JPS6027860A - アツセイ用の色原体トレ−サ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液たとえば血清、痰、尿および脳を髄液を
含む液体試料中のハプテン、抗原および抗体（以下”被
分析体（ａｎａｌｙｔｅ）　”と呼ぶ）を測定するため
の非同位元素によるアッセイに用いられる改良された組
成物に関する。特に本発明は螢光アッセイ、およびこの
種の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ’ｅ）の調製法、ならび
に改良されたアッセイ法、および試験用キットに関する
。

イムノアッセイ法は一般に、特定の被分析体（試料中に
おけるその量を測定されるべきもの）と、既知の量の標
識された形の被分析体またはその適宜な同族体（トレー
サー）との間における、被分析体およびトレーサーの双
方に対し特異的な結合剤上にある限られた数の結合部位
に対する競合に基づ（。たとえば未知の量の被分析体、
既知の量のトレーサー、および限られた既知の量の結合
剤よりなる系において、試料中の被分析体の濃度が高い
ほどより少ない量のトレーサーが結合剤に結合するであ
ろう。

トレーサーおよび結合剤の量が固定されており、唯一の
変数が被分析体の量であるならば、系の結合したトレー
サーの量および／または遊離トレーサーの量を測定する
ことにより未知の量の被分析体を測定する検定系を確立
することができる。慣用される標識には放射性同位元素
、螢光色素および酵素が含まれる。放射性同位元素の活
性、色素の螢光強度、または基質に対する酵素の活性を
、同一方法で処理されたある範囲の既知の量の被検体に
より与えられる値と比較する。標準試料の測定により得
た値を用いて特定の系に関する検量線を確立し、次いで
この検量線を用いて未知試料中の未知の被分析体ｍ　ｒ
ａ’、を判定する。

標識されたりガントおよび標識されていないリガンドを
用いるために６柚の自動フロースルーシステムを採用−
［ることもできる。トレーサーをカラム中の吸着剤に結
合させ、これを種々のパターンで溶喘するフロースルー
システムを用いて特定の系に関して標準検量線を確立し
１次いでこれらの検量線を用いて試料中の未知の被分析
体濃度を判定することができる。

イムノアッセイは、測定すべき被分析体の着が少ないた
め感度が非常に重要な分野である。ラジオイムノアッセ
イはりガントを放射性同位元素で比較的容易に標識する
ことができるため、広く用いられている。しかしラジオ
イムノアッセイの感度は、約１０−１２　Ｍに限られて
おり、より多くの場合わずか１０−８〜１０−１０Ｍの
範囲に限られている。

さらに放射性標識は半減期が短かいという障害および取
扱いの危険性により支障がある。イムノアッセイの分野
では非同位元素イムノアッセイ法を開発する傾向にある
。

螢光アッセイ法の感度は理論的にはきわめて高いが、し
ば１７ば非特異螢光（バックグラウンド）の存在により
制限される。多くの場合、希望する感度を得るのに十分
なほどパックグラウンド９を少なくすることは不可能で
ある。本発明はきわめて感度が高く、かつ螢光分析の採
用に際して直面している多くの問題を解決する螢光複合
体を提供することを目的とする。

米国特許第４，２６８，６６３号明細書〔スコールド（
ＳｋＯｌｄ）１には、グリコシダーゼ基質として用いら
れる高分子組成物が記載されている。これらのグリコシ
ダーゼ基質には、グリコシジル基により置換された発色
団を高分子本体に結合させるためのスペーサーアームが
用いられる。このスペーサーアームは、アッセイ媒質中
の被分析体の量に関して信号を調整するために立体的排
他をもたらすのに用いられる。

