DE3485965T2 - Monoklonaler antikoerper mit spezifitaet gegen nur einen typ eines isozyms der schweren kette des menschlichen herzmyosins. - Google Patents

Monoklonaler antikoerper mit spezifitaet gegen nur einen typ eines isozyms der schweren kette des menschlichen herzmyosins.

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Description

    Hintergrund der Erfindung Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft neue monoklonale Antikörper mit einer hohen Spezifität für nur einen Isozym-Typ einer schweren Kette von menschlichem Herzmyosin.
  • In den letzten Jahren machte man Gebrauch von einem Verfahren zum Erhalt eines Antikörpers in großen Mengen und mit einer hohen Spezifität, das die Herstellung eines Hybridoms durch Verschmelzen einer Antikörper produzierenden Zelle mit einer Myelomzelle und das Züchten des so erhaltenen Hybridoms zwecks Herstellung eines monoklonalen Antikörpers umfaßt. (Milstein et al, Nature, Band 256, S. 495(1975)). Mittels dieser Methode wurden eine große Anzahl monoklonaler Antikörper erhalten.
    • Stand der Technik
  • Auf dem Gebiet der Muskelforschung werden schon seit langem Antikörper gegen Muskelproteine eingesetzt. Muskeln werden grob in zwei Gruppen unterteilt, nämlich die quergestreifte Muskulatur und die glatte Muskulatur. Quergestreifte Muskeln werden wiederum in Herzmuskeln und Skelettmuskeln unterteilt, wobei man bei den Skelettmuskeln wiederum zwischen schnellen und langsamen Muskeln unterscheidet. Es wurde darüber berichtet, daß diese aufgrund des Unterschieds in der Immunogenität der Myosinmoleküle, der Hauptbestandteile der Muskeln, immunchemisch unterschieden werden können (Masaki et al: J.Bio.Chem., Band 76, S. 441(1974)).
  • Vor kurzem wurde entdeckt, daß auch bei Herzmuskeln 2 Isozyme vorliegen, nämlich V&sub1;(α-Typ) mit einer hohen ATPase-Aktivität und V&sub3;(β-Typ) mit einer niederen ATPase-Aktivität(Yazaki et al: Circulation Research, Band 35, S. 15(1974); Hou et al J.Mol.Cell. Cardiol., Band 10, S. 1053(1978)). Allgemein gesprochen enthalten bei Tieren, wie Rindern, Hunden u. a., und bei Menschen die Atrialmuskeln in erster Linie V&sub1;(α-Typ), während die Ventrikularmuskeln im wesentlichen V&sub3;(β-Typ) enthalten. Demgemäß könnten, falls es möglich wäre, monoklonale Antikörper mit einer Spezifität nur für das α-Typ- oder nur für das β-Typ- Myosin herzustellen, die Atrial- und Ventrikularmuskeln mittels einer Methode, wie das Biotin-Avidin-System, spezifisch markiert werden. Ferner könnten diese Antikörper mit Radioisotopen markiert und für die Lokalisierung eines Herzinfarkts eingesetzt werden.
  • W.A.Clark et al immunisierten Mäuse und Ratten mit dem Herzmyosin von Hühnchen oder Kaninchen und erhielten monoklonale Antikörper, die mit schweren Ketten von Herzmyosin reagierten(Biochem. Biophys. Res. Commun.,Band 95, S. 1680). Sie berichteten, daß ein Klon unter den erhaltenen Klonen eine Spezifität für Hühnchen-Herzmuskeln hatte und nicht mit dem menschlichen Herzmuskel reagierte. Zwei weitere Klonen reagierten mit Herzmuskeln von Hühnchen, Kaninchen und Ratten, und auch mit dem menschlichen Herzmuskel, aber sie reagierten auch mit Skelettmuskeln und hatten daher keine Spezifität für Herzmuskeln. Diese Antikörper würden das speziell menschliche Herzmyosin vom α- oder β-Typ nicht erkennen.
