JPS6262289B2 - - Google Patents
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Description
本発明は二つの受容体もしくは結合パートナー
を使用する特異的結合定量法に関する。このよう
な定量法においては、１番目の受容体があるリガ
ンドか、またはさらに構造的に関連ある物質を除
外して他の一つの受容体と可逆的に結合すること
ができ、該１番目の受容体が２番目の受容体によ
つて結合される。本発明においてはこのような定
量法を双受容体特異的定量法と呼ぶ。 受容体は一般にタンパクであるが、あるリガン
ドまたは標識したその類縁体に可逆的な特異的結
合親和性を有する物質も同じく使用することがで
きる。もつとも普通に使用される受容体は抗体で
ある。何となればそれらはどのような所望リガン
ドと結合するように増強できるからである。しか
しながら例えば内因子、チロキシン結合グロブリ
ン、コルチゾール結合タンパク、葉酸結合タンパ
クおよび細胞膜結合受容体タンパクのような他の
結合性タンパクも受容体の定義中に含まれる。ま
た受容体にはタンパクと結合することのできる染
料やアミノ酸のような低分子物質も含まれる。一
般則として、受容体とは結合ペアの二成分のうち
大きい方をいう。しかしながら本発明の目的に対
しては、受容体とは単に結合ペアの一方の成分と
解釈すべきである。 リガンドとは受容体の相手である。リガンドは
通常低分子量有機化合物であるが、本発明の目的
では受容体よりも大きくても、小さくても良い
が、ある受容体との結合ペアの一成分と定義され
る。 標識されたリガンド類縁体は、酵素、ラジオア
イソープもしくは他の公知の標識のような検出し
得る置換分を持つているリガンドの誘導体である
が、しかしもとのリガンドが発揮するのと殆んど
同程度の親和力をもつてもとのリガンドに対する
受容体と結合合し、認知し得るものである。 リガンドと受容体とのペアは、定義上可逆的に
結合することができ、すなわちその性質は質量作
用の法則に支配される。実際問題として、このこ
とはリガンドと受容体とのペアのいずれの一方も
特異性結合定量法において通常使用される条件
下、すなわち緩和なPH、温度および中程度のイオ
ン強度において構造的に関連した物質によつて置
き換えることができる。一般にリガンド―受溶体
ペアは107／モル以上の親和定数を発揮する
が、この範囲外でも有用な結果がよく達成され
る。 双受容体特異的結合定量法は、その特徴として
２番目の受容体に特異的な１番目の受容体を有
し、該２番目の受容体は通常リガンドと結合する
ことができる。このリガンドが一般に該定量法で
定量される物質であるが、しかし２番目の受容体
および定量すべきリガンドへの中間に３番目また
はそれ以上の受容体が位置することも可能であ
る。この定量すべきリガンドを以下サンプルリガ
ンドと呼ぶ。通常定量すべきリガンドは最初その
受容体によつて結合され、そして該受容体が次に
２番目の受容体によつて結合される。この見掛け
上冗長さは、分析技術において相当の利益を有す
る。双受容体は、サンプルリガンドの溶液からの
分離を改良し、そして試薬の調製を簡単にする目
的で少なくとも三種の違つたテクニツクに採用さ
れている。１番目のテクニツクは以後ユニバーサ
ル標識法と呼ぶ。多くの特異的結合定量法は、直
接定量、例えば有名なサンドウイツチイムノアツ
セイに標識受容体を使用する。このような定量に
おいては不溶化したサンプルリガンド受容体の過
剰が多結合性サンプルとサンプルのあらかじめ定
めた割合が結合するまでインキユベートされる。
不溶性物質を次いで洗い、他の２番目のサンプル
リガンド受容体が加えられる。追加の洗浄の後さ
らに他の受容体が加えられる。この受容体はサン
プルリガンドよりも２番目の受容体に対して特異
的である。また受容体は不溶性コンプレツクスへ
のその結合の程度を測定し得るように、ラジオア
イソトープ、酵素、安定なフリーラジカルまたは
他の公知の標識のような目印で標識される。再び
不溶性物質が洗浄される。不溶相中に残つてい
る、または洗液中に分離された標識された２番目
の受容体の量は、リガンド受容体へ結合したサン
プルリガンドの量に正比例し、従つてサンプル中
のリガンドの濃度に比例する。加えられる最後の
受容体が抗体である場合は、抗サンプルリガンド
活性を含んでいる２番目の動物種のガンマグロブ
リンに対し効果を高められた１番目の動物種のガ
ンマグロブリンを単に使用するのが普通である。
このガンマグロブリンはサンプルリガンドに対す
る特異性がどうあろうとも２番目の動物種からの
すべての抗体と結合するので、それは標識された
形でユニバーサルな標識として役立つ。ベツクら
のBiochem.J.145：607（1975）参照。この方法は
一回だけの洗浄を必要とするように以前に修正さ
れた。前述の議論から理解されるように、このテ
クニツクは試薬調製を単純化することに向けられ
る。何となればサンプルリガンド受容体に対した
だ一種の標識受容体を必要とするのみであり、従
つてすべての定量が一種だけの標識成分をもつて
実施することができるからである。 双受容体特異的結合定量法の他の二つの群は、
その決定的特徴としてサンプルリガンド受容体、
従つて標識されたコンプレツクスの不溶化の改良
にある。これら定量法の一つが米国特許第
4092408号に記載されている。この方法の要点は
競合的イムノアツセイにおいて以前採用された単
一不溶性受容体に代えて、受容体の不溶化したペ
アを使用することである。この方法はサンプルリ
ガンド受容体に対する受容体を不溶化し、サンプ
ルリガンド受容体、次いで標識したサンプルリガ
ンド類縁体とサンプルとの混合物を順次に加え、
相を分離し、標識したサンプルリガンド類縁体の
分布を測定することよりなる。 双受容体特異性結合定量法の３番目のグループ
は上の方法に密接に関連している。定量中サンプ
ルリガンド受容体に対する不溶化した受容体を供
給する代りに、サンプルリガンド受容体を結合し
得る可溶性受容体を加えてサンプルリガンド受容
体と、そしてそれへ結合しているかも知れないサ
ンプルリガンドまたは標識したサンプルリガンド
類縁体を沈デンさせる。このテクニツクは、標識
したサンプルリガンド類縁体をサンプルと一所に
加える競合的定量にも、また標識したサンプル、
リガンド受容体が前述のようにサンプルリガンド
受容体がサンプルリガンドと結合するのを許容さ
れ終つてから使用されるサンドイツチ定量にも、
またはサンプルリガンドが一成分である他のどん
な慣用システムにも使用することができる。沈デ
ンはサンプルリガンド受容体に対する受容体の事
前凝集により、またはサンプルリガンド受容体に
対する受容体を不溶性支持体上へ不動化もしくは
吸収することによつて助長することができる。こ
の３番目のグループは慣例上双抗体相分離法と呼
ばれている。定量は沈デンが発生するまで完全に
水溶性の試薬をもつて実施されるので、サンプル
リガンド受容体へ結合される標識された類縁体の
量に影響しないことが特に望ましい。 この双受容体法は、主として他のものに対する
そのような受容体の親和性が不十分であるという
事実に基因して多くの欠点および制限を蒙つてい
た。これは受容体の吸着のために比較的大きいプ
ラスチツクもしくは固体表面を必要とし、被覆し
た試験管中で使用することを困難にすること、お
よび広範囲の長いインキユベーシヨンを必要と
し、そのため定量終了に要する全時間を大きく延
長することによつて示される。これら低親和性
は、サンプルリガンド受容体を高めるのに使用す
る受容体もしくは抗原を得るのが困難な場合特に
重要である。 このような欠点が自動化された再負荷し得るラ
ジオイムノアツセイ系に不溶性双受容体を使用す
ることを大きく阻んで来た。これらの系は、受容
体に結合した物質、例えばサンプルリガンドおよ
び標識したリガンド類縁体を溶出することによる
定量後毎に、普通の不溶性受容体の循環的再負荷
を特徴としている。これらシステムは、抗原のよ
うな大分子を定量しようとする場合に特に不利で
ある。これら分子は、不溶性表面にわたつて広が
つている受容体のカーペツト内にかくれた受容体
部位へ侵透することが少ない。これが低いサンプ
ルリガンド受容体親和力そして広い吸収面積また
は長い反応時間の必要性の結果となる。これは速
度と感度とが重要であるときには重大問題であ
る。 さらにこのような再負荷し得るシステムは完全
に再負荷し得ることは殆んどない。すなわちサン
プルリガンドまたは標識したサンプルリガンド類
縁体の完全な溶出は、特に受容体結合部位が大気
中であるときは達成困難である。さらに塩類およ
び極端なPHを含む溶出試薬はリガンドを除去する
かも知れないが、それらはまた受容体を不可逆的
な変性し、それらを再使用に適さなくする。 従つて本発明の一目的は自動化された特異的結
合定量法に容易に再負荷し得る受容体を供給する
ことである。 他の目的は改良された親和力を有する標識され
た普偏的受容体を提供することである。 さらに他の目的は、サンプルリガンドの双受容
体特異的結合定量法の親和性を改良することであ
る。 他の目的は双受容体定量法において相分離を促
進することである。 さらに他の目的は十分なサンプルリガンドを結
合するため双受容体定量法で必要な表面積を減ら
すことである。 本発明のそれ以外の目的は、本明細書全体を考
慮することによつて当業者には自明となるであろ
う。 上述の目的は、前述の双受容体に代えて次の構
造を有する複合体を使用することによつて達成さ
れる。 ＡBL(BL)oA1 ただし式中BLはサンプルリガンド以外の結合
するリガンドであり、ＡBLは該結合するリガンド
に特異的な受容体であり、A1はサンプルリガン
ドに対して特異的な受容体であり、ｎは少なくと
も１であり、BLにA1に共有結合し、そしてＡBL
はBLに可逆的に結合している。 結合するリガンドBLが本発明の特徴である。
それは通常分子量1000以下、好ましくは400以下
であつて、哺乳動物中に高力価の高親和性抗体を
高めるすぐれた能力を有する低分子から選択され
る。それはまた非免疫性可逆結合系の一成分、例
えばビタミンB12、トリヨードチロニンまたは葉
酸であつてもよい。本発明に使用するための候補
結合リガンドの適性は当業者には容易に決定する
ことができる。例えば、免疫系の場合結合するリ
ガンドは、ウシ血清アルブミンのような担体タン
パクへ共有結合で結合することができ、そしてハ
プテン抗体を生産する公知方法に従つて動物へ注
射したときの生産物でよい。次にフルオレスセイ
ンのような参照リガンドについて同じ方法を繰り
返す。もし抗体力価および結合するリガンドに対
する親和力がフルオレスセインについて得られた
力価および親和力と殆んど同じであれば、そのと
きは候補リガンドは本発明に使用するのに満足で
ある。通常結合リガンド―受容体ペアは107／
モル以上の親和定数や持つていなければならな
い。受容体―リガンド親和力の測定は、免疫およ
び非免疫特異性結合系について当業者に慣用され
ている。 結合リガンドを選択するために使用するそれほ
ど厳格ではないがしかし適当であるテストは、一
動物種のガンマグロブリンがそれに対して高めら
れた他の動物種に対して示すよりも該リガンドが
その受容体に対して大きい親和力を示すことであ
る。該結合リガンドのその受容体に対する親和力
は一義的に重要であり、受容体と結合リガンドと
の親和力が高ければ高い程、該結合リガンドは本
発明に使用するのに一層価値がある。 多種類の高力価高親和性結合リガンドが既知で
あり、本発明で使用するのに適している。例示的
物質はフルオレスセイン、ジニトロベンゼン、抗
原性多糖類、ナフチルアミン類、アクリジン類お
よびローダミン類である。フルオレスセインが好
ましい。 これらリガンドの多くは、極めて緩和な条件
下、すなわち放射性ヨード化、被覆試験管吸収ま
たは不溶性支持体への共有結合のような処理より
も一層少ない抗体力価のロスを生ずるような条件
下で受容体と結合させることができる。抗体力価
の重大な損失は、抗体が高力価高親和力に製造困
難である場合には許容できない。本発明は製造困
難な抗体または受容体に対し、安価な高力価高親
和性結合リガンド受容体を犠性にすることを可能
とする。なんとなれば結合リガンド受容体の共有
結合附着によつておこる力価の低下を、該受容体
の不溶化もしくはラジオアイソトープ標識化によ
つて生ずる低下以下に低くすることができるから
である。 リガンドが次に同一または異種のサンプルリガ
ンド受容体へ結合されるか否かにかかわらず、結
合リガンドとそれらの受容体との混合物が使用で
きる。前者の具体例は単一の受容体が使用される
一つのサンプルリガンドの定量に応用される。こ
の受容体は複数の異種結合リガンドで標識するこ
とが可能であり、また該リガンドは複数のそれに
対する受容体を提供することによつて不溶化され
る。後者の具体例は、複数のサンプルリガンドの
系列的定量に関して後で議論する。 結合するリガンドは受容体A1に種々の慣用結
