視覚的に
検出可能な発色粒子を標識として用いることにより、シ
グナル生成試薬をさらに添加する必要なく、試料中の分
析対象物の存在または濃度を直接発色読み取りすること
ができる。発色粒子として使用する物質としては、米国
特許第４，３１３，７３４号および同第４，３７３，９
３２号明細書（参照のため本明細書に引用する）に開示
されているように、金などのコロイド金属、および染料
粒子などが挙げられる。コロイド状セレン粒子などの非
金属コロイドの調製および使用は、同時継続中の米国特
許出願第０７２，０８４号明細書（１９８７年７月９日
出願）（参照のため本明細書に引用する）に開示されて
いる。イムノクロマトグラフィーにおけるコロイド状粒
子標識の使用は、同時継続中の米国特許出願第０７２，
４５９号明細書（１９８７年７月１３日出願）（参照の
ため本明細書に引用する）に開示されている。標識とし
て使用するための有機ポリマーラテックス粒子は、同時
継続中の米国特許出願第２４８，８５８号明細書（１９
８８年９月２３日出願）（参照のため本明細書に引用す
る）に開示されている。

【００３１】標識自体かまたは１または２以上の別の物
質とともに検出可能なシグナルを生成し得る限り、特定
の標識を選択することは本発明にとって重要ではない。 標識か特異的結合成分のいずれかを変えることにより、
種々の異なる指示試薬を調製することができる。

【００３２】捕捉試薬 　　本発明の捕捉試薬は、一般に固相物質に結合した特
異的結合成分である。一般に、固定化した捕捉試薬は、
検出および／または測定のためのアッセイ反応生成物を
固相物質上に固定化する働きをする。捕捉試薬は、他の
物質と特異的に結合することのできるいかなる物質であ
ってもよい。捕捉試薬には、ＡＳＲの分析対象物成分、
ＡＳＲのリガンド成分または補助特異的結合成分と結合
することのできる結合成分が含まれている。

【００３３】本発明はまた、最初は固相物質に結合して
いない捕捉試薬も包含する。アッセイ試薬間で複合体が
生成したら、固相を分離機構として用いることができる
。反応混合物を固相物質と接触させ、新たに生成したサ
ンドイッチ複合体を固相物質により保持させる。この工
程を行うため、同時継続中の米国特許出願第１５０，２
７８号明細書（１９８８年１月２９日出願）（参照のた
め本明細書に引用する）に開示されているようにそれ自
体が捕捉試薬を結合する固相を用いる方法；捕捉試薬に
特異的な結合成分を固相に結合させる方法；または荷電
物質（捕捉試薬に結合した反対荷電の物質を誘引し結合
させる）などの反応剤を固相に結合させる方法などの別
法を用いることができる。本発明のＡＳＲおよびアッセ
イ態様を用いた沈澱アッセイまたは凝集アッセイもまた
考えることができる。

【００３４】本発明のアッセイ装置は多くの形態をとり
得るが、その幾つかは固相用に選択した物質に依存する
。しばしば、固相物質は適当なクロマトグラフィー物質
、吸湿性物質、多孔質物質または毛管性物質である。 本発明において固相物質としては、１または２以上のア
ッセイ試薬を含有する１または２以上の層を有するフロ
ー−スルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）アッセイ装置
に使用するための繊維ガラス、セルロースまたはナイロ
ンパッド；浸漬読み取り（ｄｉｐ　ａｎｄ　ｒｅａｄ）
アッセイのためのディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃ
ｋ）；クロマトグラフィー法に使用するための試験スト
リップ（たとえば、紙またはガラス繊維など）または薄
層クロマトグラフィーに使用するための試験ストリップ
（たとえば、ニトロセルロースなど）（この場合、固相
物質の単一のストリップの別々のまたは重複しないゾー
ン中に１または２以上の試薬が含有される）；または当
業者によく知られた吸収物質またはフィルム物質などが
挙げられる。固相物質にはまた、ポリアクリルアミドビ
ーズ、ポリスチレンビーズまたはチューブ、マグネチッ
クビーズ、マイクロタイタープレートまたはガラスまた
はプラスチック試験管、または滑らかな表面、ウエルま
たはチャネルを有するシート、スライドまたはプレート
などの他の固体物質も含まれるが、これらに限られるも
のではない。

【００３５】天然物質、合成物質または合成的に修飾し
た天然物質を固相物質として用いることができ、その例
としては、多糖類、たとえば紙、セルロースおよびセル
ロース誘導体（酢酸セルロース、ニトロセルロースなど
）を含むセルロース物質；シリカ；繊維ガラス；多孔質
ポリマーマトリックス中に均一に分散させた不活化アル
ミナ、ケイソウ土または他の細かに分割した無機物質な
どの無機物質（ポリマーとしては、塩化ビニル、塩化ビ
ニル−プロピレンコポリマー、および塩化ビニル−酢酸
ビニルコポリマーなど）；天然の布（たとえば、綿など
）および合成の布（たとえば、ナイロンなど）；シリカ
ゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチンなどの
多孔質ゲル；ポリアクリルアミドなどのポリマーフィル
ム；磁性粒子；マイクロタイタープレート；ポリスチレ
ンチューブ；タンパク結合膜；アガロース；セファデッ
クスＲ（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ、ピスカ
タウエイ、ＮＪ）；トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙ
ｌ）Ｒ（ポワント−ジラール（Ｐｏｉｎｔｅｔ−Ｇｉｒ
ａｒｄ）、フランス）；シリコン粒子；多孔質繊維マト
リックスなどが挙げられる。固相物質は妥当な固有の強
度を有していなければならないが、別の支持物質により
強度を提供することもできる。

【００３６】しかしながら、本発明の捕捉試薬は、不溶
性の固相物質に直接または間接に結合した特異的結合成
分に限られることはない。たとえば、凝集アッセイにお
いては、捕捉試薬の特異的結合成分はウシ血清アルブミ
ンなどの可溶性の担体物質に結合させることができる。

【００３７】補助物質 　　本発明にとって重大なことではないが、捕捉試薬は
また、別の固相基体物質により濾過もしくは保持し固定
化し得る粒子、たとえば「ビーズ」または「微細粒子」
上にコーティングすることもできる。「保持および固定
化」とは、粒子が一旦固相基体物質上に位置すれば該物
質内のどの位置にも実質的に移動することができないこ
とを意味する。この粒子は、ポリスチレン、ポリメタク
リレート、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ラテ
ックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニ
トリル、ポリカーボネートまたは同様の物質からできた
、あらゆる適当な種類の粒状物質から当業者により選択
することができる。

【００３８】本発明の他の態様では、指示試薬に界面活
性剤を添加する。幾つかの例において、指示試薬の活性
は貯蔵の間に減少することがある。指示試薬希釈緩衝液
に界面活性剤を添加すると指示試薬の性能が有意に改善
され、不活性になったと思われる指示試薬または活性が
大きく減少した指示試薬の活性を回復することすらでき
る。界面活性剤処理により指示試薬の性能が改善される
結果、アッセイを行うのに必要な指示試薬の量をしばし
ば減少させることができる。

【００３９】使用する界面活性剤の量および種類は、指
示試薬を生成するのに用いた特異的結合成分、標識およ
びカップリング法に依存して変わる。界面活性剤の適当
な種類および量を選択する場合、特異的結合成分または
標識活性の安定性に及ぼす界面活性剤の影響は重要であ
る。界面活性剤の種類および量は、特異的結合成分およ
び標識の安定性を維持し、他のアッセイ試薬と両立し、
かつアッセイ試薬の所望の結合反応に影響を与えないの
が好ましい。さらに、指示試薬の活性を維持するのに必
要な界面活性剤の量は、一般に、不活化した指示試薬の
活性を回復するのに必要な量よりも少ない。指示試薬の
長期安定性が界面活性剤への暴露により影響される場合
は、アッセイに試薬を使用する直前に界面活性剤を指示
試薬に添加すればよい。

