JP2665850B2 - ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体Info
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- JP2665850B2 JP2665850B2 JP3326961A JP32696191A JP2665850B2 JP 2665850 B2 JP2665850 B2 JP 2665850B2 JP 3326961 A JP3326961 A JP 3326961A JP 32696191 A JP32696191 A JP 32696191A JP 2665850 B2 JP2665850 B2 JP 2665850B2
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- antibody
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ｈＢＮＰのＣ端を認識
するモノクル−ナル抗体、該抗体を産生するハイブリド
−マ、該ハイブリド−マを培地中またはマウス腹腔内で
培養し、それぞれ培地または腹水から該抗体を採取する
ことを特徴とする該モノクロ−ナル抗体の製造法、およ
び該抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法に関する。
するモノクル−ナル抗体、該抗体を産生するハイブリド
−マ、該ハイブリド−マを培地中またはマウス腹腔内で
培養し、それぞれ培地または腹水から該抗体を採取する
ことを特徴とする該モノクロ−ナル抗体の製造法、およ
び該抗体を用いるｈＢＮＰの免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain na
triuretic peptide: BNP）は松尾ら（Nature 332, 78-8
1 (1988)）によりブタ脳より発見された。ＢＮＰには、
２６個のアミノ酸残基からなる豚（ｐ）ＢＮＰ−２６
と、３２個のアミノ酸残基からなるｐＢＮＰ−３２が存
在する。これらは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（at
rium natriuretic peptide: ANP）と類似した末梢およ
び中枢での作用を有しており、ＡＮＰと共に、体液の恒
常性維持・血圧調節に重要に関与していると考えられて
いる。また、ＢＮＰはヒトの心臓で合成・分泌されるこ
とが示唆されていたが（Biochem. Biophys. Res. Commu
n. 159, 1427-1434 (1989)）、最近ヒト心臓より単離・
同定された（FEBS Lett. 259, 341-345 (1990)）。ヒト
ＢＮＰ（ｈＢＮＰ）は３２アミノ酸残基からなり、ｈＢ
ＮＰ前駆体の配列７７−１０８に一致する。
triuretic peptide: BNP）は松尾ら（Nature 332, 78-8
1 (1988)）によりブタ脳より発見された。ＢＮＰには、
２６個のアミノ酸残基からなる豚（ｐ）ＢＮＰ−２６
と、３２個のアミノ酸残基からなるｐＢＮＰ−３２が存
在する。これらは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（at
rium natriuretic peptide: ANP）と類似した末梢およ
び中枢での作用を有しており、ＡＮＰと共に、体液の恒
常性維持・血圧調節に重要に関与していると考えられて
いる。また、ＢＮＰはヒトの心臓で合成・分泌されるこ
とが示唆されていたが（Biochem. Biophys. Res. Commu
n. 159, 1427-1434 (1989)）、最近ヒト心臓より単離・
同定された（FEBS Lett. 259, 341-345 (1990)）。ヒト
ＢＮＰ（ｈＢＮＰ）は３２アミノ酸残基からなり、ｈＢ
ＮＰ前駆体の配列７７−１０８に一致する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＢＮＰ
は体液の恒常性維持・血圧調節に重要に関与しているこ
とから、血液中のＢＮＰを免疫測定法などにより測定す
ることができれば高血圧や心機能・腎機能の診断などｈ
ＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に役立つと考えら
れる。ところが、ｈＢＮＰの健常人血漿中レベルは０.
９±０.０７ｆｍｏｌ／ｍｌ（３.１２±０.２４ｐｇ／
ｍｌ）であり、血漿より抽出することなく直接血中のｈ
ＢＮＰを測定することは不可能であった。
は体液の恒常性維持・血圧調節に重要に関与しているこ
とから、血液中のＢＮＰを免疫測定法などにより測定す
ることができれば高血圧や心機能・腎機能の診断などｈ
ＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に役立つと考えら
れる。ところが、ｈＢＮＰの健常人血漿中レベルは０.
９±０.０７ｆｍｏｌ／ｍｌ（３.１２±０.２４ｐｇ／
ｍｌ）であり、血漿より抽出することなく直接血中のｈ
ＢＮＰを測定することは不可能であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記の状況に鑑みて鋭意研究を行った結果、ｈＢＮＰのＣ
端に対するモノクローナル抗体を調製しｈＢＮＰに特異
的なサンドイッチラジオイムノアッセイを確立すること
に成功した。本発明は、ｈＢＮＰのＣ端を特異的に認識
するモノクローナル抗体であってその結合部位にＣ末端
のヒスチジン残基が含まれているモノクローナル抗体お
よび該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発
明のモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰと反応するがｈＢ
ＮＰのＣ端にＴｙｒ残基を導入したペプチドとは反応し
ない。さらにＴｙｒに代わってＨｉｓ以外のアミノ酸残
基を導入しても反応しないと推定される。このことから
本発明のモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰ（７）Ｃ端の
Ｈｉｓ残基、特にＨｉｓ残基のカルボキシル基を認識す
るといえる。また、本発明のモノクローナル抗体はハイ
ブリドーマＢＣ２０３により産生することができる。こ
のハイブリドーマＢＣ２０３は、茨城県つくば市東１丁
目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平
成３（１９９１）年８月２０日から、Ｍｏｕｓｅ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａＢＣ２０３、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
３５１５として、ブダペスト条約に基づき寄託されてい
る。
記の状況に鑑みて鋭意研究を行った結果、ｈＢＮＰのＣ
端に対するモノクローナル抗体を調製しｈＢＮＰに特異
的なサンドイッチラジオイムノアッセイを確立すること
に成功した。本発明は、ｈＢＮＰのＣ端を特異的に認識
するモノクローナル抗体であってその結合部位にＣ末端
のヒスチジン残基が含まれているモノクローナル抗体お
よび該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。本発
明のモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰと反応するがｈＢ
ＮＰのＣ端にＴｙｒ残基を導入したペプチドとは反応し
ない。さらにＴｙｒに代わってＨｉｓ以外のアミノ酸残
基を導入しても反応しないと推定される。このことから
本発明のモノクローナル抗体は、ｈＢＮＰ（７）Ｃ端の
Ｈｉｓ残基、特にＨｉｓ残基のカルボキシル基を認識す
るといえる。また、本発明のモノクローナル抗体はハイ
ブリドーマＢＣ２０３により産生することができる。こ
のハイブリドーマＢＣ２０３は、茨城県つくば市東１丁
目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平
成３（１９９１）年８月２０日から、Ｍｏｕｓｅ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａＢＣ２０３、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
３５１５として、ブダペスト条約に基づき寄託されてい
る。
【０００５】本発明のハイブリド−マは次のようにして
作製される。まずｈＢＮＰのＣ端、好ましくはｈＢＮＰ
[27−32]に対応するペプチドを合成し、免疫原性を高め
るために牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結
合させる。得られたコンジュゲ−トをフロイントの完全
アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウス
の免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマ
ウスの腹腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種するこ
とにより行なう。最終免疫の３日ないし５日後に脾臓を
取り出し、抗体産生細胞として使用する。この時同時
に、抗体産生細胞と融合させてハイブリド−マを得るた
めの親細胞として、適切なマ−カ−を持つミエロ−マ細
胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイ
ブリド−マを作製する。バイブリド−マ作製における培
地として、イ−グルＭＥＭ、ダルベッコ変法培地、ＲＰ
ＭＩ−１６４０などの通常良く使用されているものを用
いる。融合にあたってはまず、親細胞であるミエロ−マ
と脾細胞を約１：５の割合で用意する。融合剤としては
ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を５０％濃度で用い
るのが融合率が高いとされている。融合株はＨＡＴ選択