合基を介して共有結合することができる。例えば
フルオレスセインが結合リガンドとして使用され
る場合には、フルオレスセインイソシアネート、
ジクロルトリアジニルアミノフルオレスセインま
たはヨードアセチルアミノフルオレスセインを使
用することができ、これらすべてはタンパクと共
有結合で容易に結合させることができ、前二者は
タンパクアミノ基へ、最後はスルフヒドリル基へ
結合する。類似のアクリジン化合物もタンパクへ
共有結合させることができる。ジニトロベンゼン
の場合は、２，４―ジニトロフロルベンゼンを使
用することができる。精製したバクテリア細胞壁
抗原のような多糖類の場合には、受容体への共有
結合は、多製類の過ヨード酸塩酸化、シツフ塩基
の形成およびその後の還元によつて達成すること
ができる。結合リガンドとしてナフチルアミンを
使用する場合には、ダンジルクロライドを受容体
との結合物を形成すべき反応剤として使用するこ
とができる。 サンプルリガンド受容体へ結合する結合リガン
ドの数とタイプとは、サンプルリガンド受容体の
サイズとそしてそのサンプリガンド結合部位の性
質とに依存する。普通は20以下、通常は１乃至５
の結合リガンドがサンプルリガンド受容体へ結合
する。受容体が大きければ大きい程、もつと多く
の結合リガンドがサンプルリガンドの結合を妨害
することなしに結合することができる。そのほか
に結合リガンドはサンプルリガンド結合部位もし
くはその附近で結合してはならない。もしサンプ
ルリガンド部位が未知であれば、そのときは該部
位は過剰のサンプルリガンドの存在下に結合を行
うか、または有機保護基の使用によつて保護する
ことができる。さらに結合するリガンドは、サン
プルリガンドと結合リガンドとの同時結合の立体
障害を最小にするかまたは除去するように、すな
わち結合するリガンドがサンプルリガンド受容体
結合部位からできるだけ遠くなつて、そのためサ
ンプルリガンドと結合リガンド受容体とが同時に
結合し得るように選定されそして配置される。こ
のパラメータは通常きまりきつた実験によつて最
適化される。 フルオレスセインの場合は、使用する特定の受
容体に応じてサンプルリガンド受容体重量の約
2.5％乃至50％範囲の結合リガンド割合が最適な
結果を与えることが判明しているが、しかしフル
オレスセインのみならず他の結合リガンドでも約
0.01乃至60重量％のかなりの広い範囲が使用でき
る。 結合リガンドが結合する受容体A1は、定量し
ようと欲するサンプルリガンドと特異的かつ可逆
的に結合するどんな分子でも通常よい。普通該受
容体は抗体のような結合するタンパクである。例
外的には、該受容体は最終的にサンプルリガンド
を結合する他の受容体に対して特異的であつても
よい。A1が抗体であるときは、それは抗原性リ
ガンド単独か、またはリガンドがハプテンであれ
ば抗原性タンパクへ共有結合したリガンドを注射
することにより、慣用の方法で適当な動物中に高
めることができる。非免疫性サンプルリガンド受
容体は種々のソースから単離することができ、そ
して多数のそのような結合性タンパクが市販され
ている。例えばサンプルリガンドビタミンB12に
対する結合するタンパクである内因子は、ブタの
腸から得ることができ、そしてサンプルリガンド
として葉酸に対する葉酸結合タンパクは再構成し
た脱脂粉乳から得ることができる。特異的結合定
量に使用するのに適当な多数の他の結合タンパク
は公知であり、そして例えば血漿中のチロキシン
の定量にチロキシン結合性グロブリン、血清コル
チゾールの定量にコルチゾール結合性タンパク、
およびACTHのようなペプチドホルモンの定量
に膜結合特異的受容体タンパクを本発明において
使用することができる。 結合性リガンド受容体であるＡBLは、好ましく
はどんな慣用方法においても該結合リガンドに対
する抗体を高めることによつて産生される。例え
ば該結合リガンドはウシ血清アルブミンへ共有結
合することができ、そして公知方法によつて抗体
を高めるのに使用することができる。ＡBLが抗体
である場合には、ＡBLを高めるのに使用する動物
はサンプルリガンド受容体を高めるのに使用する
動物と異なる必要はない。しかしながら該動物は
該結合リガンドに対して高められる高親和力と高
力価を持つ抗血清を産生する能力から選定されな
ければならない。結合リガンド受容体は、結合リ
ガンドとサンプルリガンド受容体との間の共有結
合とは対照的に、結合リガンドへ可逆的にＡBL(B
Ｌ）ｏA1複合体の形で結合される。このような可逆
的結合はこの分野では良く認められており、それ
らは単に結合リガンドとその受容体とを混合する
だけで普通形成されており、そして水素結合およ
びフアン、デル、ワールド力に基いているものと
考えられる。これらのもつと顕著な特性は、本発
明の場合はその平衡は解離よりも結合に有利に最
適化されるけれども質量作用の法則に支配されな
ければならないということである。 この結合リガンド受容体は、一般にサンプルリ
ガンドとは異なる結合リガンドに対して特異的活
性を示す。サンプルリガンドと結合リガンドとが
同じであることも可能であるけれども、サンプル
リガンドとサンプルリガンド受容体との結合体の
製造および使用は、余分の工程を伴う。製造の場
合、反応性のサンプルリガンド誘導体がサンプル
リガンド受容体と受容体の結合部位またはその近
所で共有結合することを防止することが必要であ
る。さもなけば該リガンドによる立体障害によつ
て該受容体はサンプルリガンドと少ししか結合し
ない。なおサンプルリガンドの傾向は丁度その点
においてその受容体と結合しようとする。しかし
ながらこの問題は、リガンドとその受容体とを、
該受容体を、該リガンドを含む不溶化したマトリ
ツクスへ結合するように結合させることによつて
克服することができる。 結合体の使用はもつと困難である。何となれば
サンプルリガンドが結合リガンドと異なる場合が
そうであるように、サンプルリガンドとサンプル
リガンド受容体とを同時に混合することは好まし
くないからである。 普通結合リガンド受容体を不溶化することが好
ましく、そしてそれを定量を始める前に行うこと
が好ましい。またサンプルリガンド受容体は特異
的結合定量を行う前または最中に不溶化すること
もできる。結合リガンド受容体の目的がすべての
成分が溶液中で反応し終つた後に不溶化を行うも
のである上述の受容体沈デンテクニツクの場合に
はそうではない。不溶化の一つのテクニツクが米
国特許第3646346号に記載されており、そこでは
受容体溶液は、十分な受容体が吸収されるまで単
にプラスチツク試験管壁と接触させられる。代り
に結合リガンド受容体は特定の懸濁液上へ吸収す
ることができる。また以前酵素または抗体につい
て使用されたタンパク不溶化方法のような良く知
られたテクニツクを使用して不溶性マトリツクス
へ共有結合で架橋することにより、またはポリエ
チレングリコールのような沈デン剤を使用する
か、もしくはグルタルアルデヒドのような架橋剤
を使用して凝集によつて受容体を不溶化すること
も本発明の範囲内である。これら方法の組み合わ
せも同様に使用することができる。例えば凝集し
た受容体をプラスチツク試験管へ吸収することが
できる。 本発明の複合体は前述した公知の双受容体特異
的結合定量法のすべてと、そしてこの複合体を使
用することによつて改善することのできる二つの
他の方法に使用することができる。他の方法と
は、親和力クロマトグラフイーと、そして再負荷
特異的結合定量法の二つである。 親和力クロマトグラフイーは、不純溶液から酵
素、抗体、抗原および血液タンパク分画のような
物質を精製するための良く知られた技術である。
例えばCuatrecasas et al、Annual Review of
Biochemistry， volume 40，p.259（1971）お
よび米国特許第3842061号参照。この技術は所望
の物質の結合パートナーを不溶化し、不純溶液を
該結合パートナー上を通過させ、結合した不溶化
した物質を洗浄し、そして例えばPHもしくはイオ
ン強度を変えることによつて結合した物質を溶離
することよりなる。この親和力クロマドグラフイ
ーは、前述した特異性結合定量法の欠点、すなわ
ち不溶化した結合パートナーとその可溶性結合物
質との間の低親和性、および結合した物質を不溶
性親和力マトリツクスから分離することの困難を
免れ得ない。本発明の複合体の使用は分離効率を
改善する。また不溶化した結合リガンド受容体か
ら所望の物質および結合リガンド結合物の凝集体
の分離は、結合リガンドの過剰を凝集体へ加える
ときの結合リガンド置換によつて簡単にされる。
所望の物質はその後透析その他でその受容体から
容易に分離することができる。 連続流でもバツチ式でも、接触する不溶性マト
リツクスを使用する多数回の慣用特異的結合定量
法を実施する能力は、本発明の複合体によつて大
きく高められる。このような定量法の顕著な特徴
は、それらは同じ容器内で実施されるということ
であり、それら定量法は、互に差別することので
きる異なるラジオアイソトープ、例えば 57Coお
よび 125I（米国特許第3952091）の使用により、
またはめいめいの副成分へ結合した受容体の一種
を持つている装置の副成分を除去することによ
り、分離または区別することができる。このよう
な副成分は試験管の内壁へ付着させた条片または
礼でよい。本発明は異なつた標識を持つているサ
ンプルリガンド類縁体を合成するかなりの不便さ
を解消し、そしてラジオイムノアツセイの場合は
実用的標識として使用し得るラジオアイソトープ
の数の固有の制限を克服する。特に本発明の改良
された受容体複合体は、再負荷特異的結合定量系
に価値ある用途を有する。 そのような系は公知であり、例えばアメリカ特
許第4053284号、同4039652号を参照。本発明によ
つて達成されるサンプルリガンドのその受容体に
よる吸収の改善された動力学は、連続流定量にお
いて相当に有利である。何故ならば受容体の量を
減らすことが可能であり、または流量を増すこと
が可能であるからである。そのほかに結合リガン
ド受容体をその上に不溶化して持つている単一の
吸収剤をすべての定量に使用することができ、異
なる測定を行う度毎に吸収剤を取り換える必要が
ない。サンプルリガンドを取り換えることがしば
しば不便である自動化設備においては、このこと
が特に有利である。最後に結合した標識したサン
プルリガンド類縁体の溶出は、結合リガンド受容
体から結合リガンドとサンプルリガンド受容体の
容易な可逆結合によつて容易化される。結合リガ
ンドはその環境の小変化、例えばPHを２だけ低下
させることによつて離れるものが選定される。こ
れら小変化は、これまでに採用された強い条件、
例えばPH2.5と異なつて、結合リガンド受容体を
不可逆的に変性することがない。 多数回再負荷特異的結合定量法の例示的具体例
は、その内壁をフルオレスセインに対するウサギ
抗体で被覆したコイル状毛細管を使用する。ビタ
ミンB12とトリヨードチロニンを順番に定量する
方法は、該チユーブ内を以下の試薬を含む溶液を
そこで述べる順序で通過させ、めいめいの溶液の
後で適度に希薄食塩水または水で洗浄することよ
りなる。 (1) フルオレスセイン―内因子結合物 (2) テストサンプルと 57Co標識ビタミンB12との
混合物 (3) 弱酢酸 (4) フルオレスセイン―トリヨードチロニン抗体 (5) テストサンプルと 125I標識トリヨードチロニ
ンとの混合物 (6) 弱酢酸 標準および対照も同じ方法で繰り返す。溶出さ
れた放射能または標識したサンプルリガンドの通
過後毎に保持された放射能を測定することができ
る。保持された放射能は、コイル状毛細管の近所
へ適当な放射能カウンターを置くことによつて測
定することができる。試薬(1)および(2)、(4)および
(5)は、毛細管を通過させる前に合併することがで
きる。 別法として、毛細管の内壁へフルオレスセイン
受容体とジニトロベンゼン受容体の混合物を吸収
させ、毛細管をテストサンプル、 57Co標識ビタ
ミンB12， 125I標識トリヨードチロニン、フルオ
レスセイン―内因子結合物およびジニトロベンゼ
ン―トリヨードチロニン抗体結合物の混合物を通
過させ、フルオレスセイン水溶液を毛細管を通過
させ、洗液の放射能を測定し、ジニトロベンゼン
の水溶液を毛細管を通過させ、そして洗液の放射
能を測定するのがもつと便利である。上述の二つ
の実例においては、二つの異なる標識の存在は同
一であるが、この方法は 125Iが唯一の標識である
他の定量法でも等しくよく実施できる。 本発明がもつとも良く適する三種の慣用の双受
容体特異的結合定量法へ転ずると、試薬の濃度、
インキユベーシヨン時間および他の定量操作パラ
メーターは、この発明による双受容体の使用によ
り大きくは変更されないことを注意すべきであ
る。定量を最適とするため必要な少しの修正は、
当業者が行い得る範囲である。 多結合性サンプルリガンドのための改良したユ
ニバーサル標識テクニツクにおいては、本発明の
複合体は、ガンマグロブリンと標識した抗ガンマ
