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Diese Erfindung bezieht sich auf Kits und ein Verfahren für den
Immunassay von menschlichem natriuretischem Vorhof-Polypeptid (hANP), worin
monoklonale Antikörper mit einbezogen sind, die α-hANP erkennen, und auf
Hybridome, die derartige monoklonale Antikörper erzeugen, für die
Verwendung in den Kits und bei dem Verfahren. Insbesondere bezieht sie sich auf
Kits und ein Verfahren für den Immunassay von menschlichem natriuretischem
Vorhof-Polypeptid, worin monoklonale Antikörper (und entsprechende
Hybridome), welche die N-terminale Hälfte der Ringstruktur von α-hANP erkennen,
mit einbezogen sind.
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Natriuretisches Vorhof-Polypeptid (ANP) ist in dem Granulat, welches
von den Zellen des Vorhofcordismuskels erzeugt wird, vorhanden, und weist
starke diuretische und natriuretische Wirkungen auf. Diese Sorte Polypeptid
wird nicht nur beim Menschen, sondern auch bei Ratten gefunden und wird als
hANP bzw. rANP bezeichnet. hANP und rANP sind jeweils weiterhin in drei
Arten α, β- und γ klassifiziert. α-hANP besteht aus 28 Aminosäureresten.
Dessen Cys (7) und Cys (23), die an der 7. bzw. 23. Position von dem
N-terminalen Ende angeordnet sind, bilden eine Disulfid-Bindung, und die
Sequenz zwischen ihnen bildet eine Ringstruktur (Biochem. Biophys. Res.
Commun. (im nachfolgenden als BBRC abgekürzt) 118, 131 bis 139, 1984).
α-rANP unterscheidet sich von α-hANP nur in bezug auf einen Rest in der 12.
Position vom N-terminalen Ende, welcher Ile bzw. Met in α-rANP bzw. α-hANP
ist (BBRC, 117, 839 bis 865, 1983) . β-hANP ist ein antiparalleles Dimer von
α-hANP (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 184098/1985).
γ-hANP besteht aus 126 Aminosäureresten, wobei die Aminosäuren 99 bis 126
am C-terminalen Ende α-hANP entsprechen. Was Verfahren zum Messen von ANP
anbelangt, so sind Radioimmunassay-Verfahren unter Verwendung von Antiserum
schon aufgestellt worden (Science 228, 323 bis 325, 1985; Nature 314, 264
bis 266, 1985; BBRC 124, 815 bis 821, 1984; BBRC 124, 663 bis 668, 1984;
BBRC 125, 315 bis 323, 1984) . Es ist bekannt, dass Antiserum CR-3 das
C-terminale Fragment (17-28) von ANP erkennt.
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Was einen monoklonalen Antikörper, der α-hANP erkennt, anbelangt so
ist 11A-A11 bekannt. Der Antikörper wird unter Verwendung von Atriopeptin
II, eine Art Ratten-ANP, als Antigen erhalten, und dessen Epitop ist
zwischen Cys (7) und Ser (25) angeordnet und umfasst die Disulfid-Bindung.
Somit wird das Epitop als ein Teil der Ringstruktur von ANP angesehen.
Jedoch wird die Affinität dieses Antikörpers nicht von dem Unterschied
zwischen Met (12, menschlich) und Ile (12, Ratte) beeinflusst, und der
Antikörper erkennt rANP und hANP (Life Science 38, 1991 bis 1997, 1986).
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Bei dem gebräuchlichen Immunassay von ANP ist es notwendig, ANP von
Plasmaproben zu extrahieren. Somit bestand eine grosse Nachfrage nach einem
monoklonalen Antikörper mit einer derartig hohen Affinität, dass es
ermöglicht wird, einen hochempfindlichen Assay ohne Extraktion zu erzielen. Als
monoklonalen Antikörper, der ANP erkennt, gibt es das zuvor genannte
11A-A11, welches nicht nur hANP, sondern auch rANP erkennt. Wenn ein
Antikörper zur Verfügung gestellt werden könnte, der spezifisch die N-terminale
Stelle von ANP erkennt, könnte es, da Antiserum CR-3 für ANP die
C-terminale Stelle von ANP erkennt, möglich sein, Sandwich-Immunassays
unter Verwendung dieser beiden Antikörperarten durchzuführen. Es besteht
deshalb eine starke Nachfrage nach einem monoklonalen Antikörper, welcher
hohe Affinität aufweist, welcher spezifisch die N-terminale Stelle von hANP
erkennt.
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Bekannte Immunassays für hANP sind Radioimmunassays unter Verwendung
von Radioisotopen (im nachfolgenden als RIA abgekürzt) und Enzymimmunassays
unter Verwendung von Enzymen (EIA).
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American Society of Hypertension Symposium Series, Bd. 2; Advances in
Atrial Peptide Research; Second World Congress, New York, USA, Mai 1987;
Raven Press (veröffentlicht 1988), Bd. 0, Nr. 0, Seiten 191 bis 195 (ANP
Synthesis, storage, and radioimmunoassays (Mukoyama et al) offenbaren die
Herstellung und Charakterisierung eines monoklonalen Antikörpers, KY-ANP-I,
zu α-ANP. Der monoklonale Antikörper wird in Radioimmunassays (RIA)s) für
den Nachweis von α-hANP verwendet.
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Im Falle von RIA bestand die Tendenz, dessen Verwendung wegen
Problemen im Hinblick auf die erforderliche Ausrüstung und Anlagen zu vermeiden.
Somit bestand eine starke Nachfrage im Hinblick auf die Entwicklung eines
hochempfindlichen EIA, welcher an jedem Platz verwendet werden könnte. Bei
der Enzymmarkierung ist Glutaraldehyd bisher im allgemeinen als
Überbrückungsagens verwendet worden. Jedoch wird es neuerdings selten wegen
Polymerisationsproblemen und geringer Ausbeute verwendet. Als
Überbrückungsagenzien, die an die Stelle von Glutaraldehyd treten, werden
solche Agenzien, wie beispielsweise N-Hydroxysuccinimidoester von N,N'-o-
Phenylendimaleimid und N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)maleimid (J.
Immunoassay 4, 209 bis 327 (1983)) neuerdings verwendet. Es gibt jedoch keinen
Bericht darüber, dass diese in einem Assay von hANP verwendet werden
können. Zusammengefasst bedeutet dies somit, dass vor dieser Erfindung kein
hochempfindlicher Immunassay für hANP existierte.
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Demgemäss liefert die vorliegende Erfindung ein Kit für den Immunassay
von α-hANP, umfassend einen monoklonalen Antikörper, welcher den
N-terminalen Teil der Ringstruktur von α-hANP erkennt, und einen
Antikörper, welcher den C-terminaleN Teil von α-hANP erkennt, wobei einer dieser
Antikörper auf einer festen Phase immobilisiert ist, und der andere
markiert ist.