法により選択する。生じるハイブリド−マのスクリ−ニ
ングは培養上清を用い、競合法ラジオイムノアッセイな
どの既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリンを
分泌しているハイブリド−マのクロ−ンを選択する。ハ
イブリド−マの単一性を吟味するため、９６ウエル細胞
培養プレ−トにハイブリド−マを１穴に１個より多くな
らないように蒔き、生育してくるクロ−ンについて再び
スクリ−ニングを行なう。このサブクロ−ニングを繰り
返すことにより、単一性のハイブリド−マを得る。
作製される。まずｈＢＮＰのＣ端、好ましくはｈＢＮＰ
[27−32]に対応するペプチドを合成し、免疫原性を高め
るために牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結
合させる。得られたコンジュゲ−トをフロイントの完全
アジュバント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウス
の免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマ
ウスの腹腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種するこ
とにより行なう。最終免疫の３日ないし５日後に脾臓を
取り出し、抗体産生細胞として使用する。この時同時
に、抗体産生細胞と融合させてハイブリド−マを得るた
めの親細胞として、適切なマ−カ−を持つミエロ−マ細
胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハイ
ブリド−マを作製する。バイブリド−マ作製における培
地として、イ−グルＭＥＭ、ダルベッコ変法培地、ＲＰ
ＭＩ−１６４０などの通常良く使用されているものを用
いる。融合にあたってはまず、親細胞であるミエロ−マ
と脾細胞を約１：５の割合で用意する。融合剤としては
ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）を５０％濃度で用い
るのが融合率が高いとされている。融合株はＨＡＴ選択
法により選択する。生じるハイブリド−マのスクリ−ニ
ングは培養上清を用い、競合法ラジオイムノアッセイな
どの既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリンを
分泌しているハイブリド−マのクロ−ンを選択する。ハ
イブリド−マの単一性を吟味するため、９６ウエル細胞
培養プレ−トにハイブリド−マを１穴に１個より多くな
らないように蒔き、生育してくるクロ−ンについて再び
スクリ−ニングを行なう。このサブクロ−ニングを繰り
返すことにより、単一性のハイブリド−マを得る。
【０００６】本発明はまた、上記ハイブリド−マを培地
中またはマウス腹腔内で培養し、それぞれ培地または腹
水から該モノクロ−ナル抗体を採取することを特徴とす
る該モノクロ−ナル抗体の製造法を提供する。まず、上
記で得られたハイブリド−マを培養容器中（in vitro）
または動物体内（in vivo）で培養する。 in vitro 系
で培養する場合、培地は先に述べた通常培地に牛胎児血
清（FSC; fetal calf serum）を添加したものでよく、
この培地で３日から５日培養の後、培養上清からモノク
ロ−ナル抗体を得る。in vivo系の培養では、ハイブリ
ド−マを哺乳動物の腹腔に接種し、１〜３週間後に腹水
を採取し、これよりモノクロ−ナル抗体を得る。in viv
o 系での培養の場合、invitro 系での培養に比べて遥か
に大量の抗体を効率的に取得しうるので好ましい。本発
明で得られたモノクロ−ナル抗体ＢＣ２０３は、ｈＢＮ
ＰのＣ端側を認識するが、後記実施例に示される通り、
ｈＢＮＰのＣ末端のヒスチジン残基にチロシン残基が導
入されたTyr33−ｈＢＮＰとは全く結合しないことか
ら、Ｃ末端のヒスチジン残基を認識すると考えられる。
中またはマウス腹腔内で培養し、それぞれ培地または腹
水から該モノクロ−ナル抗体を採取することを特徴とす
る該モノクロ−ナル抗体の製造法を提供する。まず、上
記で得られたハイブリド−マを培養容器中（in vitro）
または動物体内（in vivo）で培養する。 in vitro 系
で培養する場合、培地は先に述べた通常培地に牛胎児血
清（FSC; fetal calf serum）を添加したものでよく、
この培地で３日から５日培養の後、培養上清からモノク
ロ−ナル抗体を得る。in vivo系の培養では、ハイブリ
ド−マを哺乳動物の腹腔に接種し、１〜３週間後に腹水
を採取し、これよりモノクロ−ナル抗体を得る。in viv
o 系での培養の場合、invitro 系での培養に比べて遥か
に大量の抗体を効率的に取得しうるので好ましい。本発
明で得られたモノクロ−ナル抗体ＢＣ２０３は、ｈＢＮ
ＰのＣ端側を認識するが、後記実施例に示される通り、
ｈＢＮＰのＣ末端のヒスチジン残基にチロシン残基が導
入されたTyr33−ｈＢＮＰとは全く結合しないことか
ら、Ｃ末端のヒスチジン残基を認識すると考えられる。
【０００７】本発明はさらに、上記で作製されたモノク
ロ−ナル抗体(A)と、該抗体とはｈＢＮＰの認識部位が
異なる抗体(B)を用いて、ｈＢＮＰをサンドイッチする
ことを特徴とするｈＢＮＰの免疫測定法を提供する。該
抗体(B)としては、モノクロ−ナル抗体が好ましく、例
えばｈＢＮＰのリング構造を認識するモノクロ−ナル抗
体 KY-hBNP-II（特願平2-99623）が挙げられる。このモ
ノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マKY-hBNP-II
は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の微生物工業技術
研究所に、平成２（１９９０）年４月１１日から、Mous
e Hybridoma KY-hBNP-II、微工研条寄第２８６３号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２８６３）として、ブダペスト条約に基
づき寄託されている。以下に、サンドイッチラジオイム
ノアッセイを例として本発明の免疫測定法を簡単に説明
する。
ロ−ナル抗体(A)と、該抗体とはｈＢＮＰの認識部位が
異なる抗体(B)を用いて、ｈＢＮＰをサンドイッチする
ことを特徴とするｈＢＮＰの免疫測定法を提供する。該
抗体(B)としては、モノクロ−ナル抗体が好ましく、例
えばｈＢＮＰのリング構造を認識するモノクロ−ナル抗
体 KY-hBNP-II（特願平2-99623）が挙げられる。このモ
ノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マKY-hBNP-II
は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の微生物工業技術
研究所に、平成２（１９９０）年４月１１日から、Mous
e Hybridoma KY-hBNP-II、微工研条寄第２８６３号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２８６３）として、ブダペスト条約に基
づき寄託されている。以下に、サンドイッチラジオイム
ノアッセイを例として本発明の免疫測定法を簡単に説明
する。
【０００８】(1)放射性同位元素標識抗体の調製 上記抗体(A)または(B)のどちらか一方の抗体のＩｇＧ画
分をペプシンで消化してF(ab’)2断片とし、さらにこれ
を２−メルカプトエチルアミンで還元してFab’ を得
る。得られたFab’断片をクロラミンＴ法やマレイミド
モノヨ−ド(125I)チラミンを用いた方法などの公知の方
法に従って放射性同位元素で標識する。調製した標識抗
体はゲル濾過、カラムクロマトグラフィ−などにより精
製する。
分をペプシンで消化してF(ab’)2断片とし、さらにこれ
を２−メルカプトエチルアミンで還元してFab’ を得
る。得られたFab’断片をクロラミンＴ法やマレイミド
モノヨ−ド(125I)チラミンを用いた方法などの公知の方
法に従って放射性同位元素で標識する。調製した標識抗
体はゲル濾過、カラムクロマトグラフィ−などにより精
製する。
【０００９】(2)固相化第二抗体の作製 特開昭62-132172と同様の方法で抗マウスIgG Fc Fragme
nt抗体を、通常の免疫測定法に使用される市販の抗原抗
体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状
物（ビ−ズ）あるいは球状物（ボ−ル）、チュ−ブ、プ
レ−トなどに吸着させる。
nt抗体を、通常の免疫測定法に使用される市販の抗原抗
体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状
物（ビ−ズ）あるいは球状物（ボ−ル）、チュ−ブ、プ
レ−トなどに吸着させる。
【００１０】(3)ｈＢＮＰの測定 チュ−ブにｈＢＮＰ標準液または試料をとり、これに上
記(1)で調製した標識抗体（(A)または(B)）と、もう一
方の抗体（(B)または(A)）を加えて反応させた後、上記
(2)の固相化抗体を加えさらに反応させる。遠心後、上
清を除去して洗浄し、沈降した標識抗体の放射能を測定
する。また、固相化第二抗体として、標識抗体とは異な
る抗体(A)または(B)を直接固相化して用いることも可能
である。この場合、ｈＢＮＰ標準液または試料に標識抗
体(A)または(B)と、固相化抗体(B)または(A) を反応さ
せ、遠心後、上清を除去して洗浄し沈降した標識抗体の
放射能を測定する。
記(1)で調製した標識抗体（(A)または(B)）と、もう一
方の抗体（(B)または(A)）を加えて反応させた後、上記
(2)の固相化抗体を加えさらに反応させる。遠心後、上
清を除去して洗浄し、沈降した標識抗体の放射能を測定
する。また、固相化第二抗体として、標識抗体とは異な
る抗体(A)または(B)を直接固相化して用いることも可能
である。この場合、ｈＢＮＰ標準液または試料に標識抗
体(A)または(B)と、固相化抗体(B)または(A) を反応さ
せ、遠心後、上清を除去して洗浄し沈降した標識抗体の
放射能を測定する。
