JPH0678763A - α−ｈＡＮＰを認識するモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ミエロ−マ細胞と抗α−ｈＡＮＰ抗体産生細胞
を融合させてハイブリド−マを作製し、このハイブリド
−マからα−ｈＡＮＰのリング構造のＮ端側の約半分を
認識するモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ
を選択することにより、所望のモノクロ−ナル抗体を産
生するハイブリド−マを得た。 【効果】このハイブリド−マが産生するモノクロ−ナル
抗体を用いたα−ｈＡＮＰの免疫学的測定試薬を用いれ
ば、α−ｈＡＮＰを抽出することなく直接検体中のα−
ｈＡＮＰを測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はα−ヒト心房性ナトリウ
ム利尿ポリペプチド（α−ｈＡＮＰ）のリング構造のＮ
端側の約半分を認識するモノクロ−ナル抗体を産生する
ハイブリド−マに関し、さらに詳しくは、α−ｈＡＮＰ
[7-16]断片に含まれ、かつ、Ｍｅｔ[12]を含む部分を認
識するモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マに
関する。

【０００２】

【従来の技術】心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（at
rial natriuretic polypeptide、ANP）は、心房筋細胞
により産生され顆粒中に含まれる、強い利尿作用および
ナトリウム排泄作用を有するポリペプチドである。この
ようなポリペプチドはヒトのみならずラットにおいても
見出されており、それぞれｈＡＮＰ、ｒＡＮＰと呼ばれ
る。ｈＡＮＰおよびｒＡＮＰはさらにα、β、γの３つ
のタイプに分類される。α−ｈＡＮＰは２８アミノ酸残
基からなり、Ｎ端から７番目のＣｙｓ[7]と２３番目の
Ｃｙｓ[23]がジスルフィド結合しており、その間の配列
がリング状構造をなしている (Biochem. Biophys. Res.
Commun. (以下 BBRC と略記する) 118、 131-139、 198
4)。α−ｒＡＮＰは、α−ｈＡＮＰではＮ端から１２番
目の残基がＭｅｔであるのに対し、α−ｒＡＮＰではＩ
ｌｅである点でのみ異なっている (BBRC 117、 839-865、
1983)。β−ｈＡＮＰは、α−ｈＡＮＰの逆平行二量体
である (特開昭60-184098)。γ−ｈＡＮＰは１２６アミ
ノ酸残基からなり、そのＣ端の９９〜１２６アミノ酸が
α−ｈＡＮＰに相当する。

【０００３】ＡＮＰの測定法としては既に抗血清を用い
たラジオイムノアッセイが確立されている (Science 22
8、 323-325、 1985; Nature 314、 264-266、 1985; BBRC
124、815-821、 1984; BBRC 124、 663-668、 1984; BBRC 1
25、 315-323、 1984)。このうち、抗血清ＣＲ−３はＡＮ
ＰのＣ末端断片[17-28]を認識することが知られてい
る。

【０００４】また、α−ｈＡＮＰを認識するモノクロ−
ナル抗体としては１１Ａ−Ａ１１が知られている。該抗
体はラットのＡＮＰの一種であるアトリオペプチンIIを
抗原として得られたもので、そのエピト−プはジスルフ
ィド結合を含むＣｙｓ[7]−Ｓｅｒ[25]の間に存在し、
即ちＡＮＰのリング構造の一部であろうと考えられてい
る。但し、該抗体の親和性はＭｅｔ[12、ヒト]とＩｌｅ
[12、ラット]間で差がなく、ｒＡＮＰとｈＡＮＰを認識
する (Life Science, Vol. 38, 1991-1997, 1986)。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来のＡＮＰのイムノ
アッセイにおいては、試料からＡＮＰを抽出する必要が
あり、抽出の必要がない高感度のアッセイを可能にする
親和性の高いモノクロ−ナル抗体が待望されていた。Ａ
ＮＰを認識するモノクロ−ナル抗体としては上記の１１
Ａ−Ａ１１が得られていたが、該抗体はｈＡＮＰのみな
らずｒＡＮＰも認識してしまう。また、上記の様にＡＮ
Ｐ抗血清ＣＲ−３はＡＮＰのＣ末端側を認識するので、
ＡＮＰのＮ端側断片を特異的に認識する抗体が得られれ
ば、そのような２種の抗体によるサンドイッチイムノア
ッセイが可能になる。従って、ｈＡＮＰのＮ端側断片を
特異的に認識する親和性の高いモノクロ−ナル抗体が待
望されていた。

【０００６】ｈＡＮＰの免疫学的測定法としては、従
来、ラジオアイソト−プを利用するラジオ・イムノアッ
セイ（以下ＲＩＡと略記する）と酵素を利用するエンザ
イム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）とが知られているが、
ＲＩＡの場合には施設・設備の問題からなるべくその利
用を避ける傾向にあり、利用場所を問わない高感度のＥ
ＩＡの開発がむしろ望まれている。ＥＩＡにおける酵素
標識法としてはその架橋剤としてグルタルアルデヒドを
利用する方法が従来一般的であったが、最近では重合の
問題や収率の低さなどの点で問題があり、あまり用いら
れなくなった。グルタルアルデヒドに替わる架橋剤とし
て、最近、Ｎ,Ｎ’-Ｏ-フエニレンジマレイミド、Ｎ−
（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが知られて
いる［J. Immunoassay４, ２０９〜３２７（１９８
３）］が、ｈＡＮＰに応用した報告は無く、未だに、高
感度のｈＡＮＰの免疫学的測定法が開発されたとは言え
ない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らはｈＡＮＰの
Ｎ端側断片を特異的に認識する親和性の高いモノクロ−
ナル抗体を創製すべく鋭意研究を行なった結果、α−ｈ
ＡＮＰのリング構造のＮ端側断片を認識するモノクロ−
ナル抗体を産生するハイブリド−マを得て、そのモノク
ロ−ナル抗体を利用するα−ｈＡＮＰの高感度測定法を
完成するに至った。