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Der monoklonale Antikörper des Kits kann mindestens einen Teil der
Sequenz von α-hANP (7-16) , welche Met (12) umfasst, erkennen. Ein Beispiel
für einen derartigen monoklonalen Antikörper ist einer, der aus einem von
ECACC 87082001 erhältlichen Hybridom erhältlich ist.
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Der Antikörper des Kits, welcher die C-terminale Stelle von α-hANP
erkennt, ist aus Anti-α-hANP (17-28)-Antiserum erhältlich.
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Die Feststoffphase des Kits kann Glaskugeln oder Polystyrolkugeln
umfassen. Die Markierung des Antikörpers kann ein Enzym umfassen.
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Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren für den
Immunassay von α-hANP in einer Testprobe, umfassend Mischen der Testprobe mit
einem monoklonalen Antikörper, welcher den N-terminalen Teil der
Ringstruktur von α-hANP erkennt, und mit einem Antikörper, welcher die C-terminale
Stelle von α-hANP erkennt, wobei einer der Antikörper auf einer
Feststoffphase immobilisiert ist, und der andere markiert ist, Ermöglichen, dass die
Antikörper mit dem α-hANP in der Testprobe reagieren, Entfernen der
nichtumgesetzten Antikörper aus dem Reaktionsprodukt, und Messen der Menge des
umgesetzten markierten Antikörpers mit Hilfe der Markierung.
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Bei der Messung von α-hANP mit Hilfe konventioneller RIA-Verfahren ist
es bis jetzt erforderlich gewesen, α-hANP aus einer Plasmaprobe zu
extrahieren. Jedoch ist es unter Verwendung dieser Erfindung möglich, α-hANP in
einer Testprobe direkt zu messen, ohne α-hANP zu extrahieren.
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Weiterhin können derartige Messungen nicht nur mit Hilfe eines
Zweistufen-Verfahrens, bei dem ein auf einer Feststoffphase immobilisierter
Antikörper zuerst mit α-hANP umgesetzt wird, und anschliessend ein
markierter Antikörper weiterhin umgesetzt wird, durchgeführt werden, sondern sie
können auch mit Hilfe eines Einstufen-Verfahrens durchgeführt werden, bei
dem α-hANP und ein markierter Antikörper gleichzeitig mit einem auf einer
Feststoffphase immobilisierten Antikörper umgesetzt werden. Somit kann
α-hANP leicht gemessen werden, und es wird somit möglich, leicht und genau
Herzkrankheiten, Nierenkrankheiten, Hypertonie (essentielle und sekundäre),
ödematose Krankheiten (Lebercirrhose, Nephrose, kataplektisches Ödem, etc.)
und Entwässerung, die mit Abnormalien in bezug auf den
Gleichgewichtszustand von Körperflüssigkeiten verbunden ist, zu diagnostizieren und zu
verfolgen.
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In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
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FIG. 1 Kreuzreaktivitäten von α-hANP, α-rANP und α-hANP-Fragmenten mit
einem monoklonalen Antikörper für die Verwendung in einem Kit oder bei
einem Verfahren gemäss dieser Erfindung;
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FIG. 2 eine Standardkurve (O) von α-hANP und Verdünnungskurven ( , ,
) von Plasma mit Hilfe von EIA;
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FIG. 3 eine Standardkurve (O) von α-hANP und Verdünnungskurven ( , ,
) von Plasma mit Hilfe eines Einstufen-EIA.
(1) Herstellung eines einen monoklonalen Antikörper erzeugenden
Hybridoms:
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α-hANP ist ein aus 28 Aminosäureresten bestehendes Polypeptid, und
dessen Molekulargewicht ist vergleichsweise gering. Folglich ist dessen
Fähigkeit, Antikörpererzeugung zu induzieren (Immunogenität) gering. Aus
diesem Grunde und um es als Antigen zu verwenden, wird es mit
Rinderserumalbumin oder Rinderthyroglobulin kombiniert. Das erhaltene Konjugat wird
mit einem geeigneten Adjuvans, wie beispielsweise komplettem Freund'schen
Adjuvans, emulgiert und wird anschliessend zum Immunisieren von Mäusen
verwendet.
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Die Immunisierung wird durchgeführt, indem Mäuse mehrere Male in
Intervallen von einigen Wochen intraperitoneal, subkutan oder intravenös mit
der zuvor beschriebenen Emulsion geimpft werden. 3 bis 5 Tage nach der
letzten Immunisierung wird die Milz, welche als Quelle der
Antikörper-erzeugenden Zellen verwendet wird, herausgenommen. Zur gleichen Zeit wird als
andere Elternstammteilzellen, die mit den Antikörper-produzierenden Zellen
unter Herstellung von Hybridomen zu verschmelzen sind, ein
Myelomzellenstamm
mit geeignetem Marker, wie beispielsweise Fehlen von Hypoxanthin-
Guaninphosphoribosyl-Transferase (HGPRT-) oder Fehlen von Thymidinkinase
(TK-) hergestellt, und der Myelomzellenstamm wird anschliessend mit den
Antikörper-erzeugenden Zellen unter Herstellung eines Hybridoms
verschmolzen.
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Als Kulturmedium zum Herstellen des Hybridoms gibt es verschiedene
Beispiele, wie Eagle's MEM, Dulbeccos modifiziertes Medium und RPMI-1640,
welche im allgemeinen unter Hinzugabe von etwa 15 fötalem Kalbsserum
(FCS) , je nach Fall, verwendet werden.
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Zuerst werden Myelom als parenterale Zellen und Milzzellen im
Verhältnis von 1:6,5 hergestellt. Als Fusionsmittel wird im allgemeinen 50 %-iges
Polyethylenglykol (PEG) wegen der hohen Fusionsrate verwendet. Fusionierte
Stämme werden mit Hilfe des HAT-Selektionsverfahrens selektiert. Die
erzeugten Hybridome werden gemäss bekannten Verfahren, wie dem
Membranfluoreszenz-Antikörper-Verfahren, dem Assay-Verfahren im Hinblick auf
enzymgebundenes Immunsorbens (ELISA-Verfahren) oder dem Immungewebe-Färbeverfahren
unter Verwendung des Kulturüberstands gefunden. Dabei werden Hybridomklone,
die das Ziel-Immunglobulin erzeugen, selektiert. Um die Hybridome
monoklonal zu machen, werden normale Milzzellen als Futterschicht in eine Platte
mit 96 Mikrovertiefungen in einer Menge von 10&sup6; Zellen/Vertiefung gebracht,
wobei die Hybridome in einer geringeren Menge als 1 Zelle/Vertiefung
eingebracht werden, und mit den Klonen, die wachsen, wird erneut Screening
durchgeführt. Es werden mit derartigem wiederholten Subklonieren
monoklonale Hybridome erhalten.
