JPH0570436B2

JPH0570436B2 -

Info

Publication number: JPH0570436B2
Application number: JP62218662A
Authority: JP
Inventors: Hiroo Imura; Ichikazu Nakao; Eiji Ishikawa; Masao Kono; Takeshi Inoe
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1987-09-01
Filing date: 1987-09-01
Publication date: 1993-10-05
Also published as: JPH0678763A; JPH0753105B2; JPS6461500A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はα−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペ
プチド（α−hANP）のリング構造のＮ端側の約
半分を認識するモノクローナル抗体、さらに詳し
くは、α−hANPのMet［12］を含むリング構造
のＮ端側の約半分の配列を認識するモノクローナ
ル抗体に関する。さらに本発明は、α−hANPの
酵素免疫測定法（以下、EIAと略記する。）に使
用する、固相に固定化したα−hANPのＮ端側ま
たはＣ端側を認識する抗体および該固定化抗体と
は互いに認識部位の異なる酵素標識抗体からなる
α−hANPの免疫学的測定試薬に関する。従来の技術心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（atrial
natriuretic Polypeptide、ANP）は、心房筋細
胞により産性され顆粒中に含まれる、強い利尿作
用およびナトリウム排泄作用を有するポリペプチ
ドである。このようなポリペプチドはヒトのみな
らずラツトにおいて見出されており、それぞれ
hANP、rANPと呼ばれる。hANPおよびrANP
はさらにα，β，γの３つのタイプに分類され
る。α−hANPは28アミノ酸残基からなり、Ｎ端
から７番目のCys［７］と23番目のCys［23］がジ
スルフイド結合しており、その間の配列がリング
状構造をなしている（Biochem.Biophys.Res.
Commun.（以下BBRCと略記する）118、131−
139、1984）。α−rANPは、α−hANPではＮ端
から12番目の残がMetであるのに対し、α−
rANPではIleである点でのみ異なつている
（BBRC 117、839−865、1983）。β−hANPは、
α−hANPの逆平行二量体である（特開昭60−
184098）。γ−hANPは126アミノ酸残基からな
り、そのＣ端の99〜126アミノ酸がα−hANPに
相当する。ANPの測定法としては既に抗血清を
用いたラジオイムアツセイが確立されている
（Science 228、323−325、1985；Nature 314、
264−266、1985；BBRC 124、815−821、
1984；BBRC 124、663−668、1984；BBRC
125、315−323、1984）。このうち、抗血清CR−
３はANPのＣ末端断片［17−28］を認識するこ
とが知られている。また、α−hANPを認識するモノクローナル抗
体としては11A−A11が知られている。該抗体は
ラツトのANPの一種であるアトリオペプチン
を抗原として得られたもので、そのエピトープは
ジスルフイド結合を含むCys［７］−Ser［25］の間
に存在し、即ちANPのリング構造の一部であろ
うと考えられている。但し、該抗体の親和性は
Met［12、ヒト］とIle［12、ラツト］間で差がな
く、rANPとhANPを認識する（Life Science，
Vol.38，1991−1997，1986）。発明が解決しようとする問題点従来のANPのイムノアツセイにおいては、試
料からANPを抽出する必要があり、抽出の必要
がない高感度のアツセイを可能にする親和性の高
いモノクローナル抗体が待望されていた。ANP
を認識するモノクローナル抗体としては上記の
11A−A11が得られていたが、該抗体はhANPの
みならず、rANPも認識してしまう。また、上記
の様にANP抗血清CR−３はANPのＣ末端側を
認識するので、ANPのＮ端側断辺を特異的に認
識する抗体が得られれば、そのような２種の抗体
によるサンドイツチイムノアツセイが可能にな
る。従つて、hANPのＮ端側断片を特異的に認識
する親和性の高いモノクローナル抗体が待望され
ていた。 hANPの免疫学的測定法としては、従来、ラジ
オアイソトープ利用するラジオ・イムノアツセイ
（以下RIAと略記する）と酵素を利用するエンザ
イム・イムノアツセイ（EIA）とが知られている
が、RIAの場合には施設・設備の問題からなるべ
くその利用を避ける傾向にあり、利用場所を問わ
ない高感度のEIAの開発がむしろ望まれている。
EIAにおける酵素標識法としては、その架橋剤と
してグルタルアルデヒドを利用する方法が従来一
般的であつたが、最近では重合の問題や収率の低
さなどの点で問題があり、あまり用いられなくな
つた。グルタアルデヒドに替わる架橋剤として
は、最近、Ｎ，N′−Ｏ−フエニレンジマレイミ