【００１１】本発明はラジオイムノアッセイに限らずエ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）も包含する。ＥＩＡ
における酵素標識抗体は以下のように調製する。まず、
ＩｇＧ画分をペプシンで消化してF(ab’)2断片とし、更
にこれを２−メルカプトエチルアミンで還元してFab’
断片を得る。IgGからFab’の調製について は、J. Immu
noassay 4, 209〜327 (1983)に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。次
に、調製したFab’断片を酵素で標識する。標識酵素と
しては、アルカリ性ホスファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ
などが利用可能であるが、本発明においては、特に西洋
わさびペルオキシダ−ゼが好ましく用いられる。また、
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・
Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン
酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、
４，４’−ジチオジピリジン、その他公知の架橋剤が利
用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反
応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて、既知の方法に
従って行なえばよい。
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）も包含する。ＥＩＡ
における酵素標識抗体は以下のように調製する。まず、
ＩｇＧ画分をペプシンで消化してF(ab’)2断片とし、更
にこれを２−メルカプトエチルアミンで還元してFab’
断片を得る。IgGからFab’の調製について は、J. Immu
noassay 4, 209〜327 (1983)に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。次
に、調製したFab’断片を酵素で標識する。標識酵素と
しては、アルカリ性ホスファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、グルコ−スオキシダ−ゼ
などが利用可能であるが、本発明においては、特に西洋
わさびペルオキシダ−ゼが好ましく用いられる。また、
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミ
ド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・
Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン
酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、
４，４’−ジチオジピリジン、その他公知の架橋剤が利
用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反
応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて、既知の方法に
従って行なえばよい。
【００１２】本発明の免疫測定法は最小検出感度が１ｐ
ｇ／ｍｌと、非常に高感度であり、かつｈＢＮＰに極め
て特異的であるため、例えば血漿からｈＢＮＰを抽出す
ることなく血漿サンプル中のｈＢＮＰレベルを直接測定
することが可能である。
ｇ／ｍｌと、非常に高感度であり、かつｈＢＮＰに極め
て特異的であるため、例えば血漿からｈＢＮＰを抽出す
ることなく血漿サンプル中のｈＢＮＰレベルを直接測定
することが可能である。
【００１３】以下に実施例により本発明を詳細に説明す
る。実施例のアミノ酸配列中の略語の意味は以下の通
り。 Boc: t-butyloxycarbonyl, Tos: tosyl, PAM: 4-(oxyme
thyl)-phenylacetamidomethyl, Cl-Z: 2-chloro-benzyl
oxycarbonyl, Br-Z: 2-bromo-benzyloxycarbonyl, Bom:
benzyloxymethyl, Bzl: benzyl, cHex: cyclohexyl
る。実施例のアミノ酸配列中の略語の意味は以下の通
り。 Boc: t-butyloxycarbonyl, Tos: tosyl, PAM: 4-(oxyme
thyl)-phenylacetamidomethyl, Cl-Z: 2-chloro-benzyl
oxycarbonyl, Br-Z: 2-bromo-benzyloxycarbonyl, Bom:
benzyloxymethyl, Bzl: benzyl, cHex: cyclohexyl
【００１４】
【実施例】Ｉ．抗ｈＢＮＰモノクロ−ナル抗体産生ハイ
ブリド−マの作製と抗体の産生 (1)免疫用コンジュゲ−トの作製 （ｈＢＮＰフラグメント(27-32)の合成） Boc-His(Tos)-PAM-Resin(Applied Biosystems社製)(0.2
5mmol)から出発、シオノギ SRL-02機(その他のアミノ酸
合成機でも可）により固相法の常法どおり合成し、Boc-
Lys(Cl-Z)-Val-Leu-Arg(Tos)-His(Tos)-PAM-Resinを得
た（各保護アミノ酸はApplied Biosystems社製）。これ
をHF/アニソ−ルで処理して脱保護、得られた粗ペプチ
ドを逆相クロマト（カラム：和光純薬 RQ-2, 24×360m
m）、溶媒：0-50% CH3CN／0.1% CF3COOHの直線濃度勾配
により精製して目的物を得た(59mg)。 分析用HPLC（カラム：Nucleosil 5C18, 4.6×150mm(信
和化工(株)); 溶媒: 5% CH3CN／0.1% CF3COOH; 流速:
1.8ml/min.; 検出: 220nm）で単一ピ−ク（保持時間:
6.04min.）を与えた。 酸加水分解物（6M HCl, 110℃, 24hr）のアミノ酸分析
(日立自動アミノ酸分析計835型)結果は次の通り： Val 0.95(1); Leu 1.00(1); Lys 0.90(1); His 0.95
(1); Arg 2.00(2).
ブリド−マの作製と抗体の産生 (1)免疫用コンジュゲ−トの作製 （ｈＢＮＰフラグメント(27-32)の合成） Boc-His(Tos)-PAM-Resin(Applied Biosystems社製)(0.2
5mmol)から出発、シオノギ SRL-02機(その他のアミノ酸
合成機でも可）により固相法の常法どおり合成し、Boc-
Lys(Cl-Z)-Val-Leu-Arg(Tos)-His(Tos)-PAM-Resinを得
た（各保護アミノ酸はApplied Biosystems社製）。これ
をHF/アニソ−ルで処理して脱保護、得られた粗ペプチ
ドを逆相クロマト（カラム：和光純薬 RQ-2, 24×360m
m）、溶媒：0-50% CH3CN／0.1% CF3COOHの直線濃度勾配
により精製して目的物を得た(59mg)。 分析用HPLC（カラム：Nucleosil 5C18, 4.6×150mm(信
和化工(株)); 溶媒: 5% CH3CN／0.1% CF3COOH; 流速:
1.8ml/min.; 検出: 220nm）で単一ピ−ク（保持時間:
6.04min.）を与えた。 酸加水分解物（6M HCl, 110℃, 24hr）のアミノ酸分析
(日立自動アミノ酸分析計835型)結果は次の通り： Val 0.95(1); Leu 1.00(1); Lys 0.90(1); His 0.95
(1); Arg 2.00(2).
【００１５】（コンジュゲ−トの作製）ウシチログロブ
リン水溶液(40 mg/2.0 ml)とｈＢＮＰフラグメント(27-
32)水溶液(16 mg/1.0 ml)を混和し、さらに1-エチル-3
(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶
液(46 mg/0.6 ml)を加え、0℃、2時間撹拌し反応させ
た。反応液を蒸留水に対して4℃で2日間透析し、透析内
液を凍結乾燥した。結合比は、透析内液の一部をゲル濾
過後、および透析内液をそのままアミノ酸分析して算出
し、ウシチログロブリン１分子に対し、ｈＢＮＰフラグ
メント(27-32)29分子であった。
リン水溶液(40 mg/2.0 ml)とｈＢＮＰフラグメント(27-
32)水溶液(16 mg/1.0 ml)を混和し、さらに1-エチル-3
(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶
液(46 mg/0.6 ml)を加え、0℃、2時間撹拌し反応させ
た。反応液を蒸留水に対して4℃で2日間透析し、透析内
液を凍結乾燥した。結合比は、透析内液の一部をゲル濾
過後、および透析内液をそのままアミノ酸分析して算出
し、ウシチログロブリン１分子に対し、ｈＢＮＰフラグ
メント(27-32)29分子であった。
【００１６】(2)免疫 上記のｈＢＮＰフラグメント(27-32)-ウシチログロブリ
ンコンジュゲ−トの生理食塩水懸濁液(コンジュゲ−ト
濃度 4 mg/ml)とフロイントの完全アジュバントを等量
ずつ混合して乳濁液とし、これをBALB/cマウス(雌、６
週令)の背部皮下に0.1mlずつ３週間間隔で５回注射し
た。マウス１匹１回当りのコンジュゲ−ト投与量は200
μg、ハプテンのｈＢＮＰフラグメント(27-32)としての
投与量は5.6μgであった。更に最終免疫の３週間後に、
ブ−スタ−としてｈＢＮＰフラグメント(27-32)ウシチ
ログロブリンコンジュゲ−ト400μg(ハプテン量11.2μ
g)を懸濁した生理食塩水0.1mlを２日連続して腹腔内に
投与した。
ンコンジュゲ−トの生理食塩水懸濁液(コンジュゲ−ト
濃度 4 mg/ml)とフロイントの完全アジュバントを等量
ずつ混合して乳濁液とし、これをBALB/cマウス(雌、６