米国特許第４．５２９，４６１号明細書〔カンナ（Ｋｈ
ａｎｎａ）　ｌには、下記式の螢光甲状腺ホルモン複合
体が記載されている。

上記式中 Ａは化合物の螢光効率または物理的特性、特に水溶性に
有害な作用を与えないいずれかの基であり；Ａは普通は
水素東予、アルキル基、ハロゲン原子（特に原子番号９
〜５３のもの、殊に原子番号１７〜３５のもの）、およ
び置換アルキル基であり、ここでアルキル基は前記のハ
ロゲン原子により、また原子番′＠８〜１６のカルコゲ
ン（酸素原子およびイオウ原子）（たとえば水酸基、メ
ルカプト基、１〜２個の炭素原子をもつオキシエーテル
基、または１〜２個の炭素原子をもつチオエーテル基、
または１〜２個の炭素原子をもつ非オキソカルボニル基
、特にカルボキシ基、アルコキシ部分の炭素原子数が１
〜２のアルコキシカルボニル基、またはカルボキシアミ
ドとしてのカルコゲン）により置換されていてもよく、
置換基の総数は普通は１〜４、より普通には１〜２であ
り、ここでアルキル基は１〜６個、より普通には１〜２
個の炭素原子をもつものである。

本発明の一観点によれば、特定のス４−サー基を介して
リガンドに結合し、アッセイに用いられるトレーサーを
与える色原体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）よりなる複合体が
提供される。

本発明の他の観点傾よれば、トレーサーが特定のスペー
サー基を介してリガンドに結合した色原体よりなる複合
体である、被分析体のアッセイ法が提供される□ 本発明のさらに他の観点によれば、被分析体のアッセイ
に用いられるアッセイキットが提供され、このキットに
は特定のスペーサー基を介してリガンドに結合した色原
体の複合体がトレーサーとして含まれる。

より詳細には、上記トレーサーはジカルボン酸から誘導
されるスペーサー基を介してリガンドに連結ないしは結
合した色原体よりなる。

ス４−サー基は下記構造式の一つにより表わすことがで
きる： これらの式中、Ｒは１個（好ましくは少な（とも２個）
ないし１３個の炭素原子をもつ置換された、または置換
されていない２価の脂肪族炭化水素残基であり、Ｒが置
換されている場合、置換基は好ましくは親水性の基、た
とえば水酸基、カルボキシル基、アミノまたはチオであ
る。

本発明により製造されるトレーサーは下記の構造式によ
り表わされる： ０ 山Ａ−へ−Ｒ−δ−Ｂ これらの式中、Ｒは先に定義されたものであり、Ａは色
原体およびリガンドの一方であり、Ｂは色原体またはり
ガンどの他方である。

上記複合体の製造に際し、スペーサー基がそのカルボニ
ル基を介して結合している場合、これに結合している色
原体またはりガントはこのカルボニル基に結合して複合
体を形成しうる置換基、特にアミノ基または水酸基をも
つ。同様にスは−サー基がそのヒト９ラジド基を介して
結合している場合、これに結合している色原体またはり
ガントはこのヒドラジド基と結合しうる置換基；特にカ
ルボニル基をもつ。

このように上記トレーサーはマーカーとしての機能を有
する色原体、好ましくは螢光性化合物を含み、この色原
体は前記の型のスペーサー基を介してリガンドに結合し
ている。

ここで用いられる”被分析体（ａｎａｌｙｔｅ）”とい
う語は、アッセイされるべきハプテン、抗原または抗体
を表わす。

ここで用いられる”リガンドという語はハシテン、抗原
または抗体を表わす。被分析体のアッセイに際しては、
被分析体に応じてトレーサーとして用いられる複合体の
一部であ３リガンドは、被分析体、被分析体の適宜な同
族体、または被分析体の結合剤である。

ここで用いられる“適宜な同族体”という語は、被分析
体のアッセイに用いられる結合剤により結合する被分析
体の同族体を表わす。

トレーサーの識別可能なマーカーとして用いられる色原
体は、吸光性の色素、好ましくは螢光を発する吸光性色
素（螢光化合物）である。非螢光性色原体を用いること
もできる。螢光化合物は。

スペーサー基のヒト９ラジト９基またはカルボニル基と
結合してリガント０との複合体を生成することができる
置換基を含むかまたはそのような基を付与されたもので
ある。色原体は通常は縮合した芳香族化合物または縮合
しない芳香族化合物である。