ド、Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルなどが知られている［J.Immuno−assay４，
209〜327（1983）］が、hANPに応用した報告は無
く、未だに、高感度のhANPの免疫学的測定法が
開発されたとは言えない。問題点を解決するための手段本発明者らはhANPのＮ端側断片を特異的に認
識する親和性の高いモノクローナル抗体を創製す
べく鋭意研究をを行なつた結果、α−hANPのリ
ング構造のＮ端側断片を認識するモノクローナル
抗体を得、それを利用するα−hANPの高感度測
定法を完成するに至つた。 (1) モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調
製 α−hANPは28アミノ酸残基からなるポリペプ
チドであり、比較的低分子であるため抗体の産生
を誘起する能力（免疫原性）が低い。そのため、
抗原として用いるためには牛血清アルブミン、牛
チログロブリンなどと結合させる。得られた複合
体は、フロイントの完全アジユバント等の適当な
アジユバントに乳濁し、マウスの免疫に用いる。免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹
腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種すること
により行なう。最終免疫後３日ないし５日後に脾
臓を取り出し、抗体産生細胞として使用する。こ
の時同時に抗体産生細胞と融合させてハイブリド
ーマを得るための親細胞として、ヒポキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフエラーゼ
欠損（HGPRT^-）あるいはチミジンキナーゼ欠
損（TK^-）の様な適切なマーカーを持つミエロ
ーマ細胞株を用意し、これと抗体産生細胞と融合
させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマ作製における培地として、イー
グルMEM、ダルベツコ変法培地、RPMI−1640
などの通常良く使用されているものに、適宜約15
％の牛胎児血清（FCS、fetal calf serum）を加
えて用いる。まず、親細胞であるミエローマと脾細胞を約
１：6.5の割合で用意する。融合剤としてはよく
用いられているポリエチレングリコール（PEG）
の50％を用いるのが融合率が高いとされている。
融合株はHAT選択法により選択する。生じるハ
イブリドーマのスクリーニングは培養上清を用
い、膜螢光抗体法、ELISA法（Enzyme Linked
Immunosorbent Assay）、免疫組織染色法など
既知の方法により行ない、目的の免疫グロブリン
を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択
する。ハイブリドーマの単一性を吟味するため、
96穴のマイクロウエルにフイーダーレイヤー
（feeder layer）として正常な脾細胞をおよび
10⁶ce11／well蒔いた上にハイブリドーマを１穴
に１個より多くなならないように蒔き、生育して
くるクローンについて再びスクリーニングを行な
う。このサブクローニングを繰り返すことによ
り、単一性のハイブリドーマを得る。 (2) モノクローナル抗体の産生次に、本発明のモノクローナル抗体を製造する
ために、上記で得られたハイブリドーマを培養容
器中（in vitro）または動物体内（in vivo）で
培養する。vitro系で培養する場合、培地は先に
述べた通常培地にFCSを添加したものでよく、こ
の培地で３から５日培養の後、培養上清からモノ
クローナル抗体を得る。in vivo系の培養では、
ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７な
いし14日後に腹水を採取し、これよりモノクロー
ナル抗体を得る。in vivo系での培養の場合、in
vitro系での培養に比べて遥かに大量の抗体を効
率的に取得しうるので好ましい。こうして得られた培養上清または腹水からのモ
ノクローナル抗体の精製は、硫安分画、DEAEセ
フアロースカラム等の既知の方法を適宜組み合わ
せて、例えば後記実施例に記載したようにして行
なうことが出来る。本発明で得られたモノクローナル抗体KY−
ANP−Ｉは、後記参考例に示される通り、α−
hANPを特異的に認識し、rANPに対しては殆ど
親和性を示さない。そのエピトープはα−hANP
のリング構造のＮ末端側半分、詳細にはCys［７］
からGly［16］に含まれる部分を認識しているも
のと推定され、またhANPとは反応しないことか
ら、Met［12］を含む部分であると考えられる。
該エピトープはα−hANPのみならずβ−
hANP、γ−hANPにも共通の部分であり、該抗
体はβ−hANP、γ−hANPに対しても反応性を
有する。また、本抗体はα−hANPに対して高い親和性
（Ka＝4.5×10⁹M^-1）を示した。第１図に示すα
−hANPの標準曲線から、90％および50％阻害濃
度（IC₉₀、IC₅₀）はそれぞれ10pg／チユーブ、
100pg／チユーブであつた。本発明のモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉ
を産生するハイブリドーマKY−ANY−Ｉは
1987年８月20日から英国Porton Down，