【０００８】(1) モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド
−マの調製 α−ｈＡＮＰは２８アミノ酸残基からなるポリペプチド
であり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起する
能力（免疫原性）が低い。そのため、抗原として用いる
ためには牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結
合させる。得られた複合体は、フロイントの完全アジュ
バント等の適当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫
に用いる。

【０００９】免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウス
の腹腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種することに
より行なう。最終免疫後３日ないし５日後に脾臓を取り
出し、抗体産生細胞として使用する。この時同時に抗体
産生細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親細
胞として、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフエラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ^-）あるいはチミ
ジンキナーゼ欠損（ＴＫ^-）の様な適切なマーカーを持
つミエローマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを
融合させてハイブリドーマを作製する。

【００１０】ハイブリドーマ作製における培地として、
イーグルＭＥＭ、ダルベツコ変法培地、ＲＰＭＩ−１６
４０などの通常良く使用されているものに、適宜約１５
％の牛胎児血清（FCS、fetal calf serum）を加えて用
いる。

【００１１】まず、親細胞であるミエローマと脾細胞を
約１：６.５の割合で用意する。融合剤としてはよく用
いられているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の５０
％を用いるのが融合率が高いとされている。融合株はＨ
ＡＴ選択法により選択する。生じるハイブリドーマのス
クリーニングは培養上清を用い、膜螢光抗体法、ＥＬＩ
ＳＡ法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、免疫
組織染色法など既知の方法により行ない、目的の免疫グ
ロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローンを選
択する。ハイブリドーマの単一性を吟味するため、９６
穴のマイクロウエルにフイーダーレイヤー（feeder lay
er）として正常な脾細胞をおよそ１０⁶cell/well 蒔い
た上にハイブリドーマを１穴に１個より多くならないよ
うに蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリー
ニングを行なう。このサブクローニングを繰り返すこと
により、単一性のハイブリドーマを得る。

【００１２】(2) モノクロ−ナル抗体の産生 次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（in vitr
o）または動物体内（in vivo）で培養する。invitro 系
で培養する場合、培地は先に述べた通常培地に FCS を
添加したものでよく、この培地で３から５日培養の後、
培養上清からモノクロ−ナル抗体を得る。in vivo 系の
培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、
７ないし１４日後に腹水を採取し、これよりモノクロ−
ナル抗体を得る。in vivo 系での培養の場合、in vitro
系での培養に比べて遥かに大量の抗体を効率的に取得し
うるので好ましい。

【００１３】こうして得られた培養上清または腹水から
のモノクロ−ナル抗体の精製は、硫安分画、ＤＥＡＥセ
フアロースカラム等の既知の方法を適宜組み合わせて、
例えば後記実施例に記載したようにして行なうことが出
来る。

【００１４】本発明で得られたモノクロ−ナル抗体ＫＹ
−ＡＮＰ−Ｉは、後記参考例に示される通り、α−ｈＡ
ＮＰを特異的に認識し、ｒＡＮＰに対しては殆ど親和性
を示さない。そのエピト−プはα−ｈＡＮＰのリング構
造のＮ末端側半分、詳細にはＣｙｓ[7]からＧｌｙ[16]
に含まれる部分を認識しているものと推定され、またｒ
ＡＮＰとは反応しないことから、Ｍｅｔ[12]を含む部分
であると考えられる。該エピト−プはα−ｈＡＮＰのみ
ならずβ−ｈＡＮＰ、γ−ｈＡＮＰにも共通の部分であ
り、該抗体はβ−ｈＡＮＰ、γ−ｈＡＮＰに対しても反
応性を有する。

【００１５】また、本抗体はα−ｈＡＮＰに対して高い
親和性（Ｋａ＝４.５×１０⁹ M^-1）を示した。図１に示
すα−ｈＡＮＰの標準曲線から、９０％および５０％阻
害濃度（ＩＣ₉₀、ＩＣ₅₀）はそれぞれ１０pg/チュ−
ブ、１００pg/チュ−ブであった。

【００１６】本発明のモノクロ−ナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ
−Ｉを産生するハイブリド−マＫＹ−ＡＮＰ−Ｉは１９
８７年８月２０日から英国 Porton Down, Salisbury. S
P4 OJG. の PHLS Centre for Applied Microbiology &
Research、European Collection of Animal Cell Cultu
res (ECACC) に受託番号８７０８２００１としてブタペ
スト条約に基づき寄託されている。

【００１７】(3) 抗体と担体との結合 抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビ−ズ）あるいは球状物（ボ
−ル）、チュ−ブ、プレ−トなどを用いることができ
る。これらの担体に、α−ｈＡＮＰのＮ端側またはＣ端
側を認識する抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バ
ッファ−中、pH ６〜１０、好ましくは中性付近で室温
下に一夜放置することにより行なう。抗体を吸着した担
体は、アジ化ナトリウムなどの殺菌剤の存在下、冷所に
保存する。