螢光化合物の代表的な部類として、たとえばフルオレセ
イン類、ローダミン類、クマリン類、アミノナフタレン
誘導体（ダンシル化合物、　ｄａｎｓｙｌｃｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ）、カルボシアニン類、インドール類、レタニド
（ｌａｔｈａｎｉｄｅ）キレート類などがあげられる。

感度の点で螢光性マーカーとして用いるために特に興味
深いものはフルオレセイン色素類、特にフルオレセイン
アミンである。

本発明によりリガンドに結合させるための適切な螢光性
マーカーの選択は、ここに教示するものから当業者がな
しうる範囲内にある。

本発明によりトレーサーを製造する際には、Ｒは６個よ
りも多い炭素原子を含まず、最も好ましくはアルキレン
である。スペーサー基がコノ・り酸または無水コハク酸
から誘導される場合（すなわちＲが一〇Ｈ２−（３Ｈ２
−である場合）、特に好ましい結果が得られる。

上記の型の、ジカルボン酸から誘導されたスは一す−基
を介してリガンドに結合した色原体よりなる複合体は、
上記の型の結合を生成するための当業界で既知の各種の
方法のいずれかにより、スペーサー基を螢光化合物およ
びリガント９双方に連結ないしは結合させることにより
製造できる。

たとえばペプチド結合は、活性エステル法により形成で
きる。これらの方法は当技術分野で周知であるので、本
発明を完全に理解するためにこれに関してこれ以上詳述
する必要はないと思われる。

本発明のトレーサーは各種の被分析体のいずれのアッセ
イに際しても用いることができる。本発明によりアッセ
イすることができる被分析体は。

好ましくは約６，０００までの分子量をもつものであり
、本発明は約２，０００までの分子量をもつ被分析体に
特に適している。たとえば本発明は特に低分子量のホル
モンおよび薬剤のアッセイに用いることができ、ジゴキ
シンのアッセイに際して特に良好な結果が得られる。

被分析体がハプテンまたは抗原である場合、アッセイに
用いられる結合剤は被分析体に対し特異的な結合部位１
個または２個以上をもつ抗体または天然物質であっても
よ（、被分析体が抗体である場合、結合剤は抗体に対す
る抗原または被分析体に反応して誘導される抗体であっ
てもよい。

適切な結合剤の選択は当業者のなしうる範囲内にあると
思われ、本発明を完全に理解するためにこの点に関して
これ以上詳述する必要はないと思われる。

アッセイに際して、アッセイに用いられるトレーサーの
りガント部分は、採用されるアッセイの種類により定め
られる。たとえばアッセイが抗原またはハプテンである
被分析体のためのものである場合、トレーサーのりガン
ト°部分はアッセイすべき抗原もしくはハプテンまたは
それらの適宜な同族体である。あるいは、トレーサーの
りガント部分はアッセイすべきハプテンまたは抗原の結
合剤であってもよく、この場合アッセイはトレーサーが
トレーサーに特異的な結合部位に結合することを被分析
体が阻止するように計画される。

被分析体が抗体である場合、トレーサーのりガント部分
が抗体またはその適宜な同族体であってもよく、この場
合抗体およびトレーサーの双方が被分析抗体およびトレ
ーサーの双方に対して特異的な、制限された数の結合部
位に関して競合するであろう。あるいは、トレーサーの
りガント９部分が被分析抗体に対する抗原、または被分
析抗体に反応して誘導される抗体であってもよく、この
場合被分析抗体はトレーサーがこのトレーサーに対して
特異的な結合部位に結合するのを阻止する。

被分析体をいわゆる“サンドイッチ型”のアッセイによ
り分析すべき場合には、トレーサーのりガント部分が被
分析体に対し特異的な結合部位をもち、この被分析体は
複数の決定部位をもつ。

トレーサーのりガント９部分として用いられる適切なり
ガント９の選択は、ここに教示された技術から当業者が
なしうる範囲にあると思われ、従って本発明を完全に理
解するためにこの点に関してこれ以上詳述する必要はな
いと思われる。

本発明のトレーサーは、色原体特に螢光化合物をマーカ
ーとして用いることかできる広範なアッセイのいずれに
用いろこともできる。たとえばトＶ−サーヲ同相アッセ
イ、フロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）型アッセ
イまたは均質アッセイに用いることができ、このトレー
サーは特にフロースルー型アッセイに用いるのに適して
いる。