  • Ferner immunisierten W.A.Clark et al Mäuse mit Herzmyosin von Hühnchen oder Kaninchen und erhielten monoklonale Antikörper, die mit dem Herzmyosin und der Kette von V&sub1;-Typ und mit der schweren Kette des Herzmyosins vom V&sub3;-Typ reagierten(J.Biol.Chem., Band 257, S. 5449(1982)). Es wurde jedoch gezeigt, daß diese Antikörper auch gegenseitig eine hohe Kreuzreaktivität zwischen den Isozymen derselben aufweisen, und bezüglich einer Spezifität für menschliches Herzmyosin läßt sich daraus nichts ableiten.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde vor dem oben beschriebenen technischen Hintergrund gemacht und stellt monoklonale Antikörper mit einer Spezifität für nur einen Isozym-Typ der schweren Kette des menschlichen Herzmyosins zur Verfügung.
  • Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper zur Verfügung, die eine Spezifität für entweder das α-Typ-Isozym oder das β-Typ-Isozym einer schweren Kette des menschlichen Herzmyosins aufweisen, aber das Isozym des jeweiligen anderen Typs nicht erkennen.
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung ist geeignet als Reaktionsmittel und spielt in der biochemischen und pathologischen Forschung bezüglich Herzmuskulatur, wie oben beschrieben, eine wichtige Rolle. Außerdem kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung mit Radioisotopen, wie Technetium 99m, Indium usw. markiert und für die Immunerkennung(immunodetection) eingesetzt werden, wobei er nach Verabreichung an den Patienten durch ein Gesamtkörper-gamma-scintigramm gemessen wird, wodurch ein Lokalisieren eines Herzinfarkts möglich gemacht wird. Er ist vor allem bei der Diagnose eines Atrialinfarkts, der zusammen mit einem Ventrikularinfarkt auftreten kann, von Bedeutung. Man hält auch die Feststellung einer Absonderung der schweren Kette des Myosins in das Blut während eines Herzinfarkts mittels Durchführung eines Immunoassayverfahrens mit dem Antikörper der Erfindung für möglich. Demgemäß kann der erfindungsgemäße Antikörper auch für die Prognose eines Herzinfarkts von Nutzen sein.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 1 bis 6 stellen mittels eines Fluoreszenzmikroskops gemachte Aufnahmen von Abschnitten des mit einem Antikörper der vorliegenden Erfindung markierten menschlichen Atrialmuskels oder Ventrikularmuskels dar. Fig. 1 zeigt einen normalen Atrialmuskel, der mit dem mittels der CMA-19 Zell-Linie hergestellten Antikörper markiert ist, Fig. 2 zeigt entsprechend einen normalen ventrikularen Muskel, Fig. 3 zeigt entsprechend einen normalen mit dem mittels HMC-14 Zell-Linie hergestellten Antikörper markierten Ventrikularmuskel, Fig. 4 zeigt entsprechend einen normalen Atrialmuskel, Fig. 5 zeigt einen Atrialmuskel eines Patienten mit Herzklappenfehler, der mit dem mittels der HMC-14 Zell-Linie hergestellten Antikörper markiert ist, und Fig. 6 zeigt einen Atrialmuskel eines Patienten mit Herzklappenfehler, der mit dem mittels CMA-19 Zell-Linie hergestellten Antikörper markiert ist; und
  • Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen dem Atrialdruck und dem Anteil an V&sub3;-Myosinisozym(β-Typ) in einem Atrialmuskel gemäß der Gewebsmarkierung unter Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung wiedergibt.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung läßt sich von den aus dem Stand der Technik bekannten Antikörpern dadurch unterscheiden, daß er die Eigenschaft hat, entweder ein Isozym des α-Typs oder ein Isozym des β-Typs der schweren Kette des menschlichen Herzmyosins erkennen zu können. Diese besondere Spezifität für ein Isozym bedeutet, daß der Antikörper den anderen Isozym-Typ nicht erkennt.