(2) Herstellung von monoklonalem Antikörper:
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Um einen monoklonalen Antikörper für die Verwendung in einem Kit oder
bei dem Verfahren dieser Erfindung herzustellen, wird das zuvor erhaltene
Hybridom in vitro oder in vivo kultiviert. Beim in vitro-Kultivieren können
übliche Medien, wie die zuvor genannten, unter Hinzugabe von FCS verwendet
werden. Nach 3- bis 5-tägigem Kultivieren in dem Medium wird der
monoklonale Antikörper aus dem Kulturüberstand erhalten. Im Falle der in vivo-
Kultur wird das Hybridom in den Bauch eines Säugers geimpft. Am Tage 7 bis
14 danach wird das Bauchwasser, aus dem der monoklonale Antikörper erhalten
wird, gesammelt. Im Vergleich zur in vitro-Kultur erzeugt die in
vivo-Kultur wirksam eine weit grössere Antikörpermenge. Somit ist die in
vivo-Kultur bevorzugt.
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Der auf diese Weise aus einem Kulturüberstand oder Bauchwasser
erhaltene monoklonale Antikörper wird mit Hilfe einer geeigneten Kombination
bekannter Verfahren, wie beispielsweise Ammoniumsulfat-Fraktionierung,
Verwendung einer DEAE-Sepharosesäule, etc., gereinigt. Auf diese Weise kann
beispielsweise die Reinigung auf die im nachfolgenden Beispiel beschriebene
Weise durchgeführt werden.
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Somit umfasst ein allgemeines Verfahren zum Herstellen eines
Antikörpers für die Verwendung in einem Kit oder bei einem Verfahren der Erfindung
oder zum Herstellen eines Hybridoms für die Erzeugung eines derartigen
Antikörpers Fusionieren von Myelomzellen mit Antikörper-erzeugenden Zellen,
die von einem Säuger, der mit einer immunogenen Präparation von α-hANP
immunisiert ist, erhalten worden sind, und Selektieren von Antikörpern zu
α-hANP-erzeugenden Hybridomen, und gewünschtenfalls Kultivieren des sich
ergebenden Hybridoms unter Herstellung von monoklonalem Antikörper.
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Wie später im Beispiel gezeigt werden wird, erkennt der für die
Verwendung bei dieser Erfindung erhaltene bevorzugte monoklonale Antikörper
KY-ANP-I spezifisch α-hANP, und er zeigt fast keine Affinität zu rANP. Es
wird angenommen, dass sich sein Epitop in der N-terminalen Hälfte der
Ringstruktur von α-hANP, insbesondere der Teil, der Cys (7) bis Gly (16)
umfasst, befindet. Weil er darüber hinaus sehr schwach mit rANP reagiert,
wird angenommen, dass sein Epitop ein Teil ist, welcher Met (12) enthält.
Weil das Epitop ein Teil ist, welcher nicht nur α-hANP, sondern auch β-hANP
und γ-hANP gemein ist, zeigt der Antikörper auch Reaktivität mit β-hANP und
γ-hANP.
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Darüber hinaus zeigt dieser Antikörper hohe Affinität
(Ka = 3,1x10¹&sup0; M&supmin;¹) zu α-hANP. Wie in der Standardkurve von α-hANP in
Fig. 1 dargestellt ist, betrugen die 10 %-igen und 50 %-igen
Inhibitorkonzentrationen (IC&sub1;&sub0; und IC&sub5;&sub0;) 10 pg/Röhre bzw. 100 pg/Röhre.
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Das Hybridom KY-ANP-I, welches den monoklonalen Antikörper KY-ANP-I
für die Verwendung bei dieser Erfindung erzeugt, ist in dem PHLS Centre for
Applied Microbiology and Research, European Collection of Animal Cell
Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, England, seit dem
20. August 1987 unter der Hinterlegungs-Nr. 87082001 in Übereinstimmung mit
dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
(3) Konjugation des Antikörpers mit dem Träger:
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Als Feststoffphase für das Konjugieren eines Antikörpers mit einem
Träger können solche Gegenstände, wie Glas- oder Kunststoffkugeln, Kugeln,
Röhren oder Platten, welche kommerziell erhältlich sind und im allgemeinen
bei Immunassays als Träger für Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet
werden, verwendet werden. Ein Antikörper, der die N-terminale Stelle oder
C-terminale Stelle von α-hANP erkennt, kann auf einem dieser Träger
adsorbiert werden. Die Adsorption wird üblicherweise über Nacht in
Phosphatpuffer bei pH 6 bis 10, vorzugsweise im neutralen pH-Bereich, bei
Raumtemperatur durchgeführt. Der Träger, auf den der Antikörper adsorbiert worden ist,
wird unter Kühlen in Anwesenheit eines Antiseptikums, wie beispielsweise
Natriumazid, aufbewahrt.
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Sowohl monoklonale Antikörper wie auch polyklonale Antikörper können
auf die gleiche Weise, wie zuvor angegeben, auf Träger adsorbiert werden.
(4) Kaninchen-Anti-α-hANP (17-28)-Serum:
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Kaninchen wurden mehrere Male mit α-hANP (17-28)-Rinderthyroglobulin-
Konjugat, welches mit Hilfe des Carbodiimid-Verfahrens hergestellt worden
ist, immunisiert, und 10 bis 14 Tage nach der letzten Immunisierung wurde
Blut, aus dem Kaninchen-Anti-α-hANP (17-28)-Serum hergestellt wird,
entnommen.
(5) Herstellung von mit Enzym markiertem Antikörper:
Kaninchen-IgG, F(ab')&sub2; und Fab':
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Das wie zuvor beschrieben hergestellte Antiserum wird mit
Natriumsulfat fraktioniert, welches anschliessend durch eine DEAE-Cellulosesäule
unter Erhalt von IgG geleitet wird. Das erhaltene IgG wird mit Pepsin unter
Erzeugung von F(ab')&sub2; verdaut, welches anschliessend mit
2-Mercaptoethylamin unter Erhalt von Anti-α-hANP (17-28) Fab' reduziert
wird. Die Herstellung von Fab' aus IgG ist detailliert in J. Immunoassay 4,
209 bis 327 (1983) beschrieben, und das gleiche Verfahren kann bei dieser
Erfindung verwendet werden.
Enzymmarkierung von Antikörpern:
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Als Enzym für die Markierung eines Antikörpers können alkalische
Phosphatase, β-D-Galactosidase, Peroxidase, Glucoseoxidase, etc., verwendet
werden. Bei dieser Erfindung wird Meerrettichperoxidase vorzugsweise
verwendet. Als Überbrückungsagens können N,N'-o-Phenylendimaleimid,
N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexanoat,
N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat,
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat,
4,4'-Dithiodipyridin und andere schon bekannte verwendet werden.