当技術分野で知られているように、フロースルー型アッ
セイの一様式の場合、被分析体およびトレーサーを（−
緒に、または）願次）室内を流通させる。この室内には
固体支持体上に支持されたトレーサー用結合剤が含まれ
、これによりトレーサーと被分析体が結合部位に関して
競合する。他の型の７０−スルー型アッセイの場合はま
ストレーサーと被分析体を被分析体およびトレーサーに
対する結合剤と接触させ、この結合剤に結合した被分析
体およびトレーサーならびに遊離の被分析体およびトレ
ーサーを含む生成混合物を、固体支持体上に支持された
分離剤たとえばトレーサーに対する吸着剤または結合剤
（たとえば抗体）を含む室内を流通させる。これにより
該室内で遊離のトレーサーのみが主として分離剤により
結合または吸着され、既に結合剤に結合したトレーサー
はこの室内を通過する。

いずれの場合も、室内に残存するトレーサーおよび／ま
たは室内を通過するトレーサーがアッセイすべき試料中
の被分析体の瞼の尺度として用いられる。

この種の７０−スルー型アッセイにおいては遊離のトレ
ーサーが室内で結合剤または分離剤と接触する時間は給
く僅かである。本発明者らは本発明のトレーサーがこの
種の７０−スルーＷアッセイに有効に用いられることを
見出した。すなわち本発明のトレーサーは室内で結合剤
および／または分離剤と速やかに結合する。

本発明のトレ−サーはフロースルー型アッセイに特に適
しているが、これらのトレーサーは上記の他のアッセイ
にも適している。これらのトレーサーハフロースルー型
および他の型双方のアッセイに関して、非特異的結合が
減少し、トレーサーの螢光部分の不都合な消失が避けら
れ、一方ではトレーサーのリガント９部分の結合能は保
持されるという利点をさらに与える。さらに、これらの
トレーサーは容易に製造され、かつ良好な感度をもつＯ 以上のように、本発明の好ましい実施態様によればジゴ
キシンのアッセイに用いられるトレーサーが得られる。

下記のものはこの種のアッセイに用いられる好ましいト
レーサーである。

たとえばジゴキシンについて採用されるフロースルーア
ッセイの場合、ジゴキシンを含有すると考えられる試料
をジゴキシンの結合剤（抗体）および本発明によるジゴ
キシントレーサーと共にインキュベートし、これにより
トレーサーと被分析体ジゴキシンを抗体上の結合部位に
関して競合させる。次いでこの混合物を、固体支持体上
にジゴキシン抗体が支持されている室内を流通させる。

これにより、あらかじめ結合したトレーサーは室内を通
過し、未結合のトレーサーは室内に支持された抗体によ
り結合する。室内で結合したトレーサーの量は、試料中
の被分析体ジゴキシンの綱に正比例する。従って試料中
の被分析体ジゴキシンの１は、室内を西過したトレーサ
ーおよび／または室内で結合したトレーサーの縦を測定
し、この値を既知の量の被分析体ジゴキシンを含む試料
について得た値と比較することにより測定できる。

ジゴキシンのアッセイに関してアッセイ法を記述したが
、本発明はこの種のアッセイに限定されるものではない
。同様に、結合した成分と遊離成分を分離するための結
合剤を含むフロースルー室内ニおけるフロースルー型ア
ッセイに関して好ましい実施態様を記述したが、本発明
はこの種のアッセイに限定されるべきでない。たとえば
本発明は、結合剤（たとえば抗体）がフロースルー室内
の固体支持体に支持されたフロースルー型アッセイにも
適用できる。

また本発明は、本発明のトレーサー、たとえば下記のト
レーサーを用いることによりＴ４のアラフロースルー型
アッセイに関して実施態様を記述したが、本発明は他の
型のアッセイ、たとえば均質アッセイ、固相アッセイな
どにも利用できると解すべきである。