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung ist nicht auf eine bestimmte Methode oder Form der Herstellung festgelegt, sondern die geeignete Art der Herstellung kann je nach Bestimmungszweck gewählt werden. Das den Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugende Hybridom kann durch Anwendung der allgemein üblichen Zellverschmelzungsmethode erhalten werden. Diese Zellverschmelzungsmethode wird nachstehend beschrieben.
    • (1) Herstellung der Antikörper produzierenden Zellen
  • Die Antikörper produzierenden Zellen werden hergestellt, indem ein artfremdes Tier, z. B. eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Schaf, ein Pferd, ein Rind usw. mit einem menschlichen Atrialmyosin(α-Typ), einem menschlichem Ventrikularmyosin(β-Typ) oder einem Herzmyosin, das aus Rindern, Pferden oder Schweinen gewonnen wurde und in immunchemischer Hinsicht dem α- Typ oder β-Typ des menschlichen Herzmyosins entspricht, immunisiert wird, und indem Antikörper produzierende Zellen aus Milzzellen, Thymozyten, Lymphknotenzellen und/oder aus aus dem peripheren Blutkreislauf stammenden Lymphozyten entnommen werden.
    • (2) Herstellung von Myelomzellen
  • Als Myelomzellen können aus verschiedenen Tieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen und aus Menschen gewonnene Zell-Linien verwendet werden. Die einzusetzende Zell-Linie sollte vorzugsweise gegen einen Hemmstoff(drug) resistent, in einem selektiven Medium nicht lebensfähig, aber nach der Verschmelzung lebensfähig sein. Die am meisten verwendete Zell-Linie ist eine 8-Azaguanin-resistente Zell-Linie, die in bezug auf Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase Mangelmutation zeigt und in einem Hypoxanthin-Aminoputerin-Thymidin(HAT)-Medium nicht gezüchtet werden kann. Die Zell-Linie ist vorzugsweise auch vom "Nicht-Ausscheidungs"(non-secretor)-Typ. Typische Beispiele für solche Zell-Linien sind P&sub3;/x63-Ag 8 U&sub1;(P&sub3;U&sub1;), P&sub3;/x63-Ag/8 6.5.3.(X63.6.5.3), P&sub3;/NSI-1-Ag 4 - 1(NS-1), Sp210-Ag14 (SP2), abgeleitet aus der Mausmyelom MOPC-21-Zell-Linie. Das Rattenmyelom 210 RCY 3 Ag 1.2.3(Y3 Ag 1.2.3), und das menschliche Myelom U-266-AR&sub1;, und GM 1500 stehen ebenfalls zur Verfügung.
    • (3) Zellverschmelzung
  • Die Zellverschmelzung kann durch Mischen von 10&sup7; bis 10&sup8; Myelomzellen mit Antikörper produzierenden Zellen bei einem Mischungsverhältnis von 1 : 4 bis 1 : 10 in einem Medium zum Züchten von Tierzellen, wie z. B. "Eagle's minimum essential medium"(MEM) und RPMI 1640 erfolgen. Als Verschmelzungshilfsmittel kann man ein Polyäthylenglykol(PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1 000 bis 6000, einen Polyvinylalkohol, ein Virus oder ähnliches einsetzen.
    • (4) Die Selektion des Hybridoms in einem selektiven Medium
  • Die Selektion des Hybridoms aus den Zellen nach der Zellverschmelzung läßt sich durch selektives Wachstum in einem selektiven Medium durchführen. Die Zellen werden z. B. geeigneterweise mit z. B. RPMI 1640 Medium, enthaltend 15% Serum eines Kalbfötus, verdünnt und auf eine Mikrotiterplatte aufgebracht, so daß sich ca. 10&sup5; bis 10&sup6; Zellen in jeder Vertiefung befinden, ein selektives Medium(z. B., HAT-Medium) wird in jede Vertiefung gegeben, woraufhin man das selektive Medium durch ein geeignetes anderes Medium austauscht.