週令)の背部皮下に0.1mlずつ３週間間隔で５回注射し
た。マウス１匹１回当りのコンジュゲ−ト投与量は200
μg、ハプテンのｈＢＮＰフラグメント(27-32)としての
投与量は5.6μgであった。更に最終免疫の３週間後に、
ブ−スタ−としてｈＢＮＰフラグメント(27-32)ウシチ
ログロブリンコンジュゲ−ト400μg(ハプテン量11.2μ
g)を懸濁した生理食塩水0.1mlを２日連続して腹腔内に
投与した。
【００１７】(3)細胞融合 ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、そ
の細胞を0.17M塩化アンモニウム溶液中に氷冷下５分間
おいて赤血球を破壊した。残った細胞をRPMI1640培地に
懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じ
くRPMI1640培地に懸濁した8-アザグアニン耐性ミエロ−
マ細胞(X63.653) 3.76×107個と脾リンパ球 1.88×108
個を混合し、遠心(1,000rpm、10分)後、上清を除去し
た。細胞沈殿 物にRPMI1640培地に溶解した50%ポリエチ
レングリコ−ル(分子量4,000、メルク)0.8 mlを１分間
かけてピペットの先で撹拌しながら加え、更に1.5分間
撹拌した 。その後2 mlのRPMI1640培地を２分間かけ
て、次に同じく2 mlを１分間かけて撹拌しながら加え
た。更に18 mlのRPMI1640培地を穏やかに撹拌しながら
徐々に滴 加した。遠心後、上清を除去し沈殿した細胞
をHAT培地(1×10-4Mヒポキサンチン 、4×10-7Mアミノ
プテリン、1.6×10-5Mチミジンを含む20%FCS-RPMI1640
培地)100 mlに懸濁し、96ウエル細胞培養プレ−ト(コ−
スタ−社)7枚の各ウエルに0.1 ml ずつ分注した。細胞
培養プレ−トには前もって栄養細胞としてマウス脾臓細
胞のHAT培地懸濁液を5×104個/0.1 mlずつ入れておい
た。以後2〜3日に一度ずつHAT培 地を半量ずつ新しいも
のと入れ替えた。約10日後にはハイブリド−マの増殖が
認められた。ハイブリド−マが増殖してきたのは全部で
670ウエル(99.7%)であった。
の細胞を0.17M塩化アンモニウム溶液中に氷冷下５分間
おいて赤血球を破壊した。残った細胞をRPMI1640培地に
懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じ
くRPMI1640培地に懸濁した8-アザグアニン耐性ミエロ−
マ細胞(X63.653) 3.76×107個と脾リンパ球 1.88×108
個を混合し、遠心(1,000rpm、10分)後、上清を除去し
た。細胞沈殿 物にRPMI1640培地に溶解した50%ポリエチ
レングリコ−ル(分子量4,000、メルク)0.8 mlを１分間
かけてピペットの先で撹拌しながら加え、更に1.5分間
撹拌した 。その後2 mlのRPMI1640培地を２分間かけ
て、次に同じく2 mlを１分間かけて撹拌しながら加え
た。更に18 mlのRPMI1640培地を穏やかに撹拌しながら
徐々に滴 加した。遠心後、上清を除去し沈殿した細胞
をHAT培地(1×10-4Mヒポキサンチン 、4×10-7Mアミノ
プテリン、1.6×10-5Mチミジンを含む20%FCS-RPMI1640
培地)100 mlに懸濁し、96ウエル細胞培養プレ−ト(コ−
スタ−社)7枚の各ウエルに0.1 ml ずつ分注した。細胞
培養プレ−トには前もって栄養細胞としてマウス脾臓細
胞のHAT培地懸濁液を5×104個/0.1 mlずつ入れておい
た。以後2〜3日に一度ずつHAT培 地を半量ずつ新しいも
のと入れ替えた。約10日後にはハイブリド−マの増殖が
認められた。ハイブリド−マが増殖してきたのは全部で
670ウエル(99.7%)であった。
【００１８】(4)ハイブリド−マの選択 ハイブリド−マの増殖してきたウエルについて、培養上
清を用いて、抗ｈＢＮＰ抗体産生の有無を競合法ライジ
オイムノアッセイで検定した。まず、培養上清50μl、
アッセイ用緩衝液(後述のＶに記載)150μlおよび、アッ
セイ用緩衝液で約15,000cpm/チュ−ブに希釈した125I標
識ｈＢＮＰ 100μl(Ｖに記載)をチュ−ブ内で混合し、
４℃で16時間以上インキュベ−トした。次に、2.5%ウシ
ガンマグロブリン100μl、25%ポリエチレングリコ−ル6
000（米山薬品工業(株)）水溶液500μlを加えて直ちに
撹拌し遠心(3000rpm、20分)後、上清を除去して沈殿の
放射能をガンマカウンタ−(アロカARC-600型)で測定し
た。5000cpm(非特異的結合値の約５倍のcpm)以上の放射
能を与えるものを抗体陽性とした。全部で10ウエルが抗
体陽性として選択された。
清を用いて、抗ｈＢＮＰ抗体産生の有無を競合法ライジ
オイムノアッセイで検定した。まず、培養上清50μl、
アッセイ用緩衝液(後述のＶに記載)150μlおよび、アッ
セイ用緩衝液で約15,000cpm/チュ−ブに希釈した125I標
識ｈＢＮＰ 100μl(Ｖに記載)をチュ−ブ内で混合し、
４℃で16時間以上インキュベ−トした。次に、2.5%ウシ
ガンマグロブリン100μl、25%ポリエチレングリコ−ル6
000（米山薬品工業(株)）水溶液500μlを加えて直ちに
撹拌し遠心(3000rpm、20分)後、上清を除去して沈殿の
放射能をガンマカウンタ−(アロカARC-600型)で測定し
た。5000cpm(非特異的結合値の約５倍のcpm)以上の放射
能を与えるものを抗体陽性とした。全部で10ウエルが抗
体陽性として選択された。
【００１９】(5)モノクロ−ン化 上記(4)によって選択されたハイブリド−マを限界希釈
法でクロ−ニングした。96ウエル細胞培養プレ−トにハ
イブリド−マを１個/200μl/ウエルの濃度で培養し、ハ
イブリド−マが増殖してきたウエルの培養上清につい
て、(4)のラジオイムノアッセイを行ない、抗体陽性の
ウエルのハイブリド−マを培養拡大した。この操作を２
〜３回繰り返し、抗体産生細胞株ＢＣ２０３を確立し
た。
法でクロ−ニングした。96ウエル細胞培養プレ−トにハ
イブリド−マを１個/200μl/ウエルの濃度で培養し、ハ
イブリド−マが増殖してきたウエルの培養上清につい
て、(4)のラジオイムノアッセイを行ない、抗体陽性の
ウエルのハイブリド−マを培養拡大した。この操作を２
〜３回繰り返し、抗体産生細胞株ＢＣ２０３を確立し
た。
【００２０】(6)腹水抗体液の作製 確立したハイブリド−マを腹腔に移植し、抗体濃度の高
い腹水を作製した。マウス(BALB/c雌、10日前にプリス
タンを0.5ml腹腔内投与)にRPMI1640に懸濁したハイブリ
ド−マ約1×107個を腹腔内に投与した。１〜３週間目に
適宜腹水を採取し、細胞を遠心分離した後、上清にアジ
化ナトリウム0.1%を加えて凍結保存した。この方法でハ
イブリド−マＢＣ２０３の産生するモノクロ−ナル抗体
ＢＣ２０３を高濃度に含む腹水ＢＣ２０３Ａを得た。
い腹水を作製した。マウス(BALB/c雌、10日前にプリス
タンを0.5ml腹腔内投与)にRPMI1640に懸濁したハイブリ
ド−マ約1×107個を腹腔内に投与した。１〜３週間目に
適宜腹水を採取し、細胞を遠心分離した後、上清にアジ
化ナトリウム0.1%を加えて凍結保存した。この方法でハ
イブリド−マＢＣ２０３の産生するモノクロ−ナル抗体
ＢＣ２０３を高濃度に含む腹水ＢＣ２０３Ａを得た。
【００２１】II．モノクロ−ナル抗体のクラス・サブク
ラスの決定 ハイブリド−マが産生する免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・
サブクラスに特異的な抗体(Serotec社、マウスモノクロ
−ナル抗体タイピング用キット)を用いて、免疫拡散法
によって行なった。その結果腹水ＢＣ２０３Ａは抗IgG1
抗体との間のみ沈降線が認められ、IgG1に属することが
わかった。
ラスの決定 ハイブリド−マが産生する免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・
サブクラスに特異的な抗体(Serotec社、マウスモノクロ
−ナル抗体タイピング用キット)を用いて、免疫拡散法
によって行なった。その結果腹水ＢＣ２０３Ａは抗IgG1
抗体との間のみ沈降線が認められ、IgG1に属することが
わかった。
【００２２】III．モノクロ−ナル抗体の親和性(結合定
数)の測定 Ｖに記載の方法に準じてｈＢＮＰの標準曲線作成の操作
を行ない、ｈＢＮＰの各濃度についてのスカッチャ−ド
法に基づいて縦軸に沈殿の放射能/上清の放射能、横軸
に抗原の結合した抗体の濃度をプロットし、得られた直
線の傾きから、抗体の結合定数を測定した。その結果、
1.3×109M-1と求められた。
数)の測定 Ｖに記載の方法に準じてｈＢＮＰの標準曲線作成の操作
を行ない、ｈＢＮＰの各濃度についてのスカッチャ−ド
法に基づいて縦軸に沈殿の放射能/上清の放射能、横軸
に抗原の結合した抗体の濃度をプロットし、得られた直
線の傾きから、抗体の結合定数を測定した。その結果、
1.3×109M-1と求められた。
【００２３】IV．モノクロ−ナル抗体の特異性 (1)Tyr33-125I標識ｈＢＮＰの合成 Boc-Tyr(Br-Z)-PAM-Resin(Applied Biosystems), 0.25m
mol Tyrから出発し、Applied Biosystems 430A機により
参考例のTyr0-ｈＢＮＰ-32の合成に準じTyr33-ｈＢＮＰ
の精製品を得た(7.0mg)。さらに参考例と同様にして標
識し目的物を得た。分析用 HPLC（カラム: YMC A-302 S
-5 120A ODS, 4.6×150mm(株式会社YMC); 溶媒: 19.0%
CH3CN／0.1% CF3COOH; 流速: 1.0ml/min.; 検出: 220n
m）で単一ピ−ク（保持時間: 5.98min.）を与えた。酸
加水分解物（6M HCl, 110℃, 20h, フェノ−ル共存下）
のアミノ酸分析結果は次の通り： Asp 1.05(1); Ser 5.46(6); Glu 1.04(1); Gly 5.21
(5); Val 1.97(2); Met 1.94(2); Ile 0.97(1); Leu 2.