本発明の他の観点によれば、本発明のトレーサーを用い
るアッセイを行うための試薬のキットまたは包装品が提
供される。キットには特定の成分として上記の型のトレ
ーサー、およびアッセイすべき被分析体に対する結合剤
（特に抗体）が含まれ、この結合剤は固体支持体上に支
持された、または支持されていない形で存在する。キツ
Ｈ＆分は、適当であれば試薬のキットまたは包装品中で
別個の容器、たとえばバイアルに入れられる。キットに
は他の成分たとえば被分析体の標準液（既知の濃度の被
分析体、緩衝剤などを含む被分析体試料）が含まれてい
てもよい。

本発明は下記の実倫例に関してさらに記述されるであろ
うが、これにより本発明の範囲が限定されるべきではな
い。

特に指示しない限り、温度はすべて℃であり、％および
部は液体混合物の場合容量によることを除いてすべて重
量による。下記の略号を用いる。

ｍｌ＝ミリリットル　μ＝ミクロン ｇ＝グラム　１＝センナメートル ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー 關＝ミリメートリ　■−ミリグラム Ｒｔ＝移動率　）Ｔ　＝規定度 Ｍ−モル５１８１　Ａ＝オングストローム１−ＢＯＧ＝
３級ブチルオキシカルボニルＦＩＴＯ＝フルオレセイン
イソチオシアネートＤＴＡＦ　＝　）クロルトリアジニ
ルアミノフルオレセインＭｅＯＨ＝メタノール ＥｔＯＡｃ　＝酢酸エチル ＣＨＯ１３＝クロロホルム ＣＨ２０１２−ジクロルメタン ＴＨＦ　＝テトラヒドロンラン ＨＯＡｃ　＝酢酸 ＭｇＳＯ４＝硫酸マグネシウム Ｎａ２ＳＯ４＝硫酸ナトリウム ＮａＨＣＯ３＝炭酸水素ナトリウム Ｈ２０＝水 実施例　１ フルオレセインアミン−９（キシゲニン複合体フルオレ
セインアミン（異性体１１　）　（３，４７ＩＩ。

１０．０ミリモル）を乾燥ピリジン５０１１Ｌｔ　に溶
解し、溶液な０°に冷却した。急激に攪拌されている溶
液に塩化３−カルボメトキシプロピオニル３．０１．９
（２０，０ミリモル）を添加し、１．０時間後にトリエ
チルアミン１．０１．９（１０，０ミリモル）を添加し
た。上記酸塩化物１．５１．９（１０，ＯミＩＪそル）
の添加を最初の添加の２．０時間後に行い、得られた混
合物を一夜放蓋した。反応混合物を蒸発させ、残渣を１
Ｍ−ＨＣｌ１５Ｑ＊／およびＥｔＯＡｃ　１５　Ｑｄで
処理した。有機相を分離し、プラインで洗浄し。

乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。この粗生成物
（Ｉ）をさらに精製することな（用いた。

粗エステル（１）をＭｅＯＨ７Ｑ　ｍｌに溶解し、Ｍｅ
ＯＨ５０づ中のヒドラジン水化物２５ｒｙｉｌの溶液を
攪拌下に添加した。反応混合物を室温で１．０時間攪拌
し、揮発性物質を蒸発により除去した。残存する残渣を
水に溶解し、クエン酸を添加して生成物を沈殿させた。

得られた懸濁液をＥｔｏＡｃで抽出し。

層を分離し、　ＥｉＯＡｃ層を水で抽出し、ワットマン
ＰＳ−１Ｆ紙により濾過し、蒸発させて粗生成物を得た
。この物質なＭｅＯＨに入れ、少量のシリカゲルを添加
し、溶剤を蒸発させた。シリカに吸着された生成物を、
シリカゲルのカラム上で最初ゆ５％ＭｅＯＨ／　ＣＨＣ
ｌ３により溶離するクロマトグラフィー処理した。生成
物が溶離するまで溶離液の極性（ＭｅＯＨの％）を高め
た。これによって、２０％ＭｅＯＨ／　ＧＨＧｌ　３で
展開した際のＲｆ（シリカゲル）値が０．１４の赤橙色
粉末として比較的純粋なヒドラジド誘導体が単離された
。