Salisbury.SP4 OJG.のPHLS Centre for
Applied Microbiology＆Research、European
Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）
に受託番号87082001としてブタペスト条約に基づ
き寄託されている。 (3) 抗体と担体との結合抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測
定法に使用される市販の抗原抗体反応用担体、例
えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビー
ズ）あるいは球状物（ボール）、チユーブ、プレ
ートなどを用いることができる。これらの担体
に、α−hANPのＮ端側またはＣ端側を認識する
抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バツフア
ー中、PH６〜10、好ましくは中性付近で室温下に
一夜放置することにより行なう。抗体を吸着した
担体は、アジ化ナトリウムなどの殺菌剤の存在
下、冷所に保存する。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
について、同様の処理で担体に結合せしめること
ができる。 (4) ウサギ抗α−hANP［17−28］血清カルボジイミド法により調製したα−hANP
［17−28］−ウシ・チログロブリン複合体をウサギ
に投与して数回免疫し、最終免疫から10〜14日後
に採血してウサギ抗α−hANP［17−28］血清を
調製する。 (5) 酵素標識抗体の調製ウサギIgG、Ｆ（ab′）₂およびFab′ 上記で調製した抗血清を硫酸ナトリウムで分画
し、次いで、DEAE−セルロースのカラムを通す
ことによりIgGを調製する。得られたIgGをペプ
シンで消化してＦ（ab′）₂断片とし、更にこれを２
−メルカプトエチルアミンで還元すれば、目的の
抗α−hANP［17−28］Fab′が得られる。IgGか
らFab′の調製については、ジヤーナル・オブ・
イムノアツセイ［J.Immunoassay］、４、209〜
327（1983）に詳細な説明があり、本発明において
も、同様の手法を利用することができる。抗体の酵素標識抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスフア
ターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが利用可能
であるが、本発明においては、特に西洋わさびペ
ルオキシダーゼが好ましく用いられる。また、架
橋剤としては、Ｎ，N′−ｏ−フエニレンジマレ
イミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン酸、・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−
マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエス
テル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン
酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，4′−ジチ
オジピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能で
ある。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応
は、それぞれの架情剤の性質に応じて、既知の方
法に従つて行なえばよい。また、抗体としては、
場合によつては、そのフラグメント、例えば
Fab′、Fab、Ｆ（ab′）₂を用いる。本発明において
は、架橋剤として４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル
または６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシン
イミドエステルを用いるのが好ましい。また、ポ
リクローナル、モノクローナル抗体にかかわらず
同様の処理により酵素標識体を得ることができ
る。従つて、上記２架橋剤を用いて得られる酵素
標識抗体は、一般式（）；【化】［但し、式中Ａはα−hANPのＮ端側またはＣ
端側を認識する抗体またはそのフラグメントを、
Ｂは標識酵素を、Ｒは４−メチレンシクロヘキシ
ルまたはペンタメチレンをそれぞれ表わす。］で
表わすことができる。このようにして得られる酵素標識抗体は、好ま
しくは、アフイニテイ・クロマトグラフイーによ
る精製すれば、更に感度の高い免疫測定系が可能
となる。精製した酵素標識抗体は、安定剤として
チメロサールまたはグリセリンを加えて、あるい
は凍結乾燥して冷暗所に保存する。上記で調整された免疫学的測定試薬を用いてα
−hANPを測定する際の抗体の組合わせとして
は、α−hANPのＮ端側を認識する抗体を固定化
した場合にはＣ端側を認識する抗体を酵素標識抗
体とし、Ｃ端側を認識する抗体を固定化した場合
にはＮ端側を認識する抗体を酵素標識抗体とすれ
ばよい。一般には、固定化には比較的大量の抗体
が必要であるため安定的に大量の抗体が得られる
モノクローナル抗体（例えば、本発明のNK−