【００４０】単独または組み合わせて使用することので
きる界面活性剤の例としては、たとえば、アルキルピラ
ノシド、ポリオキシエチレンソルビタン（ツイーン）、
ポリオキシエチレンエーテル（たとえば、トリトンＲ、
ローム＆ハース）、ポリグリコールエーテル（たとえば
、テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）Ｒ、ユニオン・カ
ーバイド）、ソルビタン（スパンズ（Ｓｐａｎｓ））、
他の非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤（ド
デシル硫酸塩など）、カチオン性界面活性剤（アルキル
アンモニウム塩など）および両性イオン性界面活性剤（
チャップス（Ｃｈａｐｓ））などが挙げられるが、これ
らに限られるものではない。

【００４１】本発明はさらに、ＡＳＲおよび本発明のア
ッセイを行うのに必要な成分を含む試薬キットをも提供
する。このキットには、未結合のＡＳＲ、または１また
は２以上の特異的結合成分を含む前以て生成した複合体
の一部としてのＡＳＲも含まれる。

【００４２】分析対象物置換試薬 　　ＡＳＲは少なくとも２つの成分を有し、その第一の
成分は分析対象物と同一もしくはその類似体であり、第
二の成分は分析対象物とは関係のないリガンドもしくは
非分析対象物である。それゆえ、ＡＳＲの第一の成分は
薬物や薬物類似体などの分析対象物であってよく、第二
の成分は、一般に遊離の形態で試料中に存在しないかま
たは少なくともアッセイ反応に妨害を及ぼす量では存在
しない限り、分析対象物以外のいかなる物質またはリガ
ンドであってよい。妨害リガンドを取り除くため、試料
を使用前に処理することも考えられる。

【００４３】本発明のＡＳＲを用いることにより、結合
に利用できるエピトープが一つしかない分析対象物につ
いての明確な所見が、有利にもシグナルの出現またはシ
グナルの増加によって示される。すなわち、検出可能な
シグナルは試料中の分析対象物の濃度に比例して増加す
る。このことが達成されるのは、ＡＳＲが分析対象物の
代わりに複数エピトープ物質として働くため、試料中の
分析対象物の存在または量に直接比例して検出可能な結
合複合体を生成することができるからである。ＡＳＲは
、少なくとも２つの結合部位を提供するため、少なくと
も２つの結合成分、たとえば捕捉試薬と指示試薬がＡＳ
Ｒに結合して免疫複合体を生成し、この複合体が試料中
の分析対象物の存在または量の指標となる。

【００４４】ＡＳＲは高分子量（４，０００〜２，００
０，０００）の分析対象物を含む広範囲の分析対象物の
存在または量を決定するのに有用であるが、低分子量の
分析対象物、たとえば分子量が５０〜４，０００の範囲
の分析対象物の存在または量を決定するのに特によく適
している。本発明は、ステロイド、ビタミン、プロスタ
グランジン、抗喘息薬、抗不整脈薬、抗腫瘍薬、抗痙攣
薬、抗生物質、抗関節炎薬、抗鬱薬、およびコカイン、
モルヒネ、ヘロイン、アンフェタミン、メタンフェタミ
ン、カンナビノイドなどの乱用薬物を含む、１００〜２
，０００の範囲の分子量の分析対象物の存在または量を
決定するのに特に有利である。

【００４５】上記のような多くの低分子量の分析対象物
のための従来のアッセイ法が直面する問題は、分析対象
物が小さすぎるために２つの結合成分が分析対象物に同
時に結合することができないことである。サンドイッチ
アッセイ法においては、分析対象物分子上に少なくとも
２つの結合部位またはエピトープが存在し、しかも２つ
の結合成分が分析対象物に立体障害を伴わずに結合する
ことができるように、これら２つの結合部位が充分な距
離で離れていることが必要である。

【００４６】しかしながら、本発明による分析に分析対
象物が特に適していることを決定するための要因は低分
子量のみではない。たとえば、密な分子と密でない分子
とは最長の寸法が同じ長さを有していても密な分子の方
が密でない分子よりも実際重い。さらに、分析対象物が
抗体が結合するのに適した２つのエピトープを有してし
ても、立体障害なく結合するにはこれら２つのエピトー
プが互いに充分な距離で離れて分析対象物分子上の２点
に位置していないかもしれない。また、ハプテンのよう
なある種の分析対象物では利用できる結合部位が一つし
かないかもしれない。それゆえ、本発明において有利に
検出することのできる分子の種類を説明するのに分子量
が用いられるとしても、本発明の有用性は低分子量の分
析対象物に限られるものではない。

【００４７】本発明において、ＡＳＲの第一成分は、分
析対象物、またはアッセイにおける分析対象物と共通す
る少なくとも一つのエピトープを有する分析対象物類似
体である。たとえば、分析対象物類似体は、反応性水素
原子（すなわち、ヒドロキシ酸素原子に結合した水素原
子）または反応性アミン（第一級または第二級）を除去
するか、またはアミノ誘導体を生成することによって対
応分析対象物から誘導することができる（イミノ基は、
ＡＳＲのリガンド成分への結合部位において、分析対象
物中にもともと存在する１または２以上の原子を置換す
る）。他の反応性基としては、カルボン酸、ニトリル、
ハロゲンなどが挙げられるが、これらに限られるもので
はない。

【００４８】反応性水素原子の除去により分析対象物類
似体を生成する分析対象物の例としては、プロカインア
ミド、チロキシンおよびキニジンが挙げられる。アミノ
誘導体が分析対象物類似体として有用である分析対象物
の例としては、テオフィリン、バルプロン酸（ｖａｌｐ
ｒｏｉｃ　ａｃｉｄ）、フェノバルビタール、フェニト
イン、プリミドン、ジソピラミド、ジゴキシン、クロラ
ムフェニコール、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、
カルバムアゼピン、デシプラミンおよびノルトリプチリ
ンが挙げられる。加えて、分析対象物はまた、１または
２以上の機能成分または結合部位を付加または欠失させ
て分析対象物類似体、たとえば全分析対象物の配列より
は小さい配列であるが分析対象物特異的結合成分に結合
するのに必要なエピトープは保持している部分ペプチド
またはヌクレオチド配列を生成することにより、構造的
な修飾を受けることもできる。たとえば、分析対象物類
似体は、分析対象物と共通する少なくとも一つのエピト
ープを有する合成ペプチド配列であってもよい。

【００４９】ＡＳＲの第二のリガンド成分は、一般にア
ビジン、ビオチン、フルオレセイン、フルオレセイン誘
導体、ローダミンまたはローダミン誘導体を含むが、こ
れらに限られるものではない。フルオレセイン化合物と
しては、フルオレセインアミン；フルオレセインチオイ
ソシアネート；カルボキシフルオレセイン；α−ヨード
アセトアミドフルオレセイン；（２，３−ジクロロ−１
，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレセイ
ン（ＤＴＡＦ）；（４−クロロ−６−メトキシ−１，３
，５−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレセイン；
およびアミノメチルフルオレセインなどが挙げられる。 ビオチンをＡＳＲのリガンド成分として用いる場合は、
その相補的な特異的結合成分はアビジンまたは抗ビオチ
ン抗体である。ＡＳＲのリガンド成分がフルオレセイン
またはフルオレセイン誘導体である場合は、好ましいリ
ガンドの特異的結合成分は抗フルオレセイン抗体である
。フルオレセインに対する抗体は容易に入手できるので
、フルオレセインはＡＳＲのリガンド成分として用いる
のには特に有利である。しかしながら、ＡＳＲのリガン
ド成分は、アッセイ試薬および分析対象物結合を妨害し
ない限り、実質的に上記特異的結合成分のいずれであっ
てもよい。それゆえ、リガンド成分は、分析対象物また
は分析対象物特異的結合成分とは関係しない他の抗原、
抗体、ペプチド配列、ヌクレオチド配列などであってよ
い。