【００１８】モノクロ−ナル抗体およびポリクロ−ナル
抗体について、同様の処理で担体に結合せしめることが
できる。

【００１９】(4) ウサギ抗α−ｈＡＮＰ[17-28]血清 カルボジイミド法により調製したα−ｈＡＮＰ[17-28]
−ウシ・チログロブリン複合体をウサギに投与して数回
免疫し、最終免疫から１０〜１４日後に採血してウサギ
抗α-ｈＡＮＰ[17-28]血清を調製する。

【００２０】(5) 酵素標識抗体の調製ウサギ IgG、 F(ab’)₂ および Fab’ 上記で調製した抗血清を硫酸ナトリウムで分画し、次い
で、ＤＥＡＥ−セルロ−スのカラムを通すことにより I
gG を調製する。得られた IgG をペプシンで消化して F
(ab’)₂断片とし、更にこれを２−メルカプトエチルア
ミンで還元すれば、目的の抗α−ｈＡＮＰ[17-28]Fab’
が得られる。IgGからFab’の調製については、ジャ−ナ
ル・オブ・イムノアッセイ［J.Immunoassay］、４、２
０９〜３２７ （１９８３）に詳細な説明があり、本発
明においても、同様の手法を利用することができる。

【００２１】抗体の酵素標識 抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファタ−ゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、グルコ
−スオキシダ−ゼなどが利用可能であるが、本発明にお
いては、特に西洋わさびペルオキシダ−ゼが好ましく用
いられる。また、架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マ
レイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシン
イミドエステル、４，４’−ジチオジピリジン、その他
公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素
および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じ
て、既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体とし
ては、場合によっては、そのフラグメント、例えば Fa
b’、Fab、F(ab’)₂を用いる。本発明においては、架橋
剤として４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
酸・Ｎ−スクシンイミドエステルまたは６−マレイミド
ヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステルを用いるのが
好ましい。また、ポリクロ−ナル、モノクロ−ナル抗体
にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることが
できる。従って、上記２架橋剤を用いて得られる酵素標
識抗体は、一般式（Ｉ）；

【００２２】

【化１】

【００２３】［但し、式中Ａはα-ｈＡＮＰのＮ端側ま
たはＣ端側を認識する抗体またはそのフラグメントを、
Ｂは標識酵素を、Ｒは４−メチレンシクロヘキシルまた
はペンタメチレンをそれぞれ表わす。］で表わすことが
できる。

【００２４】このようにして得られる酵素標識抗体は、
好ましくは、アフィニティ・クロマトグラフィ−により
精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能となる。
精製した酵素標識抗体は、安定剤としてチメロサ−ルま
たはグリセリンを加えて、あるいは凍結乾燥して冷暗所
に保存する。

【００２５】上記で調整された免疫学的測定試薬を用い
てα−ｈＡＮＰを測定する際の抗体の組合わせとして
は、α−ｈＡＮＰのＮ端側を認識する抗体を固定化した
場合にはＣ端側を認識する抗体を酵素標識抗体とし、Ｃ
端側を認識する抗体を固定化した場合にはＮ端側を認識
する抗体を酵素標識抗体とすればよい。一般には、固定
化には比較的大量の抗体が必要であるため安定的に大量
の抗体が得られるモノクロ−ナル抗体（例えば、本発明
のＮＫ−ＡＮＰ−Ｉ）が固定化に適しているが、抗血清
から得られるポリクロ−ナル抗体も不都合なく使用でき
る。酵素標識する抗体は、モノクロ−ナル抗体、ポリク
ロ−ナル抗体のいずれでもよく、固定化した抗体が認識
するのとは異なる部位を認識するものであればよい。例
えば、固定化抗体として本発明のＫＹ−ＡＮＰ−Ｉを用
いた場合には酵素標識抗体として上述の抗血清ＣＲ−３
や実施例中の抗血清Ｆ３６が適用でき、またこの逆の組
合わせでもよい。当然、α−ｈＡＮＰのＣ端側を認識す
るモノクロ−ナル抗体やＮ端側を認識する抗血清も本発
明に適用できる。

【００２６】

【実施例】ハイブリド−マの調製 合成α−ｈＡＮＰ（１.５ｍｇ）と牛チログロブリン
（５.４ｍｇ）を２ｍｌの蒸留水に溶解する。この溶液
に、蒸留水１ｍｌに溶解した１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド３０ｍｇを室温
で１０分かけて滴下し、室温で２４時間撹拌する。この
溶液を、蒸留水３Ｌに対して６回、３日間透析する。こ
の透析物を５つに分注して−２０℃で保存した（BBRC
124, 815-821, 1984 参照）。

【００２７】上記の分注保存した溶液（３００μｇのα
−ｈＡＮＰを含む）に蒸留水を加え１.２ｍｌとし、こ
れを１.２ｍｌのフロイントの完全アジュバントに懸濁
した。そのうち約２ｍｌを１０匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウ
スの腹腔および皮下に注射し（１匹当り２００μｌ）、
さらに３週間後に同じ方法で追加免疫した。追加免疫の
５週間後、血液中の抗体を測定し、最も強く抗体反応を
示した２匹のマウスの尾静脈に５０μｇのα−ｈＡＮＰ
を含む上記溶液をさらに追加免疫した。その４日後、２
匹のマウスから細胞融合のために脾臓細胞を採集した。

【００２８】採集した脾臓細胞（１.３×１０⁸個）とミ
エロ−マ細胞X63-Ag8.653（２×１０⁷個）をダルベッコ
培地中（ＤＭＥＭ）で混合し、１５００rpm、４℃で５
分間遠沈した。得られたペレットを３７℃に加温し解し
た後、５０％ＰＥＧ４０００（ＰＥＧ１ｇ／ＤＭＥＭ１
ｍｌ）１ｍｌを３７℃で１分間かけて滴下した。３７℃
で２分間放置した後、３７℃のＤＭＥＭ１０ｍｌを５分
かけて加え希釈し、４℃で１５％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで
遠心洗浄する。