このヒドラジ）’（［１（３０，６即、０．０７００ミ
リモル）および３−ケトシボキシゲニン（１１，５１ｖ
−０，０３００ミリモル）をＭｅＯＨ１，０ｍｊ　に溶
解し。

反応混合物を１．０時間放置した。次いで反応液の半量
を過剰の固体ナトリウムシアノボロヒドリト９で処理し
、反応混合物を数日間放置した。蒸発ののち残渣を２０
Ｘ２０ｃＩＩＬのシリカゲルプレート上での調製用薄層
クロマトグラフィーにより精製した（１．０７ｑｍ、ア
ナルテック社、２０％ＭｅＯＨ／ＧＨＧ１３　）。主バ
ンドを単離し、２０Ｘ２０鑞の分析用シリカゲルプレー
ト５枚で再クロマドグ２フイー処理しく溶離剤、２０％
ＭｅＯＨ／　ＣＨＯＩ　ｇ　）　、高Ｒｔ成分１．４５
１ｎ？および低Ｒｆ成分１．９０　ｍ９を得た。

高い方のＲｆ値をもつ複合体はバイオアッセイ系におい
て著しい結合を示した。５．５　ｃｍの距離にわたって
走行する両バンドのＲｆ値は等しかった二０．５５（２
０％ＭｅＯＨ／　０Ｈ（Ｊ　３中で展開）。

前記の構造式■をもつＴ４　トレーサーは実権例１１７
）エステル（Ｉｔから、カルボキシル部分を活性エステ
ル形に変え、次いで当技術分野で既知の方法を用いてＬ
−チロキシンと反応させることにより製造できる。

実施例１のジゴキシントレーサーは下記の実施例２に記
載のアッセイに用いることができる。このアッセイはベ
クトン・デイツキンソン・イムノダイアグノスティック
ス社によりＡＲＩＡの商標で市販されている自動装置に
関して配達される。

実施例　２ ジゴキシンのアッセイ ■、　試薬 １、吸着緩衝液４＋５、ｐＨ７４゜ ＡＲＩＡ試薬−カタログ４６１４３３５゜リン酸塩、塩
化ナトリウムおよび防腐剤を含む。