【００５０】本発明において、ＡＳＲの２つの成分は不
可逆的に結合させることができる。分析対象物成分をリ
ガンド成分に結合させるため、種々の分子架橋または連
結基を用いることもできる。たとえば、分析対象物類似
体とフルオレセイン誘導体との連結基は、７個までのヘ
テロ原子を含み、全部で０〜２０個の炭素原子とヘテロ
原子が直鎖または分枝鎖状に配列され、２個までの環基
を含むものであってよい。連結機構の種類を選択するに
あたって考慮しなければならないことは、リガンドの分
析対象物または分析対象物類似体への連結が両成分のそ
れぞれの特異的結合パートナーへの結合能を妨害しては
ならないこと、および連結機構がＡＳＲの結合成分複合
体生成能を妨害してはならないことである。

【００５１】アッセイ装置またはキットにおいて、ＡＳ
Ｒは第一特異的結合成分と可逆的に結合した試薬として
最初に提供されてよく、試料の分析対象物は第一特異的
結合成分に対する分析対象物の競合的結合によりＡＳＲ
を置換させる。一般に、ＡＳＲおよび第一特異的結合成
分の両方とも、アッセイ手順の前にカップリングまたは
結合させることなく存在させる。ＡＳＲ／第一特異的結
合成分複合体または混合物は、凍結乾燥粉末、錠剤、カ
プセルまたは液体試薬などの種々の形態であってよい。

【００５２】診断アッセイ 　　ＡＳＲは種々の結合アッセイ態様に使用することが
でき、本発明を使用した下記方法は例示にすぎず本発明
を限定するものではない。一般に、これらアッセイは「
直接」アッセイであり、指示試薬および捕捉試薬の特異
的結合成分はＡＳＲと直接反応して結合複合体を生成す
る。「間接」アッセイもまた本発明を用いて考えること
ができ、たとえば、指示試薬の特異的結合成分が補助特
異的結合成分に特異的であり、該補助特異的結合成分が
ＡＳＲに特異的であるアッセイである。

【００５３】加えて、これらアッセイは種々の方法で行
うことができる。試料、ＡＳＲ、第一特異的結合成分お
よび捕捉試薬をアッセイにおいて同時に混合することが
でき、またこれらを個々に、または種々の順番で組み合
わせて加えインキュベートすることができる。その場合
、一つの試薬の結合は他の試薬の結合を妨害または抑制
してはならない。指示試薬は他の試薬および試料と同時
に加えることもできるが、一般には他の試薬が反応して
しまった後に指示試薬を加える。下記の一般的かつ詳細
な実施例に示すような試薬の組み合わせ順序は、本発明
のアッセイ法をそのような特定の順序に限定すべきでな
いことは、当業者には理解されるであろう。しかしなが
ら、試料を加える前にＡＳＲと第一特異的結合成分を反
応させないことが好ましい。というのは、第一特異的結
合成分から試料分析対象物によりＡＳＲが置換されるこ
とは、第一特異的結合成分に対してＡＳＲと分析対象物
との間で競合結合が起こるよりも時間がかかるからであ
る。

【００５４】本発明の一つの態様において、所定量のＡ
ＳＲおよび第一特異的結合成分（たとえば、抗分析対象
物抗体）を試料と接触させる。試料中に分析対象物が存
在するならば、第一特異的結合成分への結合に対して分
析対象物はＡＳＲと競合するか、または分析対象物は第
一特異的結合成分からＡＳＲを置換させる。その結果、
残留する未結合または「遊離の」ＡＳＲは試料中の分析
対象物の量に比例する。

【００５５】ついで、上記混合物を、固相物質上に固定
化した捕捉試薬、たとえば第二特異的結合成分（抗リガ
ンド抗体など）と接触させる。幾つかまたはすべての遊
離ＡＳＲが、ＡＳＲのリガンド成分に結合した捕捉試薬
により固相上に固定化される。ついで、標識に結合した
第三特異的結合成分（該第三特異的結合成分はＡＳＲの
分析対象物成分と結合することができ、固相上に検出し
得るまたは測定し得る捕捉試薬／ＡＳＲ／指示試薬複合
体を生成する）を含む指示試薬を加えることにより固定
化ＡＳＲを検出することができる。第三特異的結合成分
は第一特異的結合成分と同一であってよく、それゆえ、
この例においては指示試薬は標識に結合した第二の抗分
析対象物抗体であってよい。この標識は、単独かまたは
シグナル生成系の別の成分との相互反応により検出可能
なシグナルを生成することができる。固定化されたＡＳ
Ｒの量は試料中の分析対象物の量に正比例するので、固
定化された指示試薬の量は試料中の分析対象物の存在ま
たは量に正比例する。検出可能なシグナルまたはシグナ
ル生成速度は、試料中の分析対象物の量が増加するにつ
れて増加する。

【００５６】本発明の別の態様では、捕捉試薬は固相物
質上の分析対象物特異的結合成分であり、指示試薬は標
識したリガンド特異的結合成分である。他の態様として
は、１または２以上の必要な試薬が１または２以上の層
中または層上に拡散的に（すなわち、固相を移動できる
）または非拡散的に（すなわち、固相内または固相上に
固定化されている）含まれている多層固相装置の使用；
１または２以上の必要なアッセイ試薬が試験ストリップ
中または試験ストリップ上の１または２以上のゾーンま
たは部位に拡散的にまたは非拡散的に含まれている、毛
管、吸収またはクロマトグラフィーアッセイのための試
験ストリップ物質の使用；捕捉試薬／ＡＳＲ／指示試薬
複合体の溶液中での生成（該複合体の検出は、溶液中で
、または固相により該複合体を溶液から分離した後に行
う）が挙げられるが、これに限られるものではない。 当業者には知られているように、固相物質の設計に際し
て、アッセイに必要な試薬を含有する充分な数のゾーン
または層を含み、いったん試料を加えたら実質的に自動
的にアッセイを行うようにすることもできる。

【００５７】本発明のＡＳＲは分析対象物が一価である
か２つの特異的結合成分が同時に結合するには小さすぎ
る場合に特に有利ではあるが、ＡＳＲの使用は一層大き
な分析対象物に対するアッセイにおいても有利である。 たとえば、本発明では、互いに妨害することなく同じ分
析対象物に結合し得る２つの抗体をアッセイで使用する
必要がない。その代わり、ＡＳＲの分析対象物成分に結
合するただ一つの抗分析対象物抗体が必要なだけであり
、第二の抗体または特異的結合成分は結合反応複合体を
完成させるためにＡＳＲのリガンド成分に結合し得るこ
とだけが必要である。この方法は重複エピトープの抗体
認識の問題を回避し、よってサンドイッチアッセイにお
いてモノクローナル抗体と同様にポリクローナル抗体の
使用を容易にする。

【００５８】さらに、多くの異なる分析対象物／リガン
ド組合せのリガンド成分として同じ特異的結合成分を用
いてよいので、多くの異なるアッセイにおける一般試薬
として同じ特異的結合成分を用いることができる。それ
ゆえ、単一の指示試薬（たとえば、標識抗リガンド抗体
）または固相物質と固定化捕捉試薬（たとえば、固定化
抗リガンド抗体）からなる単一の固相系を多くの異なる
アッセイ系において修飾することなく使用することがで
き、そうすることにより容易にアッセイを行うことを可
能にし、かつ装置製造のコストを減少させることができ
る。