グロブリンとの結合体の代りに、標識した結合リ
ガンド受容体と一所に使用する。典型的な定量法
は、不溶性サンプルリガンド受容体を調製し、こ
の受容体をサンプルとサンプルリガンドのいくら
かまたはその比例量が不溶性のその受容体に吸収
されるように接触させ、不溶物質を洗浄し、次に
それを結合リガンドのサンプルリガンド受容体へ
の結合物と接触させ、それにより事実上吸収され
たサンプルリガンドの量が結合リガンドで標識さ
れるようにし、洗浄し、そして最後に不溶性物質
を直接検出し得る物質、例えば酵素、ラジオアイ
ソートプまたは安定なフリーラジカルで標識され
た結合リガンド受容体と接触させる各工程よりな
る。標準および対照も同じ方法で処理される。洗
浄工程は任意であるが、それらはもつとも再現性
があり感度ある結果を得るためには好ましい。こ
れに関し、サンプル、結合物および標識した結合
リガンド受容体の添加はすべて―工程で実行でき
る。しかしながら標識した複合体は、サンプルが
結合し終りそして不溶性サンプルリガンド受容体
がなくなるまで洗つた後に添加するのが好まし
い。サンプルリガンド受容体は、反応終了後に不
溶化することができる。 不溶化手段として双受容体を使用する定量法
は、不溶性支持体へ結合または吸収された結合リ
ガンド受容体を持つているか、または該結合リガ
ンド受容体が結合リガンド―サンプルリガンド受
容体結合物をそれへ結合するときに不溶化する。
この相分離工程は該定量法の中心への単なる附加
工程である。このように本発明の複合体は、競合
的もしくは直接的特異的結合定量法のいずれにも
調和して使用することができる。 典型的な双受容体、直接特異的結合定量法は、
本発明の複合体を前記サンプルリガンドを含んで
いると考えられるサンプルと接触させ、それによ
り存在する該サンプルリガンドを前記結合物によ
つて吸収し、前記複合体を洗浄し、前記複合体を
標識したサンプルリガンド類縁体と接触させ、複
合体を洗浄し、そして残つている結合した、また
は未結合標識サンプルリガンド類縁体の量を測定
することよりなる。 代表的な、双受容体競合特異的結合定量法は、
本発明の複合体を、標識したサンプルリガンド類
縁体と該サンプルリガンドを含んでいると考えら
れるサンプルとに同時に接触させ、それによつて
前記サンプルと前記標識サンプルリガンド類縁体
とをそれらの溶液中の濃度に比例して前記複合体
へ競合的に結合させ、複合体を洗浄し、そして残
つている結合した、もしくは未結合標識サンプル
リガンド類縁体の量を測定することよりなる。 サンドイツチタイプの双受容体特異的結合定量
法は、本発明の複合体を前記サンプルリガンドを
含んでいると考えられるサンプルと接触させ、そ
れによつて存在する該サンプルリガンドを前記複
合体に吸収し、吸収したサンプルリガンドを該サ
ンプルリガンドに対する標識受容体の過剰と接触
させ、複合体を洗浄し、そして残りの結合した、
または未結合の標識した受容体の量を測定するこ
とからなる。 本発明のこの高められたサンドイツチ法は、
こゝで肝炎関連抗原と呼ぶ肝炎の徴候と考えられ
る抗原の定量に特に有利である。以前のサンドイ
ツチ定量法を上廻るピペツトおよび洗浄工程の節
約が得られる。従前の肝炎関連抗原定量法は、肝
炎関連抗原への抗体で被覆した不溶性表面を調製
し、該表面をテストサンプルと接触させ、該表面
を洗浄し、さらに該表面を肝炎関連抗原へ対する
標識した抗体と接触させ、該表面を洗浄し、そし
て可溶相および不溶相間における標識した抗体の
分布を測定することよりなる。本発明の改良方法
は、肝炎関連抗原への抗体で被覆した不溶性表面
の代りに、式Ｑ―ＡBL(BL)oA1の複合体を使用す
ることを含む。該式中Ｑは不溶性支持体であり、
BLは結合するリガンドであり、ＡBLはBLに対す
る受容体であり、ｎは少なくとも１であり、そし
てA1は肝炎関連抗原に対する抗体である。この
複合体を使用するときは、これまでの不溶性表面
をサンプルと接触させ、ついで肝炎関連抗原への
標識した抗体へ接触させる一連の工程を組み合わ
せ、このようにして洗浄およびピペツト工程をな
くすのが好ましい。 検出剤として標識した受容体を使用する従前技
術の特異的結合定量法、例えば前述のサンドイツ
チ定量法は、そのほかにユニバーサル受容体法と
組み合わせることができる。しかしながらこの場
合は、不溶性サンプルリガンド受容体複合体に使
用する結合リガンドは、標識したサンプルリガン
ド受容体複合体に使用するそれと異なることが推
奨される。 前述した公知の特異的結合定量法に使用される
特定の操作パラメーターおよび緩衝液のような慣
用の試薬の調製方法は、本発明の複合体にも使用
することができる。例えば抗体のような不溶性受
容体の製造方法は良く知られており、そして適当
な標識したサンプルリガンド類縁体もそうであ
る。反応条件の小さな修正は当業者の技術の範囲
内であり、こゝで強調するには及ばない。 本発明の方法および組成物は、普通キツトに具
体化される。例えば競合的特異的結合定量法は、
一般に標識したサンプルリガンド類縁体、緩衝液
結合リガンド受容体と該結合リガンドへ共有結合
で結合された、サンプルリガンドに特異的な受容
体よりなる複合体であつてサンプルリガンドと標
識した類縁体の両方へ同時に溶液中で結合するこ
とのできる複合体、そして複合体とサンプルリガ
ンドとサンプルリガンド類縁体との結合体を不溶
化する手段を含んでいるキツトで市販されるであ
ろう。該不溶化手段は、例えば定量を実施するた
めの試験管として使用することができて、そして
その内側表面へ結合リガンドの受容体を吸収させ
たポリプロピレン製、ポリスチレン製もしくは他
の適当なプラスチツク製のチユーブの形をしたプ
ラスチツク表面とすることができる。該手段はま
た、例えばデキストランもしくはガラス球のよう
な水不溶性固体粒子であつて、それへ結合リガン
ドの受容体を慣用方法で共有結合させたものとす
ることができる。不溶化手段は、結合リガンドの
受容体を選択的にあらかじめ凝集するのに使用す
るポリエチレングリコールのような試薬とするこ
ともできる。この場合は結合リガンドおよびあら
かじめ凝集した受容体を共有結合によつて結合し
た、反応に中性な担体タンパク、例えばガンマグ
ロブリンをそのほかに使用するのが好ましい。こ
の予凝集物質は結合物の不溶化を助ける。このキ
ツトは通常結合リガンド受容体と、結合リガンド
ーサンプルリガンド受容体結合物との別々の部分
標本を含むであろうが、しかしこれらは単一の試
薬中に合併することもできる。結合物中の結合リ
ガンドと、そしてサンプルリガンドの受容体との
相対的比率は広い範囲で変えることができる。フ
ルオレスセインのような結合リガンドと抗体もし
くは結合性タンパクのような受容体との結合、例
えばフルオレスセインイソシアネートをそれらに
反応させることによる結合は、結合リガンドの非
常に大割合、ある場合には等重量以上が結合する
までは、受容体がそれらのそれぞれのサンプルリ
ガンドと結合する能力へ重大な影響を与えない。
結合リガンドの割合の増加による結合能力の減少
の程度は、特定の受容体毎に、そして個々の結合
リガンド毎に変化する。どの場合でも、サンプル
リガンドとの最大の結合力を与え、同時に不溶化
を確実にするため結合物の結合リガンドの受容体
に対する十分な結合力を与える割合もしくはその
範囲を決定するためには、簡単な試行錯誤を実施
すればよい。 以下の特定の実施例は例証のためであり、本発
明の範囲を制限するためのものではない。 実施例 １ 以下の成分を含有するビタミンB12定量用のキ
ツトを調製した。 １ 既知量のビタミンB12を含有する標準溶液。 ２ 57Coを含有するビタミンB12の標識類縁体。 ３ グルタミン酸の緩衝溶液。 ４ 内因子とフルオレスセインとが結合した複合
体の溶液。 ５ ポリエチレングリコールで処理し、次に予凝
集したウサギフルオレスセイン抗血清。 ６ フルオレスセインを結合した担体タンパク
（ウシガンマグロブリン）の溶液。 標準溶液は、リン酸塩緩衝食塩水リン酸カリウ
ム10mM、食塩0.9％、NaN30.1％、PH7.4）中ヒト
血清アルブミン40mg／mlと、ウシガンマグロブリ
ン20mg／mlとを含んでいるタンパク溶液中へ適当
量のビタミンB12を加えることによつて調製した
（前記緩衝液を以後「PBS」という）。最終標準液
は１ml当りビタミンB12をそれぞれ2000，1000，
500，200，100，50およびゼロピコグラムを含有
していた。 標識した類縁体の溶液は、100マイクロリツト
ルが毎分約10000カウント（約30ピコグラム）含
有するように希釈したコバルト57で標識したビタ
ミンB12の溶液である。 上のNo.３の緩衝液は、グルタミン酸、ゼラチン
およびシアン化カリウムを41mM、0.1％および
2.1mM濃度にそれぞれ含有し、PH3.5であつた。
この緩衝液はビタミンB12のような化合物をサン
ブル中の特異的結合タンパクが分離し、それをシ
アノ誘導体へ変える役目を果す。 複合体の溶液は、以下の操作によるフルオレス
セインイソシアネートとの反応によつて共有結合
させた内因子を含んでいた。炭酸塩緩衝液
（0.5M，PH9.4）１mlと内因子２mgとを含んでい
る試験管へ、フルオレスセインイソシアネート１
mgを含んでいる炭酸塩緩衝液２mlを加えた。かき
まぜた後反応液を一夜室温で放置する。それを次
に10mlピペツト中９ml（全ベツト容積）の多糖類
（セフアデツクスＧ―25）のカラムへ適用し、
PBS（リン酸塩25mM濃度）で平衡化した。PBS
で溶出すると、空白体積とともに着色した単一バ
ンドが得られた。これを集め、（0.3mg／ml）そし
てPBSで１：65に希釈した。 ウサギフルオレスセイン抗体は、フルオレスセ
インイソシアネート1gとウシ血清アルブミン1g
とを0.5M炭酸塩緩衝液PH9.5の30ml中へ溶解し、
室温で一夜ゆるやかにかきまぜることによつて反
応を進行させることによつて調製した。混合物を
次に透析物中にフルオレスセインが検出されなく
なるまでPBSでよく透析した。溶液を凍結乾燥
し、固形物をフロインドのアジユバンド中でウサ
ギに投与した。フルオレスセイン抗体を含んでい
るウサギから得られた血清は、イムノグロブリン
を沈デンするように抗血清を硫安飽和度40％と
し、沈デンをもとの抗血清の体積と等しいPBS中
に再懸濁することによつて部分精製した。これを
ポリエチレングリコール6000を６％含有するPBS
中へ１：50に希釈することによつて予備凝集し
た。かきまぜた懸濁液は、使用前室温で少なくと
も１時間平衡化させた。 フルオレスセインへ結合した担体タンパクは、
前述のフルオレスセイン結合ウシ血清アルブミン
の製造方法と同じ操作を使用し、フルオレスセイ
ンイソシアネートとウシガンマグロブリンとをモ
ル比20：１で0.5M炭酸塩緩衝液で室温で反応さ
せることによつて製造した。製品はタンパク3.5
mg／mlを含む溶液となるようにPBSで１：10に希
釈した。 定量は、別々の12×75mmガラス試験管へそれぞ
れ0.5mlづつのグルタミン酸緩衝溶液と、場合に
応じてビタミンB12の標準液または未知溶液の0.1
mlづつを加せることによつて実施した。100℃で
20分間インキユベートし、そして室温へ冷却した
後、それぞれの試験管へ標識した類縁体溶液0.1
mlづつとそして複合体溶液0.1mlづつを加え、混
合物を37℃で１時間インキユベートした。次に各
試験管へフルオレスセインへ結合した支持体タン
パク0.1mlと、予備凝集した抗フルオレスセイン
抗体1.0mlとを加え、混合物を37℃で20分間イン
キユベートし、その後試験管を5000rpmで15分間
遠心した。上清を傾しやし、沈デンしたペレツト
についてガンマカウンタで残存放射能を測定し
た。複合体の溶液を除くすべての成分を含んでい
る類似の試験管中には、特別な自然カウントは測
定されなかつた。 標準溶液についての成績は次のとおりであつ
た。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝11150
を使用する特異的結合定量法に関する。このよう
な定量法においては、１番目の受容体があるリガ
ンドか、またはさらに構造的に関連ある物質を除
外して他の一つの受容体と可逆的に結合すること
ができ、該１番目の受容体が２番目の受容体によ
つて結合される。本発明においてはこのような定
量法を双受容体特異的定量法と呼ぶ。 受容体は一般にタンパクであるが、あるリガン
ドまたは標識したその類縁体に可逆的な特異的結
合親和性を有する物質も同じく使用することがで
きる。もつとも普通に使用される受容体は抗体で
ある。何となればそれらはどのような所望リガン
ドと結合するように増強できるからである。しか
しながら例えば内因子、チロキシン結合グロブリ
ン、コルチゾール結合タンパク、葉酸結合タンパ
クおよび細胞膜結合受容体タンパクのような他の
結合性タンパクも受容体の定義中に含まれる。ま
た受容体にはタンパクと結合することのできる染