ANP−Ｉ）が固定化に適しているが、抗血清か
ら得られるポリクローナル抗体も不都合なく使用
できる。酵素標識する抗体は、モノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、固定
化した抗体が認識するのとは異なる部位を認識す
るものであればよい。例えば、固定化抗体として
本発明のKY−ANP−Ｉを用いた場合には酵素
標識抗体として上述の抗血清CR−３や実施例中
の抗血清F36が適用でき、またこの逆の組合わせ
でもよい。当然、α−hANPのＣ端側を認識する
モノクローナル抗体やＮ端側を認識する抗血清も
本発明に適用できる。実施例ハイブリドーマの調製合成α−hANP（1.5mg）と牛チログロブリン
（5.4mg）を２mlの蒸留水に溶解する。この溶液
に、蒸留水１mlに溶解した１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド30mg
を室温で10分かけて滴下し、室温で24時間撹拌す
る。この溶液を、蒸留水３に対して６回、３日
間透析する。この透析物を５つに分注して−20℃
で保存した（BBRC124，815−821，1984参照）。上記の分注保存した溶液（300μgのα−hANP
を含む）に蒸留水を加え1.2mlとし、これを1.2ml
のフロイントの完全アジユバントに懸濁した。そ
のうち約２mlを10匹のBALB／ｃ雌マウスの腹
腔および皮下に注射し（１匹当り200μl）、さらに
３週間後に同じ方法で追加免疫した。追加免疫の
５週間後、血液中の抗体を測定し、最も強く抗体
反応を示した２匹のマウスの尾静脈に50μgのα
−hANPを含む上記溶液をさらに追加免疫した。
その４日後、２匹のマウスから細胞融合ために脾
臓細胞を採集した。採集した脾臓細胞（1.3×10⁸個）とミエローマ
細胞X63−Ag8.653（２×10⁷個）をダルベツコ培
地中（DMEM）で混合し、1500rpm、４℃で５
分間遠沈した。得れたペレツトを37℃に加温し解
した後、50％PEG4000（PEG1ｇ／DMEM1ml）
１mlを37℃で１分間かけて滴下した。37℃で２分
間放置した後、37℃のDMEM10mlを５分かけて
加え希釈し、４℃で15％FCS添加DMEMで遠心
洗浄する。得られた細胞は96穴プレートに蒔き、HAT培
地中で２週間、さらにHT培地中で１週間培養し
た。全768ウエル中約30％（212／768）でハイブ
リドーマが増殖し、そのうち４％（８／212）が
抗α−hANP抗体を産生していた。最も高い抗体価を示したエルの細胞は限界希釈
法によりクローン化した。即ち、フイーダー細胞
としてBALB／ｃマウス胸腺細胞を10⁶個／ウエ
ル、ハイブリドーマを１個／ウエルとなるように
ウエルに加え培養し、この操作を２回行なつた。このクローニングによつて、最も安定に大量の
抗体を産生するクローンを選択し、KY−ANP
−Ｉと命名した。上記の、免疫マウスの抗血清およびハイブリド
ーマ培養上清中の抗体価は下記の様にして測定し
た。免疫マウスの抗血清またはハイブリドーマの培
養上清をサンプルとし、該サンプル希釈液100μl、
アツセイバツフアー（RIAバツフアー）300μl、
¹²⁵I−α−hANP（10000cpm）100μlの混合液40℃
で24時間反応させる。これをデキストラン−コー
テツド−チヤーコール１mlと混合し４℃で５分間
反応させる。その後、４℃で30分間3000rpmにて
遠心し、その上清の放射活性をγ−カウンターで
測定することにより、サンプル希釈液中の抗体価
を求めた。上記¹²⁵I−α−hANPはクロラミンＴ法によつ
て調製した。即ち、α−hANP（1μg）とNa¹²⁵I
（1mCi）を混合し、10μlのクロラミンＴ（5.25
mg／ml）を加え、10秒後に20μlのピロ亜硫酸ナト
リウム（4.5mg／ml）を加える。さらに、２％ゼ
ラチン１mlを加え、Sep−Pak C18（Waters社
製）で精製する。モノクローナル抗体の調製 BALB／ｃマウスを、0.5mlのプリスタンを腹
腔に２回１〜２週間間隔で投与することにより前
処理した。そのマウスの腹腔に、200μlのDMEM
に懸濁した５×10⁶個のハイブリドーマKY−
ANP−Ｉを注射した。得られた腹水をプロテイ
ンＡ−セフアロースCL−4Bカラムで精製し、モ
ノクローナル抗体KY−ANP−Ｉを得た。 KY−ANP−Ｉの諸性状本モノクローナル抗体のアイソタイプの決定は
オクタロニー法に従つて行ない、IgG₁サブクラ
スに属するものと決定された。親和性は、ラジオ
バインデイングアツセイによりスキヤツチヤード
プロツトを作成することにより求め、その結果
Ka＝4.5×10⁹M^-1であつた。エピトープは、種々のANP関連ペプチドに対
する交差反応性をRIAで調べることにより決定し
た。その結果を第１図に示す。α−ANP［17−
28］とα−ANP［１−６］には殆ど反応しないこ
とからエピトープはα−ANP［７−16］に含まれ
ると推定される。さらに、α−hANP［８−22］、
α−rANPとも反応しないことから、エピトープ
はリング構造を成していることが必要で、かつ、
Metを含んでいるものと推定される。即ち、本発
明モノクローナル抗体が認識するエピトープは、
α−hANPのリング構造のＮ端側の約半分である
と結論された。また、上記抗体価測定法に従いKY−ANP−
Ｉとβ−hANPおよびｒ−hANPとの反応性を調