【００２９】得られた細胞は９６穴プレ−トに蒔き、Ｈ
ＡＴ培地中で２週間、さらにＨＴ培地中で１週間培養し
た。全７６８ウエル中約３０％（２１２／７６８）でハ
イブリド−マが増殖し、そのうち４％（８／２１２）が
抗α−ｈＡＮＰ抗体を産生していた。

【００３０】最も高い抗体価を示したウエルの細胞は限
界希釈法によりクロ−ン化した。即ち、フィ−ダ−細胞
としてＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を１０⁶個／ウエ
ル、ハイブリド−マを１個／ウエルとなるようにウエル
に加え培養し、この操作を２回行なった。

【００３１】このクロ−ニングによって、最も安定に大
量の抗体を産生するクロ−ンを選択し、ＫＹ−ＡＮＰ−
Ｉと命名した。

【００３２】上記の、免疫マウスの抗血清およびハイブ
リド−マ培養上清中の抗体価は下記の様にして測定し
た。

【００３３】免疫マウスの抗血清またはハイブリド−マ
の培養上清をサンプルとし、該サンプル希釈液１００μ
ｌ、アッセイバッファ−（ＲＩＡバッファ−）３００μ
ｌ、¹²⁵Ｉ-α−ｈＡＮＰ（１００００ｃｐｍ）１００μ
ｌの混合液を４℃で２４時間反応させる。これをデキス
トラン−コ−テッド−チャ−コ−ル１ｍｌと混合し４℃
で５分間反応させる。その後、４℃で３０分間３０００
ｒｐｍにて遠心し、その上清の放射活性をγ−カウンタ
−で測定することにより、サンプル希釈液中の抗体価を
求めた。

【００３４】上記¹²⁵Ｉ-α−ｈＡＮＰはクロラミンＴ法
によって調製した。即ち、α−ｈＡＮＰ（１μｇ）とNa
¹²⁵I（１ｍＣｉ）を混合し、１０μｌのクロラミンＴ
（５.２５ｍｇ／ｍｌ）を加え、１０秒後に２０μｌの
ピロ亜硫酸ナトリム（４.５ｍｇ／ｍｌ）を加える。さ
らに、２％ゼラチン１ｍｌを加え、Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ
１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）で精製する。

【００３５】モノクロ−ナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０.５ｍｌのプリスタンを腹腔
に２回１〜２週間間隔で投与することにより前処理し
た。そのマウスの腹腔に、２００μｌのＤＭＥＭに懸濁
した５×１０⁶個のハイブリド−マＫＹ−ＡＮＰ−Ｉを
注射した。得られた腹水をプロテインＡ−セファロ−ス
ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、モノクロ−ナル抗体ＫＹ−
ＡＮＰ−Ｉを得た。

【００３６】ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉの諸性状 本モノクロ−ナル抗体のアイソタイプの決定はオクタロ
ニ−法に従って行ない、ＩｇＧ₁サブクラスに属するも
のと決定された。親和性は、ラジオバインディングアッ
セイによりスキャッチャ−ドプロットを作成することに
より求め、その結果Ｋａ＝４.５×１０⁹M^-1であった。

【００３７】エピト−プは、種々のＡＮＰ関連ペプチド
に対する交差反応性をＲＩＡで調べることにより決定し
た。その結果を図１に示す。α−ＡＮＰ[17-28]とα−
ＡＮＰ[1-6]には殆ど反応しないことからエピト−プは
α−ＡＮＰ[7-16]に含まれると推定される。さらに、α
−ｈＡＮＰ[8-22]、α−ｒＡＮＰとも反応しないことか
ら、エピト−プはリング構造を成していることが必要
で、かつ、Ｍｅｔを含んでいるものと推定される。即
ち、本発明のモノクロ−ナル抗体が認識するエピト−プ
は、α−ｈＡＮＰのリング構造のＮ端側の約半分である
と結論された。

【００３８】また、上記抗体価測定法に従いＫＹ−ＡＮ
Ｐ−Ｉとβ−ｈＡＮＰおよびγ−ｈＡＮＰとの反応性を
調べた結果、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉはα−ｈＡＮＰのみなら
ずγ−ｈＡＮＰも認識し、さらに、β−ｈＡＮＰも交差
反応性８０％で反応した。

【００３９】抗α−ｈＡＮＰ[17-28]ウシ・チログロブ
リン血清の作製 α−ｈＡＮＰ[17-28]を公知のカルボジイミド法（BBRC
117, 695, 1984）により、ウシ・チログロブリンと結合
させる。α−ｈＡＮＰ[17-28] ３.１mgを含む水溶液０.
5mlにウシ・チログロブリン１９mgを含む水溶液０.７ml
を加え、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩４０mgを含む水溶液１
mlを加えて、氷冷下で２時間撹拌する。この反応液を蒸
留水２Ｌに対して４℃で３回透析したのち、凍結乾燥し
て複合体２１mgを得る。ウシ・チログロブリンに対する
α−ｈＡＮＰ[17-28]の結合モル比は、アミノ酸分析法
により求めた結果、３０であった。