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Die Reaktionen dieser Überbrückungsagenzien mit Enzymen und
Antikörpern kann mit Hilfe bekannter Verfahren in Abhängigkeit von den
Eigenschaften des jeweiligen Agenses durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den
Umständen werden Antikörperfragmente, wie beispielsweise Fab', Fab und
F(ab')&sub2; als Antikörper verwendet. Es ist wünschenswert, als
Überbrückungsagens bei dieser Erfindung N-Succinimidyl-4-
(N-maleimidomethyl)cyclohexanoat oder N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat zu verwenden.
Darüber hinaus können unabhängig davon, ob die Antikörper polyklonal oder
monoklonal sind, mit Enzym markierter Antikörper mit Hilfe der gleichen
Verfahren erhalten werden. Deshalb können mit Enzym markierte Antikörper,
die unter Verwendung der zuvor beschriebenen beiden Überbrückungsagenzien
erhalten worden sind, durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt
werden
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(wobei A einen Antikörper oder dessen Fragment, welches beispielsweise die
N-terminale Stelle oder C-terminale Stelle von α-hANP erkennt, bedeutet, B
bedeutet ein Markierungsenzym und R bedeutet 4-Methylencyclohexyl oder
Pentamethylen).
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Es ist wünschenswert, dass die auf diese Weise erhaltenen, mit Enzym
markierten Antikörper mittels Affinitätschromatografie gereinigt werden, so
dass ein empfindlicheres Immunassaysystem erreicht wird. Die gereinigten,
mit Enzym markierten Antikörper werden an einem kühlen und dunklen Platz
mit einem Stabilisator, wie beispielsweise Thimerosal oder Glycerin,
gelagert, oder sie werden, nachdem sie lyophilisiert worden sind, gelagert.
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Wenn α-hANP unter Verwendung des zuvor hergestellten
Immunassayreagenses gemessen wird, kann eine Kombination von Antikörpern folgendermassen
angeordnet werden. In den Fällen, in denen ein Antikörper, der die
N-terminale Stelle von α-hANP erkennt, immobilisiert wird, wird ein Antikörper,
der die C-terminale Stelle erkennt, mit Enzym markiert. Beim
Immobilisieren eines Antikörpers ist im allgemeinen eine vergleichsweise grosse Menge
an Antikörper erforderlich. Deshalb ist für die Immobilisierung ein
monoklonaler Antikörper, welcher gleichbleibend in grosser Menge erhalten
werden
kann (beispielsweise KY-ANP-I) geeignet. Jedoch kann ein aus Antiserum
hergestellter polyklonaler Antikörper auch ohne Schwierigkeit verwendet
werden. Was den mit Enzym zu markierenden Antikörper anbelangt, so kann
entweder ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper
verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass er eine Stelle erkennt, die
sich von der unterscheidet, die von dem immobilisierten Antikörper erkannt
wird. Wenn beispielsweise KY-ANP-I als immobilisierter Antikörper verwendet
wird, kann das zuvor genannte Antiserum CR-3 oder das im Beispiel erwähnte
Antiserum F-36 als mit Enzym markierter Antikörper verwendet werden.
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Es kann auch die umgekehrte Kombination verwendet werden. Natürlich
können monoklonale Antikörper, die die C-terminale Stelle von α-hANP
erkennen, und Antiseren, die die N-terminale Stelle von α-hANP erkennen, bei
dieser Erfindung verwendet werden.
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Im allgemeinen liefert die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers
in einem Kit oder beim Verfahren der Erfindung für den Immunassay von
α-hANP, vorzugsweise für die in vitro-Diagnose.
BEISPIEL
Herstellung von Hybridom:
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Synthetisches α-hANP (1,5 mg) und Rinderthyroglobulin (5,4 mg) wurden
in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise
eine Lösung von 30 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid in 1 ml
destilliertem Wasser während einer Dauer von 10 Minuten bei Raumtemperatur
hinzugefügt, woran sich 24-stündiges Rühren der Mischung bei Raumtemperatur
anschloss. Diese Lösung wurde 6 mal gegen 3 l destilliertes Wasser während
einer Dauer von 3 Tagen dialysiert. Das Dialysat wurde in 5 Portionen
geteilt, welche bei -20ºC gelagert wurden (siehe BBRC 124, 815 bis 821,
1984).
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Zu der in geteilten Portionen gelagerten Lösung (die 300 ug α-hANP
enthielt) wurde destilliertes Wasser unter Auffüllung von 1,2 ml gegeben,
welche anschliessend in 1,2 ml komplettem Freundschen Adjuvans suspendiert
wurde. Davon wurden etwa 2 ml intraperitoneal und subkutan in 10 weibliche
BALB/c-Mäuse (200 ul pro Tier) injiziert. Die Tiere wurden auf die gleiche
Weise 3 Wochen später zusätzlich immunisiert. 5 Wochen nach der
zusätzlichen Immunisierung wurden die Antikörper in dem Blut gemessen, und 2
Mäusen, die die herausragendste Immunreaktion zeigten, wurden weiterhin
zusätzlich durch die Schwanzvene mit der zuvor beschriebenen Lösung, die
50 ug α-hANP enthielt, immunisiert. 4 Tage danach wurden die Milzzellen aus
den beiden Mäusen für die Zellfusion entnommen.
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Die entnommenen Milzzellen (1,3 x 10&sup8; Stück) und Myelomzellen
X63-Ag8.653 (2 x 10&sup7; Stück) wurden in Dulbecco's Medium (DMEM) gemischt,
und die Mischung wurde bei 1500 U/min 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die
erhaltenen Pellets wurden durch Erwärmen bei 37ºC geschmolzen, und
anschliessend wurde 1 ml 50 %-iges PEG 4000 (PEG 1 g/DMEM 1 ml) tropfenweise
während einer Dauer von 1 Minute hinzugegeben. Dann liess man die Mischung
2 Minuten bei 37ºC stehen, anschliessend wurde die Lösung durch
tropfenweises Hinzugeben von 10 ml DMEM von 37ºC während einer Dauer von 5 Minuten
verdünnt. Diese wurde dann mittels Zentrifugation bei 4ºC mit DMEM, welches
15 % FCS enthielt, gewaschen.
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Die erhaltenen Zellen wurden auf eine Platte mit 96 Vertiefungen gesät
und 2 Wochen in HAT-Medium und weiterhin 1 Woche in HT-Medium kultiviert.
Hybridome vermehrten sich in etwa 30 von insgesamt 768 Vertiefungen
(212/768), wobei festgestellt wurde, dass 4 % (8/212) davon
α-hANP-Antikörper erzeugten.
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Die Zellen in den Vertiefungen, die den höchsten Antikörpertiter
zeigten, wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens kloniert. Als
Futterzellen wurden BALB/c-Maus-Thymuszellen in die Vertiefungen in einer
Konzentration von 10&sup6; Stück/Vertiefung gegeben, und Hybridome wurden in einer
Konzentration von 1 Stück/Vertiefung hineingefüllt und dort kultiviert.