べた結果、KY−ANP−Ｉはα−hANPのみなら
ずγ−hANPも認識し、さらに、β−hANPも交
差反応性80％で反応した。抗α−hANP［17−28］ウシ・チログロブリン
血清の作製 α−hANP［17−28］を公知のカルボジイミド
法（BBRC 117，695，1984）により、ウシ・チ
ログロブリンと結合させる。α−hANP［17−28］
3.1mgを含む水溶液 0.5mlにウシ・チログロブリン19mgを含む水溶
液0.7mlを加え、これに１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩40
mgを含む水溶液１mlを加えて、氷冷下で２時間撹
拌する。この反応液を蒸留水２に対して４℃で
３回透析したのち、凍結乾燥して複合体21mgを得
る。ウシ・チログロブリンに対するα−hANP
［17−28］の結合モル比は、アミノ酸分析法によ
り求めた結果、30であつた。免疫ならびに採血上記α−hANP［17−28］−ウシ・チログロブリ
ン複合体0.25mgを生理食塩水0.25mlに溶かし、こ
れを等量のフロインド（Freund）完全アジユバ
ンドに懸濁して家兎の背部20ケ所以上に皮下注射
する。これを３週間毎に６回繰り返し、最終投与
後10日目に頚動脈から全採血して抗血清F36を得
る。ウサギIgGの調製抗α−hANP血清（F36）１mlに硫酸ナトリウ
ム0.18ｇを撹拌下にゆつくり加え、添加物が完全
に溶解してから、22〜25℃で撹拌を続ける。次い
で混合物を温度22〜25℃、回転数10000rpmの条
件で10分間遠心分離し、沈澱物１mlのリン酸ナト
リウム・バツフアー（PH6.3；17.5mmol／）に
溶かし、同じバツフアー中で透析する。上澄液
を、予め同じバツフアー（PH6.3；17.5mmol／
）で平衡化したDEAEセルロース・カラムに通
す。上澄液中の10mgの蛋白を通過せしめるに要す
るDEAEセルロースの湿潤容量は１mlである。
IgGの収量は、280nmでの吸光度から、280nmで
の吸光度を1.5ｇ^-1，cm¹とし、IgGの分子量を
150000として計算し、７mgであつた（ジヤーナ
ル・オブ・イムノアツセイ［J.Immunoassay］、
４、209〜327（1983）参照）。Ｆ（ab′）₂の調製ウサギIgG10mgを酢酸ナトリウム・バツフアー
（PH4.5，0.1mol／）１mlに対して５℃で透析す
る。透析したIgG溶液に、0.05ml（容量１／20）
の塩化ナトリウム水溶液（2mol／）を加える。
この溶液に、ブタ胃粘膜由来のペプシン（0.2
mg／10mg IgG）を加え、溶解する。混合物を37
℃で15〜24時間反応させる。次いで、水酸化ナト
リウム水溶液（1mol／）でPH８に調整し、セ
フアデツクスＧ−150のカラム（1.0〜1.5mlに対
して1.5x45cm、2.0〜2.5mlに対して2.0x45cm）に
かけ、ホウ酸ナトリウム・バツフアー（PH8.0、
0.1mol／）で溶出する。Ｆ（ab′）₂の収量は、
280nmでの吸光度から、280nmでの吸光度を1.48
ｇ^-1，cm^-1、Ｆ（ab′）₂の分子量を92000として
計算し、６mgであつた（ジヤーナル・オブ・イム
ノアツセイ［J.Immunoassay］、４、209〜327
（1983）参照）。 Fab′の調製Ｆ（ab′）₂3mgをリン酸ナトリウム・バツフアー
（PH6.0，0.1mol／）0.45mlに溶解する。これに
用時調製した5mmol／のEDTAを含む２−メ
ルカプトエチルアミン／リン酸ナトリウム・バツ
フアー溶液（PH6.0，0.1mol／）を加え、37℃
で1.5時間反応させる。次いで、反応混合物をセ
フアデツクスＧ−25のカラム（1x30cm）にかけ、
リン酸ナトリウム・バツフアー（PH6.0，
0.1mol／；5mmol／のEDTA含有）で溶出
する。Fab′の収量は、280nmでの吸光度から、
280nmでの吸光度を1.48ｇ^-1， cm^-1、Ｆ
（ab′）₂の分子量を46000として計算し、2.5mgであ
つた（ジヤーナル・オブ・イムノアツセイ［J.
Immunoassay］、４、209〜327（1983）参照）。抗α−hANP［17−28］Fab′−ペルオキシダー
ゼ標識体の調製西洋わさび・ペルオキシダーゼ２mg（50nmol）
をリン酸ナトリウム・バツフアー（PH7.0、
0.1mol／）0.3mlに溶かし、これに６−マレイ
ミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル
0.65mg（2100nmol）およびＮ，Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド0.03mlからなる溶液を加え、30℃でか
きまぜながら0.5〜１時間反応させる。次いで、
反応混合物を遠心分離にかけ、過剰の試薬を沈澱
物として除去し、上清液をセフアデツクスＧ−25
のカラム（1.0x45cm）に通して、リン酸ナトリウ
ム・バツフアー（PH6.0、0.1mol／）で、流速
30〜40ml／ｈ、各フラクシヨンの容量を0.5〜1.0
mlとして溶出する。底部にフアインメツシユフイ
ルターを有するセフアデツクスＧ−50（fine，
Pharmacia）のカラム（1.0×6.4cm，５ml）を上
記バツフアーで平衡させ、試験管中で100ｇで２
分間遠心する。そのカラムに上記反応物（0.5ml）