【００５９】加えて、捕捉試薬／ＡＳＲ／指示試薬サン
ドイッチ複合体を前以て生成させ、第一特異的結合成分
を使用しないアッセイを行うことができる。この前以て
生成した複合体はまた、固相物質に前以て結合させてお
くこともできる。この方法は逆アッセイと呼ばれ、分析
対象物（試料中に存在するならば）が指示試薬に結合し
固相から指示試薬を置換することによって、固定化捕捉
部位において固相に結合したシグナルを減少させる。こ
の方法はまた、多分析対象物アッセイを行うことを可能
にし、該アッセイは抗フルオレセイン抗体などの「一般
」捕捉試薬を固相上の３つの異なる部位で使用して各分
析対象物に対して別々の結果を得ることができる。たと
えば、一般捕捉試薬と（１）フルオレセイン／テトラヒ
ドロカンナビノールＡＳＲおよび標識抗テトラヒドロカ
ンナビノール抗体指示試薬、（２）フルオレセイン／コ
カインＡＳＲおよび標識抗コカイン抗体指示試薬、およ
び（３）フルオレセイン／オピアトＡＳＲおよび標識抗
オピアト抗体指示試薬との異なるサンドイッチ複合体を
各部位に前以て生成させることができる。１、２または
すべての分析対象物を含有する試料を固相と接触させる
ことにより各指示試薬を置換し、１または２以上の部位
におけるシグナル生成の減少により１または２以上の分
析対象物の存在を示すことができる。

【００６０】多分析対象物アッセイはまた、適当なリガ
ンド成分および分析対象物成分を用い、アッセイにおけ
る各異なる分析対象物を置換するために異なるＡＳＲ、
たとえば、（１）フルオレセイン／コカインＡＳＲ、（
２）ローダミン／テトラヒドロカンナビノールＡＳＲ、
および（３）アミノメチルフルオレセイン／オピアトＡ
ＳＲを生成させることによっても行うことができる。そ
れゆえ、適当な捕捉試薬および指示試薬を用い、各分析
対象物について別々の結果の得られる多分析対象物アッ
セイを単一の固相上で行うことができる。

【００６１】また、第一特異的結合成分／ＡＳＲ／指示
試薬複合体を前以て生成させて試料と反応させ、分析対
象物でＡＳＲ／指示試薬サブ複合体を置換させた後に捕
捉試薬と反応させるアッセイ法も考えられる。たとえば
、フロー−スルーアッセイ装置または試験ストリップア
ッセイ装置においては、第一特異的結合成分／ＡＳＲ／
指示試薬を第一反応部位に固定化し、該第一反応部位の
下流にある第二反応部位に捕捉試薬を固定化する。

【００６２】

【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。下記実施例は、本発明のＡＳＲおよびアッセイ手順
を行う方法を説明するものである。なお、当業者であれ
ば、本発明の発明概念を適用し得る、半定量アッセイお
よび定量アッセイを含む他の多くのアッセイを考えるこ
とができるであろう。

【００６３】実施例１（コカインのエンザイムイムノア
ッセイ） （ａ）コカイン免疫原の調製：下記手順を用いて免疫原
を調製し、ＡＳＲの分析対象物成分および抗コカイン抗
体（すなわち、分析対象物特異的結合成分）の両方を調
製した。塩酸コカイン（２．０ｇ）を蒸留水（１００ｍ
ｌ）および濃塩酸（８．０ｍｌ）中に溶解し、１９時間
還流した。 室温に冷却した後、安息香酸が沈殿し、濾過した。この
濾液をクロロホルムで洗浄して残留する安息香酸を除去
した。得られた水性溶液を減圧下で蒸発乾固した。残渣
（塩酸エクゴニン）をメタノール性塩化水素（１５０ｍ
ｌ）中で１７時間還流することによりエステル化した。 溶媒を減圧除去してエクゴニンメチルエステルを油状物
として得た。

【００６４】４−（クロロメチル）安息香酸（２．３ｇ
）をメチレンクロライド（５０ｍｌ）中に懸濁し、オキ
サリルクロライド（２．０ｍｌ）を加え、ついでジメチ
ルホルムアミド（２滴）を加えた。２時間撹拌した後、
溶媒を減圧除去した。乾燥ベンゼンを加え、減圧除去し
た。乾燥ベンゼン（２０ｍｌ）を再び加え、この混合物
をエクゴニンメチルエステル（１．０ｇ）に加えた。室
温で１９時間撹拌した後、メチレンクロライド（３００
ｍｌ）を加え、混合物を塩酸（１Ｎ、１００ｍｌ）で２
回抽出した。コンバインした水性溶液を炭酸カリウムで
ｐＨ９の塩基性にし、メチレンクロライドで２回抽出し
た。コンバインした有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過し、溶媒を減圧除去した。適当な比のメタノール／
クロロホルムで溶出するシリカゲルカラムにより純粋な
４−（クロロメチル）コカインを得た。

【００６５】上記４−（クロロメチル）コカイン（０．
６ｇ）をｐ−ジオキサン（２５ｍｌ）および濃水酸化ア
ンモニウム（２５ｍｌ）中に溶解した。この溶液を室温
で１８時間撹拌した。溶媒を減圧除去して４’−（アミ
ノメチル）コカインを得た。残渣をｐ−ジオキサン（１
５ｍｌ）および蒸留水（１５ｍｌ）中に溶解し、混合物
を２１時間還流した。溶媒を減圧除去して４−（アミノ
メチル）ベンゾイルエクゴニンを褐色油状物として得た
。残渣をｐ−ジオキサン（４．０ｍｌ）および蒸留水（
４．０ｍｌ）中に溶解し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカー
ボネート（０．３ｇ）を加えた。この混合物を室温で３
時間撹拌した。溶媒を除去し、得られた４−［（ｔ−ブ
トキシカルボニルアミノ）メチル］ベンゾイルエクゴニ
ンをシリカゲルカラムによりクロロホルム／メタノール
の適当な混合物で溶出して精製した。精製した生成物を
メチレンクロライド（５．０ｍｌ）およびトリフルオロ
酢酸（５．０ｍｌ）中に溶解し、室温で２時間撹拌した
。ついで、溶媒を除去して純粋な４−（アミノメチル）
ベンゾイルエクゴニンビス（トリフルオロ酢酸）塩を得
た。

【００６６】２５％水性グルタルアルデヒド溶液を脱色
炭と約５分間混合し、０．２ミクロンフィルターで濾過
した。この溶液のアリコート（０．６５ｍｌ）を、水性
ウシ血清アルブミン（１３ｍｌ、３．８９ｍｇ／ｍｌ）
を入れた４つのびんのそれぞれに加え、直ちにゆっくり
と１８時間回転して混合した。これら４つの溶液をコン
バインし、セルロース透析管（ＭＷ１２，０００〜１４
，０００）中で０．０６Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に
対して室温で１８時間透析した。透析管から溶液を除い
た後、タンパク質濃度は２．６８ｍｇ／ｍｌと決定され
た。

【００６７】上記４−（アミノメチル）ベンゾイルエク
ゴニンビス（トリフルオロ酢酸）塩（２２８ｍｇ）を、
０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液（１１．
４ｍｌ、ｐＨ７．５）中に溶解した。この溶液のアリコ
ート（４ｍｌ）を撹拌しながらウシ血清アルブミングル
タルアルデヒド誘導体（２５ｍｌ、３．６８ｍｇ／ｍｌ
）に加えた。 この混合物の撹拌を室温で１８時間続けた。この混合物
をセルロース透析管（ＭＷ１２，０００〜１４，０００
）中で０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（ＴＲＩＳ）（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有、トリス−
緩衝食塩水［ＴＢＳ］；ｐＨ８．０）に対して室温で１
８時間透析した。この透析管からの溶液を０．１５Ｍ　
ＮａＣｌを充填し溶出したセファデックスＲカラム上で
精製して精製免疫原を得た。