２、溶離緩衝液４１−４、ｐＨ１０，２゜ＡＲＩＡ試薬
−カタログ鷹６１４２１１Ｐ０５０％メチルアルコール
、グリシン緩衝剤および防腐剤を含む。

３、ジゴキシン標準液 ＡＲＩＡ試薬−カタログ４６１２８３９゜防腐剤を含む
安定化されたヒト血漿中にジゴキシンを含む。

４、ジゴキシン抗体室 ＡＲＩＡ試薬−カタログ４６３０５１９゜セルロースに
共有結合したジゴキシン抗体を含む。

５、クゴキシンー螢光トレーサー（実施例１のトレーサ
ー） 吸着緩衝液４Ｐ５、ｐＨ７，４（試薬＋１）中に希釈さ
れたもの。

６、ジゴキシン多クローン抗体 吸着緩衝液＋５、ｐＨ７，４（試薬＋−１）中に希釈さ
れたもの。

Ｚ　蒸留水 ■、装置の組立て １、　ディスク２をディスク読取器に挿入する。

ファイル２７をコンピューターに読み取らせる。

２、全操作に十分な量を含む試薬びんを下記のように装
置に乗せる。

青キャップー吸着緩衝液≠５．ｐＨ７，４（試薬＋、１
）。

黄キャップー蒸留水（試薬＋７）。

赤キャップー溶離緩衝液＋４．７’Ｈ１０，２（試薬≠
２）。

緑リングージゴキシン螢光トレーサー（試薬＋５）。

褐色リング−ジゴキシン多クローン抗体（試薬≠６）。

３、　β／γ弁がγの位：燈に引かれていることを確認
する。

４、Ｇ−Ｈ弁がＨの位置に引かれていることを確認する
。

５、これが第１回のジゴキシン試験であるならば、始動
ブランク２蘭を抗体および予備フィルターの位置に挿入
し、始動ルーティン操作を行う（ＯＰコード９）。

６、始動終了後に始動ブランクを取り除き、２個の抗体
室を抗体および予備フィルターの位置に接続する。

７１２５μｌの標準液対照および患者試料を試料カップ
にピペットで測り入れ、円錐形ギャップでふたをする。

８、回転台に下記のように試料カップを乗せる。

内輪： 位置番号　内容 −Ｘ−１０１ゼロ標準液３５０μ１ １０２．１０３　吸着緩衝液　＋５ １０４−　Ｉ　Ｑ　６　−ｔ！　Ｔ：１標準液１０７　
、１０８　０．５＋ｖ／ｍｇ標準液１０９．１１０　１
．０Ｉｎｙ／ｍｌ標準液１１１．１１２　２．０■／ｍ
Ａ標準液１１３．１１４　４．０η／ｍＥ標準液１１５
　、１１６　８．０ｉｎ９／ｆｆｌ／ｌ”漂準液１１８
−　患者試料 ■■最後１０カップ　吸着緩衝液　＋−５外輪： 全アッセイに十分な数の空の反応カップを置く。

■トレー丈−１試料、抗体および緩衝液を反応カップに
一度ピイツトで測り入れ。

試験を中断し、反応カップを取り出し、保存し、空の反
応カップと置き換える。

これを再度操り返す。二度目に機械を始動したときは、
試験は中断せずに続行する。位＃１０２および１０！１
からの緩衝液が一旦反応カツブに移行したら、これらの
反応カップを、予め機械により調製された最大結合試料
を与える反応カップ３個と置き換える。

≠≠最後１０個の緩衝液カップはそのアッセイにおいて
プログラムのギヤザー相（ｇａｔｈｅｒ　ｐｈａｓｅ）
を除くために用いられる。最初の２個は１００μｌの標
準液および５５．５１１１の吸着緩衝液≠５（血清ブラ
ンクに用いられる）を含む反応カップと置き換えられる
。

■、プログラミング １、新たな試薬にＯＰコード２０を捜す。

２、ＯＰコード１３を選ぶ；番号１０１から始め、最終
アッセイ試別番号で終える。

６、蝋終試料番号はアッセイ中にプレークーブレーク−
２−５（ＢＲＥＡＫ−Ｂ、ＲＥＡＫ−２−３）を用いて
変えることができる。

４、　アッセイはプレクーブレーク−２−６を用いて中
断することができる。

■、　試料の採取 抗体室を通過する試薬がすべて下記に従って採取される
ように、フラクションコレクターなＡＲＩＡにつなぐ。

試験管番号　内　容 １、　緩衝液　５．４　ｍＡ！ −）＋２．　溶出した試料９５０μ１ ６、　溶離緩衝液　９５０μｌ ■試験管２を取り、渦巻攪拌にかけ、螢光計で読み取る
。

■、螢光１１Ｊ定−ＰＥ　ＩＩｓ　５０Ａ、計測器の準
備 励起（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）＝４８８　ｎｍ／スリッ
ト＝１０発光（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）　＝５１５ｎｍ／ス
リット＝１５Ｂ、　ｆ’ｒｌＩ御部の時間（秒）ダイヤ
ルを用いて９５０μノの容量に合せる。約５本の試験管
に９５０μｌのグリシン−メタノール緩衝液、試料を満
たし、試料全体が気泡を含まずにキュはツ）Ｋ移動する
のに十分な時間吸引する〔真空ゲージを１７　ｐｓｉ　
（約１．２ｋｇ／ｃｍ２）とすべきである〕。