料やアミノ酸のような低分子物質も含まれる。一
般則として、受容体とは結合ペアの二成分のうち
大きい方をいう。しかしながら本発明の目的に対
しては、受容体とは単に結合ペアの一方の成分と
解釈すべきである。 リガンドとは受容体の相手である。リガンドは
通常低分子量有機化合物であるが、本発明の目的
では受容体よりも大きくても、小さくても良い
が、ある受容体との結合ペアの一成分と定義され
る。 標識されたリガンド類縁体は、酵素、ラジオア
イソープもしくは他の公知の標識のような検出し
得る置換分を持つているリガンドの誘導体である
が、しかしもとのリガンドが発揮するのと殆んど
同程度の親和力をもつてもとのリガンドに対する
受容体と結合合し、認知し得るものである。 リガンドと受容体とのペアは、定義上可逆的に
結合することができ、すなわちその性質は質量作
用の法則に支配される。実際問題として、このこ
とはリガンドと受容体とのペアのいずれの一方も
特異性結合定量法において通常使用される条件
下、すなわち緩和なPH、温度および中程度のイオ
ン強度において構造的に関連した物質によつて置
き換えることができる。一般にリガンド―受溶体
ペアは107／モル以上の親和定数を発揮する
が、この範囲外でも有用な結果がよく達成され
る。 双受容体特異的結合定量法は、その特徴として
２番目の受容体に特異的な１番目の受容体を有
し、該２番目の受容体は通常リガンドと結合する
ことができる。このリガンドが一般に該定量法で
定量される物質であるが、しかし２番目の受容体
および定量すべきリガンドへの中間に３番目また
はそれ以上の受容体が位置することも可能であ
る。この定量すべきリガンドを以下サンプルリガ
ンドと呼ぶ。通常定量すべきリガンドは最初その
受容体によつて結合され、そして該受容体が次に
２番目の受容体によつて結合される。この見掛け
上冗長さは、分析技術において相当の利益を有す
る。双受容体は、サンプルリガンドの溶液からの
分離を改良し、そして試薬の調製を簡単にする目
的で少なくとも三種の違つたテクニツクに採用さ
れている。１番目のテクニツクは以後ユニバーサ
ル標識法と呼ぶ。多くの特異的結合定量法は、直
接定量、例えば有名なサンドウイツチイムノアツ
セイに標識受容体を使用する。このような定量に
おいては不溶化したサンプルリガンド受容体の過
剰が多結合性サンプルとサンプルのあらかじめ定
めた割合が結合するまでインキユベートされる。
不溶性物質を次いで洗い、他の２番目のサンプル
リガンド受容体が加えられる。追加の洗浄の後さ
らに他の受容体が加えられる。この受容体はサン
プルリガンドよりも２番目の受容体に対して特異
的である。また受容体は不溶性コンプレツクスへ
のその結合の程度を測定し得るように、ラジオア
イソトープ、酵素、安定なフリーラジカルまたは
他の公知の標識のような目印で標識される。再び
不溶性物質が洗浄される。不溶相中に残つてい
る、または洗液中に分離された標識された２番目
の受容体の量は、リガンド受容体へ結合したサン
プルリガンドの量に正比例し、従つてサンプル中
のリガンドの濃度に比例する。加えられる最後の
受容体が抗体である場合は、抗サンプルリガンド
活性を含んでいる２番目の動物種のガンマグロブ
リンに対し効果を高められた１番目の動物種のガ
ンマグロブリンを単に使用するのが普通である。
このガンマグロブリンはサンプルリガンドに対す
る特異性がどうあろうとも２番目の動物種からの
すべての抗体と結合するので、それは標識された
形でユニバーサルな標識として役立つ。ベツクら
のBiochem.J.145：607（1975）参照。この方法は
一回だけの洗浄を必要とするように以前に修正さ
れた。前述の議論から理解されるように、このテ
クニツクは試薬調製を単純化することに向けられ
る。何となればサンプルリガンド受容体に対した
だ一種の標識受容体を必要とするのみであり、従
つてすべての定量が一種だけの標識成分をもつて
実施することができるからである。 双受容体特異的結合定量法の他の二つの群は、
その決定的特徴としてサンプルリガンド受容体、
従つて標識されたコンプレツクスの不溶化の改良
にある。これら定量法の一つが米国特許第
4092408号に記載されている。この方法の要点は
競合的イムノアツセイにおいて以前採用された単
一不溶性受容体に代えて、受容体の不溶化したペ
アを使用することである。この方法はサンプルリ
ガンド受容体に対する受容体を不溶化し、サンプ
ルリガンド受容体、次いで標識したサンプルリガ
ンド類縁体とサンプルとの混合物を順次に加え、
相を分離し、標識したサンプルリガンド類縁体の
分布を測定することよりなる。 双受容体特異性結合定量法の３番目のグループ
は上の方法に密接に関連している。定量中サンプ
ルリガンド受容体に対する不溶化した受容体を供
給する代りに、サンプルリガンド受容体を結合し
得る可溶性受容体を加えてサンプルリガンド受容
体と、そしてそれへ結合しているかも知れないサ
ンプルリガンドまたは標識したサンプルリガンド
類縁体を沈デンさせる。このテクニツクは、標識
したサンプルリガンド類縁体をサンプルと一所に
加える競合的定量にも、また標識したサンプル、
リガンド受容体が前述のようにサンプルリガンド
受容体がサンプルリガンドと結合するのを許容さ
れ終つてから使用されるサンドイツチ定量にも、
またはサンプルリガンドが一成分である他のどん
な慣用システムにも使用することができる。沈デ
ンはサンプルリガンド受容体に対する受容体の事
前凝集により、またはサンプルリガンド受容体に
対する受容体を不溶性支持体上へ不動化もしくは
吸収することによつて助長することができる。こ
の３番目のグループは慣例上双抗体相分離法と呼
ばれている。定量は沈デンが発生するまで完全に
水溶性の試薬をもつて実施されるので、サンプル
リガンド受容体へ結合される標識された類縁体の
量に影響しないことが特に望ましい。 この双受容体法は、主として他のものに対する
そのような受容体の親和性が不十分であるという
事実に基因して多くの欠点および制限を蒙つてい
た。これは受容体の吸着のために比較的大きいプ
ラスチツクもしくは固体表面を必要とし、被覆し
た試験管中で使用することを困難にすること、お
よび広範囲の長いインキユベーシヨンを必要と
し、そのため定量終了に要する全時間を大きく延
長することによつて示される。これら低親和性
は、サンプルリガンド受容体を高めるのに使用す
る受容体もしくは抗原を得るのが困難な場合特に
重要である。 このような欠点が自動化された再負荷し得るラ
ジオイムノアツセイ系に不溶性双受容体を使用す
ることを大きく阻んで来た。これらの系は、受容
体に結合した物質、例えばサンプルリガンドおよ
び標識したリガンド類縁体を溶出することによる
定量後毎に、普通の不溶性受容体の循環的再負荷
を特徴としている。これらシステムは、抗原のよ
うな大分子を定量しようとする場合に特に不利で
ある。これら分子は、不溶性表面にわたつて広が
つている受容体のカーペツト内にかくれた受容体
部位へ侵透することが少ない。これが低いサンプ
ルリガンド受容体親和力そして広い吸収面積また
は長い反応時間の必要性の結果となる。これは速
度と感度とが重要であるときには重大問題であ
る。 さらにこのような再負荷し得るシステムは完全
に再負荷し得ることは殆んどない。すなわちサン
プルリガンドまたは標識したサンプルリガンド類
縁体の完全な溶出は、特に受容体結合部位が大気
中であるときは達成困難である。さらに塩類およ
び極端なPHを含む溶出試薬はリガンドを除去する
かも知れないが、それらはまた受容体を不可逆的
な変性し、それらを再使用に適さなくする。 従つて本発明の一目的は自動化された特異的結
合定量法に容易に再負荷し得る受容体を供給する
ことである。 他の目的は改良された親和力を有する標識され
た普偏的受容体を提供することである。 さらに他の目的は、サンプルリガンドの双受容
体特異的結合定量法の親和性を改良することであ
る。 他の目的は双受容体定量法において相分離を促
進することである。 さらに他の目的は十分なサンプルリガンドを結
合するため双受容体定量法で必要な表面積を減ら
すことである。 本発明のそれ以外の目的は、本明細書全体を考
慮することによつて当業者には自明となるであろ
う。 上述の目的は、前述の双受容体に代えて次の構
造を有する複合体を使用することによつて達成さ
れる。 ＡBL(BL)oA1 ただし式中BLはサンプルリガンド以外の結合
するリガンドであり、ＡBLは該結合するリガンド
に特異的な受容体であり、A1はサンプルリガン
ドに対して特異的な受容体であり、ｎは少なくと
も１であり、BLにA1に共有結合し、そしてＡBL
はBLに可逆的に結合している。 結合するリガンドBLが本発明の特徴である。
それは通常分子量1000以下、好ましくは400以下
であつて、哺乳動物中に高力価の高親和性抗体を
高めるすぐれた能力を有する低分子から選択され
る。それはまた非免疫性可逆結合系の一成分、例
えばビタミンB12、トリヨードチロニンまたは葉
酸であつてもよい。本発明に使用するための候補
結合リガンドの適性は当業者には容易に決定する
ことができる。例えば、免疫系の場合結合するリ
ガンドは、ウシ血清アルブミンのような担体タン
パクへ共有結合で結合することができ、そしてハ
プテン抗体を生産する公知方法に従つて動物へ注
射したときの生産物でよい。次にフルオレスセイ
ンのような参照リガンドについて同じ方法を繰り
返す。もし抗体力価および結合するリガンドに対
する親和力がフルオレスセインについて得られた
力価および親和力と殆んど同じであれば、そのと
きは候補リガンドは本発明に使用するのに満足で
ある。通常結合リガンド―受容体ペアは107／
モル以上の親和定数や持つていなければならな
い。受容体―リガンド親和力の測定は、免疫およ
び非免疫特異性結合系について当業者に慣用され
ている。 結合リガンドを選択するために使用するそれほ
ど厳格ではないがしかし適当であるテストは、一
動物種のガンマグロブリンがそれに対して高めら
れた他の動物種に対して示すよりも該リガンドが
その受容体に対して大きい親和力を示すことであ
る。該結合リガンドのその受容体に対する親和力
は一義的に重要であり、受容体と結合リガンドと
の親和力が高ければ高い程、該結合リガンドは本
発明に使用するのに一層価値がある。 多種類の高力価高親和性結合リガンドが既知で
あり、本発明で使用するのに適している。例示的
物質はフルオレスセイン、ジニトロベンゼン、抗
原性多糖類、ナフチルアミン類、アクリジン類お
よびローダミン類である。フルオレスセインが好
ましい。 これらリガンドの多くは、極めて緩和な条件
下、すなわち放射性ヨード化、被覆試験管吸収ま
たは不溶性支持体への共有結合のような処理より
も一層少ない抗体力価のロスを生ずるような条件
下で受容体と結合させることができる。抗体力価
の重大な損失は、抗体が高力価高親和力に製造困
難である場合には許容できない。本発明は製造困
難な抗体または受容体に対し、安価な高力価高親
和性結合リガンド受容体を犠性にすることを可能
とする。なんとなれば結合リガンド受容体の共有
結合附着によつておこる力価の低下を、該受容体
の不溶化もしくはラジオアイソトープ標識化によ
つて生ずる低下以下に低くすることができるから
である。 リガンドが次に同一または異種のサンプルリガ
ンド受容体へ結合されるか否かにかかわらず、結
合リガンドとそれらの受容体との混合物が使用で
きる。前者の具体例は単一の受容体が使用される
一つのサンプルリガンドの定量に応用される。こ
の受容体は複数の異種結合リガンドで標識するこ
とが可能であり、また該リガンドは複数のそれに
対する受容体を提供することによつて不溶化され
る。後者の具体例は、複数のサンプルリガンドの
系列的定量に関して後で議論する。 結合するリガンドは受容体A1に種々の慣用結
合基を介して共有結合することができる。例えば
フルオレスセインが結合リガンドとして使用され
る場合には、フルオレスセインイソシアネート、
ジクロルトリアジニルアミノフルオレスセインま
たはヨードアセチルアミノフルオレスセインを使
用することができ、これらすべてはタンパクと共
有結合で容易に結合させることができ、前二者は
タンパクアミノ基へ、最後はスルフヒドリル基へ
結合する。類似のアクリジン化合物もタンパクへ
共有結合させることができる。ジニトロベンゼン
の場合は、２，４―ジニトロフロルベンゼンを使
用することができる。精製したバクテリア細胞壁
抗原のような多糖類の場合には、受容体への共有
結合は、多製類の過ヨード酸塩酸化、シツフ塩基
の形成およびその後の還元によつて達成すること
ができる。結合リガンドとしてナフチルアミンを
使用する場合には、ダンジルクロライドを受容体
との結合物を形成すべき反応剤として使用するこ
とができる。 サンプルリガンド受容体へ結合する結合リガン
ドの数とタイプとは、サンプルリガンド受容体の
サイズとそしてそのサンプリガンド結合部位の性
質とに依存する。普通は20以下、通常は１乃至５
の結合リガンドがサンプルリガンド受容体へ結合