  • Wenn beispielsweise eine 8-Azaguanin-resistente Zell-Linie als Myelomzelle und ein HAT-Medium als selektives Medium eingesetzt werden, dann sterben nicht-verschmolzene Myelomzellen am ca. 10.Tag nach dem Züchten ab und die Antikörper produzierenden Zellen können über einen längeren Zeitraum in-vitro nicht gezüchtet werden. Demgemäß sind alle Zellen, die zwischen dem 10. und 14.Tag gezüchtet wurden, Hybridome.
    • (5) Erkennen von Hybridomen, die einen Antikörper für die schwere Kette des Herzmyosins vom α-Typ und einen Antikörper für die schwere Kette des Herzmyosins vom β-Typ produzieren.
  • Das Erkennen von Hybridomen, die einen Antikörper für die schwere Kette des Herzmyosins vom α-Typ und einen Antikörper für die schwere Kette des Herzmyosins vom β-Typ produzieren, wird nach der "Enzyme Linked Immunosorbent Assay"-Methode, nachstehend "ELISA" genannt, durchgeführt.
  • Genauer gesagt eine schwere Kette des Herzmyosins vom α-Typ, wie z. B. das Atrialmyosin vom Rind oder eine schwere Kette des Herzmyosins vom β-Typ, wie ein menschliches Ventrikularmyosin wird zuerst in einer Pufferlösung, wie einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung(PBS) oder Natriumhydrogencarbonat (pH: 8,0), auf 10 bis 100 ug/ml gelöst; Anteilsmengen von jeweils 50 ul werden auf eine weiche Platte(96 Vertiefungen), wie eine Polyvinylchlorid(PVC)-Platte für ELISA aufgebracht; dann läßt man die Platte bei 4ºC über Nacht stehen. Daraufhin wird das Antigen entfernt und nach dem Waschen mit PBS wird PBS-haltiges 1%-Rinderserum Albumin(BSA) zugegeben und die Mischung läßt man bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen, um die Stellen, an welche kein Antigen gebunden ist, mit BSA zu blockieren. Mengenanteile von je 50 ul aus dem Überstand jeder Vertiefung werden zugegeben, bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dreimal mit PBS gewaschen. Dann wird ein Biotinyl- Antimaus-Immunglobulinserum(zweiter Antikörper) zugegeben und man läßt die Mischung bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wird ein Avidin-D-Enzymkomplex zugegeben, und die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang stehen gelassen. Nach viermaligem Waschen mit PBS, wird die optische Dichte durch Zugabe des Substrats für das Enzym gemessen.
  • Die Vertiefung, die einen monoklonalen Antikörper mit einer Spezifität für das Antigen enthält, läßt sich nach dem oben beschriebenen Verfahren leicht feststellen, so daß das Erkennen eines Hybridoms ermöglicht wird.
    • (6) Klonen
  • In jeder Vertiefung können zwei oder mehrere Arten von Hybridomen enthalten sein, und deshalb wird das Klonen beispielsweise gemäß der Methode der eingeschränkten Verdünnung zwecks Erhalt eines einen monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoms durchgeführt.
    • (7) Herstellung des Antikörpers
  • Der reinste monoklonale Antikörper läßt sich dadurch herstellen, daß man das den genannten Antikörper erzeugende Hybridom in einem Medium zum Züchten von Tierzellen, wie einem RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 bis 15% Serum eines Kalbfötus, oder in einem serumfreien Medium züchtet und den Antikörper aus dem Überstand gewinnt. Was die Methode und die Bedingungen der Zellzüchtung betrifft, so können die üblicherweise bei Tierzellzüchtungsverfahren angewandten Methoden und Bedingungen eingesetzt werden.