【００６８】（ｂ）コカイン／フルオレセインＡＳＲ：
上記工程（ａ）で調製した４−（アミノメチル）ベンゾ
イルエクゴニンビス（トリフルオロ酢酸）塩（１７ｍｇ
）および５−（４，６−ジクロロ−１，３，５−トリア
ジン−２−イルアミノ）フルオレセイン（２４ｍｇ）を
メタノール（２．０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０
．１ｍｌ）中に溶解した。この混合物を室温で１６時間
撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られたＡＳＲ（コ
カイン類似体／フルオレセインリガンド複合体）をシリ
カゲルプレート上でクロロホルム／メタノールの適当な
混合物で溶出して精製した。ついで、このＡＳＲをＴＢ
Ｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に６２ｎＭに希釈した。

【００６９】（ｃ）コカイン指示試薬：抗コカイン抗体
／アルカリホスファターゼ結合体：当業者に知られた方
法および上記工程（ａ）で得た免疫原を用いて抗コカイ
ン抗体を産生させた。この抗体を下記反応に従って精製
した。コカインヒツジ血清（１６０ｍｌ）を０℃に冷却
した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の硫酸ア
ンモニウム（１６０ｍｌ、５０％飽和）を加え、混合物
を０℃で１０分間穏やかに撹拌した。この溶液を０℃に
て１０，０００×ｇで１５分間遠心分離にかけた。上澄
み液を注いで除き、ペレットを０℃にて２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）中の硫酸アンモニウム（５０％飽
和）中に再懸濁した。この溶液を０℃にて１０，０００
×ｇで１０分間再び遠心分離にかけ、上澄み液を注いで
除いた。 得られた固体を再懸濁し、固体が白色となるまで遠心分
離にかけた。最後に、得られた白色固体を２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に溶解して２１１ｍｌのタン
パク質（１５ｍｇ／ｍｌ）を得た。

【００７０】上記タンパク質溶液の一部（９０ｍｌ）の
コンダクタンスが緩衝液単独のコンダクタンス未満か等
しくなるまで２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希
釈した。ついで、（ジエチルアミノ）エチルセルロース
（ＤＥＡＥ−セルロース、５６０ｇ）［１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）で前以て平衡化したもの］を加え
、得られたスラリーを１０分毎に混合した。１時間後、
ＤＥＡＥ−セルロースを濾過し、半容量の１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。濾液をコンバ
インし、タンパク質（３４５ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ）
に濃縮した。 ついで、得られた抗コカイン抗体を下記反応によりアル
カリホスファターゼに結合した。

【００７１】アルカリホスファターゼ（０．３１３ｍｌ
、１０ｍｇ／ｍｌ）を反応緩衝液（０．６５６ｍｌ）［
Ｈ２Ｏ　１．５Ｌ、トリエタノールアミン１４．８ｇ、
塩化マグネシウム０．４８０ｇ、および塩化亜鉛（１４
ｇ／１００ｍｌ蒸留水を２０ｍｌ）、６ＮＮａＯＨでｐ
Ｈ７．３に調節］およびグルタルアルデヒド（０．００
７ｍｌ）と混合した。この混合物を室温で約１５分間撹
拌した。この混合物に抗コカイン抗体（０．４４２ｍｌ
、５．４１ｍｇ／ｍｌ）を加え、２〜３分間穏やかに撹
拌し、室温でさらに１５分間放置して抗体／酵素結合体
を生成させた。

【００７２】ついで、等容量のトリス停止緩衝液（Ｈ２
Ｏ　２Ｌ、トリス７２．６ｇ、ＮａＣｌ３５．０４ｇ、
塩化マグネシウム１．２２ｇ、および塩化亜鉛溶液［６
０ｍｌ、１４ｇ／１００ｍｌ蒸留水］、６Ｎ　ＮａＯＨ
でｐＨ７．３に調節）および結合体反応混合物をコンバ
インし、５〜１０分間撹拌した。ついで、指示試薬を除
去し、結合体緩衝液（Ｈ２Ｏ　１Ｌ、ＴＢＳ　６ｇ、Ｎ
ａＣｌ　６ｇ、塩化マグネシウム０．２ｇ、および塩化
亜鉛０．０１ｇ；ｐＨ８．０）で希釈して１：１０の濃
度とした。指示試薬の基質は、ニトロブルーテトラゾリ
ウムクロリド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ；アミノメチルプロ
パノール９．０ｇおよび塩化マグネシウム０．２ｇを含
有するＨ２Ｏ　１Ｌ中にＮＢＴ０．１５ｇおよびＢＣＩ
Ｐ　０．５ｇ）であった。

【００７３】（ｄ）捕捉試薬；抗フルオレセイン抗体：
ウシ血清アルブミン（１００ｍｇ）を蒸留水（２．０ｍ
ｌ）中に溶解し、この混合物のｐＨを１Ｎ　ＮａＯＨで
９に調節した。１Ｎ　ＮａＯＨを加えてｐＨを９に維持
しながら、ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ）中のフ
ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、１００ｍ
ｇ）を撹拌しながら滴下した。ＦＩＴＣをすべて滴下し
終わった後、混合物を室温で２時間撹拌した。ついで、
この溶液をセルロース透析管（ＭＷ１２，０００〜１４
，０００）中で１０ｍＭリン酸緩衝液（１．０Ｌ、ｐＨ
７）に対して２時間透析した。ついで、この透析管を、
０．９％水性塩化ナトリウム（４．０Ｌ）に２回変えて
それぞれ１９時間透析し、ついで、０．９％水性塩化ナ
トリウム中の１０％ジメチルホルムアミドに３回変えて
それぞれ２４時間透析した。最後の溶液では、透析溶液
中にフルオレセインの存在が認められたなかった。つい
で、得られた免疫原溶液を透析管から除き、凍結乾燥し
てオレンジ色の固体を得た。この免疫原を標準法に従っ
て用い、ウサギ抗フルオレセイン抗体捕捉試薬を生成し
た。得られた抗体を上記工程（ｃ）に記載の方法により
精製した。

【００７４】（ｅ）フロー−スルー固相物質上の捕捉試
薬：この物質は、上記工程（ｄ）で得た精製抗フルオレ
セイン抗体（すなわち、リガンド特異的結合成分）（１
００μｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ溶液）をカルボキシ誘導体
化ラテックス微細粒子［セラジン（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）
、インディアナポリス、インディアナ］に共有結合的に
結合させたものであった。抗体の微細粒子へのカップリ
ングは下記方法により行った。上記精製抗体（８．６ｍ
ｇ）、微細粒子（２６０ｍｇ）、水（２０ｍｌ）および
２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（１００ｍＭ
　ＭＥＳ、０．０５ｍｌ）をコンバインし、溶液のｐＨ
を調節した（３Ｎ　ＨＣｌまたは３Ｎ　ＮａＯＨを用い
てｐＨ６．３に）。ついで、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（１ｍｇ／ｍｌ
　ＥＤＡＣ、０．１ｍｌ）を加え、溶液を１５〜３０℃
で３〜３．５時間穏やかに撹拌した。反応を停止させる
ため、混合物を２４００〜４０００×ｇで１０〜２０分
間遠心分離にかけた。上澄み液をデカントし、捨てた。