00(2); Tyr 1.01(1); Phe 1.00(1); Lys 3.01(3); His
0.95(1); Arg 3.88(4); Pro 1.05(1).
mol Tyrから出発し、Applied Biosystems 430A機により
参考例のTyr0-ｈＢＮＰ-32の合成に準じTyr33-ｈＢＮＰ
の精製品を得た(7.0mg)。さらに参考例と同様にして標
識し目的物を得た。分析用 HPLC（カラム: YMC A-302 S
-5 120A ODS, 4.6×150mm(株式会社YMC); 溶媒: 19.0%
CH3CN／0.1% CF3COOH; 流速: 1.0ml/min.; 検出: 220n
m）で単一ピ−ク（保持時間: 5.98min.）を与えた。酸
加水分解物（6M HCl, 110℃, 20h, フェノ−ル共存下）
のアミノ酸分析結果は次の通り： Asp 1.05(1); Ser 5.46(6); Glu 1.04(1); Gly 5.21
(5); Val 1.97(2); Met 1.94(2); Ile 0.97(1); Leu 2.
00(2); Tyr 1.01(1); Phe 1.00(1); Lys 3.01(3); His
0.95(1); Arg 3.88(4); Pro 1.05(1).
【００２４】(2)抗体の特異性 Ｉ−(4)のラジオイムノアッセイにおいて、ｈＢＮＰの
Ｃ末端のヒスチジン残基にタイロシン残基が導入された
Tyr33-125I標識ｈＢＮＰとは全く結合しない事より、Ｃ
末端のヒスチジン残基を認識することがわかった。 Ｖ．モノクロ−ナル抗体を用いたｈＢＮＰのサンドイッ
チラジオイムノアッセイ Ｉに記載のモノクロ−ナル抗体ＢＣ２０３とハイブリド
−マKY-hBNP-II(特願平2-99623)が産生する抗ｈＢＮＰ
(1-32)モノクロ−ナル抗体(以下KY-hBNP-IIと略する)の
Fab’を125Iで標識したものを用いて、ｈＢＮＰのサン
ドイッチラジオイムノアッセイを作製した。
Ｃ末端のヒスチジン残基にタイロシン残基が導入された
Tyr33-125I標識ｈＢＮＰとは全く結合しない事より、Ｃ
末端のヒスチジン残基を認識することがわかった。 Ｖ．モノクロ−ナル抗体を用いたｈＢＮＰのサンドイッ
チラジオイムノアッセイ Ｉに記載のモノクロ−ナル抗体ＢＣ２０３とハイブリド
−マKY-hBNP-II(特願平2-99623)が産生する抗ｈＢＮＰ
(1-32)モノクロ−ナル抗体(以下KY-hBNP-IIと略する)の
Fab’を125Iで標識したものを用いて、ｈＢＮＰのサン
ドイッチラジオイムノアッセイを作製した。
【００２５】(1)125I標識KY-hBNP-II Fab’の作製 （腹水の精製）：ハイブリド−マKY-hBNP-IIから得た腹
水3 mlをProtein G sepharose 4FF、MAb TrapTM G(Phar
macia社製)により精製した。腹水を結合緩衝液（Protei
n G sepharose 4FF、MAb TrapTM Gのキットの一部）で
２倍に希釈し、予め結合緩衝液で平衡化したProtein G
sepharose 4FFカラム(3 ml容量)に加え、結合緩衝液30
mlで抗体IgG以外の不純物を洗浄した。次いで溶出緩衝
液（Protein G sepharose 4FF、MAb TrapTM Gのキット
の一部）15 mlで1 ml分画に分集し、吸光度よりIgG画分
(280 nmでのODが0.2以上)を集め、セントリコン-100(商
品名，アミコン)にて濃縮、更に0.1 Mクエン酸緩衝液(p
H4.1)で緩衝液の交換を行ないIgG画分18 mgを得た。
水3 mlをProtein G sepharose 4FF、MAb TrapTM G(Phar
macia社製)により精製した。腹水を結合緩衝液（Protei
n G sepharose 4FF、MAb TrapTM Gのキットの一部）で
２倍に希釈し、予め結合緩衝液で平衡化したProtein G
sepharose 4FFカラム(3 ml容量)に加え、結合緩衝液30
mlで抗体IgG以外の不純物を洗浄した。次いで溶出緩衝
液（Protein G sepharose 4FF、MAb TrapTM Gのキット
の一部）15 mlで1 ml分画に分集し、吸光度よりIgG画分
(280 nmでのODが0.2以上)を集め、セントリコン-100(商
品名，アミコン)にて濃縮、更に0.1 Mクエン酸緩衝液(p
H4.1)で緩衝液の交換を行ないIgG画分18 mgを得た。
【００２６】（F(ab’)2の作製）：上記KY-hBNP-IIのIg
G溶液(4.57 mg/2.19 ml)に、2.5%(W/V)のペプシン(ブタ
胃粘膜、シグマ社)を、更に最終濃度0.1 Mになるように
塩化ナトリウムを加え、37℃で１時間インキュベ−トし
た。ついで、0.1 Mナトリウムホウ酸緩衝液(pH8.0)で平
衡化したSephadex G-100カラム(1.5×58 cm)(Bio-Rad
社)でゲル濾過によりF(ab’)2を得、更に混在する未消
化のIgGはAffigel Protein A MAPS-II(Bio-Rad社)によ
り除去し精製した。すなわち、Affigel Protein Aに吸
着しない分画を集めセントリコン-30(商品名，アミコ
ン）にて濃縮し、0.1Mナ トリウムリン酸緩衝液(5 mM E
DTAを含む、pH6.0)で緩衝液の交換を行ないF(ab’)2画
分1.4 mgを得た。
G溶液(4.57 mg/2.19 ml)に、2.5%(W/V)のペプシン(ブタ
胃粘膜、シグマ社)を、更に最終濃度0.1 Mになるように
塩化ナトリウムを加え、37℃で１時間インキュベ−トし
た。ついで、0.1 Mナトリウムホウ酸緩衝液(pH8.0)で平
衡化したSephadex G-100カラム(1.5×58 cm)(Bio-Rad
社)でゲル濾過によりF(ab’)2を得、更に混在する未消
化のIgGはAffigel Protein A MAPS-II(Bio-Rad社)によ
り除去し精製した。すなわち、Affigel Protein Aに吸
着しない分画を集めセントリコン-30(商品名，アミコ
ン）にて濃縮し、0.1Mナ トリウムリン酸緩衝液(5 mM E
DTAを含む、pH6.0)で緩衝液の交換を行ないF(ab’)2画
分1.4 mgを得た。
【００２７】（Fab’の作製）：KY-hBNP-IIのF(ab’)2
溶液(0.4 mg/70 μl)に、0.1 M 2-メルカプトエチルア
ミン塩酸塩溶液(5 mM EDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸
緩衝液、pH6.0)を加え最終濃度10 mMとし、37℃で90分
間インキュベ−トした。これを5 mMEDTA含有0.1 Mナト
リウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したTSK gel 2000X
L(0.78×30 cm)（東ソ−(株)）で濾過して、Fab’を分
取しセントリコン-30(商品名，ア ミコン）で60 μlま
で濃縮し、Fab’分画(0.2 mg/60 μl)とした。
溶液(0.4 mg/70 μl)に、0.1 M 2-メルカプトエチルア
ミン塩酸塩溶液(5 mM EDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸
緩衝液、pH6.0)を加え最終濃度10 mMとし、37℃で90分
間インキュベ−トした。これを5 mMEDTA含有0.1 Mナト
リウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したTSK gel 2000X
L(0.78×30 cm)（東ソ−(株)）で濾過して、Fab’を分
取しセントリコン-30(商品名，ア ミコン）で60 μlま
で濃縮し、Fab’分画(0.2 mg/60 μl)とした。
【００２８】（マレイミドモノヨ−ド(125I)チラミ
ン）：マレイミドチラミン(1 mg/ml DMSO)15μlをガラ
スチュ−ブに取り、0.2 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH7.