Ｃ０時間の遅れ６０秒において最初の最大結合試験管を
吸引し、計器の読みが約１２００となるように計測器を
調節する。

００時間の遅れを３０秒に設定し、残りの試験管を読み
増る。

■、計算 Ａ、各個を平均最大結合値から差し引く。これは−次結
合した（または可溶性結合した）画分に等しい正味の螢
光を与えるであろう。

Ｂ、Ａで得た各個をゼロ標準液の平均正味螢光で割って
Ｂ／Ｂｏ値をめる。

Ｃ０標準液に関するＢ／Ｂｏ値を対数方眼紙にプロット
し、未知試料のＮ−１キシン濃度を計算する。

■、注　釈 １、　試験管はすべてグリシン−メタノール緩衝液で９
５０μｌに希釈したトレーサー希釈液９４．７μ４を採
取することにより調製された。

これらは次式により最大カラム結合を測定するために用
いられる。

２、次式により可溶性抗体の結合率（％）を定める。

ゼロの正味螢光（−次結合） ”’　Ｍａｘ−Ｂｉｎｄ　”　Ｓ　、　Ｂ。

−ル緩衝液の螢光 上記の手法に関して、本発明の多数の修正および変更が
可能であり、従って特許請求の範囲内において本発明は
特定の記述以外の態様で実施することができる。

特許出願人　ベクトン・デイツキンソン・アンド・カン
Ｉ！二一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ジカルボン酸から誘導された下記の構造式％式％
   （）： （これらの式中、Ｒは１３個以下の炭素原子を有する置
   換されたおよび置換されていない２価の脂肪族炭化水素
   残基よりなる群から選ばれる）で表わされるスイーサー
   基を介してリガンドに結合した色原体からなるアッセイ
   用のトレーサ０ （２）色原体がフルオレセイン系色素である、特許請求
   の範囲第１項記載のトレーサー。 （３）Ｒが２個の炭素原子を有するアルキレン基である
   、特許請求の範囲第２項記載のトレーサ０ （４）トレーサーが下記の構造式： を竹する、特許請求の範囲第１項記載のトレーサー。 （５）　リガンドがジゴキシゲニンである、特許請求の
   範囲第１項記載のトレーサー。 （６）　リガンＰがＬ−チロキシンである、特許請求の
   範囲第１項記載のトレーサー。 （７）トレーサーが下記の構造式： を有する、特許請求の範囲第１項記載のトレーサー。 （８）色原体がスペーサー基を介してリガント９に結合
   しているトレーサーを用いる１皮分析体のアッセイ法で
   あって、該トレーサーが、ジカルボン酸から誘導された
   下記の構造式ｆａｌ、（ｂｌまたは（Ｃ）： （これらの式中、Ｒは１３個以下の炭素原子を有する置
   換されたおよび置換されていない２価の脂肪族炭化水素
   残基よりなる群から選ばれる）で表わされるスペーサー
   基を介してリガンドに結合した色原体からなるアッセイ
   用のトレーサーであることにより改良されたアッセイ法
   。 （９）　アッセイに際してトレーサーが該トレーサーに
   対する結合剤を含む質流室を特徴する特許請求の範囲第
   ８項記載のアッセイ法。 ００　色原体がフルオレセイン系色素である、特許請求
   の範囲第９項記載のアッセイ法。 （１１）　Ｒが２個の炭素原子を有するアルキレン基で
   ある、特許請求の範囲第１０項記載のアッセイ法。 （１２１）レーサーが下記の構造式： を有する、特許請求の範囲第９項記載のアッセイ法。 ０３）　リガン１がジゴキシゲニンである、特許請求の
   範囲第９項記載のアッセイ法。 （１，１＋　リガンドがＬ−チロキシンである、特許請
   求の範囲第９項記載のアッセイ法。 を有する、特許請求の範囲第９項ｉビ戟のアッセイ法。 （１６）　）レーサーが下記の構造式：を有する、特許
   請求の範囲第８項記載のアッセイ法。 （１７）　色原体がスに一す−基を介してリガントに結
   合しているトレーサー、および該トレーサーに対する結
   合剤を含む、被分析体のアッセイに用いられる試薬キッ
   トであって、該トレーサーがジカルボン酸から誘導され
   た下記の構造式（ａ）。 （ｂ）または（Ｃ）： （これらの式中、Ｒは１３個以下の炭素原子を有する置
   換されたおよび置換されていない２価の脂肪族炭化水素
   残基よりなる群から選ばれる）で表わされるスペーサー
   基を介してリガンドに結合した色原体からなるアッセイ
   用のトレーサーであることにより改良された試薬キット
   。 （国　リガント°がジゴキシゲニンである、特許請求の
   範囲第１７項記載の試薬ギット。