【００４０】免疫ならびに採血 上記α−ｈＡＮＰ[17-28]−ウシ・チログロブリン複合
体０.２５mgを生理食塩水０.２５mlに溶かし、これを等
量のフロインド（Freund）完全アジュバンドに懸濁して
家兎の背部２０ケ所以上に皮下注射する。これを３週間
毎に６回繰り返し、最終投与後１０日目に頚動脈から全
採血して抗血清Ｆ３６を得る。

【００４１】ウサギ IgG の調製 抗α-hANP 血清（Ｆ３６）１mlに 硫酸ナトリウム 0.18
ｇを撹拌下にゆっくり加え、添加物が完全に溶解してか
ら、２２〜２５℃で撹拌を続ける。次いで混合物を温度
２２〜２５℃、回転数 10,000 rpmの条件で１０分間遠
心分離し、沈澱物を１mlのリン酸ナトリウム・バッファ
−（pH 6.3; 17.5 mmol/Ｌ）に溶かし、同じバッファ−
中で透析する。上澄液を、予め同じバッファ−（pH 6.
3; 17.5 mmol/Ｌ）で平衡化した DEAE セルロ−ス・カ
ラムに通す。上澄液中の１０mgの蛋白を通過せしめるに
要する DEAE セルロ−スの湿潤容量は１mlである。IgG
の収量は、２８０nmでの吸光度から、２８０nmでの吸光
度を 1.5 g^-1Ｌ,cm^-1とし、IgGの分子量を 150,000 と
して計算し、７mgであった（ジャ−ナル・オブ・イムノ
アッセイ［J.Immunoassay］、４、２０９〜３２７（１
９８３）参照）。

【００４２】F(ab’)₂ の調製 ウサギ IgG １０mgを酢酸ナトリウム・バッファ−（pH
4.5, O.1 mol/Ｌ）１mlに対して５℃で透析する。透析
した IgG 溶液に、0.05 ml（容量１／２０）の塩化ナト
リウム水溶液（２ mol／Ｌ）を加える。この溶液に、
ブタ胃粘膜由来のペプシン（0.2 mg/10 mg IgG）を加
え、溶解する。混合物を３７℃で１５〜２４時間反応さ
せる。次いで、水酸化ナトリウム水溶液（1 mol/Ｌ）で
pH８に調整し、セファデックスＧ−１５０のカラム（1.
0〜1.5 mlに対して 1.5 x 45 cm, 2.0〜2.5 mlに対して
2.0 x 45 cm）にかけ、ホウ酸ナトリウム・バッファ−
（pH8.0、 0.1 mol/Ｌ）で溶出する。F(ab’)₂の収量
は、２８０nmでの吸光度から、２ ８０nmでの吸光度を
1.48 g^-1 Ｌ,cm^-1、F(ab’)₂ の分子量を 92,000 とし
て計 算し、６mgであった（ジャ−ナル・オブ・イムノ
アッセイ［J.Immunoassay］、 ４、２０９〜３２７（１
９８３）参照）。

【００４３】Fab’ の調製 F(ab’)₂ ３mgをリン酸ナトリウム・バッファ−（pH 6.
0, 0.1 mol/Ｌ）0.45ml に溶解する。これに用時調製し
た 5 mmol/ＬのＥＤＴＡを含む２−メルカプトエチルア
ミン／リン酸ナトリウム・バッファ−溶液（pH 6.0, 0.
1 mol/Ｌ）を加え、３７℃で 1.5 時間反応させる。次
いで、反応混合物をセファデックスＧ− ２５のカラム
（1 x 30 cm）にかけ、リン酸ナトリウム・バッファ−
（pH 6.0, 0.1 mol/Ｌ； 5 mmol/ＬのＥＤＴＡ含有）で
溶出する。Fab’の収量は、２８０nm での吸光度から、
２８０nmでの吸光度を 1.48 g^-1.Ｌcm^-1、F(ab’)₂ の
分子量を 46,000 として計算し、２.５mgであった（ジ
ャ−ナル・オブ・イムノアッセイ ［J.Immunoassay］、
４、２０９〜３２７（１９８３）参照）。

【００４４】抗α-hANP [17-28] Fab’-ペルオキシダ−
ゼ標識体の調製 西洋わさび・ペルオキシダ−ゼ２mg (50 nmol)をリン酸
ナトリウム・バッファ−（pH 7.0、 0.1 mol/Ｌ)0.3 ml
に溶かし、これに６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ-スクシ
ンイミドエステル 0.65 mg(2100 nmol)およびＮ,Ｎ−ジ
メチルホルムアミド 0.03 mlからなる溶液を加え、３０
℃でかきまぜながら 0.5〜1 時間反応させる。次いで、
反応混合物を遠心分離にかけ、過剰の試薬を沈殿物とし
て除去し、上清液をセファデックスＧ−２５のカラム
（1.0 x 45 cm）に通して、リン酸ナトリウム・バッフ
ァ−（pH 6.0、 0.1 mol/Ｌ)で、流速 30〜40 ml/h、各
フラクションの容量を 0.5〜1.0 mlとして溶出する。底
部にファインメッシュフィルタ−を有するセファデック
スＧ-５０（fine, Pharmacia）のカラム（1.0 × 6.4 c
m, 5 ml）を上記バッファ−で平衡させ、試験管中で１
００ｇで２分間遠心する。そのカラムに上記反応物
（０.５ml）を付し、同様に遠心する。得られたフ ラク
ションをマイクロコンセントレイタ−（CENTRICON-30、
Amicon Corp）中で 、４℃、２０００ｇで遠心すること
により濃縮する。