【００７５】ついで、得られた微細粒子を所定量の０．
１％ツイーン２０溶液（バッチサイズとほぼ同じかまた
は０．１０倍）中に懸濁した。ついで、遠心分離および
懸濁工程を繰り返した。ついで、微細粒子を緩衝液（結
合体緩衝液＋０．１％ツイーン２０）中に懸濁し、再び
遠心分離にかけた。ついで、最終的に得られた微細粒子
調製液を希釈し、調製液（６０μｌ）をガラス繊維パッ
ド上に沈積させた。ついで、パッドに６％にべ溶液でオ
ーバーコーティングし、乾燥させた。

【００７６】（ｆ）コカインイムノアッセイプロトコー
ル：第一特異的結合成分（精製抗コカイン抗体、３０μ
ｌ、２．７４ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ　ＴＢＳ中）および
上記工程（ｂ）で得たＡＳＲとしてのコカイン類似体／
フルオレセインリガンド（１００μｌ）を、既知量のコ
カイン分析対象物を含有する尿試料（４００μｌ）に加
えた。ＡＳＲの分析対象物成分と試料中の分析対象物と
は抗コカイン抗体結合部位に対して競合し、試料中の薬
物が多くなればなるほど混合物中に存在する遊離のＡＳ
Ｒは多くなった。上記混合物を上記工程（ｅ）の固相物
質上に直ちに注いだ。該固相物質にはリガンド特異的捕
捉試薬（抗フルオレセイン抗体）が固定化されており、
ＡＳＲを固相上の抗フルオレセイン抗体に結合させるこ
とができた。ついで、固相を洗浄した（塩酸グアニジン
およびツイーン２０を用いて）。

【００７７】この固相物質に上記工程（ｃ）で得た指示
試薬（２００μｌ）を接触させて、固定化ＡＳＲの分析
対象物成分に指示試薬を結合させ指示試薬と固相物質上
の捕捉試薬との間にＡＳＲをサンドイッチさせた。試料
中に分析対象物が存在していない場合はＡＳＲは第一特
異的結合成分と捕捉試薬との間にすでにサンドイッチさ
れており、指示試薬は結合する部分がなくて固相物質に
結合せずに流れ落ちてしまった。固相物質を再び洗浄し
て未反応指示試薬を除去した。

【００７８】３滴の酵素基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を固
相に適用した。表１は、異なるコカイン濃度を有する試
料について行ったアッセイの結果を示す。表中、陰性（
−）は発色がなかったことを、陽性（＋）は発色があっ
たことを、二重陽性（＋＋）は強い発色があったことを
示す。閾値量のコカインが試料中に存在しておれば、基
質は固相上に固定化された指示試薬と反応し、シグナル
が生成した。閾値量未満のコカインが試料中に存在して
いる場合には、固相上に指示試薬は存在せず、基質は反
応することができなかった。 　　　　　　表１（コカインイムノアッセイ結果）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　試料濃度（ｎｇ／ｍｌ）微細粒子の希釈
　　　　　　　　０　　　　　　１０　　　　　　５０
　　　　１００　　　　２００　　１：８　　　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　＋　　　　　　　＋
＋　　　　　＋＋　　　　　　＋＋　　１：１６　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　ｎ／ｐ　　　　　＋
　　　　　　　＋＋　　　　　　＋＋（注）−：発色せ
ず；＋：発色；＋＋：強い発色；ｎ／ｐ：実施せず

【０
０７９】実施例２（モルヒネのエンザイムイムノアッセ
イ） （ａ）モルヒネ免疫原の調製：下記手順により免疫原を
調製し、これから抗オピアト抗体を調製した。モルヒネ
−３−β−Ｄ−グルクロニド（１００．４ｍｇ）を、３
滴の１．０Ｍ水酸化ナトリウムを加えた蒸留水（１２ｍ
ｌ）中に溶解した。過ホウ素酸ナトリウム（３６ｍｇ）
を加え、ｐＨを３．０に調節し、混合物を室温で１．５
時間撹拌した。エチレングリコール（０．０１６ｍｌ）
を加え、撹拌を１時間続けた。チログロブリン（５０．
６ｍｇ）を加え、ｐＨを８．０に調節し、さらに１時間
後、１当量の水素化シアノホウ素ナトリウムを加えた。 一夜撹拌した後、溶液を食塩水に対して２日間透析した
。この免疫原を標準法に従って用いてヒツジ抗オピアト
抗体を調製し、これを実質的に実施例１工程（ｃ）に記
載の方法に従って精製した。

【００８０】（ｂ）モルヒネ／フルオレセインＡＳＲ：
モルヒネ（８６ｍｇ）を無水エタノール（１．３ｍｌ）
中に溶解すると同時にエタノール中のカリウムエトキシ
ド（１．０Ｍ溶液を０．３４５ｍｌ）で処理した。エチ
ルブロモアセテート（５７．６ｍｇ）を加え、混合物を
窒素雰囲気下、室温で７時間撹拌した。生成物をクロロ
ホルム／メタノール（２：１）で溶出し、シリカゲル薄
層プレート上のクロマトグラフィーにより精製してモル
ヒネ−３−（エトキシカルボニルメチル）エーテル（３
９ｍｇ）を得た。上記モルヒネ−３−（エトキシカルボ
ニルメチル）エーテル（３９ｍｇ）を、初期水素圧４０
ｐｓｉにて１０％パラジウム／炭素（１０ｍｇ）上、エ
タノール（１５ｍｌ）および濃塩酸（０．００９ｍｌ）
中で水素化した。２時間後、濾過および溶媒除去により
生成物を単離して７，８−ジヒドロモルフィン−３−（
エトキシカルボニルメチル）エーテル（４９ｍｇ）を得
た。

【００８１】上記７，８−ジヒドロモルフィン−３−（
エトキシカルボニルメチル）エーテル（４９ｍｇ）をメ
タノール（１．０ｍｌ）中に溶解し、新たに蒸留した１
，２−ジアミノエタン（０．２０ｍｌ）を加えた。この
混合物を窒素雰囲気下、室温にて１６時間撹拌した。揮
発性物質を減圧下で除去して７，８−ジヒドロモルフィ
ン−３−［（２−アミノエチル）アミノカルボニルメチ
ル］エーテル塩酸塩（５８ｍｇ）を得た。上記７，８−
ジヒドロモルフィン−３−［（２−アミノエチル）アミ
ノカルボニルメチル］エーテル塩酸塩（１９ｍｇ）をメ
タノール（０．７５ｍｌ）中に溶解し、６−［４，６−
ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ］
フルオレセイン（２７．９ｍｇ）を加えた。室温で３０
時間撹拌した後、混合物をジメチルホルムアミド（０．
２０ｍｌ）で希釈し、薄層シリカゲルクロマトグラフィ
ープレート上に筋を引いた。クロロホルム／メタノール
／酢酸で展開して精製モルヒネ／フルオレセインＡＳＲ
を生成した。ついで、このＡＳＲをＴＢＳ中に２００ｍ
Ｍに希釈した（２０ｍＭ；ｐＨ７．４）。

【００８２】（ｃ）モルヒネ指示試薬；抗モルヒネ抗体
／アルカリホスファターゼ結合体：抗オピアト抗体を下
記反応によりアルカリホスファターゼに結合させた。ア
ルカリホスファターゼ（１．２５ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ
）を反応緩衝液（２．６ｍｌ）およびグルタルアルデヒ
ド（０．０２６ｍｌ）と混合した。この混合物を室温で
約１５分間撹拌した。この混合物に精製抗オピアト抗体
（１．３１ｍｌ；０．７５９ｍｇ／ｍｌ）を加え、これ
を２〜３分間穏やかに撹拌し、ついで室温でさらに１５
分間放置して抗体／酵素結合体を生成させた。等容量の
トリス停止緩衝液および上記結合体反応混合物をコンバ
インし、５〜１０分間撹拌した。ついで、得られた指示
試薬を除去し、緩衝液（実施例１（ｃ）の結合体緩衝液
＋２％ツイーン２０）で希釈して１：１０濃度を得た。 指示試薬の基質は、実施例１（ｃ）と同じくＮＢＴ／Ｂ
ＣＩＰであった。