0)60μl、Na125I 208 MBq(5.6 mCi)を加える。次いで、
0.5%クロラミンＴ(0.2 Mナトリウムリン酸緩衝液、pH7.
0)10μlを加え、30秒間激しく撹拌した。逆相HPLC展開
溶媒(0.1% TFA:CH3CN:CH3OH=5:3:2)で平衡化したNucleo
sil 10C18カラム(0.46×30 cm)で逆相HPLCを行なってマ
レイミドモノヨ−ド(125I)チラミン画分を分取し、窒素
気流化、60℃で蒸発乾固し、2%ジメチルスルホキシド(D
MSO)、5 mM EDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH
6.0)50μlで溶解した。
ン）：マレイミドチラミン(1 mg/ml DMSO)15μlをガラ
スチュ−ブに取り、0.2 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH7.
0)60μl、Na125I 208 MBq(5.6 mCi)を加える。次いで、
0.5%クロラミンＴ(0.2 Mナトリウムリン酸緩衝液、pH7.
0)10μlを加え、30秒間激しく撹拌した。逆相HPLC展開
溶媒(0.1% TFA:CH3CN:CH3OH=5:3:2)で平衡化したNucleo
sil 10C18カラム(0.46×30 cm)で逆相HPLCを行なってマ
レイミドモノヨ−ド(125I)チラミン画分を分取し、窒素
気流化、60℃で蒸発乾固し、2%ジメチルスルホキシド(D
MSO)、5 mM EDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH
6.0)50μlで溶解した。
【００２９】（KY-hBNP-II Fab’の125I標識）：KY-hBN
P-II Fab’70μgをガラスチュ−ブに取り、マレイミド
モノヨ−ド(125I)チラミン130 MBqを加え、室温で90分
間インキュベ−トした。1% S-カルボキシメチル BSA溶
液(0.02% N-エチルマレイミド、5 mM EDTA含有0.1 Mナ
トリウムリン酸緩衝液、pH6.0)を加えて混和し、予め5
mMEDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡
化したPD-10(Sephadex G10, Bio-Rad)カラムでゲル濾過
し、更にSuperose 12カラム(Pharmacia社製、1.0×30 c
m)により標識抗体の精製を行なった。すなわち、5 mM E
DTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化
したSuperose-12(Pharmacia社製)カラムでゲル濾過し、
予め1% S-カルボキシメチル BSA溶液を10μlずつ入れた
ガラスチュ−ブに分取して精製125I KY-hBNP-II Fab’
画分約26〜40MBq(約0.7〜1.1mCi)を得 た。
P-II Fab’70μgをガラスチュ−ブに取り、マレイミド
モノヨ−ド(125I)チラミン130 MBqを加え、室温で90分
間インキュベ−トした。1% S-カルボキシメチル BSA溶
液(0.02% N-エチルマレイミド、5 mM EDTA含有0.1 Mナ
トリウムリン酸緩衝液、pH6.0)を加えて混和し、予め5
mMEDTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡
化したPD-10(Sephadex G10, Bio-Rad)カラムでゲル濾過
し、更にSuperose 12カラム(Pharmacia社製、1.0×30 c
m)により標識抗体の精製を行なった。すなわち、5 mM E
DTA含有0.1 Mナトリウムリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化
したSuperose-12(Pharmacia社製)カラムでゲル濾過し、
予め1% S-カルボキシメチル BSA溶液を10μlずつ入れた
ガラスチュ−ブに分取して精製125I KY-hBNP-II Fab’
画分約26〜40MBq(約0.7〜1.1mCi)を得 た。
【００３０】(2)固相化第二抗体の作製 特開昭62-132172と全く同様の方法で抗マウスIgG Fc fr
agment特異家兎血清(Rockland社)をImmunobeads matrix
(Bio-Rad社)に固相化した。
agment特異家兎血清(Rockland社)をImmunobeads matrix
(Bio-Rad社)に固相化した。
【００３１】(3)試薬 アッセイ用緩衝液：１リットル中にエチレンジアミン四
酢酸・二ナトリウム塩0.372g、シスチン二塩酸塩0.063
g、アジ化ナトリウム0.1g、アプロチニン106KIUおよび
ウシ血清アルブミン1gを含む0.1 Mリン酸緩衝液(pH7.0) 腹水希釈液：ＢＣ２０３Ａをアッセイ用緩衝液 で千倍
に希釈したもの ｈＢＮＰ標準液：アッセイ用緩衝液にｈＢＮＰを0.1 pg
〜100 pg/tubeの範囲で７点の濃度(0.1、0.4、1、4、1
0、40、100)で含むもの
酢酸・二ナトリウム塩0.372g、シスチン二塩酸塩0.063
g、アジ化ナトリウム0.1g、アプロチニン106KIUおよび
ウシ血清アルブミン1gを含む0.1 Mリン酸緩衝液(pH7.0) 腹水希釈液：ＢＣ２０３Ａをアッセイ用緩衝液 で千倍
に希釈したもの ｈＢＮＰ標準液：アッセイ用緩衝液にｈＢＮＰを0.1 pg
〜100 pg/tubeの範囲で７点の濃度(0.1、0.4、1、4、1
0、40、100)で含むもの
【００３２】(4)方法 シオノギチュ−ブ（商品名）にｈＢＮＰ標準液または試
料100μlをとり、これに125I標識KY-hBNP-II Fab’およ
び腹水希釈液(ＢＣ２０３Ａ)を各々100μlずつ加えて４
℃、16時間以上インキュベ−トした後、固相化抗マウス
IgG Fc fragment特異家兎血清Immunobeads懸濁液0.1 ml
(2 mg/ml)を加え、４℃で４時間インキュベ−トした。3
000rpm、10分間遠心後、上清を吸引除去し、洗浄液（0.
1% Tween-80および0.9% 塩化ナトリウムを含む0.01 Mリ
ン酸緩衝液(pH7.0)）1 mlで洗浄した後、更に3000rpmで
10分間遠心後、上清を吸引除去し、沈降した125I標識抗
体の放射能をガンマカウンタ−(アロカ ARC-600型)で
測定した。
料100μlをとり、これに125I標識KY-hBNP-II Fab’およ
び腹水希釈液(ＢＣ２０３Ａ)を各々100μlずつ加えて４
℃、16時間以上インキュベ−トした後、固相化抗マウス
IgG Fc fragment特異家兎血清Immunobeads懸濁液0.1 ml
(2 mg/ml)を加え、４℃で４時間インキュベ−トした。3
000rpm、10分間遠心後、上清を吸引除去し、洗浄液（0.