Dieses Verfahren wurde zweimal durchgeführt.
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Mit Hilfe derartigen Klonens wurde ein Klcn, der die grösste Menge an
Antikörper gleichmässig erzeugt, selektiert, und er wurde als KY-ANP-I
bezeichnet.
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Die Antikörpertiter in dem von den immunisierten Mäusen erhaltenen
Antiserum und in dem Überstand der Hybridomkultur wurden folgendermassen
gemessen:
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Antiserum von immunisierter Maus oder Überstand der Hybridomkultur
wurde als Probe genommen. Man liess eine Mischung aus 100 ul verdünnter
Lösung der Probe, 300 ul Assaypuffer (RIA-Puffer) und 100 ul ¹²&sup5;I-α-hANP
(10.000 cpm) 24 Stunden bei 4ºC reagieren, woran sich Mischen der Lösung
mit 1 ml Dextran-überzogener künstlicher Kohle anschloss, und man liess die
Mischung 5 Minuten bei 4ºC reagieren. Danach wurde die Mischung 30 Minuten
bei 4ºC bei 3000 U/min zentrifugiert, und die Radioaktivität ihres
Überstands
wurde mit einem γ-Zähler gemessen, woraus der Antikörpertiter in der
verdünnten Lösung der Probe berechnet wurde.
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Das zuvor genannte ¹²&sup5;I-α-hANP wurde mit Hilfe des
Chloramin-T-Verfahrens hergestellt. α-hANP (1 ug) wurde mit Na¹²&sup5;I (1 mCi) gemischt, wozu
10 ul Chloramin T (5,25 mg/ml) gegeben wurden, und 10 Sekunden danach
wurden 20 ul Natriumpyrosulfit (4,5 mg/ml) hinzugefügt. Dazu wurde weiterhin
1 ml 2 %-ige Gelatine gegeben, wobei anschliessend mit Sep-Pak C18
(hergestellt von Waters) gereinigt wurde.
Herstellung von monoklonalem Antikörper:
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BALB/c-Mäuse wurden zweimal in Intervallen von 1 bis 2 Wochen
vorbehandelt, indem 0,5 ml Pristan pro Tier zum gleichen Zeitpunkt
intraperitoneal verabreicht wurde. Jeder dieser Mäuse wurde anschliessend
intraperitoneal 5 x 10&sup6; Stück in 200 ul DMEM suspendiertes Hybridom KY-ANP-I
injiziert. Das erhaltene Bauchwasser wurde mit Hilfe einer Protein A-Sepharose
CL-4B-Säule unter Erhalt von monoklonalem Antikörper KY-ANP-I gereinigt.
Eigenschaften von KY-ANP-I:
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Das Isotop dieses monoklonalen Antikörpers wurde mit Hilfe des
Ouchterlony-Verfahrens als IgG&sub1; bestimmt. Dessen Affinität wurde erhalten,
indem ein Scatchard-Plot, basierend auf Radiobindungsassay, durchgeführt
wurde, und als Ergebnis wurde festgestellt, dass Ka = 3,1 x 10¹&sup0; M&supmin;¹.
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Dessen Epitop wurde durch Messen seiner Kreuzreaktivität mit
verschiedenen ANP-verwandten Peptiden mittels RIA bestimmt, und das Ergebnis ist in
Fig. 1 dargestellt. Weil beinahe keine Reaktion mit α-ANP (17-28) und α-ANP
(1-6) gezeigt ist, wird angenommen, dass das Epitop in α-ANP (7-16)
enthalten war. Daneben reagiert es sehr schwach mit α-hANP (8-22) oder α-rANP.
Deshalb wird angenommen, dass es für das Epitop notwendig ist, Ringstruktur
zu besitzen, und dass das Epitop Met enthält. Es wird die Schlussfolgerung
gezogen, dass das mit Hilfe des monokltnalen Antikörpers gemäss dieser
Erfindung erkannte Epitop annähernd die N-terminale Hälfte der Ringstruktur
von α-hANP ist.
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Es wurden die Reaktivitäten von KY-ANP-I mit β-hANP und γ-hANP mit
Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens zum Messen des Antikörpertiters
untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass KY-ANP-I nicht nur
α-hANP, sondern auch γ-hANP erkennt und dass es darüber hinaus mit β-hANP
mit 80 %-iger Kreuzreaktivität reagiert.
Herstellung von Anti-α-hANP (17-28)-Rinderthyroglobulinserum:
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α-hANP (17-28) wurde mit Hilfe des bekannten Carbodiimid-Verfahrens
(BBRC 117, 695, 1984) an Thyroglobulin gebunden. Zu 0,5 ml einer wässrigen
Lösung, die 3,1 mg α-hANP (17-28) enthielt, wurden 0,7 ml einer wässrigen
Lösung, die 19 mg Rinderthyroglobulin enthielt, hinzugegeben. Dazu wurde
1 ml einer wässrigen Lösung, die 40 mg
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid enthielt, gegeben, und die Mischung wurde 2
Stunden unter Kühlen mit Eis gerührt. Die Reaktionslösung wurde dreimal bei
4ºC gegen 2 l destilliertes Wasser dialysiert, anschliessend wurde sie
unter Erhalt von 21 mg des Konjugats lyophilisiert. Das Molverhältnis von
gebundenem α-hANP (17-28) zu Rinderthyroglobulin wurde mit Hilfe des
Aminosäure-Analyseverfahrens zu 30 bestimmt.
Immunisierung und Blutentnahme:
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In 0,25 ml physiologischer Kochsalzlösung wurden 0,25 mg des zuvor
beschriebenen α-hANP (17-28)-Rinderthyroglobulinkonjugats gelöst. Diese wurde
in einer gleichen Menge von komplettem Freundschen Adjuvans suspendiert,
und die Lösung wurde in ein Kaninchen an 20 oder mehr Stellen auf dem
Rücken subkutan injiziert. Dieses Verfahren wurde 6 mal in Abständen von 3
Wochen durchgeführt, und am 10. Tag nach der letzten Injektion entzog man
dem Kaninchen von der Halsschlagader Blut unter Erhalt von Antiserum F36.