を付し、同様に遠心する。得られたフラクシヨン
をマイクロコンセントレイター（CENTRICON
−30、Amicon Corp）中で、４℃、2000ｇで遠
心することにより濃縮する。このようにして調製したマレイミド・ペルオキ
シダーゼ結合物1.8mg（45nmol）をリン酸ナトリ
ウム・バツフアー（PH6.0、0.1mol／）に溶か
し、これに、Fab′約2.0mg（43nmol）を5mmol／
のEDTAを含有するリン酸ナトリウム・バツ
フアー（PH6.0、0.1mol／）0.2〜0.4mlに溶かし
た溶液を加え、４℃で20時間または30℃で１時間
反応させる。反応混合物中のマレイミド−ペルオ
キシダーゼ結合物およびFab′の最終濃度を50〜
100μmol／とする。この反応混合物をウルトロ
ゲル・AcA44のカラム（1.5x45cm）に通し、リ
ン酸ナトリウム・バツフアー（PH6.5、0.1mol／
）で溶出する。流速は0.3〜0.5ml／minとし各
フラクシヨン約1.0mlとする。こうして目的の抗
α−hANP［17−28］Fab′−ペルオキシダーゼ標
識体約2.5mgを得た（ジヤーナル・オブ・イムノ
アツセイ［J.Immunoassay］、４、209〜327
（1983）参照）。 hANP［17−28］−非特異ウサギIgG結合物 0.2mlのリン酸ナトリウム緩衝液（0.1mol／、
PH7.0）にhANP［17−28］（0.5mg）を溶解したも
のを、Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶かし
た105mmol／の６−マレイミドヘキサン酸・
Ｎ−スクシンイミドエステル（0.01ml）と30℃で
30分間反応させる。反応物は5mmol／の
EDTAを含む0.1mol／のリン酸ナトリウム／
バツフアー（PH6.0）を用いてセフアデツクスＧ
−10のカラム（1.0×45cm）によりゲル濾過する。
hANP［17−28］に導入されたマレイミド基の平
均値は0.6／分子であつた。 0.1mol／リン酸ナトリウムバツフアー
（0.60855ml、PH7.5）に溶解した非特異ウサギIgG
（10mg）を、Ｎ，N′−ジメチルホルムアミドに溶
かした210nmol／の無水Ｓ−アセチルメルカプ
トスクシン酸（0.03ml）と30℃で30分間反応させ
る。この反応混合物に0.1mol／トリス塩酸バ
ツフアー（0.1ml、PH7.0）、0.1mol／EDTA
（0.02ml）および1mol／塩酸ヒドロキシルアミ
ン（0.1ml、PH7.0）を加え、30℃で５分間反応さ
せる。反応物は5mol／のEDTAを含む
0.1mol／のリン酸ナトリウムバツフアー（PH
6.0）を用いてセフアデツクスＧ−25のカラム
（1.0×45cm）によよりゲ濾過する。非特異ウサギ
IgGに導入されたチオール基の平均値は11／分子
であつた。上記マレイミド−hANP［17−28］の一部（2.0
ml）を5mmol／のEDTAを含む0.1mol／の
リン酸ナトリウムバツフアー（PH6.0、0.25ml）
中のメルカプトスクシニル化された非特異ウサギ
IgG（2.4mg）と30℃で30分間反応させた。0.01ml
の0.1mol／Ｎ−エチルマレイミドを反応物
に加え残存するマレイミド基をブロツクした。そ
の混合物を0.1mol／のリン酸ナトリウムバツ
フアー（PH7.0）を用いてセフアデツクスＧ−25
のカラム（1.0×45cm）によりゲル濾過した。非
特異ウサギIgGに結合したhANP［17−28］分子
の平均数は、チオール基の還元から計算して、
8.7／分子であつた。抗hANP［17−28］Fab′−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識物の精製 hANP［17−28］−非特異ウサギIgG結合物（２
mg）、牛チログロブリン（10mg）、マウス血清タン
パク（20mg）をそれぞれ臭化シアン活性化セフア
ロース4B（１ｇ）に結合させた。１ｇ／ゼラチ
ンと50mg／チメロサールを含む0.8mlの
0.1mol／リン酸ナトリウムバツフアー（PH6.5）
中の抗hANP［17−28］Fab′−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識物（7.8mg）を、牛チログロブリ
ン−セフアロース4Bのカラム（0.55×4.0cm）と
マウス血清タンク−セフアロース4Bのカラム
（0.55×4.0cm）に、１ｇ／ゼラチンと0.1mol／
塩化ナトリウムを含む10mmol／リン酸ナト
リウムバツフアー（PH7.5）を用いて、流速0.5
ml／ｈで通し、次いで、hANP［17−28］−非特異
ウサギIgG−セフアロース4Bのカラム（0.35×2.0
cm）から3.2nmol／塩酸（PH2.5）で溶出し精製
した。0.35mgの精製標識物を含む溶出液（１ml）
は直ちに0.1mlの1mol／リン酸ナトリウムバツ
フアー（PH7.0）と0.01mlの100ｇ／ゼラチンに
混合した。標識物の量はペルオキシダーゼ活性か
ら計算し、約0.35mgであつた。モノクローナル抗−α−hANP−被覆ポリスチ
レンボールの調製ポリスチレンボール（直径3.2mm、プリシジヨ
ン・プラスチツク・ボール・カンパニー
（Precision Plastic Ball Co.）（米国シカゴ）社
製）50個を0.1Mリン酸ナトリウム・バツフアー