する。受容体が大きければ大きい程、もつと多く
の結合リガンドがサンプルリガンドの結合を妨害
することなしに結合することができる。そのほか
に結合リガンドはサンプルリガンド結合部位もし
くはその附近で結合してはならない。もしサンプ
ルリガンド部位が未知であれば、そのときは該部
位は過剰のサンプルリガンドの存在下に結合を行
うか、または有機保護基の使用によつて保護する
ことができる。さらに結合するリガンドは、サン
プルリガンドと結合リガンドとの同時結合の立体
障害を最小にするかまたは除去するように、すな
わち結合するリガンドがサンプルリガンド受容体
結合部位からできるだけ遠くなつて、そのためサ
ンプルリガンドと結合リガンド受容体とが同時に
結合し得るように選定されそして配置される。こ
のパラメータは通常きまりきつた実験によつて最
適化される。 フルオレスセインの場合は、使用する特定の受
容体に応じてサンプルリガンド受容体重量の約
2.5％乃至50％範囲の結合リガンド割合が最適な
結果を与えることが判明しているが、しかしフル
オレスセインのみならず他の結合リガンドでも約
0.01乃至60重量％のかなりの広い範囲が使用でき
る。 結合リガンドが結合する受容体A1は、定量し
ようと欲するサンプルリガンドと特異的かつ可逆
的に結合するどんな分子でも通常よい。普通該受
容体は抗体のような結合するタンパクである。例
外的には、該受容体は最終的にサンプルリガンド
を結合する他の受容体に対して特異的であつても
よい。A1が抗体であるときは、それは抗原性リ
ガンド単独か、またはリガンドがハプテンであれ
ば抗原性タンパクへ共有結合したリガンドを注射
することにより、慣用の方法で適当な動物中に高
めることができる。非免疫性サンプルリガンド受
容体は種々のソースから単離することができ、そ
して多数のそのような結合性タンパクが市販され
ている。例えばサンプルリガンドビタミンB12に
対する結合するタンパクである内因子は、ブタの
腸から得ることができ、そしてサンプルリガンド
として葉酸に対する葉酸結合タンパクは再構成し
た脱脂粉乳から得ることができる。特異的結合定
量に使用するのに適当な多数の他の結合タンパク
は公知であり、そして例えば血漿中のチロキシン
の定量にチロキシン結合性グロブリン、血清コル
チゾールの定量にコルチゾール結合性タンパク、
およびACTHのようなペプチドホルモンの定量
に膜結合特異的受容体タンパクを本発明において
使用することができる。 結合性リガンド受容体であるＡBLは、好ましく
はどんな慣用方法においても該結合リガンドに対
する抗体を高めることによつて産生される。例え
ば該結合リガンドはウシ血清アルブミンへ共有結
合することができ、そして公知方法によつて抗体
を高めるのに使用することができる。ＡBLが抗体
である場合には、ＡBLを高めるのに使用する動物
はサンプルリガンド受容体を高めるのに使用する
動物と異なる必要はない。しかしながら該動物は
該結合リガンドに対して高められる高親和力と高
力価を持つ抗血清を産生する能力から選定されな
ければならない。結合リガンド受容体は、結合リ
ガンドとサンプルリガンド受容体との間の共有結
合とは対照的に、結合リガンドへ可逆的にＡBL(B
Ｌ）ｏA1複合体の形で結合される。このような可逆
的結合はこの分野では良く認められており、それ
らは単に結合リガンドとその受容体とを混合する
だけで普通形成されており、そして水素結合およ
びフアン、デル、ワールド力に基いているものと
考えられる。これらのもつと顕著な特性は、本発
明の場合はその平衡は解離よりも結合に有利に最
適化されるけれども質量作用の法則に支配されな
ければならないということである。 この結合リガンド受容体は、一般にサンプルリ
ガンドとは異なる結合リガンドに対して特異的活
性を示す。サンプルリガンドと結合リガンドとが
同じであることも可能であるけれども、サンプル
リガンドとサンプルリガンド受容体との結合体の
製造および使用は、余分の工程を伴う。製造の場
合、反応性のサンプルリガンド誘導体がサンプル
リガンド受容体と受容体の結合部位またはその近
所で共有結合することを防止することが必要であ
る。さもなけば該リガンドによる立体障害によつ
て該受容体はサンプルリガンドと少ししか結合し
ない。なおサンプルリガンドの傾向は丁度その点
においてその受容体と結合しようとする。しかし
ながらこの問題は、リガンドとその受容体とを、
該受容体を、該リガンドを含む不溶化したマトリ
ツクスへ結合するように結合させることによつて
克服することができる。 結合体の使用はもつと困難である。何となれば
サンプルリガンドが結合リガンドと異なる場合が
そうであるように、サンプルリガンドとサンプル
リガンド受容体とを同時に混合することは好まし
くないからである。 普通結合リガンド受容体を不溶化することが好
ましく、そしてそれを定量を始める前に行うこと
が好ましい。またサンプルリガンド受容体は特異
的結合定量を行う前または最中に不溶化すること
もできる。結合リガンド受容体の目的がすべての
成分が溶液中で反応し終つた後に不溶化を行うも
のである上述の受容体沈デンテクニツクの場合に
はそうではない。不溶化の一つのテクニツクが米
国特許第3646346号に記載されており、そこでは
受容体溶液は、十分な受容体が吸収されるまで単
にプラスチツク試験管壁と接触させられる。代り
に結合リガンド受容体は特定の懸濁液上へ吸収す
ることができる。また以前酵素または抗体につい
て使用されたタンパク不溶化方法のような良く知
られたテクニツクを使用して不溶性マトリツクス
へ共有結合で架橋することにより、またはポリエ
チレングリコールのような沈デン剤を使用する
か、もしくはグルタルアルデヒドのような架橋剤
を使用して凝集によつて受容体を不溶化すること
も本発明の範囲内である。これら方法の組み合わ
せも同様に使用することができる。例えば凝集し
た受容体をプラスチツク試験管へ吸収することが
できる。 本発明の複合体は前述した公知の双受容体特異
的結合定量法のすべてと、そしてこの複合体を使
用することによつて改善することのできる二つの
他の方法に使用することができる。他の方法と
は、親和力クロマトグラフイーと、そして再負荷
特異的結合定量法の二つである。 親和力クロマトグラフイーは、不純溶液から酵
素、抗体、抗原および血液タンパク分画のような
物質を精製するための良く知られた技術である。
例えばCuatrecasas et al、Annual Review of
Biochemistry， volume 40，p.259（1971）お
よび米国特許第3842061号参照。この技術は所望
の物質の結合パートナーを不溶化し、不純溶液を
該結合パートナー上を通過させ、結合した不溶化
した物質を洗浄し、そして例えばPHもしくはイオ
ン強度を変えることによつて結合した物質を溶離
することよりなる。この親和力クロマドグラフイ
ーは、前述した特異性結合定量法の欠点、すなわ
ち不溶化した結合パートナーとその可溶性結合物
質との間の低親和性、および結合した物質を不溶
性親和力マトリツクスから分離することの困難を
免れ得ない。本発明の複合体の使用は分離効率を
改善する。また不溶化した結合リガンド受容体か
ら所望の物質および結合リガンド結合物の凝集体
の分離は、結合リガンドの過剰を凝集体へ加える
ときの結合リガンド置換によつて簡単にされる。
所望の物質はその後透析その他でその受容体から
容易に分離することができる。 連続流でもバツチ式でも、接触する不溶性マト
リツクスを使用する多数回の慣用特異的結合定量
法を実施する能力は、本発明の複合体によつて大
きく高められる。このような定量法の顕著な特徴
は、それらは同じ容器内で実施されるということ
であり、それら定量法は、互に差別することので
きる異なるラジオアイソトープ、例えば 57Coお
よび 125I（米国特許第3952091）の使用により、
またはめいめいの副成分へ結合した受容体の一種
を持つている装置の副成分を除去することによ
り、分離または区別することができる。このよう
な副成分は試験管の内壁へ付着させた条片または
礼でよい。本発明は異なつた標識を持つているサ
ンプルリガンド類縁体を合成するかなりの不便さ
を解消し、そしてラジオイムノアツセイの場合は
実用的標識として使用し得るラジオアイソトープ
の数の固有の制限を克服する。特に本発明の改良
された受容体複合体は、再負荷特異的結合定量系
に価値ある用途を有する。 そのような系は公知であり、例えばアメリカ特
許第4053284号、同4039652号を参照。本発明によ
つて達成されるサンプルリガンドのその受容体に
よる吸収の改善された動力学は、連続流定量にお
いて相当に有利である。何故ならば受容体の量を
減らすことが可能であり、または流量を増すこと
が可能であるからである。そのほかに結合リガン
ド受容体をその上に不溶化して持つている単一の
吸収剤をすべての定量に使用することができ、異
なる測定を行う度毎に吸収剤を取り換える必要が
ない。サンプルリガンドを取り換えることがしば
しば不便である自動化設備においては、このこと
が特に有利である。最後に結合した標識したサン
プルリガンド類縁体の溶出は、結合リガンド受容
体から結合リガンドとサンプルリガンド受容体の
容易な可逆結合によつて容易化される。結合リガ
ンドはその環境の小変化、例えばPHを２だけ低下
させることによつて離れるものが選定される。こ
れら小変化は、これまでに採用された強い条件、
例えばPH2.5と異なつて、結合リガンド受容体を
不可逆的に変性することがない。 多数回再負荷特異的結合定量法の例示的具体例
は、その内壁をフルオレスセインに対するウサギ
抗体で被覆したコイル状毛細管を使用する。ビタ
ミンB12とトリヨードチロニンを順番に定量する
方法は、該チユーブ内を以下の試薬を含む溶液を
そこで述べる順序で通過させ、めいめいの溶液の
後で適度に希薄食塩水または水で洗浄することよ
りなる。 (1) フルオレスセイン―内因子結合物 (2) テストサンプルと 57Co標識ビタミンB12との
混合物 (3) 弱酢酸 (4) フルオレスセイン―トリヨードチロニン抗体 (5) テストサンプルと 125I標識トリヨードチロニ
ンとの混合物 (6) 弱酢酸 標準および対照も同じ方法で繰り返す。溶出さ
れた放射能または標識したサンプルリガンドの通
過後毎に保持された放射能を測定することができ
る。保持された放射能は、コイル状毛細管の近所
へ適当な放射能カウンターを置くことによつて測
定することができる。試薬(1)および(2)、(4)および
(5)は、毛細管を通過させる前に合併することがで
きる。 別法として、毛細管の内壁へフルオレスセイン
受容体とジニトロベンゼン受容体の混合物を吸収
させ、毛細管をテストサンプル、 57Co標識ビタ
ミンB12， 125I標識トリヨードチロニン、フルオ
レスセイン―内因子結合物およびジニトロベンゼ
ン―トリヨードチロニン抗体結合物の混合物を通
過させ、フルオレスセイン水溶液を毛細管を通過
させ、洗液の放射能を測定し、ジニトロベンゼン
の水溶液を毛細管を通過させ、そして洗液の放射
能を測定するのがもつと便利である。上述の二つ
の実例においては、二つの異なる標識の存在は同
一であるが、この方法は 125Iが唯一の標識である
他の定量法でも等しくよく実施できる。 本発明がもつとも良く適する三種の慣用の双受
容体特異的結合定量法へ転ずると、試薬の濃度、
インキユベーシヨン時間および他の定量操作パラ
メーターは、この発明による双受容体の使用によ
り大きくは変更されないことを注意すべきであ
る。定量を最適とするため必要な少しの修正は、
当業者が行い得る範囲である。 多結合性サンプルリガンドのための改良したユ
ニバーサル標識テクニツクにおいては、本発明の
複合体は、ガンマグロブリンと標識した抗ガンマ
グロブリンとの結合体の代りに、標識した結合リ
ガンド受容体と一所に使用する。典型的な定量法
は、不溶性サンプルリガンド受容体を調製し、こ
の受容体をサンプルとサンプルリガンドのいくら
かまたはその比例量が不溶性のその受容体に吸収
されるように接触させ、不溶物質を洗浄し、次に
それを結合リガンドのサンプルリガンド受容体へ
の結合物と接触させ、それにより事実上吸収され
たサンプルリガンドの量が結合リガンドで標識さ
れるようにし、洗浄し、そして最後に不溶性物質
を直接検出し得る物質、例えば酵素、ラジオアイ
ソートプまたは安定なフリーラジカルで標識され
た結合リガンド受容体と接触させる各工程よりな
る。標準および対照も同じ方法で処理される。洗
浄工程は任意であるが、それらはもつとも再現性
があり感度ある結果を得るためには好ましい。こ
れに関し、サンプル、結合物および標識した結合
リガンド受容体の添加はすべて―工程で実行でき
る。しかしながら標識した複合体は、サンプルが
結合し終りそして不溶性サンプルリガンド受容体
がなくなるまで洗つた後に添加するのが好まし
い。サンプルリガンド受容体は、反応終了後に不