  • Andererseits kann, um Antikörper in größeren Mengen herzustellen, eine Methode Anwendung finden, bei welcher nach intraperitonealer Verabreichung eines Mineralöls, wie z. B. Pristan(2,6,10,14-Tetramethylpentadekan) an artgleiche Tiere, aus welchen das ursprüngliche Myelom des Hybridoms gewonnen wurde, das Hybridom intraperitoneal injiziert wird, um sich dort in großen Mengen zu vermehren. Hybridome wachsen in Aszites-Tumoren innerhalb 10 bis 18 Tage, wobei Antikörper in hohen Konzentrationen in Serum und Aszitesflüssigkeit erzeugt werden(ca. 1 bis 20 mg/ml). Wenn eine Reinigung erforderlich ist, dann kann diese nach einer Ammoniumsulfatfraktionierung durch ein Verfahren, wie z. B. der DEAE-Zellulose-Ionenaustausch-Säulenchromatographie, der Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung von Sepharose 4B mit einem daran gebundenen Herzmyosin o. ä., oder der Gelfiltrations-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
  • Beispiele für bevorzugte Hybridome zur Herstellung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung, die bis jetzt erhalten worden sind, sind die Hybridom CMA-10-Zell-Linie als die den Antikörper mit einer Spezifität für die schwere Kette des Herzmyosins von α-Typ erzeugende Zell-Linie und die HMC-14-Zell-Linie, die HMC-48-Zell-Linie und die HMC-50-Zell-Linie als die den Antikörper mit einer Spezifität für die schwere Kette des Herzmyosins von β-Typ erzeugende Zell-Linie.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Die Methode zur Herstellung dieser Hybridome und die Eigenschaften des Antikörpers der vorliegenden Erfindung werden nachstehend in allen Einzelheiten beschrieben.
    • I. Das Gewinnen des Hybridoms
  • Atrialmyosin vom Rind(1 mg/ml) oder menschliches Ventrikularmyosin (1 mg/ml) wird in einer physiologischen Natriumchloridlösung gelöst und mit einem vollständigen Freund's Adjuvans in einem Verhältnis von 1 : 1 vermischt, um eine Emulsion zu erhalten. Die Emulsion wird intraperitoneal einer BALB/C-Maus(weiblich, 6 Wochen alt) mehrmals in Abständen von 2 Wochen(50 ug/Kopf) verabreicht, und schließlich werden 30 ug Atrialmyosin vom Rind oder menschliches Ventrikularmyosin intravenös verabreicht.
  • Drei Tage nach der letzten Immunisierung, werden Milzzellen aus der Maus entnommen und mit MEM gewaschen. Das Mausmyelom P&sub3;U&sub1; wird mit MEM gewaschen und mit den Milzzellen in einem Verhältnis von 10 : 1 gemischt. Nach dem Zentrifugieren wird nach und nach 1 ml einer 50%-igen PEG 1000-MEM-Lösung zu einem so erhaltenen Kügelchen oder Kuchen zugegeben, um eine Zellverschmelzung durchzuführen. Außerdem wird die MEM-Lösung allmählich zugegeben, um eine Endmenge von 10 ml zu erhalten. Dann wird wieder zentrifugiert und das Kügelchen wird in RPMI 1640-Medium, enthaltend 15% Serum eines Kalbfötus, auf 1 · 10&sup5; Zellen/0,1 ml als P&sub3;U&sub1; suspendiert und über eine 96 Vertiefungen aufweisende Mikroplatte in 0,1 ml pro Vertiefung gesprüht.
  • Einen Tag später werden Anteilsmengen von je 0,1 ml an HAT-Medium zugegeben und daraufhin wird das Medium alle 3 bis 4 Tage mit frischem HAT-Medium erneuert. Ungefähr am 7.Tag läßt sich in einigen der Vertiefungen das Wachstum von Hybridomen feststellen.
  • Anteilsmengen von jeweils 50 ul des flüssigen Überstands an Stellen, wo Hybridome gewachsen sind, werden auf eine weiche Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, die vorher mit einem Atrialmyosin eines Rindes(α-Typ) oder einem menschlichen Ventrikularmyosin(β-Typ) bedeckt worden ist.