（PH7.0）１mlに入れ、これに100γ／ml量のモノク
ローナル抗−α−hANP−IgG₁（KY−ANP−
Ｉ）を加え、室温で一夜放置する。このポリスチ
レンボールをリン酸ナトリウム・バツフアー（PH
7.0）で洗浄し、0.1％量のアジ化ナトリウムを加
え、冷蔵庫中で保存する。血漿の採取一夜絶食した健常男子被験者（26−32才）の肘
前静脈より、午前９時仰臥位にて採血する。ま
た、同一被験者にフロセミド（furosemide）40
mgを静注投与して、１時間歩行した後に同様に採
血する。血液は冷却したプラスチツク注射筒で採
取し、アプロチニンおよびEDTAを入れ、予め
冷却した使い捨てシリコン被覆ガラスチユーブに
移し、遠心（500xg）して血漿を分離する。アプ
ロチニンおよびEDTAの最終濃度は、それぞれ
1000カリクレイン不活性化単位（KIU）／mlお
よび１mg／mlである。サンドイツチ法によるα−hANPの酵素免疫測定
法モノクローナル抗α−hANP IgG₁（KY−
ANP−Ｉ）被覆ポリスチレンボール１個をα−
hANP標準溶液または血漿（総容量0.15ml）に加
え、４℃で24時間静置する。α−hANP標準溶液
は10mMリン酸ナトリウム・バツフアー（PH
7.0；１mg／mlゼラチン、0.3M塩化ナトリウム、
0.2mMシスチン、1mM EDTA、１mg／mlナト
リウムアジド、および1000KIU／mlアプロチニ
ンを含む）で最終容量が0.15mlとなるように希釈
する。また、血漿（50μl）は0.1mlの10mMリン
酸ナトリウム・バツフアー（PH7.0；１mg／mlゼ
ラチン、0.4M塩化ナトリウム、0.3mMシスチン、
1.5mM EDTA、1.5mg／mlナトリウムアジド、お
よび1000KIU／mlアプロチニンを含む）と混合
する。反応混合物から溶液部分を除き、ポリスチレン
ボールは２mlの10mMリン酸ナトリウム・バツフ
アー（PH7.0；0.1M塩化ナトリウム含有）で２回
洗浄後、アフイニテイクロマトグラフイーにより
精製したウサギ抗α−hANP［17−28］Fab′−ペ
ルオキシダーゼ結合物50ngと10mMリン酸ナトリ
ウム・バツフアー（PH8.0；１mg／mlゼラチン、
0.2mMシスチンおよび1mM EDTAを含む）0.15
mlとを混合し、４℃で24時間静置する。溶液部分
を除去し、ポリスチレンボールを上記同様２回洗
浄した後、別の試験管に移す。結合しているペル
オキシダーゼの活性は、３−（４−ヒドロキシフ
エニル）プロピオン酸を基質として、30℃で60分
間静置後、その螢光強度を測定した。螢光強度は
200ng／mlキニーネ／50mM硫酸を基準として測
定する。特異性この方法によるEIAにおいては、α−hANPの
標準希釈曲線は、α−hANP［４−28］、α−
hANP［５−28］およびα−hANP［７−28］の曲
線と一致するので、Ｎ末端側の構造変化は影響の
ないことが分かる。逆に、Ｃ末端側アミノ酸を欠
如せしめると、反応性が著しく減少する。しか
し、末端のフラグメントα−hANP［17−28］お
よびα−hANP［１−６］とは反応しない。β−
hANPおよびα−rANPとの交差反応は分子基準
で、それぞれ4.7％および0.01％であつた。これ
らの結果は、使用した抗体の特異性と一致する。
ポリスチレン・ボールに固定化したマウス・モノ
クローナルIgG₁は、α−hANPの環状構造のＮ
末端側の半分に特異性を示し、ペルオキシダーゼ
に結合したウサギFab′は、α−hANP［17−28］
に特異性を示す。血漿の影響血漿およびα−hANPの非存在下に測定した結
合ペルオキシダーゼ活性（非特異的結合）は、
1pmolのモノクローナル抗−α−hANP IgG₁
（KY−ANP−Ｉ）と前処理した血漿の存在下で
測定したペルオキシダーゼ活性と一致する。4.3
〜332pg／mlのANPを含有する血漿に加えたα−
hANP（10〜200pg／ml）の回収率は81〜94％で
ある。血漿の希釈曲線はチユーブ当りの血漿量は
１〜50μlの範囲にある限り、血漿の非存在下で得
たα−hANPの標準曲線と平行関係にある。従つ
て、使用した血漿量が50μl以下の場合には血漿に
よる障害は殆ど認めない。その結果を第２図に示
す。 EIAの感度 α−hANPの測定限界は30fg（10amol）／チユ
ーブである。血漿50μlを用いたときの血漿α−
hANPの感度は0.6pg／ml（0.2fmol／ml）であ
る。EIAにおけるこの感度は、既存のRIAに比較
して、１桁ないし２桁高い値を示す。 EIAの再現性本発明品の再現性は、血漿中のα−hANPが５
〜158pg／mlの範囲内で５種類の異なつたレベル
で求めた。実験内および実験間での再現性は、そ
れぞれ変動係数3.2〜9.4％（ｎ＝20）および5.4〜
12.0％であつた。定常状態および循環血液量減少状態でのEIAに
よる健常人での血漿α−hANPレベルおよびそ
のRIAによる場合との比較健常人における定常状態α−hANPレベルは
EIAでは24.5±5.9pg／mlであつた。フロセミド
（furosemide）（40mg）を静注し、１時間歩行後
の循環血液量減少状態での血漿α−hANPレベル
は15.3±3.7pg／mlに低下した。RIAによつて同
時に測定した血漿α−hANPレベルは、それぞれ
28.2±5.7pg／mlおよび18.3±3.2pg／mlであつた。
EIA(y)とRIA(x)により測定したα−hANPレベル