溶化することができる。 不溶化手段として双受容体を使用する定量法
は、不溶性支持体へ結合または吸収された結合リ
ガンド受容体を持つているか、または該結合リガ
ンド受容体が結合リガンド―サンプルリガンド受
容体結合物をそれへ結合するときに不溶化する。
この相分離工程は該定量法の中心への単なる附加
工程である。このように本発明の複合体は、競合
的もしくは直接的特異的結合定量法のいずれにも
調和して使用することができる。 典型的な双受容体、直接特異的結合定量法は、
本発明の複合体を前記サンプルリガンドを含んで
いると考えられるサンプルと接触させ、それによ
り存在する該サンプルリガンドを前記結合物によ
つて吸収し、前記複合体を洗浄し、前記複合体を
標識したサンプルリガンド類縁体と接触させ、複
合体を洗浄し、そして残つている結合した、また
は未結合標識サンプルリガンド類縁体の量を測定
することよりなる。 代表的な、双受容体競合特異的結合定量法は、
本発明の複合体を、標識したサンプルリガンド類
縁体と該サンプルリガンドを含んでいると考えら
れるサンプルとに同時に接触させ、それによつて
前記サンプルと前記標識サンプルリガンド類縁体
とをそれらの溶液中の濃度に比例して前記複合体
へ競合的に結合させ、複合体を洗浄し、そして残
つている結合した、もしくは未結合標識サンプル
リガンド類縁体の量を測定することよりなる。 サンドイツチタイプの双受容体特異的結合定量
法は、本発明の複合体を前記サンプルリガンドを
含んでいると考えられるサンプルと接触させ、そ
れによつて存在する該サンプルリガンドを前記複
合体に吸収し、吸収したサンプルリガンドを該サ
ンプルリガンドに対する標識受容体の過剰と接触
させ、複合体を洗浄し、そして残りの結合した、
または未結合の標識した受容体の量を測定するこ
とからなる。 本発明のこの高められたサンドイツチ法は、
こゝで肝炎関連抗原と呼ぶ肝炎の徴候と考えられ
る抗原の定量に特に有利である。以前のサンドイ
ツチ定量法を上廻るピペツトおよび洗浄工程の節
約が得られる。従前の肝炎関連抗原定量法は、肝
炎関連抗原への抗体で被覆した不溶性表面を調製
し、該表面をテストサンプルと接触させ、該表面
を洗浄し、さらに該表面を肝炎関連抗原へ対する
標識した抗体と接触させ、該表面を洗浄し、そし
て可溶相および不溶相間における標識した抗体の
分布を測定することよりなる。本発明の改良方法
は、肝炎関連抗原への抗体で被覆した不溶性表面
の代りに、式Ｑ―ＡBL(BL)oA1の複合体を使用す
ることを含む。該式中Ｑは不溶性支持体であり、
BLは結合するリガンドであり、ＡBLはBLに対す
る受容体であり、ｎは少なくとも１であり、そし
てA1は肝炎関連抗原に対する抗体である。この
複合体を使用するときは、これまでの不溶性表面
をサンプルと接触させ、ついで肝炎関連抗原への
標識した抗体へ接触させる一連の工程を組み合わ
せ、このようにして洗浄およびピペツト工程をな
くすのが好ましい。 検出剤として標識した受容体を使用する従前技
術の特異的結合定量法、例えば前述のサンドイツ
チ定量法は、そのほかにユニバーサル受容体法と
組み合わせることができる。しかしながらこの場
合は、不溶性サンプルリガンド受容体複合体に使
用する結合リガンドは、標識したサンプルリガン
ド受容体複合体に使用するそれと異なることが推
奨される。 前述した公知の特異的結合定量法に使用される
特定の操作パラメーターおよび緩衝液のような慣
用の試薬の調製方法は、本発明の複合体にも使用
することができる。例えば抗体のような不溶性受
容体の製造方法は良く知られており、そして適当
な標識したサンプルリガンド類縁体もそうであ
る。反応条件の小さな修正は当業者の技術の範囲
内であり、こゝで強調するには及ばない。 本発明の方法および組成物は、普通キツトに具
体化される。例えば競合的特異的結合定量法は、
一般に標識したサンプルリガンド類縁体、緩衝液
結合リガンド受容体と該結合リガンドへ共有結合
で結合された、サンプルリガンドに特異的な受容
体よりなる複合体であつてサンプルリガンドと標
識した類縁体の両方へ同時に溶液中で結合するこ
とのできる複合体、そして複合体とサンプルリガ
ンドとサンプルリガンド類縁体との結合体を不溶
化する手段を含んでいるキツトで市販されるであ
ろう。該不溶化手段は、例えば定量を実施するた
めの試験管として使用することができて、そして
その内側表面へ結合リガンドの受容体を吸収させ
たポリプロピレン製、ポリスチレン製もしくは他
の適当なプラスチツク製のチユーブの形をしたプ
ラスチツク表面とすることができる。該手段はま
た、例えばデキストランもしくはガラス球のよう
な水不溶性固体粒子であつて、それへ結合リガン
ドの受容体を慣用方法で共有結合させたものとす
ることができる。不溶化手段は、結合リガンドの
受容体を選択的にあらかじめ凝集するのに使用す
るポリエチレングリコールのような試薬とするこ
ともできる。この場合は結合リガンドおよびあら
かじめ凝集した受容体を共有結合によつて結合し
た、反応に中性な担体タンパク、例えばガンマグ
ロブリンをそのほかに使用するのが好ましい。こ
の予凝集物質は結合物の不溶化を助ける。このキ
ツトは通常結合リガンド受容体と、結合リガンド
ーサンプルリガンド受容体結合物との別々の部分
標本を含むであろうが、しかしこれらは単一の試
薬中に合併することもできる。結合物中の結合リ
ガンドと、そしてサンプルリガンドの受容体との
相対的比率は広い範囲で変えることができる。フ
ルオレスセインのような結合リガンドと抗体もし
くは結合性タンパクのような受容体との結合、例
えばフルオレスセインイソシアネートをそれらに
反応させることによる結合は、結合リガンドの非
常に大割合、ある場合には等重量以上が結合する
までは、受容体がそれらのそれぞれのサンプルリ
ガンドと結合する能力へ重大な影響を与えない。
結合リガンドの割合の増加による結合能力の減少
の程度は、特定の受容体毎に、そして個々の結合
リガンド毎に変化する。どの場合でも、サンプル
リガンドとの最大の結合力を与え、同時に不溶化
を確実にするため結合物の結合リガンドの受容体
に対する十分な結合力を与える割合もしくはその
範囲を決定するためには、簡単な試行錯誤を実施
すればよい。 以下の特定の実施例は例証のためであり、本発
明の範囲を制限するためのものではない。 実施例 １ 以下の成分を含有するビタミンB12定量用のキ
ツトを調製した。 １ 既知量のビタミンB12を含有する標準溶液。 ２ 57Coを含有するビタミンB12の標識類縁体。 ３ グルタミン酸の緩衝溶液。 ４ 内因子とフルオレスセインとが結合した複合
体の溶液。 ５ ポリエチレングリコールで処理し、次に予凝
集したウサギフルオレスセイン抗血清。 ６ フルオレスセインを結合した担体タンパク
（ウシガンマグロブリン）の溶液。 標準溶液は、リン酸塩緩衝食塩水リン酸カリウ
ム10mM、食塩0.9％、NaN30.1％、PH7.4）中ヒト
血清アルブミン40mg／mlと、ウシガンマグロブリ
ン20mg／mlとを含んでいるタンパク溶液中へ適当
量のビタミンB12を加えることによつて調製した
（前記緩衝液を以後「PBS」という）。最終標準液
は１ml当りビタミンB12をそれぞれ2000，1000，
500，200，100，50およびゼロピコグラムを含有
していた。 標識した類縁体の溶液は、100マイクロリツト
ルが毎分約10000カウント（約30ピコグラム）含
有するように希釈したコバルト57で標識したビタ
ミンB12の溶液である。 上のNo.３の緩衝液は、グルタミン酸、ゼラチン
およびシアン化カリウムを41mM、0.1％および
2.1mM濃度にそれぞれ含有し、PH3.5であつた。
この緩衝液はビタミンB12のような化合物をサン
ブル中の特異的結合タンパクが分離し、それをシ
アノ誘導体へ変える役目を果す。 複合体の溶液は、以下の操作によるフルオレス
セインイソシアネートとの反応によつて共有結合
させた内因子を含んでいた。炭酸塩緩衝液
（0.5M，PH9.4）１mlと内因子２mgとを含んでい
る試験管へ、フルオレスセインイソシアネート１
mgを含んでいる炭酸塩緩衝液２mlを加えた。かき
まぜた後反応液を一夜室温で放置する。それを次
に10mlピペツト中９ml（全ベツト容積）の多糖類
（セフアデツクスＧ―25）のカラムへ適用し、
PBS（リン酸塩25mM濃度）で平衡化した。PBS
で溶出すると、空白体積とともに着色した単一バ
ンドが得られた。これを集め、（0.3mg／ml）そし
てPBSで１：65に希釈した。 ウサギフルオレスセイン抗体は、フルオレスセ
インイソシアネート1gとウシ血清アルブミン1g
とを0.5M炭酸塩緩衝液PH9.5の30ml中へ溶解し、
室温で一夜ゆるやかにかきまぜることによつて反
応を進行させることによつて調製した。混合物を
次に透析物中にフルオレスセインが検出されなく
なるまでPBSでよく透析した。溶液を凍結乾燥
し、固形物をフロインドのアジユバンド中でウサ
ギに投与した。フルオレスセイン抗体を含んでい
るウサギから得られた血清は、イムノグロブリン
を沈デンするように抗血清を硫安飽和度40％と
し、沈デンをもとの抗血清の体積と等しいPBS中
に再懸濁することによつて部分精製した。これを
ポリエチレングリコール6000を６％含有するPBS
中へ１：50に希釈することによつて予備凝集し
た。かきまぜた懸濁液は、使用前室温で少なくと
も１時間平衡化させた。 フルオレスセインへ結合した担体タンパクは、
前述のフルオレスセイン結合ウシ血清アルブミン
の製造方法と同じ操作を使用し、フルオレスセイ
ンイソシアネートとウシガンマグロブリンとをモ
ル比20：１で0.5M炭酸塩緩衝液で室温で反応さ
せることによつて製造した。製品はタンパク3.5
mg／mlを含む溶液となるようにPBSで１：10に希
釈した。 定量は、別々の12×75mmガラス試験管へそれぞ
れ0.5mlづつのグルタミン酸緩衝溶液と、場合に
応じてビタミンB12の標準液または未知溶液の0.1
mlづつを加せることによつて実施した。100℃で
20分間インキユベートし、そして室温へ冷却した
後、それぞれの試験管へ標識した類縁体溶液0.1
mlづつとそして複合体溶液0.1mlづつを加え、混
合物を37℃で１時間インキユベートした。次に各
試験管へフルオレスセインへ結合した支持体タン
パク0.1mlと、予備凝集した抗フルオレスセイン
抗体1.0mlとを加え、混合物を37℃で20分間イン
キユベートし、その後試験管を5000rpmで15分間
遠心した。上清を傾しやし、沈デンしたペレツト
についてガンマカウンタで残存放射能を測定し
た。複合体の溶液を除くすべての成分を含んでい
る類似の試験管中には、特別な自然カウントは測
定されなかつた。 標準溶液についての成績は次のとおりであつ
た。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝11150
【表】
本発明によるヒト血清の定量結果と、慣用のラ
ジオイムノアツセイ法により得られた結果との比
較は、満足な相関関係を示した。 実施例 ２ それぞれが実施例１の成分No.１乃至No.４と類似
しているが、しかし以下の違いを有する成分を含
んでいるヒト血清中のビタミンB12定量用のキツ
トを調製した。グルタミン酸緩衝液は、0.05Mホ
ウ酸ナトリウム、KCN8マイクログラム／ml、PH
9.3のホウ酸塩変性緩衝液で置き換えた。この緩
衝液はビタミンB12結合タンパクを変性し、該ビ
タミンを定量のために遊離する。複合体溶液は、
フルオレスセインを内因子の重量の0.5／１の比
でなく、0.275／１の比を使用して調製し、溶液
を0.1％NaN3の代りに0.02％KCNを使用した同様
なPBS（以後「PBS―KCN」という）で１：65の
代りに１：500に希釈した。標準溶液はPBS―
KCN中ヒト血清アルブミン7g／の溶液を用い
て調製した。実施例１のNo.５およびNo.６の成分の
代りに被覆した試験管を以下のように調製した。 実施例１のように調製したウサギフルオレスセ
イン抗血清の再懸濁した硫安沈デンの１／２mlを
PH6.0のPBS400mlと混合した。混合物を37℃へ加
温し、それへ添加前に37℃へ加温したPBSPH6.0
中のグルタルアルデヒド２％溶液100mlを加え
た。それへ新たに調製したリン酸緩衝液1.0M、
PH8.5の400mlを加え、混合物をかきまぜ、その後
新たに調製したナトリウムボロハイドライド水溶
液0.051Mの75mlを加えた。混合物を室温で半時
間かきまぜ、1.0Mリン酸緩衝液PH8.5中2.67％の
新たに調製したアスコルビン酸溶液250mlを加え
た。得られた溶液１mlづつを所望本数の10×75mm
ポリプロピレン試験管中へ加え、そして室温で一
夜放置した。各試験管から溶液を吸引除去し、各
試験管をゼラチン１％とEDTA0.01Mを含むPH7.5
の10mMトリス緩衝液で２回洗浄した。試験管を
乾燥し、使用するまでデシケーター中に室温で貯
蔵した。 定量は、まず成分No.２とNo.３とをホウ酸塩変性