1% Tween-80および0.9% 塩化ナトリウムを含む0.01 Mリ
ン酸緩衝液(pH7.0)）1 mlで洗浄した後、更に3000rpmで
10分間遠心後、上清を吸引除去し、沈降した125I標識抗
体の放射能をガンマカウンタ−(アロカ ARC-600型)で
測定した。
【００３３】(5)標準曲線 サンドイッチラジオイムノアッセイの典型的な標準曲線
を図１に示す。測定範囲は1 pg/mlから1000 pg/mlで良
好な直線性を示し、最小検出感度は1 pg/mlであった。
なお、図中 -○- (Ascites)は上記方法による標準曲
線、-△- (BC2035)は上記方法中の腹水希釈液(ＢＣ２０
３Ａ)に代えて、ハイブリド−マＢＣ２０３の培養上清
から得たモノクロ−ナル抗体を用いたときの標準曲線を
示す。
を図１に示す。測定範囲は1 pg/mlから1000 pg/mlで良
好な直線性を示し、最小検出感度は1 pg/mlであった。
なお、図中 -○- (Ascites)は上記方法による標準曲
線、-△- (BC2035)は上記方法中の腹水希釈液(ＢＣ２０
３Ａ)に代えて、ハイブリド−マＢＣ２０３の培養上清
から得たモノクロ−ナル抗体を用いたときの標準曲線を
示す。
【００３４】(6)健常人の血漿中レベル 本直接測定法により測定した健常人の血漿中レベルは、
表１に示したように１pg/mlから15pg/mlの範囲であり、
本発明の免疫測定法で十分測定可能な範囲であった。
表１に示したように１pg/mlから15pg/mlの範囲であり、
本発明の免疫測定法で十分測定可能な範囲であった。
【表１】
【００３５】(7)直接測定法と抽出測定法との比較 血漿中のＢＮＰを直接測定する本発明の直接測定法と、
血漿中のＢＮＰを抽出したのちに測定する抽出測定法と
の比較を行なった。血漿からのＢＮＰの抽出はSep pak
C18 cartridge(商品名, Waters)を用いて行ない、それ
以降は上記サンドイッチラジオイムノアッセイと同様の
方法で行なった。その結果、表２に示したように、本測
定法は抽出測定法と良い相関性を示した（相関係数，r=
0.98）。このことから、本発明の測定方法は、ＢＮＰを
抽出することなく十分な測定感度が得られるので、抽出
測定法に比べ非常に簡便な方法であることいえる。
血漿中のＢＮＰを抽出したのちに測定する抽出測定法と
の比較を行なった。血漿からのＢＮＰの抽出はSep pak
C18 cartridge(商品名, Waters)を用いて行ない、それ
以降は上記サンドイッチラジオイムノアッセイと同様の
方法で行なった。その結果、表２に示したように、本測
定法は抽出測定法と良い相関性を示した（相関係数，r=
0.98）。このことから、本発明の測定方法は、ＢＮＰを
抽出することなく十分な測定感度が得られるので、抽出
測定法に比べ非常に簡便な方法であることいえる。
【００３６】
【表２】 表２ ────────────────────────────── hBNP level(pg/ml) Plasma No. 抽出測定法 直接測定法 ────────────────────────────── １ ５７.６ ７１.９ ２ １７５ １９６ ３ ５４８ ６５０ ４ １７.０ ２４.９ ５ １０４０ １１１７ ６ １１９１ １１２０ ７ ４.８ ４.２ ８ ３４４ ４００ ９ １２７３ ９６９ １０ ７６９ ８３３ １１ １４.５ １２.８ １２ ２.３ ２.０ １３ ５.１ ５.２ ──────────────────────────────
【００３７】
【参考例】モノクロ−ナル抗体を用いたラジオイムノア
ッセイ本発明のモノクロ−ナル抗体を用いて競合法によ
るラジオイムノアッセイを行なった。 (1)125I標識ｈＢＮＰの作製 （Tyr0-ｈＢＮＰ-32の合成） ｈＢＮＰには標識すべきチロシン残基が存在しないの
で、ｈＢＮＰのＮ端にチロシン残基を導入したTyr0-ｈ
ＢＮＰを合成した。Boc-His(Bom)-PAM-resin (NOVA Bio
chem AG), 0.45mmolから出発し、Applied Biosystems 4
30A機により固相法の常法どおり合成し、Boc-Tyr(Br-Z)
-Ser(Bzl)-Pro-Lsy(Cl-Z)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(Bzl)-G
ly-Cys(4-CH3OBzl)-Phe-Gly-Arg(Tos)-Lys(Cl-Z)-Met-A
sp(OcHex)-Arg-Ile-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(B
zl)-Gly-Leu-Gly-Cys(4-CH3OBzl)-Lys(Cl-Z)-Val-Leu-A
rg(Tos)-Arg(Tos)-His(Bom)-PAM-resin を得た。この半
量をHF/p-crezole/dimethylsulfide処理して脱保護、蒸
留水で希釈後、アンモニア水でpH９にして室温で24時間
撹拌しS-S架橋をした。得られた粗ペプチドを逆相クロ
マト（カラム: YMC S-50 120A ODS AM-type, 30×200m
m）、溶媒:0-40% CH3CN/0.1% CF3COOHの直線濃度勾配に
より精製、さらにHPLC分取（カラム: μ-bondasphere 1
5C18 300A, 30×300mm (Waters)）、溶媒; 12-22% CH3C
N／0.1% CF3COOHの直線濃度勾配、ついでカラム:YMC 34
2-5 S-5 120A ODS, 20×150mm、 溶媒: 19.5% CH3CN, 0.
1% CF3COOH で精製して目的物を得た(3.9mg)。
ッセイ本発明のモノクロ−ナル抗体を用いて競合法によ
るラジオイムノアッセイを行なった。 (1)125I標識ｈＢＮＰの作製 （Tyr0-ｈＢＮＰ-32の合成） ｈＢＮＰには標識すべきチロシン残基が存在しないの
で、ｈＢＮＰのＮ端にチロシン残基を導入したTyr0-ｈ
ＢＮＰを合成した。Boc-His(Bom)-PAM-resin (NOVA Bio
chem AG), 0.45mmolから出発し、Applied Biosystems 4
30A機により固相法の常法どおり合成し、Boc-Tyr(Br-Z)
-Ser(Bzl)-Pro-Lsy(Cl-Z)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(Bzl)-G
ly-Cys(4-CH3OBzl)-Phe-Gly-Arg(Tos)-Lys(Cl-Z)-Met-A
sp(OcHex)-Arg-Ile-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(B
zl)-Gly-Leu-Gly-Cys(4-CH3OBzl)-Lys(Cl-Z)-Val-Leu-A
rg(Tos)-Arg(Tos)-His(Bom)-PAM-resin を得た。この半
量をHF/p-crezole/dimethylsulfide処理して脱保護、蒸
留水で希釈後、アンモニア水でpH９にして室温で24時間
撹拌しS-S架橋をした。得られた粗ペプチドを逆相クロ
マト（カラム: YMC S-50 120A ODS AM-type, 30×200m
m）、溶媒:0-40% CH3CN/0.1% CF3COOHの直線濃度勾配に
より精製、さらにHPLC分取（カラム: μ-bondasphere 1
5C18 300A, 30×300mm (Waters)）、溶媒; 12-22% CH3C
N／0.1% CF3COOHの直線濃度勾配、ついでカラム:YMC 34
2-5 S-5 120A ODS, 20×150mm、 溶媒: 19.5% CH3CN, 0.
1% CF3COOH で精製して目的物を得た(3.9mg)。
【００３８】分析用HPLC（カラム: Cosmosil 5C18, 4.6
×150mm (ナカライテスク); 溶媒: 20% CH3CN／0.1% CF
3COOH; 流速: 1.0ml/min.; 検出: 220nm）で単一ピ−ク
（保持時間: 9.10min.）を与えた。 酸加水分解物（6M HCl, 110℃, 20h, フェノ−ル共存
下）のアミノ酸分析結果は次の通り：Asp 0.99(1); Ser
4.98(6); Glu 0.97(1); Gly 4.75(5); Val 1.90(2); M
et 1.82(2); Ile 0.95(1); Leu 2.02(2); Tyr 0.85(1);
Phe 0.93(1); Lys 2.79(3); His 1.00(1); Arg 3.78
(4); Pro 0.89(1). （ ( )内は理論比、Serは未補正）
×150mm (ナカライテスク); 溶媒: 20% CH3CN／0.1% CF
3COOH; 流速: 1.0ml/min.; 検出: 220nm）で単一ピ−ク
（保持時間: 9.10min.）を与えた。 酸加水分解物（6M HCl, 110℃, 20h, フェノ−ル共存
下）のアミノ酸分析結果は次の通り：Asp 0.99(1); Ser
4.98(6); Glu 0.97(1); Gly 4.75(5); Val 1.90(2); M
et 1.82(2); Ile 0.95(1); Leu 2.02(2); Tyr 0.85(1);
Phe 0.93(1); Lys 2.79(3); His 1.00(1); Arg 3.78
(4); Pro 0.89(1). （ ( )内は理論比、Serは未補正）
【００３９】（Na125Iによる標識化） Tyr0-ｈＢＮＰ 10μgに0.5Mリン酸緩衝液(pH7.5)0.05ml
とNa125I(Amersham社製)18.8MBq.を加え混和後、0.2%ク
ロラミンＴ溶液0.01mlを加え、30秒間撹拌した。次い
で、1%メタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加え混和後、10%
ヨウ化カリウム0.01mlを加え、反応溶液をHPLC( colum
n;YMC-A-302 S-5 12A ODS)：4.6×150mm、アセトニトリ
ル−トリフルオロ酢酸のグラジエント溶出により、保持
時間19分にモノヨ−ド体として4.2Mbeq.を得た。
とNa125I(Amersham社製)18.8MBq.を加え混和後、0.2%ク
ロラミンＴ溶液0.01mlを加え、30秒間撹拌した。次い
で、1%メタ重亜硫酸ナトリウム溶液を加え混和後、10%
ヨウ化カリウム0.01mlを加え、反応溶液をHPLC( colum
n;YMC-A-302 S-5 12A ODS)：4.6×150mm、アセトニトリ
ル−トリフルオロ酢酸のグラジエント溶出により、保持
時間19分にモノヨ−ド体として4.2Mbeq.を得た。
【００４０】(2)試薬 アッセイ用緩衝液：１リットル中にエチレンジアミン四
酢酸・二ナトリウム塩0.372g、シスチン二塩酸塩0.063
g、アジ化ナトリウム0.1g、アプロチニン106KIUおよび
ウシ血清アルブミン1gを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0 腹水希釈液：ＢＣ２０３Ａをアッセイ用緩衝液で4.2万
倍したもの ｈＢＮＰ標準液：アッセイ用緩衝液に市販ｈＢＮＰ
（(株)ペプチド研究所）を0.046〜99.9ng/mlの範囲で３
倍刻みの濃度で含む 2.5%ウシガンマグロブリン：アッセイ用緩衝液に溶解し
たもの 25%ポリエチレングリコ−ル：ポリエチレングリコ−ル6
000（米山薬品工業(株)）をウシ血清アルブミンを除い
たアッセイ用緩衝液に溶解したもの
酢酸・二ナトリウム塩0.372g、シスチン二塩酸塩0.063
g、アジ化ナトリウム0.1g、アプロチニン106KIUおよび
ウシ血清アルブミン1gを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0 腹水希釈液：ＢＣ２０３Ａをアッセイ用緩衝液で4.2万
倍したもの ｈＢＮＰ標準液：アッセイ用緩衝液に市販ｈＢＮＰ
（(株)ペプチド研究所）を0.046〜99.9ng/mlの範囲で３
倍刻みの濃度で含む 2.5%ウシガンマグロブリン：アッセイ用緩衝液に溶解し
たもの 25%ポリエチレングリコ−ル：ポリエチレングリコ−ル6