  • Unter Verwendung von Avidin-D-Peroxidase(hergestellt von der Firma Vector Co.) als Avidin-D-Enzym-Konjugat, Wasserstoffperoxid, 4-Aminoantipyrin und Phenol als Substrat und einem chromogenen Wirkstoff gemäß der oben beschriebenen ELISA-Methode, werden diejenigen Überstände, die mit dem Atrialmyosin des Rindes, aber nicht mit dem menschlichen Ventrikularmyosin reagieren(ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für eine schwere Kette des Herzmyosins vom α-Typ ist in diesem Überstand enthalten) und diejenigen Überstände, die mit dem Ventrikularmyosin, aber nicht mit dem Atrialmyosin des Rindes reagieren(ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für eine schwere Kette des Herzmyosins von β-Typ ist in diesen Überständen enthalten), ausgewählt und die Hybridome werden mittels der Methode der eingeschränkten Verdünnung geklont.
  • Als Ergebnis werden ein Hybridom der CMA-19 Zell-Linie, das einen Antikörper mit einer Spezifität für eine schwere Kette eines Herzmyosins vom α-Typ erzeugt, und ein Hybridom der HMC- 14 Zell-Linie, der HMC-48 Zell-Linie und der HMC-50 Zell-Linie, das einen Antikörper mit einer Spezifität für eine schwere Kette eines Herzmyosins vom β-Typ erzeugt, erhalten.
    • II. Herstellung des monoklonalen Antikörpers
  • Jedes der Hybridome der CMA-19-Zell-Linie, der HMC-14-Zell-Linie, der HMC-48 Zell-Linie und der HMC-50-Zell-Linie werden in einem RPMI 1640 Medium, enthaltend 15 % Serum eines Kalbfötus auf einer 96 Vertiefungen enthaltenden Platte,dann jeweils in Flaschen mit 25 cm² bzw. 75 cm² Bodenfläche gezüchtet, und die Überstände der Zellkulturen werden gesammelt.
  • Die Titer an dem Anti-Herzmyosin-Antikörper in jedem Überstand werden mittels der ELISA-Methode bestimmt und die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse werden erhalten. Der Titer wird ausgedrückt als Verdünnungsgröße der Antikörperprobe aus der Originallösung, die 50%, bezogen auf 100%, der Extinktion zeigt, die mittels der ELISA-Methode für die Probe erhalten wird, in welcher eine ausreichende Menge an Antikörper in bezug auf das aufgetragene Antigen vorliegt. Tabelle 1 Hybridon-Zell-Linie Titer bezüglich des Herzmuskelmyosins vom Rind Titer bezüglich des menschlichen Herzmuskelmyosins
  • Diese Antikörper zeigten praktisch keine Kreuzreaktionsfähigkeit mit dem menschlichen Skelettmuskel
    • III. Bestimmung einer Unterklasse des Antikörpers
  • Eine weiche Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wird mit jedem monoklonalen Antikörper überzogen und, nach dem Blockieren mit 1% BSA enthaltendem PBS, werden die Reaktionen mit dem Anti-IgA- Antikörper, mit dem Anti-IgG&sub1;-Antikörper, dem Anti-IgG2a-Antikörper, dem Anti-IgG2b-Antikörper, dem Anti-IgG&sub3;-Antikörper und dem Anti-IgM-Antikörper mittels eines MONOBID EIA KIT(hergestellt von der Firma ZYMED Co.) zur Bestimmung der Unterklasse jedes monoklonalen Antikörpers beobachtet.
  • Das Ergebnis zeigt, daß der mittels der CMA-19-Zell-Linie erhaltene Antikörper IgG&sub1;/k ist, der mittels der HMC-14-Zell-Linie erhaltene Antikörper IgG2a/k ist, und die mittels der HMC- 48-Zell-Linie und der HMC-50-Zell-Linie erhaltenen Antikörper IgG2b/k sind.
    • IV.Gewebsmarkierung mit dem Antikörper vorliegender Erfindung
  • Nachdem während einer Operation am offenen Herzen, bei der Herzklappen ausgewechselt werden usw., Gewebsproben eines menschlichen Atrial- und Ventrikularmuskels entnommen worden sind, werden diese mittels Tissue-TEK II fixiert, und Gewebsabschnitte mittels eines Kryostatverfahrens präpariert.