Herstellung von Kaninchen-IgG:
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Zu 1 ml Anti-α-hANP-Serum (F36) wurde langsam 0,18 g Natriumsulfat
unter Rühren hinzugefügt, und nachdem das hinzugefügte Material vollständig
gelöst war, wurde das Rühren bei 22 bis 25ºC fortgesetzt. Die Mischung
wurde anschliessend 10 Minuten bei 22 bis 25ºC bei 10.000 U/min
zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 1 ml Natriumphosphatpuffer (pH 6,3;
17,5 mMol/l) gelöst, und er wurde anschliessend gegen den gleichen Puffer
dialysiert. Der Überstand wurde durch eine DEAE-Cellulosesäule, die zuvor
mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war (pH 6,3, 17,5 mMol/l),
geleitet. Das Nassvolumen der DEAE-Cellulose, das erforderlich war, um
10 mg Protein indem Überstand durchzuleiten, beträgt 1 ml. Die erhaltene
Menge IgG betrug 7 mg, berechnet unter Verwendung des
Extinktionskoeffizienten von 1,5 g&supmin;¹ l cm&supmin;¹ bei 280 nm, und das Molekulargewicht von IgG
betrug 150.000 (siehe J. Immunoassay 4, 209 bis 327 (1983)).
Herstellung von F(ab')&sub2;:
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10 mg Kaninchen-IgG wurden bei 5ºC gegen 1 ml Natriumacetatpuffer
(pH 4,5, 0,1 Mol/l) dialysiert. Zu der dialysierten IgG-Lösung wurden
0,05 ml (1/20 Volumen) einer wässrigen Natriumchlorid-Lösung (2 Mol/l)
gegeben. Darin wurde Pepsin (0,2 mg/10 mg IgG) , welches von der
Schleimmembran des Schweinemagens abstammte, gelöst. Man liess die Mischung bei 37ºC
15 bis 24 Stunden reagieren. Anschliessend wurde die Mischung mit einer
wässrigen Natriumhydroxid-Lösung (1 Mol/l) auf einen pH-Wert von 8
eingestellt, danach wurde die Mischung auf eine Sephadex G-150-Säule
(1,5 x 45 cm für 1,0 bis 1,5 ml, 2,0 x 45 cm für 2,0 bis 2,5 ml) gegeben
und mit Natriumboratpuffer (pH 8,0, 0,1 Mol/l) eluiert. Die Menge des
erhaltenen F(ab')&sub2; betrug 6 mg, berechnet unter Verwendung eines
Extinktionskoeffizienten von 1,48 g&supmin;¹ l cm&supmin;¹ bei 280 nm, und das Molekulargewicht von
F(ab')&sub2; betrug 92.000 (siehe J. Immunoassay, 4, 209 bis 327 (1983)).
Herstellung von Fab':
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3 mg F(ab')&sub2; wurden in 0,45 ml Natriumphosphatpuffer (pH 6,0,
0,1 Mol/l) gelöst. Dazu wurde 2-Mercaptoethylamin/Natriumphosphatpuffer-
Lösung (pH 6,0, 0,1 Mol/l), welche 5 mMol/l EDTA enthielt, gegeben, wobei
die Pufferlösung unmittelbar vor Verwendung hergestellt worden war.
Anschliessend liess man die Mischung 1,5 Stunden bei 37ºC reagieren. Danach
wurde die Reaktionsmischung auf eine Sephadex G-25-Säule (1x30 cm) gegeben
und mit Natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 Mol/l; enthält 5 mMol/l EDTA)
eluiert. Die erhaltene Menge Fab' betrug 2,5 mg, berechnet unter Verwendung
von einem Extinktionskoeffizienten von 1,48 g&supmin;¹ l cm&supmin;¹ bei 280 nm, und das
Molekulargewicht von F(ab')&sub2; betrug 46.000 (siehe J. Immunoassay, 4, 209
bis 327 (1983)).
Herstellung von mit Peroxidase markiertem Anti-α-hANP (17-28) Fab':
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2 mg Meerrettichperoxidase (50 nMol) wurden in 0,3 ml
Natriumphosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 Mol/l) gelöst. Dazu wurde eine Mischung aus 0,65 mg
(2100 nMol) N-Succinimityl-6-maleimido-hexanoat und 0,03 ml
N,N-Dimethylformamid gegeben, und man liess die Mischung unter Rühren bei 30ºC 0,5 bis
1 Stunde reagieren. Danach wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert, so
dass das überschüssige Reagens als Niederschlag entfernt wurde. Der
Überstand wurde durch eine Sephadex G-25-Säule (1,0 x 45 cm) geleitet und mit
Natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 Mol/l) bei einer Fliessgeschwindigkeit
von 30 bis 40 ml/Stunde eluiert, wobei das Volumen jeder Fraktion auf 0,5
bis 1,0 ml eingestellt war. Eine Sephadex G-50-Säule (fein, Pharmacia)
(1,0 x 6,4 cm, 5 ml) mit einem Feinmaschenfilter am Boden wurde mit dem
zuvor beschriebenen Puffer equilibriert und in einer Teströhre 2 Minuten
bei 100 x g zentrifugiert. Das zuvor genannte Reaktionsprodukt (0,5 ml)
wurde auf diese Säule gegeben und auf die gleiche Weise zentrifugiert. Die
erhaltene Fraktion wurde mittels Zentrifugieren mit einem Mikrokonzentrator
(Centricon 30 , Amicon Corp.) bei 2000 x g bei 4ºC konzentriert.
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In Natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 Mol/l) wurden 1,8 mg (45 nMol)
des auf diese Weise hergestellten Maleimidperoxidasekonjugats gelöst. Dazu
wurde eine Lösung von etwa 2,0 mg (43 nMol) Fab' in 0,2 bis 0,4 ml
Natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 Mol/l), welcher 5 mMol/1 EDTA enthielt,
gegeben, und man liess die Mischung 20 Stunden bei 4ºC oder 1 Stunde bei 30ºC
reagieren. Die Endkonzentration des Maleimid-Peroxidase-Fab'-Konjugats in
der Reaktionsmischung wurde auf 50 bis 100 uMol/l eingestellt. Diese
Reaktionsmischung wurde durch eine Ultrogel AcA 44-Säule (1,5 x 45 cm)
geleitet und mit Natriumphosphatpuffer (pH 6,5, 0,1 Mol/l) bei einer
Fliessgeschwindigkeit von 0,3 bis 0,5 ml/min eluiert, wobei das Volumen jeder
Fraktion auf etwa 1,0 ml eingestellt war. Auf diese Weise wurden etwa 2,5 mg
des gewünschten, mit Peroxidase markierten Anti-α-hANP (17-28)-Fab'
erhalten (siehe J. Immunoassay, 4, 209 bis 327 (1983)).
α-hANP (17-28)-unspezifisches Kaninchen-IgG-Konjugat:
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Man liess eine Lösung von α-hANP (17-28) (0,5 mg) in 0,2 ml
Natriumphosphatpuffer (0,1 Mol/l, pH 7,0) mit 0,01 ml 105 mMol/l N-Succinimidyl-6-
maleimidohexanoat in N,N'-Dimethylformamid 30 Minuten bei 30ºC reagieren.
Das Reaktionsprodukt wurde mit einer Sephadex G-10-Säule (1,0 x 45 cm)
unter Verwendung von 0,1 Mol/l) Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), welcher
5 mMol/l EDTA enthielt, gelfiltriert. Der Durchschnittswert der in α-hANP
(17-28) eingeführten Maleimidgruppen betrug 0,6/Molekül.