緩衝液が緩衝液0.8ml当り放射性B12を30ピコグラ
ム含有するように混合することによつて実施し
た。めいめいが成分No.２およびNo.３の混合物0.8
mlを含有する一連の12×75mmガラス試験管を用意
し、場合に応じて適当な標準溶液または未知溶液
の0.1mlを各チユーブへ加えた。各試験管を100℃
で45分間インキユベートし、次に室温へ冷却し、
複合体溶液0.1を加えた。めいめいの試験管内容
物を被覆した試験管の一つへ傾しやし、それを37
℃で３時間インキユベートした。吸引し、PBS2
mlで２回洗浄後、試験をガンマーカウンターで１
分間カウントした。結果は次のとおりであつた。 加えた標識類縁体の総カウント／分＝10600数
値は２回の測定値の平均値を示す。
ジオイムノアツセイ法により得られた結果との比
較は、満足な相関関係を示した。 実施例 ２ それぞれが実施例１の成分No.１乃至No.４と類似
しているが、しかし以下の違いを有する成分を含
んでいるヒト血清中のビタミンB12定量用のキツ
トを調製した。グルタミン酸緩衝液は、0.05Mホ
ウ酸ナトリウム、KCN8マイクログラム／ml、PH
9.3のホウ酸塩変性緩衝液で置き換えた。この緩
衝液はビタミンB12結合タンパクを変性し、該ビ
タミンを定量のために遊離する。複合体溶液は、
フルオレスセインを内因子の重量の0.5／１の比
でなく、0.275／１の比を使用して調製し、溶液
を0.1％NaN3の代りに0.02％KCNを使用した同様
なPBS（以後「PBS―KCN」という）で１：65の
代りに１：500に希釈した。標準溶液はPBS―
KCN中ヒト血清アルブミン7g／の溶液を用い
て調製した。実施例１のNo.５およびNo.６の成分の
代りに被覆した試験管を以下のように調製した。 実施例１のように調製したウサギフルオレスセ
イン抗血清の再懸濁した硫安沈デンの１／２mlを
PH6.0のPBS400mlと混合した。混合物を37℃へ加
温し、それへ添加前に37℃へ加温したPBSPH6.0
中のグルタルアルデヒド２％溶液100mlを加え
た。それへ新たに調製したリン酸緩衝液1.0M、
PH8.5の400mlを加え、混合物をかきまぜ、その後
新たに調製したナトリウムボロハイドライド水溶
液0.051Mの75mlを加えた。混合物を室温で半時
間かきまぜ、1.0Mリン酸緩衝液PH8.5中2.67％の
新たに調製したアスコルビン酸溶液250mlを加え
た。得られた溶液１mlづつを所望本数の10×75mm
ポリプロピレン試験管中へ加え、そして室温で一
夜放置した。各試験管から溶液を吸引除去し、各
試験管をゼラチン１％とEDTA0.01Mを含むPH7.5
の10mMトリス緩衝液で２回洗浄した。試験管を
乾燥し、使用するまでデシケーター中に室温で貯
蔵した。 定量は、まず成分No.２とNo.３とをホウ酸塩変性
緩衝液が緩衝液0.8ml当り放射性B12を30ピコグラ
ム含有するように混合することによつて実施し
た。めいめいが成分No.２およびNo.３の混合物0.8
mlを含有する一連の12×75mmガラス試験管を用意
し、場合に応じて適当な標準溶液または未知溶液
の0.1mlを各チユーブへ加えた。各試験管を100℃
で45分間インキユベートし、次に室温へ冷却し、
複合体溶液0.1を加えた。めいめいの試験管内容
物を被覆した試験管の一つへ傾しやし、それを37
℃で３時間インキユベートした。吸引し、PBS2
mlで２回洗浄後、試験をガンマーカウンターで１
分間カウントした。結果は次のとおりであつた。 加えた標識類縁体の総カウント／分＝10600数
値は２回の測定値の平均値を示す。
【表】
実施例 ３
以下の成分を含む葉酸定量用のキツトを調製し
た。 １ 既知量のＮ―メチルテトラヒドロ葉酸と保存
剤としてアスコルビン酸５mg／mlとを含んでい
るヒト血清の標準溶液。 ２ リジン変性緩衝液。 ３ 定量用リン酸緩衝液（実施例１記載のPBSま
たは、好ましくはリン酸0.01M、NaCl0.15M、
EDTAおよびNaN3、PH7.3）。 ４ 放射性ヨード化（ 125I）したプテロイルグル
タミン酸を含んでいる標識した葉酸類縁体の溶
液。 ５ 葉酸結合性タンパクーフルオレスセイン複合
体へ結合したフルオレスセイン抗体で被覆した
ポリプロピレン試験管。 血清標準溶液は、既知量の葉酸を再添加する以
前に内因性葉酸を除去するためあらかじめ活性炭
で処理された正常なヒト血清をベースにした市販
製品である。リジン変性用緩衝液は、リジン
0.007Mと、アスコルビン酸１mg／mlを含有し、
PH10.5を持つていた。 複合体溶液はフルオレスセインイソシアネート
へ共有結合した葉酸結合性タンパクを含み、以下
の方法で調製された。約10％が葉酸結合性タンパ
クである市販の親和クロマトグラフイーで精製し
た葉酸結合性タンパク混合物（シグマ）１mgを
0.1M炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、PH9.3の0.1ml中へ
溶解した。これへフルオレスセインイソシアネー
ト異性体Ｉ（シグマ）200マイクログラムを同じ
炭酸塩緩衝液0.1mlへ溶解した溶液を加れた。溶
液を暗室中室温で３時間かきまぜた。反応液を10
mlの使い捨て用血清学用ピペツト（ベツド体積５
ml）中へ準備したセフアデツクスG25のカラムへ
通すことにより、未反応フルオレスセインイソシ
アネートをタンパク分画から分離した。セフアデ
ツクスを膨潤し、タンパクをカラムからリン酸緩
衝液で溶出した。クロマトグラフイーカラムから
のタンパク分画をプールし、１ml当りタンパク
8.3マイクログラムを含むストツク溶液を得るよ
うに緩衝液で１：3000に希釈した。複合体は希釈
して貯蔵すると不安定であるから、希釈は使用直
前に実施しなければならない。 葉酸結合性タンパク−フルオレスセイン複合体
へ結合したフルオレスセイン抗体で被覆したポリ
プロピレン試験管は、二段階で調製した。最初実
施例２に記載のようにフルオレスセイン抗体被覆
試験管をつくる。次に複合体20，40または80ナノ
グラム／mlを含むリン酸緩衝液１mlを20本の試験
管へ加え、該試験管を暗室中室温で一夜放置し、
洗浄し、乾燥した。次に標準曲線を以下に説明す
るように引き、標準曲線中間点、スロープおよび
最大結合をもとにして最適複合体濃度を決定す
る。複合体40ナノグラム／mlが普通満足である。
複合体試験管は、最適複合体濃度で上述のように
調製した。 定量は、未被覆12×75mmポリプロピレン試験管
中へ選定した標準溶液または未知溶液の0.1ml
と、リジン変性用緩衝液0.5mlとを加えることに
よつて実施した。試験管をカバーし、100℃で15
分間インキユベートし、そして室温へ冷却した。
次に試験管へ標識した葉酸類縁体を含むPH7.3の
リン酸緩衝液0.5mlを加えた。この試験管の内容
物を混合し、対応するフルオレスセイン抗体―複
合体で被覆したポリプロピレン試験管へ移し、こ
れを37℃で90分間インキユベートした。この後試
験内容物を吸引除去し、ガンマカウンターで１分
間カウントした。フルオレスセイン抗体ー複合体
被覆試験管へ、最初の添加を２番目の添加から15
分間のインキユベーシヨンで分離して、サンプル
もしくは標準試験管および標識類縁体を順番に加
えるのが望ましい。 結果は以下のとおりである。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝25986
た。 １ 既知量のＮ―メチルテトラヒドロ葉酸と保存
剤としてアスコルビン酸５mg／mlとを含んでい
るヒト血清の標準溶液。 ２ リジン変性緩衝液。 ３ 定量用リン酸緩衝液（実施例１記載のPBSま
たは、好ましくはリン酸0.01M、NaCl0.15M、
EDTAおよびNaN3、PH7.3）。 ４ 放射性ヨード化（ 125I）したプテロイルグル
タミン酸を含んでいる標識した葉酸類縁体の溶
液。 ５ 葉酸結合性タンパクーフルオレスセイン複合
体へ結合したフルオレスセイン抗体で被覆した
ポリプロピレン試験管。 血清標準溶液は、既知量の葉酸を再添加する以
前に内因性葉酸を除去するためあらかじめ活性炭
で処理された正常なヒト血清をベースにした市販
製品である。リジン変性用緩衝液は、リジン
0.007Mと、アスコルビン酸１mg／mlを含有し、
PH10.5を持つていた。 複合体溶液はフルオレスセインイソシアネート
へ共有結合した葉酸結合性タンパクを含み、以下
の方法で調製された。約10％が葉酸結合性タンパ
クである市販の親和クロマトグラフイーで精製し
た葉酸結合性タンパク混合物（シグマ）１mgを
0.1M炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、PH9.3の0.1ml中へ
溶解した。これへフルオレスセインイソシアネー
ト異性体Ｉ（シグマ）200マイクログラムを同じ
炭酸塩緩衝液0.1mlへ溶解した溶液を加れた。溶
液を暗室中室温で３時間かきまぜた。反応液を10
mlの使い捨て用血清学用ピペツト（ベツド体積５
ml）中へ準備したセフアデツクスG25のカラムへ
通すことにより、未反応フルオレスセインイソシ
アネートをタンパク分画から分離した。セフアデ
ツクスを膨潤し、タンパクをカラムからリン酸緩
衝液で溶出した。クロマトグラフイーカラムから
のタンパク分画をプールし、１ml当りタンパク
8.3マイクログラムを含むストツク溶液を得るよ
うに緩衝液で１：3000に希釈した。複合体は希釈
して貯蔵すると不安定であるから、希釈は使用直
前に実施しなければならない。 葉酸結合性タンパク−フルオレスセイン複合体
へ結合したフルオレスセイン抗体で被覆したポリ
プロピレン試験管は、二段階で調製した。最初実
施例２に記載のようにフルオレスセイン抗体被覆
試験管をつくる。次に複合体20，40または80ナノ
グラム／mlを含むリン酸緩衝液１mlを20本の試験
管へ加え、該試験管を暗室中室温で一夜放置し、
洗浄し、乾燥した。次に標準曲線を以下に説明す
るように引き、標準曲線中間点、スロープおよび
最大結合をもとにして最適複合体濃度を決定す
る。複合体40ナノグラム／mlが普通満足である。
複合体試験管は、最適複合体濃度で上述のように
調製した。 定量は、未被覆12×75mmポリプロピレン試験管
中へ選定した標準溶液または未知溶液の0.1ml
と、リジン変性用緩衝液0.5mlとを加えることに
よつて実施した。試験管をカバーし、100℃で15
分間インキユベートし、そして室温へ冷却した。
次に試験管へ標識した葉酸類縁体を含むPH7.3の
リン酸緩衝液0.5mlを加えた。この試験管の内容
物を混合し、対応するフルオレスセイン抗体―複
合体で被覆したポリプロピレン試験管へ移し、こ
れを37℃で90分間インキユベートした。この後試
験内容物を吸引除去し、ガンマカウンターで１分
間カウントした。フルオレスセイン抗体ー複合体
被覆試験管へ、最初の添加を２番目の添加から15
分間のインキユベーシヨンで分離して、サンプル
もしくは標準試験管および標識類縁体を順番に加
えるのが望ましい。 結果は以下のとおりである。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝25986
【表】
【表】
実施例 ４
以下の成分を含むトリヨードチロニン（Ｔ―
３）定量用キツトを調製した。 １ Ｔ―３の既知量を含んでいる標準液。 ２ 125Iを含む標識したＴ―３類縁体溶液。 ３ 緩衝液（PBS）。 ４ フルオレスセインへ結合したＴ―３抗体の複
合体溶液。 ５ 実施例１記載のように予備凝集したウサギフ
ルオレスセイン抗体。 ６ 実施例１記載のように調製したフルオレスセ
インへ結合した担体タンパクの溶液。 成分１および２の溶液は活性成分をPBS中へ溶
解して調製した。成分２は0.1mlが約10000カウン
ト／分を与えるような濃度に調製した。 複合体溶液は、市販のＴ―３抗体を内因子に代
え、溶出した生成物（0.3mg／ml）の希釈度を
PBSにより１：900としたことを除いて、実施例
１の複合体の調製に使用た同じ方法で調製した。 定量は、12×75mmガラス試験管へPBS0.5mlづ
つと、そして選んだ標準液または未知溶液0.1ml
を加えることによつて実施した。残りの工程は、
この実施例の成分を実施例１の対応する成分の代
りに使用し、実施例１に記載したように実施し
た。 標準液に対する成績は次のとおりであつた。 載加した標識類縁体の総カウント／分＝10400
３）定量用キツトを調製した。 １ Ｔ―３の既知量を含んでいる標準液。 ２ 125Iを含む標識したＴ―３類縁体溶液。 ３ 緩衝液（PBS）。 ４ フルオレスセインへ結合したＴ―３抗体の複
合体溶液。 ５ 実施例１記載のように予備凝集したウサギフ
ルオレスセイン抗体。 ６ 実施例１記載のように調製したフルオレスセ
インへ結合した担体タンパクの溶液。 成分１および２の溶液は活性成分をPBS中へ溶
解して調製した。成分２は0.1mlが約10000カウン
ト／分を与えるような濃度に調製した。 複合体溶液は、市販のＴ―３抗体を内因子に代