  • Diese Abschnitte werden mittels des Antikörpers der vorliegenden Erfindung nach dem Biotin-Avidin-System markiert.
  • Genauer gesagt, wird jeder Abschnitt mit dem Antikörper vorliegender Erfindung als ersten Antikörper in PBS(0,01 M, pH-Wert 7,2) bei 37ºC 40 Minuten lang inkubiert. Dann wird nach nochmaligem Waschen die Inkubation mit Biotinyl-Antimaus-IgG-Antikörper(TAGO Co., verwendet in 20-facher Verdünnung nach der Absorption mit menschlichem Leberhomogenat und Serum) als zweitem Antikörper in entsprechender Weise durchgeführt. Dann wird nach weiterem Waschen die Inkubation mit durch Fluorescein-Isothiocyanat markiertem Avidin(E.Y. Laboratories Co., verwendet in 20-facher Verdünnung nach Absorption mit menschlichem Leberhomogenat und Serum) in entsprechender Weise durchgeführt. Diese Probe wird gewaschen und mit Glycerin versiegelt, um eine fluoreszierende Markierungsprobe zu erhalten.
  • Diese Proben werden unter dem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht. Das Ergebnis zeigt, daß bei Verwendung des durch die CMA-19- Zell-Linie hergestellten Antikörpers 95 bis 96% der Zellen im normalen Atrialmuskel markiert sind(siehe Fig. 1), aber daß weniger als 10% der Ventrikularmuskelzellen markiert sind (siehe Fig. 2). Andererseits sind bei Verwendung der HMC-14-Zell-Linie 100% der Ventrikularmuskelzellen markiert(Fig. 3), aber nur 20 bis 30% der Atrialmuskelzellen sind markiert(siehe Fig. 4).(20 bis 30% des normalen Atrialmuskels liegen in Form von αβ-Typen vor).
  • Im Gegensatz dazu sind im Herzmuskel eines Patienten mit Herzklappenfehler die mit dem mittels der HMC-14-Zell-Linie hergestellten Antikörper markierten Zellen im Atrialmuskel vermehrt vorhanden(siehe Fig. 5), und die mit dem mittels der CMA-19- Zell-Linie hergestellten Antikörper markierten Abschnitte sind in entsprechend reduzierter Form vorhanden(vgl.Fig. 6). Dieses Phänomen läßt auf das Auftreten eines isozymen Wechsels vom α- Typ zum β-Typ im Atrialmyosin bei Herzklappenfehlern schließen.
  • Ferner wird die Beziehung zwischen dem Atrialdruck und dem Verhältnis von V&sub3;-Myosinisozym(β-Typ) in einem Atrialmuskel mittels Gewebsmarkierung unter Verwendung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung untersucht, woraufhin das in Fig. 7 gezeigte Ergebnis erhalten wird. Das bedeutet, daß in einem normalen Atrialmuskel der Atrialdruck 5 mmHg oder weniger beträgt und der Gehalt an β-Typ-Isozym nur 10% oder weniger ausmacht. Andererseits beträgt bei einem Patienten mit einem Herzklappenfehler der Atrialdruck 10 mmHg oder mehr und das Isozymmuster des Atrialmuskelmyosins ist in bezug auf den α-Typ reduziert und in bezug auf den β-Typ erhöht.

Claims (2)

1. Ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für ein α- Typ-Isozym einer schweren Kette von menschlichem Herzmyosin, welcher jedoch ein β-Typ-Isozym einer schweren Kette von menschlichem Herzmyosin nicht erkennt.
2. Ein monoklonaler Antikörper mit einer Spezifität für ein β- Typ-Isozym einer schweren Kette von menschlichem Herzmyosin welcher ein α-Typ-Isozym einer schweren Kette von menschlichem Herzmyosin nicht erkennt.
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