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Eine Lösung von unspezifischem Kaninchen-IgG (10 mg) in 0,1 Mol/l
Natriumphosphatpuffer (0,6 ml, pH 7,5) wurde mit einer Lösung aus 210 mMol/l
S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (0,03 ml) in N,N'-Dimethylformamid 30
Minuten bei 30ºC umgesetzt. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 0,1 Mol/l Tris-
Hydrochlorid-Puffer (0,1 ml, pH 7,0), 0,1 Mol/l EDTA (0,02 ml) und 1 Mol/l
Hydroxylamin-hydrochlorid (0,1 ml, pH 7,0) gegeben, und die Mischung wurde
5 Minuten bei 30ºC umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde mit einer Sephadex
G-25-Säule (1,0 x 45 cm) unter Verwendung von 0,1 Mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), welcher 5 mMol/l EDTA enthielt, gelfiltriert. Der
Durchschnittswert der in das unspezifische Kaninchen-IgG eingeführten
Thiolgruppen betrug 11/Molekül.
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Ein Aliquot (2,0 ml) des zuvor genannte Maleimid-α-hANP (17-28) wurde
30 Minuten bei 30ºC mit mercaptosuccinyliertem unspezifischem Kaninchen-IgG
(2,4 mg), welches in 0,1 Mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,25 ml),
welcher 5 mMol/l EDTA enthielt, erhalten worden war, umgesetzt. Zu dem
Reaktionsprodukt wurde 0,1 ml N-Ethylmaleimid (0,01 mMol/l) hinzugefügt um
die verbleibenden Mercaptogruppen zu blockieren. Die Mischung wurde
anschliessend mit einer Sephadex G-25-Säule (1,0 x 45 cm) unter Verwendung
von 0,1 Mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelfiltriert. Die
Durchschnittszahl der Moleküle von α-hANP (17-28), die mit unspezifischem
Kaninchen-IgG kombiniert waren, betrug 8,7/Molekül, berechnet aus der Reduktion
der Thiolgruppen.
Reinigung von mit Meerrettichperoxidase markiertem Anti-hANP (17-28)
Fab':
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α-hANP (17-28)-unspezifisches Kaninchen-IgG-Konjugat (2 mg),
Rinderthyroglobulin (10 mg) und Mausserumprotein (20 mg) wurden jeweils mit
Cyanbromid-aktivierter Sepharose 4B (1 g) kombiniert. Mit
Meerrettichperoxidase markiertes Anti-hANP (17-28)-Fab' (7,8 mg) in 0,8 ml 0,1 Mol/l
Natriumphosphatpuffer (pH 6,5), welcher 1 g/l Gelatine und 50 mg/l Thimerosal
enthielt, wurde durch zwei Säulen mit einer Fliessgeschwindigkeit von
0,5 ml/Stunde geleitet, wobei 10 mMol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,5),
welcher 1 g/l Gelatine und 0,1 Mol/l Natriumchlorid enthielt, verwendet
wurden, wobei die eine Säule eine Säule aus Rinderthyroglobulin-Sepharose
4B (0,55 x 4,0 cm) war, und die andere Säule eine Säule aus
Mausserumprotein-Sepharose 4B (0,55 x 4,0 cm) war. Anschliessend wurde weiterhin mit
einer Säule aus α-hANP (17-28)-unspezifisches Kaninchen-IgG-Sepharose 4B
(0,35 x 2,0 cm) unter Verwendung von 3,2 mMol/l Salzsäure (pH 2,5)
gereinigt. Das Eluat (1 ml) , welches 0,35 mg gereinigte markierte Substanz
enthielt, wurde sofort mit 0,1 ml 1 Mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) und
0,01 ml 100 g/l Gelatine gemischt. Die Menge der markierten Substanz betrug
etwa 0,35 mg, berechnet aus der Peroxidaseaktivität.
Herstellung von mit monoklonalem Anti-α-hANP überzogenen
Polystyrolkugeln:
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50 Stück Polystyrolkugeln (Durchmesser 3,2 mm, hergestellt von
Precision Plastic Ball Co., Chicago, USA) wurden in 1 ml 0,1 M
Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelegt, zu dem 100 ug/ml monoklonales Anti-α-hANP-IgG&sub1;
(KY-ANP-I) hinzugefügt wurde, und man liess die Mischung über Nacht bei
Raumtemperatur stehen. Dann wurden die Polystyrolkugeln mit
Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Anschliessend wurde Natriumazid zu 0,1
hinzugegeben. Die auf diese Weise hergestellten Polystyrolkugeln wurden in
einem Kühlschrank aufbewahrt.
Gewinnung von Plasma:
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Blut wurde um 9 Uhr morgens von der vor dem Ellenbogen gelegenen Vene
von gesunden männlichen Personen (Alter 26 bis 32) in Rückenlage nach dem
Nachtschlaf entnommen. Es wurde wiederum Blut von den gleichen Personen auf
die gleiche Weise nach 1 Stunde Umhergehen unter intravenöser Verabreichung
von 40 mg Furosemid entnommen. Das Blut wurde mit scharf abgekühlten
Kunststoffspritzen entnommen und in scharf abgekühlte, verfügbare siliconisierte
Glasröhren, die mit Aprotinin und EDTA gefüllt waren, gebracht. Es wurde
anschliessend für die Trennung des Plasmas zentrifugiert (500 x g). Die
Endkonzentrationen von Aprotinin und EDTA betrugen 1000 Kallikrein
Inaktivatoreinheiten (KIE)/ml bzw. 1 mg/ml.
Enzymimmunassay von α-hANP mit Hilfe des Sandwich-Verfahrens:
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Eine mit monoklonalem Anti-α-hANP-IgG&sub1; (KY-ANP-I) überzogene
Polystyrolkugel wurde in α-hANP-Standardlösung oder in Plasma (Gesamtvolumen
0,15 ml) gelegt, welches anschliessend 24 Stunden bei 4ºC stehen gelassen
wurde. Die α-hANP-Standardlösung wurde mit 10 mM Natriumphosphatpuffer
(pH 7,0; enthaltend 1 mg/ml Gelatine, 0,3 M Natriumchlorid, 0,2 mM Cystin,
1 mM EDTA, 1 mg/ml Natriumazid und 1000 KIE/ml Aprotinin) auf ein
Endvolumen von 0,15 ml verdünnt. Das Plasma (50 ul) wurde mit 0,1 ml 10 mM
Natriumphosphatpuffer (pH 7,0; enthaltend 1 mg/ml Gelatine, 0,4 M
Natriumchlorid, 0,3 mM Cystin, 1,5 mM EDTA, 1,5 mg/ml Natriumazid und 1000 KIE/ml
Aprotinin) gemischt.