【００４５】このようにして調製したマレイミド・ペル
オキシダ−ゼ結合物 1.8 mg (45 nmol)をリン酸ナトリ
ウム・バッファ−（pH 6.0、 0.1 mol/Ｌ)に溶かし、こ
れに、Fab’約 2.0 mg (43 nmol) を 5 mmol/ＬのＥＤ
ＴＡを含有するリン酸ナトリウム・バッファ−（pH 6.
0、 0.1 mol/Ｌ）0.2〜0.4 mlに溶かした溶液を加え、４
℃ で２０時間または３０℃で１時間反応させる。反応
混合物中のマレイミド−ペルオキシダ−ゼ結合物および
Fab’の最終濃度を 50〜100 μmol/Ｌとする。この反
応混合物をウルトロゲル・AcA 44 のカラム（1.5 x 45 c
m）に通し、リン酸ナト リウム・バッファ−（pH 6.5、
0.1 mol/Ｌ）で溶出する。流速は 0.3〜0.5 ml/minとし
各フラクション約 1.0 mlとする。こうして目的の抗α-
hANP [17-28] Fab’-ペルオキシダ−ゼ標識体約２.５mg
を得た（ジャ−ナル・オブ・イムノアッセ イ［J.Immun
oassay］４、２０９〜３２７（１９８３）参照）。

【００４６】hANP[17-28]-非特異ウサギIgG結合物 ０.２mlのリン酸ナトリウム緩衝液（０.１mol/Ｌ、pH
7.0）にhANP[17-28]（０.５mg）を溶解したものを、N,
N’-ジメチルホルムアミドに溶かした１０５mmol/Ｌの
６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステ
ル（0.01ml）と３０℃で３０分間反応させる。反応物は
５mmol/ＬのEDTAを含む０.１mol/Ｌのリン酸ナトリウム
バッファ−（pH6.0）を用いてセファデックスＧ−１０
のカラム（1.0 × 45 cm）によりゲル濾過する。hANP[1
7-28]に導入されたマレイミド基の平 均値は０.６/分子
であった。

【００４７】０.１mol/Ｌリン酸ナトリウムバッファ−
（０.６ml、pH 7.5）に溶解した非特異ウサギＩｇＧ
（１０mg）を、N,N’-ジメチルホルムアミドに溶かした
２１０mmol/Ｌの無水Ｓ−アセチルメルカプトスクシン
酸（0.03ml）と３０℃で３０分間反応させる。この反応
混合物に０.１mol/Ｌトリス塩酸バッファ−（０.１ml、
pH7.0）、０.１mol/ＬＥＤＴＡ（０.０２ml）および１m
ol/Ｌ塩酸ヒドロキシルアミン（０.１ml、pH 7.0）を加
え、３０℃で５分間反応させる。反応物は５mmol/ＬのE
DTAを含む０.１mol/Ｌのリン酸ナトリウムバッファ−
（pH6.0）を用いてセファデックスＧ−２５のカラム
（1.0 × 45 cm）によりゲル濾過する。非特異ウサ ギ
ＩｇＧに導入されたチオ−ル基の平均値は１１/分子で
あった。

【００４８】上記マレイミド−hANP[17-28]の一部（２.
０ml）を５mmol/ＬのEDTAを含む０.１mol/Ｌのリン酸ナ
トリウムバッファ−（pH6.0、0.25ml）中のメルカプト
スクシニル化された非特異ウサギＩｇＧ（２.４mg）と
３０℃で３０分間反応させた。０.０１mlの０.１mol/Ｌ
N-エチルマレイミドを反応物に加え残存するマレイミ
ド基をブロックした。その混合物を０.１mol/Ｌのリン
酸ナトリウムバッファ−（pH7.0）を用いてセファデッ
クスＧ−２５のカラム（1.0 × 45 cm）によりゲル濾過
した。非特異ウサギＩｇＧに結合したhANP[17-28]分子
の平均数は、チオ −ル基の還元から計算して、８.７/
分子であった。

【００４９】抗hANP[17-28]Fab’-西洋ワサビペルオキ
シダ−ゼ標識物の精製 hANP[17-28]-非特異ウサギＩｇＧ結合物（２mg）、牛チ
ログロブリン（１０mg）、マウス血清タンパク（２０m
g）をそれぞれ臭化シアン活性化セファロ−ス４Ｂ（１
ｇ）に結合させた。１g/Ｌゼラチンと５０mg/Ｌチメロ
サ−ルを含む０.８mlの０.１mol/Ｌリン酸ナトリウムバ
ッファ−（pH 6.5）中の抗hANP[17-28]Fab’-西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼ標識物（７.８mg）を、牛チログロ
ブリン−セファロ−ス４Ｂのカラム（0.55 × 4.0 cm）
とマウス血清タンパク−セファロ−ス４Ｂのカラム（0.
55 × 4.0 cm）に、１ｇ/Ｌゼラチンと０.１mol/Ｌ塩化
ナトリウムを含む１０mmol/Ｌリン酸ナトリウムバッフ
ァ−（pH 7.5）を用いて、流速０.５ml/hで通し、次い
で、hANP[17-28]-非特異ウサギＩｇＧ−セファロ−ス４
Ｂのカラム（0.35 × 2.0 cm）から３.２mmol/Ｌ塩酸
（pH 2.5）で溶出し精製した。０.３５mgの精製標識物
を含む溶出液（１ml）は直ちに０.１mlの１mol/Ｌリン
酸ナトリウムバッファ−（pH 7.0）と０.０１mlの１０
０g/Ｌゼラチンに混合した。標識物の量はペルオキシダ
−ゼ活性から計算し、約０.３５mgであった。