間には、次のような相関関係にある。ｙ＝0.78x＋1.3、ｒ＝0.92、ｎ＝24 上記のデータから明らかなように、本発明方法
におけるEIAは非常に感度が高く、循環血液量減
少状態においても抽出操作なしに、血漿α−
hANP濃度を測定することができる。心疾患患者の血漿中α−hANP値本発明α−hANP測定試薬により測定した心疾
患患者の血漿中α−hANP値は、下記第１表のと
おりである。【表】【表】 EIA一段階法での適用本発明におけるEIAは一段階法でも適用可能で
ある。第３図は一段階EIAによるα−hANPの標
準曲線と血漿の希釈曲線を示す。なお、この試験
は、hANP、酵素標識抗体および抗体被覆ポリス
チレンボールを同時に混合し、４℃で24時間反応
せしめた。ペルオキシダーゼ（POD）活性の測
定は30℃で30分行なつた。他の条件は二段階法と
全く同様である。発明の効果従来のRIAによるα−hANPの測定において
は、検体中からα−hANPを抽出する必要があつ
たが、本発明のモノクローナル抗体を用いたα−
hANPの免疫学的測定試薬を用いれば、α−
hANPを抽出することなく直接検体中のα−
hANPを測定できる。またこの測定には、固相化
抗体とα−hANPを反応させた後に標識抗体を加
えて反応させる二段階法はもちろんのこと、固相
化抗体にα−hANPと標識抗体を同時に加えて反
応させる一段階法も適用することができ、簡便な
測定が可能である。このα−hANPの測定法の確
立により、心疾患、腎疾患、高血圧症（本態性、
二次性）、浮腫性疾患（肝硬変、ネフローゼ、突
発性浮腫等）、脱水症等体液バランスの異常を伴
う疾患の診断および治療経過の簡便かつ正確な観
察が可能になつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はα−hANP、α−rANP、およびα−
hANP断片と本発明のモノクローナル抗体との交
差反応性を示す。第２図はEIAによるα−hANP
の標準曲線（〇）と血漿の希釈曲線（●、▲、
■）を示す。第３図は一段階EIAによるα−
hANPの標準曲線（〇）と血漿の希釈曲線（●、
▲、■）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド
のリング構造のＮ端側の約半分を認識するモノク
ローナル抗体。２ α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド
［７−16］断片に含まれ、かつ、Met［12］を含む
部分を認識する特許請求の範囲第１項に記載のモ
ノクローナル抗体。３ハイブリドーマKY−ANP−Ｉ
（ECACC87082001）により産生されるモノクロ
ーナル抗体KY−ANP−Ｉである特許請求の範
囲第１項に記載のモノクローナル抗体。４固相に固定化した抗体である特許請求の範囲
第１項ないし第３項のいずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体。５固相がガラスビーズまたはポリスチレンボー
ルである特許請求の範囲第４項に記載のモノクロ
ーナル抗体。６ α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド
のリング構造のＮ端側の約半分を認識するモノク
ローナル抗体およびα−ヒト心房性ナトリウム利
尿ポリペプチドのＣ端側を認識する抗体からなる
２種の抗体を用い、その一方を固相に固定化した
固定化抗体とし、他方を酵素で標識した酵素標識
抗体とすることを特徴とするα−ヒト心房性ナト
リウム利尿ポリペプチドの免疫学的測定試薬。７酵素標識抗体が標識酵素を架橋剤を介して抗
体に結合したものである特許請求の範囲第６項に
記載の免疫学的測定試薬。８標識酵素がペルオキシダーゼである特許請求
の範囲第６項に記載の免疫学的測定試薬。９架橋剤が４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステルまた
は６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミ
ドエステルである特許請求の範囲第７項に記載の
免疫学的測定試薬。１０モノクローナル抗体がα−ヒト心房性ナト
リウム利尿ポリペプチド［７−16］断片に含ま
れ、かつ、Met［12］を含む部分を認識するモノ
クローナル抗体である特許請求の範囲第６項に記
載の免疫学的測定試薬。１１モノクローナル抗体がハイブリドーマKY
−ANP−Ｉ（ECACC87082001）により産生され
るモノクローナル抗体KY−ANP−Ｉである特
許請求の範囲第１０項に記載の免疫学的測定試
薬。１２ α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチ
ドのＣ端側を認識する抗体が抗α−−ヒト心房性
ナトリウム利尿ポリペプチド［17−28］抗体であ
る特許請求の範囲第６項に記載の免疫学的測定試
薬。１３抗α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプ
チド［17−28］抗体がウサギ抗α−ヒト心房性ナ
トリウム利尿ポリペプチド［17−28］血清から得
られるものである特許請求の範囲第１２項に記載
の免疫学的測定試薬。１４固相がガラスビーズまたはポリスチレンボ
ールである特許請求の範囲第６項に記載の免疫学
的測定試薬。