【００８３】（ｄ）捕捉試薬；抗フルオレセイン抗体：
実質的に上記実施例１（ｄ）に記載の方法に従って捕捉
試薬を調製した。（ｅ）フロー−スルー固相物質上の捕
捉試薬：実質的に上記実施例１（ｅ）に記載の方法に従
って固相分析装置を調製した。（ｆ）モルヒネイムノア
ッセイプロトコール：第一特異的結合成分としての精製
抗モルヒネ抗体（７５μｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍ
Ｍ　ＴＢＳ中）および実施例２（ｂ）のモルヒネ／フル
オレセインＡＳＲ（１００μｌ）を、既知量のモルヒネ
を含有する尿試料（５００μｌ）にそれぞれ加えた。Ａ
ＳＲおよび試料中の分析対象物は第一特異的結合成分へ
の結合に対して競合し、試料中の薬物が多くなればなる
ほど混合物中に存在する遊離のＡＳＲは多くなった。

【００８４】上記混合物を直ちにプレフィルター中およ
び固相物質上に注いだ。該固相物質上にはリガンド特異
的捕捉試薬が固定化されており、ＡＳＲを固相上のリガ
ンド特異的捕捉試薬に結合させることができた。プレフ
ィルターを除去し、固相を塩酸グアニジンおよびツイー
ン２０で洗浄した。

【００８５】この固相物質に上記工程（ｃ）で得た指示
試薬（２００μｌ）を接触させて、固定化ＡＳＲの分析
対象物成分に指示試薬を結合させ指示試薬と固相物質上
の捕捉試薬との間にＡＳＲをサンドイッチさせた。試料
中に分析対象物が存在していない場合はＡＳＲは第一特
異的結合成分と捕捉試薬との間にすでにサンドイッチさ
れており、指示試薬は結合する部分がなくて固相物質に
結合せずに流れ落ちてしまった。固相物質を再び洗浄（
塩酸グアニジンおよびトリトンＸ−１００の溶液で）し
て未反応指示試薬を除去した。

【００８６】３滴の酵素基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を固
相に適用した。表２は、異なるモルヒネ濃度を有する試
料について行ったアッセイの結果を示す。閾値量のモル
ヒネが試料中に存在しておれば、基質は固相上に固定化
された指示試薬と反応し、シグナルが生成した。閾値量
未満のモルヒネが試料中に存在している場合には、固相
上に指示試薬は存在せず、基質は反応することができな
かった。 　　　　　　表２（モルヒネイムノアッセイの結果）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　試料濃度（ｎｇ／ｍｌ）微細粒子の希
釈　　　０　　１００　　２００　　３５０　　６００
　　１０００　　３７５０　　１：９　　　　　　　　
　−　　　　−　　　　　　−　　　　　＋＋　　　　
＋＋　　　　　＋＋　　　　　　＋＋（注）−：発色せ
ず；＋＋：強い発色

【００８７】実施例３（ポリスチレンビーズを用いたモ
ルヒネのエンザイムイムノアッセイ） 本アッセイにおいては、実施例２（ａ）〜（ｄ）の試薬
を用いた。（ａ）ポリスチレンビーズ上の捕捉試薬：本
実施例においては、実施例２（ｄ）の抗フルオレセイン
抗体捕捉試薬をポリスチレンビーズ（０．２５インチ）
固相に共有結合的に結合させた。抗体のビーズへのカッ
プリングは下記方法により行った。ビーズの重量を計り
、１５％プロパノール溶液中、室温にて一夜洗浄した。 ついで、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）
中でビーズを３回洗浄した。ついで、ビーズに抗体（２
５μｌ）およびＰＢＳ（２４．７５ｍｌ）を加え、混合
物を室温にて一夜混合した。コーティング溶液１ｍｌ当
たり約３０μｇの抗体が得られるように、計算した。

【００８８】上記ビーズを再びＰＢＳ中で３回洗浄した
。ついで、ビーズをＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１
００の混合物中、４０℃にて１時間インキュベートした
。インキュベート後、ビーズをＰＢＳ中で３回洗浄した
。ついで、ビーズをＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン
混合物中、４０℃にて１時間インキュベートした。イン
キュベート後、ビーズを再びＰＢＳ中で３回洗浄した。 ついで、ビーズをＰＢＳ中の５％ショ糖混合物中、室温
にて２０分間インキュベートした。ついで、ビーズの水
気を切り、一夜乾燥させた。

【００８９】（ｂ）モルヒネイムノアッセイプロトコー
ル：２つの試料溶液（各２００μｌ）、すなわち０ｎｇ
／ｍｌの硫酸モルヒネ溶液および１０００ｎｇ／ｍｌの
硫酸モルヒネ溶液を試験した。第一特異的結合試薬であ
る抗オピアト抗体（６００μｌ、実施例２（ａ））を試
験管中の各溶液に加え、穏やかに撹拌した。モルヒネ／
フルオレセインＡＳＲ（２００μｌ、実施例２（ｂ））
を各試験管に加え、混合した。上記工程（ａ）に記載の
ようにして調製しリガンド特異的捕捉試薬を固定化した
ビーズを各試験管に加え、室温で５分間インキュベート
した。ついで、上記溶液を注いで除去し、ビーズを３回
洗浄した。 分析対象物特異的指示試薬（２００μｌ、実施例２（ｃ
））を各試験管に加え、室温で５分間インキュベートし
た。 ついで、指示試薬を注いで除去し、ビーズを再び３回洗
浄した。これらビーズを新たな試験管に移し、５滴のＮ
ＢＴ／ＢＣＩＰ基質を各試験管に加えた。１分以内に１
０００ｎｇ／ｍｌ試験管中のビーズの表面で発色が始ま
った。０ｎｇ／ｍｌ試験管は発色しなかった。

【００９０】実施例４（界面活性剤処理した指示試薬を
用いたイムノアッセイ） 界面活性剤を含有しない緩衝溶液を用いる他は実質的に
実施例２（ｃ）に記載の方法に従って調製したモルヒネ
アッセイ指示試薬を用いて下記アッセイを行った。その
代わり、界面活性剤（ツイーン２０）を別に指示試薬に
加えて約４．０％（ｗ／ｖ）の濃度（すなわち、指示試
薬１ｍｌ当たり約２滴の界面活性剤）とした。アッセイ
には界面活性剤処理指示試薬かまたは非処理指示試薬を
用い、フロー−スルー固相を用いて実質的に実施例２（
ｆ）に記載のプロトコールに従ってアッセイを行った。 指示試薬は、界面活性剤添加前に実質的に不活性となっ
た。モルヒネ試料は、ヒト尿中に所定量のモルヒネを含
んでいた。アッセイの結果を表３に示す。

【００９１】 　　　　　　表３（界面活性剤処理および非処理のモル
ヒネ指示試薬を比較したアッセイ結果） モルヒネ（ｎｇ／ｍｌ）　　　　界面活性剤非処理　　
　　　　界面活性剤処理　　　　　　０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　−　　　　１０００　　　　　
　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＋＋（注）−：発色なし；＋：わずか
な発色；＋＋：強い発色