【００５０】モノクロ−ナル抗-α-hANP-被覆ポリスチ
レンボ−ルの調製 ポリスチレンボ−ル（直径 3.2 mm、プリシジョン・プ
ラスチック・ボ−ル・カンパニ− (Precision Plastic
Ball Co.)(米国シカゴ)社製) ５０個を 0.1Ｍリン酸ナ
トリウム・バッファ− (pH7.0) １mlに入れ、これに１
００ γ/ml量のモノクロ−ナル抗-α-hANP-IgG₁ (KY-AN
P-I) を加え、室温で一夜放置する。このポリスチレン
ボ−ルをリン酸ナトリウム・バッファ− (pH7.0)で洗浄
し、0.1%量のアジ化ナトリウムを加え、冷蔵庫中で保存
する。

【００５１】血漿の採取 一夜絶食した健常男子被験者（２６−３２才）の肘前静
脈より、午前９時仰臥位にて採血する。また、同一被験
者にフロセミド（furosemide）４０mgを静注投与して、
１時間歩行した後に同様に採血する。血液は冷却したプ
ラスチック注射筒で採取し、アプロチニンおよびＥＤＴ
Ａを入れ、予め冷却した使い捨てシリコン被覆ガラスチ
ュ−ブに移し、遠心（500 x g）して血漿を分離する。
アプロチニンおよびＥＤＴＡの最終濃度は、それぞれ
1,000 カリクレイン不活性化単位（KIU）／mlおよび１m
g/mlである。

【００５２】サンドイッチ法によるα-hANP の酵素免疫
測定法 モノクロ−ナル抗α-hANP IgG₁ (KY-ANP-I) 被覆ポリス
チレンボ−ル１個をα-hANP標準溶液または血漿（総容
量 0.15 ml）に加え、４℃で２４時間静置する。α-hAN
P標準溶液は１０mMリン酸ナトリウム・バッファ−（pH
7.0; l mg/mlゼラチン、0.3Ｍ塩化ナトリウム、0.2mMシ
スチン、1 mMＥＤＴＡ、1 mg/mlナトリウムアジド、お
よび 1,000 KIU/mlアプロチニンを含む）で最終容量が
0.15 mlとなるように希釈する。また、血漿 (５０μl)
は 0.1 mlの１０mMリン酸ナトリウム・バッファ−（pH
7.0; l mg/mlゼラチン、0.4Ｍ塩化ナトリウム、0.3mMシ
スチン、1.5 mMＥＤＴＡ、1.5 mg/mlナトリウムアジ
ド、および 1,000 KIU/mlアプロチニンを含む）と混合
する。

【００５３】反応混合物から溶液部分を除き、ポリスチ
レンボ−ルは２mlの１０mMリン酸ナトリウム・バッファ
−（pH 7.0; 0.1Ｍ塩化ナトリウム含有）で２回洗浄
後、アフィニテイクロマトグラフィ−により精製したウ
サギ抗α-hANP[17−28] Fab’-ペルオキシダ−ゼ結合物
５０ngと１０mMリン酸ナトリウム・バッファ−（pH 8.
0; l mg/mlゼラチン、0.2mMシスチンおよび 1 mMＥＤＴ
Ａを含む）0.15 mlとを混合し、４℃で２４時間静置す
る。溶液部分を除去し、ポリスチレンボ−ルを上記 同
様２回洗浄した後、別の試験管に移す。結合しているペ
ルオキシダ−ゼの活性は、３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸を基質として、３０℃で６０分間静置
後、その螢光強度を測定した。螢光強度は２００ng/ml
キニ−ネ／５０mM硫酸を基準として測定する。

【００５４】特異性 この方法によるＥＩＡにおいては、α-hANP の標準希釈
曲線は、α-hANP[4-28]、 α-hANP[5-28]および α-hANP
[7-28]の曲線と一致するので、Ｎ末端側の構造変化は影
響のないことが分かる。逆に、Ｃ末端側アミノ酸を欠如
せしめると、反応性が著しく減少する。しかし、末端の
フラグメントα-hANP[17-28]およびα-hANP[1-6]とは反
応しない。β-hANP およびα-rANP との交差反応は分子
基準で、それぞれ 4.7％および 0.01％であった。これら
の結果は、使用した抗体の特異性と一致する。ポリスチ
レン・ボ−ルに固定化したマウス・モノクロ−ナル IgG
₁は、α-hANPの環状構造のＮ末端側の半分に特異性を示
し、ペルオキシダ−ゼに結合したウサギ Fab’は、α-h
ANP[17-28]に特異性を示す。

【００５５】血漿の影響 血漿およびα-hANPの非存在下に測定した結合ペルオキ
シダ−ゼ活性（非特異的結合）は、１ pmolのモノクロ
−ナル抗-α-hANP IgG₁(KY-ANP-I) と前処理した血漿の
存在下で測定したペルオキシダ−ゼ活性と一致する。4.
3〜332 pg/mlのＡＮＰを含有する血漿に加えたα-hANP
（10〜200 pg/ml）の回収率は８１〜９４％である。血
漿の希釈曲線はチュ−ブ当りの血漿量が１〜５０μlの
範囲にある限り、血漿の非存在下で得たα-hANPの標準
曲線と平行関係にある。従って、使用した血漿量が５０
μl 以下の場合には血漿による障害は殆ど認めない。そ
の結果を図２に示す。