000（米山薬品工業(株)）をウシ血清アルブミンを除い
たアッセイ用緩衝液に溶解したもの
【００４１】(3)方法 シオノギチュ−ブ(商品名)にｈＢＮＰ標準液または試料
100μlをとり125I標識ｈＢＮＰ100μlおよび腹水希釈液
100μlを加えて混和した後、４℃で一晩インキュベ−ト
した。ついで、４℃に冷却した2.3%ウシガンマグロブリ
ン100μl、25%ポリエチレングリコ−ル500μlを加え、
直ちに撹拌した後、４℃で3000rpm、20分間遠心した。
上清を除去した後、沈殿の放射能をガンマカウンタ−
(アロカ ARC-600型)で測定した。
100μlをとり125I標識ｈＢＮＰ100μlおよび腹水希釈液
100μlを加えて混和した後、４℃で一晩インキュベ−ト
した。ついで、４℃に冷却した2.3%ウシガンマグロブリ
ン100μl、25%ポリエチレングリコ−ル500μlを加え、
直ちに撹拌した後、４℃で3000rpm、20分間遠心した。
上清を除去した後、沈殿の放射能をガンマカウンタ−
(アロカ ARC-600型)で測定した。
【００４２】(4)標準曲線 ラジオイムノアッセイの標準曲線を図２に示す。感度(9
0%、50%阻害濃度)は、それぞれ1.3 ng/ml、11.8ng/mlで
あった。なお、図中 -○- (Ascites)は上記方法による
標準曲線、-●- (27-32No.1-F)は上記方法中の腹水希釈
液に代えて、ｈＢＮＰ(27-32)で免疫したマウス(No.1)
のFinal抗血清を用いたときの標準曲線を示す。
0%、50%阻害濃度)は、それぞれ1.3 ng/ml、11.8ng/mlで
あった。なお、図中 -○- (Ascites)は上記方法による
標準曲線、-●- (27-32No.1-F)は上記方法中の腹水希釈
液に代えて、ｈＢＮＰ(27-32)で免疫したマウス(No.1)
のFinal抗血清を用いたときの標準曲線を示す。
【００４３】
【発明の効果】本発明のｈＢＮＰの免疫測定法は、最小
検出限界が１ｐｇ／ｍｌと非常に高感度であり、血漿中
のｈＢＮＰを、抽出することなく、直接測定することが
できる。従って本方法は高血圧や心機能・腎機能の診断
などｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に有用であ
る。
検出限界が１ｐｇ／ｍｌと非常に高感度であり、血漿中
のｈＢＮＰを、抽出することなく、直接測定することが
できる。従って本方法は高血圧や心機能・腎機能の診断
などｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に有用であ
る。
【００４４】
【図１】本発明のサンドイッチラジオイムノアッセイの
標準曲線を示す。
標準曲線を示す。
【図２】本発明のモノクロ−ナル抗体を用いた競合法に
よるラジオイムノアッセイの標準曲線を示す。
よるラジオイムノアッセイの標準曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ，ＶＯ Ｌ．127，ＮＯ．３ （1990） Ｐ. 1292−1300 ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮ，ＶＯＬ. 84，ＮＯ．３ （1991．ＳＥＰ） Ｐ. 1203−1209 Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．，ＶＯ Ｌ．87，ＮＯ．４ （1991．ＡＰＲ） Ｐ．1402−1412
Claims (10)
- 【請求項１】 ｈＢＮＰのＣ端を特異的に認識するモノ
クローナル抗体であって、その結合部位にＣ末端のヒス
チジン残基が含まれているモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ハイブリドーマＢＣ２０３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３５１５）の特性を有するハイブリドーマ細胞系
によって産生されるモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 ハイブリドーマＢＣ２０３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３５１５）である請求項３記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項５】 請求項３または４記載のハイブリドーマ
を、培地中またはマウス腹腔内で培養し、それぞれ培地
または腹水からモノクローナル抗体を採取することを特
徴とする、請求項１または２記載のモノクローナル抗体
の製造方法。 - 【請求項６】 請求項１または２記載のモノクローナル
抗体と、該抗体とはｈＢＮＰの認識部位が異なる別の抗
体とを用い、ｈＢＮＰをサンドイッチすることを特徴と
するｈＢＮＰの免疫測定方法。 - 【請求項７】 該別の抗体がモノクローナル抗体である
請求項６記載の免疫測定方法。 - 【請求項８】 該別の抗体がｈＢＮＰのリング構造を認
識する抗体である請求項６記載の免疫測定方法。 - 【請求項９】 該別の抗体がハイブリドーマＫＹ−ｈＢ
ＮＰ−ｌｌ（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８６３）の特性を有す
るハイブリドーマ細胞系から産生されるモノクローナル
抗体である請求項７記載の免疫測定方法。 - 【請求項１０】 ヒト血漿中のｈＢＮＰを、抽出するこ
となく、直接測定することを特徴とする請求項６から９
までのいずれかに記載の免疫測定方法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3326961A JP2665850B2 (ja) | 1991-11-14 | 1991-11-14 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
| TW081108985A TW230787B (ja) | 1991-11-14 | 1992-11-10 | |
| EP92119353A EP0542255B1 (en) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Monoclonal antibody recognizing the C-terminus of hBNP |
| ES92119353T ES2129421T3 (es) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Anticuerpos monoclonales que reconocen el extremo c de hbnp. |
| AT92119353T ATE176804T1 (de) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Monoklonaler antikörper, der den c-terminus von hbnp erkennt |
| DK92119353T DK0542255T3 (da) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Monoklont antistof, der genkender C-terminus i hBNP |
| DE69228436T DE69228436T2 (de) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Monoklonaler Antikörper, der den C-Terminus von hBNP erkennt |
| KR1019920021448A KR100248315B1 (ko) | 1991-11-14 | 1992-11-14 | 사람 뇌성나트륨 이뇨펩티드의 카르복실 말단을 인식하는 모노클로날항체 |
| GR990400995T GR3029904T3 (en) | 1991-11-14 | 1999-04-07 | Monoclonal antibody recognizing the C-terminus of hBNP |
| US09/942,709 US6677124B2 (en) | 1991-11-14 | 2001-08-31 | Monoclonal antibody recognizing C-terminus of hBNP |
| US10/697,886 US20040253655A1 (en) | 1991-11-14 | 2003-10-31 | Monoclonal antibody recognizing C-terminus of hBNP |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3326961A JP2665850B2 (ja) | 1991-11-14 | 1991-11-14 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184384A JPH05184384A (ja) | 1993-07-27 |
| JP2665850B2 true JP2665850B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=18193724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3326961A Expired - Lifetime JP2665850B2 (ja) | 1991-11-14 | 1991-11-14 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6677124B2 (ja) |
| EP (1) | EP0542255B1 (ja) |
| JP (1) | JP2665850B2 (ja) |
| KR (1) | KR100248315B1 (ja) |
| AT (1) | ATE176804T1 (ja) |
| DE (1) | DE69228436T2 (ja) |
| DK (1) | DK0542255T3 (ja) |
| ES (1) | ES2129421T3 (ja) |
| GR (1) | GR3029904T3 (ja) |
| TW (1) | TW230787B (ja) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2665850B2 (ja) * | 1991-11-14 | 1997-10-22 | 塩野義製薬株式会社 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
| GB9211686D0 (en) * | 1992-06-03 | 1992-07-15 | Medisinsk Innovation A S | Chemical compounds |
| PT914344E (pt) | 1996-03-04 | 2005-10-31 | Scios Inc | Ensaio e reagentes para a quantificacao de hbnp |
| US6117644A (en) * | 1998-06-04 | 2000-09-12 | Ottawa Heart Institute Research Corporation | Predicting and detecting cardiac allograft rejection |
| US7432060B2 (en) | 2000-11-09 | 2008-10-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods for diagnosis of cardiovascular disease |
| US20040253242A1 (en) * | 2000-12-05 | 2004-12-16 | Bowdish Katherine S. | Rationally designed antibodies |
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