え、溶出した生成物（0.3mg／ml）の希釈度を
PBSにより１：900としたことを除いて、実施例
１の複合体の調製に使用た同じ方法で調製した。 定量は、12×75mmガラス試験管へPBS0.5mlづ
つと、そして選んだ標準液または未知溶液0.1ml
を加えることによつて実施した。残りの工程は、
この実施例の成分を実施例１の対応する成分の代
りに使用し、実施例１に記載したように実施し
た。 標準液に対する成績は次のとおりであつた。 載加した標識類縁体の総カウント／分＝10400
【表】
実施例 ５
複合体中の重量比がＴ―３抗体mg当りフルオレ
スセインイソシアネート0.1mgであり、そして溶
出した複合体生成物（0.3mg／ml）の希釈度が
PBSにより１：334である点を除いては実施例４
のそれらと同じである成分１乃至４を含んでいる
Ｔ―３定量用キツトを調製した。実施例４の成分
４および５の代りに、以下のように被覆した試験
管を調製した。 実施例１に記載のように調製した再懸濁したウ
サギ抗フルオレスセイン抗体を予備凝集せずに、
その代り80％飽和度硫安溶液の等容積で希釈し
た。生成する沈デンを一夜４℃に放置し、遠心し
て集め、そしてPBSの同量に再懸濁した。この精
製溶液を次にPH8.5の0.5Mリン酸緩衝液で１：
1000に希釈した。希釈した溶液の１mlを必要数の
10×75mmポリプロピレン試験管のそれぞれへ入
れ、室温で一夜放置した。各試験管から溶液を吸
引除去し、試験管をPH7.4のゼラチン１％を含む
10mMトリス緩衝液２mlで２回洗つた。試験管を
乾燥し、使用するまで４℃で貯蔵した。 定量は、各被覆試験管へ、PBS1.0ml、標識し
た類縁体の溶液0.1ml、そして場合に応じて選定
した標準溶液もしくは未知溶液0.1mlを加えるこ
とによつて実施した。この混合物へ複合体溶液
0.1mlを加えた。内容物とともにこの試験管を37
℃で１時間インキユベートした。内容物を次に吸
引除去し、各試験管をPBS2mlで１回洗い、試験
管をカウントした。 標準溶液についての結果は次のとおりであつ
た。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝17500
スセインイソシアネート0.1mgであり、そして溶
出した複合体生成物（0.3mg／ml）の希釈度が
PBSにより１：334である点を除いては実施例４
のそれらと同じである成分１乃至４を含んでいる
Ｔ―３定量用キツトを調製した。実施例４の成分
４および５の代りに、以下のように被覆した試験
管を調製した。 実施例１に記載のように調製した再懸濁したウ
サギ抗フルオレスセイン抗体を予備凝集せずに、
その代り80％飽和度硫安溶液の等容積で希釈し
た。生成する沈デンを一夜４℃に放置し、遠心し
て集め、そしてPBSの同量に再懸濁した。この精
製溶液を次にPH8.5の0.5Mリン酸緩衝液で１：
1000に希釈した。希釈した溶液の１mlを必要数の
10×75mmポリプロピレン試験管のそれぞれへ入
れ、室温で一夜放置した。各試験管から溶液を吸
引除去し、試験管をPH7.4のゼラチン１％を含む
10mMトリス緩衝液２mlで２回洗つた。試験管を
乾燥し、使用するまで４℃で貯蔵した。 定量は、各被覆試験管へ、PBS1.0ml、標識し
た類縁体の溶液0.1ml、そして場合に応じて選定
した標準溶液もしくは未知溶液0.1mlを加えるこ
とによつて実施した。この混合物へ複合体溶液
0.1mlを加えた。内容物とともにこの試験管を37
℃で１時間インキユベートした。内容物を次に吸
引除去し、各試験管をPBS2mlで１回洗い、試験
管をカウントした。 標準溶液についての結果は次のとおりであつ
た。 添加した標識類縁体の総カウント／分＝17500
【表】
実施例１乃至４の場合、未知検体中のサンプル
リガンドの量は、標準溶液について得られた成績
からプロツトした標準曲線へ当てはめることによ
つて容易に決定することができる。実施例５の場
合は、いくつかのほかの標準溶液を使用して得ら
れた成績を精度を改善するために所望範囲に挿入
することが望ましい。
リガンドの量は、標準溶液について得られた成績
からプロツトした標準曲線へ当てはめることによ
つて容易に決定することができる。実施例５の場
合は、いくつかのほかの標準溶液を使用して得ら
れた成績を精度を改善するために所望範囲に挿入
することが望ましい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式： ＡBL(BL)oA1 （式中BLはサンプルリガンド以外の結合リガ
ンド、ＡBLは前記結合リガンドBLに対する特異
的受容体、ｎは少なくとも１、A1はサンプルリ
ガンドに対する特異的受容体であつて、BLはA1
へ共有結合し、そして、ＡBLはBLへ可逆的に結
合しているものとする。）の複合体。 ２ BLが約1000以下の分子量を持つハプテンで
ある特許請求の範囲第１項の複合体。 ３ BLがフルオレスセイン、ジニトロベンゼ
ン、多糖類、ナフチルアミン、アクリジンまたは
ローダミンである特許請求の範囲第２項の複合
体。 ４ BLが（BL）oA1の重量の約0.01ないし60％で
ある特許請求の範囲第２項の複合体。 ５ 前記複合体は不溶性支持体Ｑへ式： Ｑ―ＡBL(BL)oA1 の形で支持されている特許請求の範囲第１項ない
し第４項のいずれかの複合体。 ６ Ｑが不溶性表面であり、A1が肝炎関連抗原
に対する標識されていない特異的抗体である特許
請求の範囲第５項の複合体。 ７ 定量すべきサンプルリガンドを、 式： ＡBL(BL)oA1 （式中BLはサンプルリガンド以外の結合リガ
ンド、ＡBLは前記結合リガンドBLに対する特異
的受容体、ｎは少なくとも１、A1はサンプルリ
ガンドに対する特異的受容体であつて、BLはA1
へ共有結合し、そしてＡBLはBLへ可逆的に結合
しているものとする。）の複合体へ結合し、前記
サンプルリガンドを前記複合体へ結合する際もし
くは結合後、(a)サンプルリガンドの標識した類縁
体、(b)サンプルリガンドに対して特異的な標識し
た受容体、(c)前記結合リガンドBLに対して特異
的な受容体ＡBLが標識されている前記複合体とか
らなる群から選ばれた標識試薬を反応せしめ、次
いで未結合標識試薬を相分離し、その後前記サン
プルリガンドと前記複合体との結合生成物へ結合
した、または結合しなかつた前記標識試薬の量を
測定することを特徴とする未知量のサンプルリガ
ンドを含んでいるサンプル中の該サンプルリガン
ドの特異的定量法。 ８ ＡBLはポリエチレングリコールによる沈デン
によつて前凝集される特許請求の範囲第７項の方
法。 ９ A1は結合性タンパクである特許請求の範囲
第７項の方法。 １０ A1が葉酸結合性タンパクであり、サンプ
ルリガンドが葉酸である特許請求の範囲第９項の
方法。 １１ A1はトリヨードチロニン抗体であり、サ
ンプルリガンドがトリヨードチロニンである特許
請求の範囲第９項の方法。 １２ A1は内因子であり、サンプルリガンドは
ビタミンB12である特許請求の範囲第９項の方
法。 １３ A1は抗体であり、サンプルリガンドは抗
原である特許請求の範囲第９項の方法。 １４ ｎが１ないし10である特許請求の範囲第７
項の方法。 １５ BLは1000以下の分子量と約107／モル以
上の親和定数を有するハプテンである特許請求の
範囲第７項の方法。 １６ BLはA1と中間に配置された分子を経由し
て共有結合している特許請求の範囲第７項の方
法。 １７ BLはフルオレスセイン、ジニトロベンゼ
ン、多糖類、ナフチルアミン、アクリジンまたは
ローダミンである特許請求の範囲第７項の方法。 １８ （BL）oA1は抗体とフルオレスセインイソ
シアネートとの反応生成物である特許請求の範囲
第７項の方法。 １９ BLはフルオレスセインであり、ＡBLはフ
ルオレスセイン抗体である特許請求の範囲第７項
の方法。 ２０ 前記複合体を前記サンプルリガンドを含む
と考えられるサンプルと接触させ、それによつて
存在するサンプルリガンドを前記複合体に吸収さ
せ、吸収したサンプルリガンドを該サンプルリガ
ンドに対する標識した受容体と接触させ、複合体
を洗浄し、そして残つている結合もしくは未結合
標識受容体の量を測定する特許請求の範囲第７項
の方法。 ２１ 前記複合体を前記サンプルリガンドを含む
と考えられるサンプルと接触させ、それによつて
存在するサンプルリガンドを前記複合体に吸収さ
せ、複合体を洗浄し、前記複合体を標識したサン
プルリガンド類縁体と接触させ、それによつて該
複合体中の未結合残存サンプルリガンド結合部位
を前記標識サンプルリガンド類縁体と結合させ、
複合体を洗浄し、そして残つている結合または未
結合標識受容体の量を測定する特許請求の範囲第
７項の方法。 ２２ 前記複合体を、標識したサンプルリガンド
類縁体および前記サンプルリガンドを含むと考え
られるサンプルとに同時に接触させ、それにより
前記サンプルリガンドと前記標識サンプルリガン
ド類縁体とをそれらの溶液中の濃度に比例して前
記複合体へ競合的に結合させ、複合体を洗浄し、
そして残つている結合または未結合標識サンプル
類縁体の量を測定する特許請求の範囲第７項の方
法。 ２３ 前記複合体は不溶性支持体Ｑへ式： Ｑ―ＡBL(BL)oA1 の形で支持されている特許請求の範囲第７項の方
法。 ２４ 前記不溶性支持体Ｑが不溶性表面である特
許請求の範囲第２３項の方法。 ２５ 前記不溶性表面はプラスチツク試験管の内
壁である特許請求の範囲第２４項の方法。 ２６ 前記不溶性表面はポリプロピレンまたはポ
リスチレンの表面である特許請求の範囲第２４項
の方法。 ２７ A1が肝炎関連抗原に対する抗体であり、
前記不溶性支持体Ｑが不溶性表面である特許請求
の範囲第２３項の方法。 ２８ 二以上のサンプルリガンドを順次定量する
ため、 (a) 定量すべきサンプルリガンドの数に等しい数
の異なる結合リガンド受容体ＡBLを不溶化し、 (b) 該結合リガンド受容体へ、前記サンプルリガ
ンドの一つに対する受容体A1へ共有結合しか
つ前記結合リガンド受容体ＡBLの一つが特異的
であるサンプルリガンド以外の結合リガンド
BLの結合物（BL）oA1の複数を吸収させて前記
式： ＡBL(BL)oA1 の複合体を生成させ、 (c) テストサンプルと、そして標識したサンプル
リガンド類縁体もしくは標識したサンプルリガ
ンド受容体を加え、 (d) 不溶相を分離し、 (e) 前記結合リガンドの一つを加えてサンプルリ
ガンド受容体へ共有結合している当該結合リガ
ンドと置換し、 (f) 結合したもしくは置換された標識を測定し、 (g) めいめいの結合リガンド／サンプルリガンド
受容体結合物（BL）oA1について(d)ないし(f)の
工程を繰り返す特許請求の範囲第７項の方法。 ２９ 異なる結合リガンド受容体は近接する不溶
性表面の複数上で不溶化される特許請求の範囲第
２８項の方法。 ３０ 結合リガンドがフルオレスセイン、ジニト
ロベンゼン、多糖類、ナフチルアミン、アクリジ
ンまたはローダミンである特許請求の範囲第２８
項の方法。 ３１ 標識したサンプルリガンド受容体を加える
特許請求の範囲第２８項の方法。 ３２ 異なる結合リガンド受容体を混合し、そし
て次に毛細管表面上で不溶化する特許請求の範囲
第２８項の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87147878A | 1978-01-23 | 1978-01-23 | |
| US05/930,130 US4271140A (en) | 1978-01-23 | 1978-08-01 | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54104391A JPS54104391A (en) | 1979-08-16 |
| JPS6262289B2 true JPS6262289B2 (ja) | 1987-12-25 |
Family
ID=27128209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16093078A Granted JPS54104391A (en) | 1978-01-23 | 1978-12-22 | Method and composite substance for measuring quantity of singular bond of twin acceptor |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4271140A (ja) |
| JP (1) | JPS54104391A (ja) |
| DE (1) | DE2902400A1 (ja) |
| FR (1) | FR2415301A1 (ja) |
| GB (1) | GB2012954B (ja) |
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