【００９２】表３に示すように
、０モルヒネ試料ではいずれの指示試薬とも発色しなか
った。モルヒネ含有試料では、界面活性剤非処理指示試
薬を用いた場合、１分後にわずかな発色のみが認められ
た。しかしながら、界面活性剤処理指示試薬を用いた場
合は、非常に強い発色が認められ、しかも発色にはわず
か１５秒後しか必要ではなかった。表４は、バックグラ
ウンドの発色と、異なる濃度の界面活性剤を含有する指
示試薬調製物を用いてアッセイしたシグナル発色との比
較を示す。これら調製物を調製するのに用いた指示試薬
は、界面活性剤の添加前に不活性となった。アッセイは
実質的に実施例２（ｆ）に記載のプロトコールに従って
行った。モルヒネ試料は、ヒト尿中のモルヒネ（１００
０ｎｇ／ｍｌ）を含んでいた。

【００９３】 　　　　　　表４（異なる量の界面活性剤を含有する指
示試薬を用いたアッセイ結果）指示試薬中の界面活性剤
（ｗ／ｖ）　　　　バックグラウンド　　　　アッセイ
結果　　　　　　　　０．６２５％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　
　　　　＋＋　　　　　　　　　１．２５％　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　　２．５％　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　　　　
〜４．０％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　＋＋（注）
−：発色なし；＋：わずかな発色；＋＋：強い発色表４
に示すように、低量の界面活性剤を用いた場合にはガラ
ス繊維パッド上で高いバックグラウンド発色が起こるこ
とが結果により示された。しかしながら、約４．０％の
濃度のツイーン２０を指示試薬に加えると、バックグラ
ウンドの発色は０となった。しかしながら、指示試薬の
活性を回復するのに必要な界面活性剤の量は指示試薬の
活性を維持するのに必要な界面活性剤の量よりも大きい
ことを理解する必要がある。

【００９４】本発明の分析対象物置換試薬（ＡＳＲ）を
用いることにより競合／サンドイッチアッセイの組み合
わせを行うことができ、実質的にあらゆる結合アッセイ
に適用することが可能である。ＡＳＲは一価の分析対象
物のアッセイに使用するのが特に有利であるが、サンド
イッチまたは免疫測定（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）ア
ッセイ読み取りが望ましい場合はいずれも用いることが
可能である。当業者であれば、本発明の発明概念を適用
することが可能な、他のアッセイ法（間接アッセイ、抑
制アッセイなど）並びに多価分析対象物のアッセイを考
えることができるであろう。上記態様および別の態様は
例示にすぎず、本発明を限定するものではない。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定する方法であって 、（ａ）試料を （ｉ）リガンド成分に結合した分析対象物成分からなる
   分析対象物置換試薬であって、該分析対象物成分は分析
   対象物と共通する少なくとも１つのエピトープを有して
   いて分析対象物特異的結合成分と結合し、該リガンド成
   分はリガンド特異的結合成分とは結合するが分析対象物
   特異的結合成分とは反応しない試薬、および（ｉｉ）試
   料の分析対象物および該分析対象物成分の両方に存在す
   るエピトープと結合し得る第一特異的結合成分と順番に
   または同時に接触させて、分析対象物／第一特異的結合
   成分複合体、分析対象物置換試薬／第一特異的結合成分
   複合体および未結合の分析対象物置換試薬からなる混合
   物を生成させ、 （ｂ）該混合物を （ｉ）該分析対象物置換試薬に特異的な第二結合成分か
   らなる捕捉試薬、および （ｉｉ）検出可能なシグナルを生成し得る標識および該
   分析対象物置換試薬に直接または間接に結合する第三特
   異的結合成分からなる指示試薬と順番または同時に接触
   させることにより、該捕捉試薬および該指示試薬と該分
   析対象物置換試薬とから検出可能な複合体を生成させ、
   ついで （ｃ）該複合体に結合した該標識、または該複合体と結
   合しなかった該指示試薬の量を検出することにより、試
   料中の分析対象物の存在または量を決定することを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】　　捕捉試薬が分析対象物置換試薬のリガ
   ンド成分に特異的であり、指示試薬が分析対象物置換試
   薬の分析対象物成分に特異的である、請求項１に記載の
   方法。
3. 【請求項３】　　分析対象物置換試薬／第一特異的結合
   成分として分析対象物置換試薬が第一特異的結合成分に
   前以て結合しており、分析対象物が試料中に存在する場
   合に該分析対象物置換試薬が該分析対象物置換試薬／第
   一特異的結合成分複合体から置換される、請求項１に記
   載の方法。
4. 【請求項４】　　捕捉試薬が分析対象物置換試薬の分析
   対象物成分に特異的であり、指示試薬が分析対象物置換
   試薬のリガンド成分に特異的であり、分析対象物が２以
   上の特異的結合成分と同時に結合しない、請求項１に記
   載の方法。
5. 【請求項５】　　捕捉試薬を固相物質に直接または間接
   に固定化させることにより、該複合体を該固相物質に固
   定化させる、請求項１、２、３または４に記載の方法。
6. 【請求項６】　　指示試薬を分析対象物置換試薬に間接
   的に結合させるか、または捕捉試薬を固相に間接的に結
   合させるための少なくとも１つの補助特異的結合成分を
   加えることをさらに含む、請求項１、２、３、４または
   ５に記載の方法。
7. 【請求項７】　　異なる分析対象物成分および共通のリ
   ガンド成分を有し捕捉試薬が該分析対象物置換試薬の該
   リガンド成分に特異的であるか、または異なる分析対象
   物成分および異なるリガンド成分を有し捕捉試薬が該分
   析対象物置換試薬の該リガンド成分に特異的である、複
   数の分析対象物置換試薬を用い、２以上の分析対象物を
   アッセイするためのものである、請求項１、２、３、４
   、５または６に記載の方法。
8. 【請求項８】　　請求項１、２、３、４、５、６または
   ７に記載の方法に使用するための、試料中の分析対象物
   の存在または量を決定するための装置であって、検出部
   位を有する固相からなり、分析対象物置換試薬が固定化
   捕捉試薬に直接または間接に結合する、ことを特徴とす
   る装置。
9. 【請求項９】　　試料中の分析対象物の存在または量を
   決定するための装置であって、 （ａ）分析対象物および分析対象物置換試薬を第一特異
   的結合成分に結合させるための第一反応部位であって、
   （ｉ）該分析対象物置換試薬はリガンド成分に結合した
   分析対象物成分からなり、該分析対象物成分は分析対象
   物と共通する少なくとも１つのエピトープを有していて
   分析対象物特異的結合成分と結合し、該リガンド成分は
   リガンド特異的結合成分とは結合し得るが分析対象物特
   異的結合成分とは結合し得ず、 （ｉｉ）該第一特異的結合成分は試料の分析対象物およ
   び該分析対象物成分の両方に存在するエピトープと結合
   することができ分析対象物／第一特異的結合成分複合体
   、分析対象物置換試薬／第一特異的結合成分複合体およ
   び未結合の分析対象物置換試薬からなる混合物を生成す
   るもの、および （ｂ）該分析対象物置換試薬に特異的な第二特異的結合
   成分からなる捕捉試薬と該混合物が反応する第二反応部
   位からなることを特徴とする装置。
10. 【請求項１０】　　請求項１、２、３、４、５、６、７
    、８または９に記載の方法または装置に使用するための
    、試料中の分析対象物の存在または量を決定するための
    キットであって、 （ａ）リガンド成分に結合した分析対象物成分からなる
    分析対象物置換試薬であって、該分析対象物成分は分析
    対象物と共通する少なくとも１つのエピトープを有して
    いて分析対象物特異的結合成分と結合し、該リガンド成
    分はリガンド特異的結合成分とは結合するが分析対象物
    特異的結合成分とは反応しない試薬、 （ｂ）試料の分析対象物および該分析対象物成分の両方
    に存在するエピトープと結合し得る第一特異的結合成分
    、および （ｃ）該分析対象物置換試薬に特異的な第二特異的結合
    成分からなる捕捉試薬からなることを特徴とするキット
    。