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Nach Entfernen des flüssigen Teils von dem Reaktionsprodukt wurde die
Polystyrolkugel zweimal mit 2 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0;
enthaltend 0,1 M Natriumchlorid) gewaschen. Dann wurde die Kugel mit 50 ng
Kaninchen-Anti-α-hANP (17-28)-Fab'-Peroxidase-Konjugat, welches mittels
Affinitätschromatografie gereinigt worden war, und 0,15 ml 10 mM
Natriumphosphatpuffer (pH 8,0; enthaltend 1 mg/ml Gelatine, 0,2 mM Cystin und 1 mM
EDTA) gemischt, und man liess die Mischung 24 Stunden bei 4ºC stehen. Nach
Entfernen des flüssigen Teils wurde die Polystyrolkugel zweimal auf die
gleiche Weise, wie zuvor beschrieben, gewaschen und in eine andere
Teströhre gebracht. Für die Bestimmung der Aktivität der konjugierten
Peroxidase wurde die Fluoreszenzintensität gemessen, nachdem die konjugierte
Peroxidase 60 Minuten bei 30ºC mit 3-(4-Hydroxy-phenyl)-propionsäure,
welche als Substrat verwendet wurde, umgesetzt worden war. Die
Fluoreszenzintensität wurde, basierend auf 200 ng/ml Chinin/50 mM Schwefelsäure als
Grundlinie gemessen.
Spezifität:
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In dem EIA gemäss diesem Verfahren war die Standardverdünnungskurve
von α-hANP identisch mit denjenigen von α-hANP (4-28), α-hANP (5-28) und
α-hANP (7-28) , welches keine Wirkung N-terminaler Modifikationen anzeigte.
Andererseits verminderte die Deletion von C-terminalen Aminosäuren die
Reaktivität beträchtlich. Es wurde jedoch keine Reaktion mit Endfragmenten:
α-hANP (17-28) und α-hANP (1-6) beobachtet. Die Kreuzreaktionen mit β-hANP
und α-rANP betrugen 4,7 bzw. 0,01 % in bezug auf Molbasis. Diese
Ergebnisse stimmten mit der Spezifität der verwendeten Antikörper überein:
Monoklonales, auf der Polystyrolkugel immobilisiertes Maus-IgG&sub1; war spezifisch
zur N-terminalen Hälfte der Ringstruktur von α-hANP, wohingegen mit
Peroxidase konjugiertes Kaninchen-Fab' spezifisch zu α-hANP (17-28) war.
Einfluss von Plasma:
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Die in Abwesenheit von Plasma und α-hANP gemessene Aktivität von
gebundener Oxidase (unspezifische Bindung) entsprach der in Anwesenheit von
Plasma, welches mit 1 pMol monoklonalem Anti-α-hANP-IgG&sub1; (KY-ANP-I)
vorbehandelt war, gemessenen Peroxidaseaktivität. Die Gewinnung von zu Plasma,
welches 4,3 bis 332 pg/ml ANP enthielt, hinzugegebenem α-hANP (10 bis
200 pg/ml) betrug 81 bis 94 %. Die Verdünnungskurve von Plasma war parallel
zu der in Abwesenheit von Plasma erhaltenen Standardkurve von α-hANP, als
das Plasmavolumen pro Röhre im Bereich von 1 bis 50 ul lag. Somit wurde
wenig Plasmainterferenz beobachtet, als das verwendete Plasmavolumen 50 ul
oder weniger betrug. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Empfindlichkeit von EIA:
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Die Nachweisgrenze von α-hANP betrug 30 fg (10 aMol)/Röhre. Bei
Verwendung von 50 ul Plasma betrug das minimale Nachweisniveau von Plasma-
α-hANP 0,6 pg/ml (0,2 fMol/ml) . Diese Empfindlichkeit des EIA war sehr viel
grösser, um die 1- bis 2-fache Grössenordnung, als diejenige von
konventionellem RIA.
Reproduzierbarkeit von EIA:
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Die Reproduzierbarkeit dieser Erfindung wurde bei 5 verschiedenen
Niveaus über den Bereich von 5 bis 158 pg/ml α-hANP im Plasma bestimmt. Die
Variationskoeffizienten im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit für den
Innen-Assay und Zwischen-Assay betrugen 3,2 bis 9,4% (n = 20) bzw. 5,4 bis
12,0 %.
Plasma-α-hANP-Spiegel bei gesunden Erwachsenen im Grundzustand und
Blutvolumen-konzentriertem Zustand mittels EIA im Vergleich zu denjenigen
mittels RIA:
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Der mittels EIA bei gesunden Erwachsenen bestimmte Grund-Plasma-
α-hANP-Spiegel betrug 24,5 ± 5,9 pg/ml. Der plasma-α-hANP-Spiegel nahm im
Blutvolumen-konzentrierten Zustand nach 1-stündigem Gehen bei intravenöser
Verabreichung von Furosemid (40 mg) auf 15,3 ± 3,7 pg/ml ab. Die
gleichzeitig mittels RIA bestimmten Plasma-α-hANP-Spiegel betrugen 28,2 ± 5,7 pg/ml
bzw. 18,3 ± 3,2 pg/ml. Die folgende Beziehung wurde zwischen Messungen von
α-hANP mittels EIA (y) und RIA (x) festgestellt:
-
y = 0,78x + 1,3
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r = 0,92, n = 24
-
Wie aus den obigen Daten ersichtlich ist, ist EIA mittels des
Verfahrens dieser Erfindung so empfindlich, dass es selbst bei dem
Blutvolumenkonzentrierten Zustand möglich ist, die Plasma-α-hANP-Konzentration ohne
Extraktion zu messen.
Plasma-α-hANP-Spiegel bei Patienten mit Herzkrankheiten:
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Die mit dem α-hANP-Messreagens gemäss dieser Erfindung gemessenen
Plasma-α-hANP-Spiegel bei Patienten mit Herzkrankheiten sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1
Patient Nr.
Erhaltener Spiegel (pg/ml)
ANMERKUNG: Die Patienten 1 bis 3 litten an schwerem Herzversagen
Anwendung des Einstufen-Verfahrens bei EIA:
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Der EIA gemäss dieser Erfindung kann auch mittels des
Einstufen-Verfahrens durchgeführt werden. Fig. 3 zeigt die Standardkurve von α-hANP und
die Verdünnungskurven von Plasma mit Hilfe des Einstufen-Verfahrens. Bei
diesem Verfahren wurden hANP, Enzym-markierter Antikörper und mit
Antikörper überzogene Polystyrolkugeln alle gleichzeitig gemischt, und man liess
die Reaktion 24 Stunden bei 4ºC ablaufen.
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Die Peroxidase-(POD)-Aktivität wurde 30 Minuten bei 30ºC gemessen. Die
anderen Bedingungen waren die gleichen wie diejenigen des
Zweistufen-Verfahrens.