【００５６】ＥＩＡの感度 α-hANPの測定限界は３０ fg（10 amol）/チュ−ブであ
る。血漿５０μlを用いたときの血漿α-hANPの感度は
０.６ pg/ml（０.２ fmol/ml）である。ＥＩＡにおける
この感度は、既存のＲＩＡに比較して、１桁ないし２桁
高い値を示す。

【００５７】ＥＩＡの再現性 本発明品の再現性は、血漿中のα−ｈＡＮＰが５〜１５
８ pg/mlの範囲内で５種類の異なったレベルで求めた。
実験内および実験間での再現性は、それぞれ変動係数
３.２〜９.４％（ｎ＝２０）および５.４〜１２.０％で
あった。

【００５８】定常状態および循環血液量減少状態でのＥ
ＩＡによる健常人での血漿α-hANPレベルおよびそのＲ
ＩＡによる場合との比較 健常人における定常状態α-hANPレベルはＥＩＡでは２
４.５±５.９pg/mlであった。フロセミド（furosemid
e）（４０mg）を静注し、１時間歩行後の循環血液量減
少状態での血漿α-hANPレベルは１５.３±３.７ pg/ml
に低下した。ＲＩＡによって同時に測定した血漿α-hAN
Pレベルは、それぞれ２８.２±５.７ pg/mlおよび１８.
３±３.２ pg/mlであった。ＥＩＡ (y)とＲＩＡ (x)に
より測定したα-hANPレベル間には、次のような相関関
係にある。

【００５９】y ＝ ０.７８x ＋ １.３、 r ＝ ０.９２、n ＝ ２４

【００６０】上記のデ−タから明らかなように、本発明
方法におけるＥＩＡは非常に感度が高く、循環血液量減
少状態においても抽出操作なしに、血漿α-hANP濃度を
測定することができる。

【００６１】心疾患患者の血漿中α−ｈＡＮＰ値 本発明α−ｈＡＮＰ測定試薬により測定した心疾患患者
の血漿中α−ｈＡＮＰ値は、下記表１のとおりであっ
た。

【００６２】

【表１】

【００６３】ＥＩＡ一段階法での適用 本発明におけるＥＩＡは一段階法でも適用可能である。
図３は一段階ＥＩＡによるα−ｈＡＮＰの標準曲線と血
漿の希釈曲線を示す。なお、この試験は、ｈＡＮＰ、酵
素標識抗体および抗体被覆ポリスチレンボ−ルを同時に
混合し、４℃で２４時間反応せしめた。ペルオキシダ−
ゼ（ＰＯＤ）活性の測定は３０℃で３０分行なった。他
の条件は二段階法と全く同様である。

【００６４】

【発明の効果】従来のＲＩＡによるα−ｈＡＮＰの測定
においては、検体中からα−ｈＡＮＰを抽出する必要が
あったが、本発明のモノクロ−ナル抗体を用いたα−ｈ
ＡＮＰの免疫学的測定試薬を用いれば、α−ｈＡＮＰを
抽出することなく直接検体中のα−ｈＡＮＰを測定でき
る。またこの測定には、固相化抗体とα−ｈＡＮＰを反
応させた後に標識抗体を加えて反応させる二段階法はも
ちろんのこと、固相化抗体にα−ｈＡＮＰと標識抗体を
同時に加えて反応させる一段階法も適用することがで
き、簡便な測定が可能である。このα−ｈＡＮＰの測定
法の確立により、心疾患、腎疾患、高血圧症（本態性、
二次性）、浮腫性疾患（肝硬変、ネフロ−ゼ、突発性浮
腫等）、脱水症等体液バランスの異常を伴う疾患の診断
および治療経過の簡便かつ正確な観察が可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】α−ｈＡＮＰ、α−ｒＡＮＰ、およびα−ｈＡ
ＮＰ断片と本発明のモノクロ−ナル抗体との交差反応性
を示す。

【図２】ＥＩＡによるα−ｈＡＮＰの標準曲線（○）と
血漿の希釈曲線（●、▲、■）を示す。

【図３】一段階ＥＩＡによるα−ｈＡＮＰの標準曲線
（○）と血漿の希釈曲線（●、▲、■）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 井上 健 兵庫県神戸市西区伊川谷町有瀬131−２− 907

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ミエロ−マ細胞と抗α−ヒト心房性ナトリ
   ウム利尿ポリペプチド抗体産生細胞を融合させてハイブ
   リド−マを作製し、該ハイブリド−マからα−ヒト心房
   性ナトリウム利尿ポリペプチドのリング構造のＮ端側の
   約半分を認識するモノクロ−ナル抗体を産生するハイブ
   リド−マを選択することにより得られることを特徴とす
   る、該モノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ。
2. 【請求項２】該モノクロ−ナル抗体が、α−ヒト心房性
   ナトリウム利尿ポリペプチド[7-16]断片に含まれ、か
   つ、Ｍｅｔ[12]を含む部分を認識することを特徴とする
   請求項１に記載のハイブリド−マ。
3. 【請求項３】該ミエロ−マ細胞が、ヒポキサンチン−グ
   アニン−ホスホリボシルトランスフェラ−ゼ欠損または
   チミジンキナ−ゼ欠損を持つものであることを特徴とす
   る請求項１に記載のハイブリド−マ。
4. 【請求項４】該抗体産生細胞が、ヒト心房性ナトリウム
   利尿ポリペプチドで免疫されたマウスの脾臓由来である
   ことを特徴とする請求項１に記載のハイブリド−マ。
5. 【請求項５】ハイブリド−マＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ（ＥＣＡ
   ＣＣ８７０８２００１）である請求項１に記載のハイブ
   リド−マ。