JPH0625762B2 - ミオシン軽鎖の測定法 - Google Patents
ミオシン軽鎖の測定法Info
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- JPH0625762B2 JPH0625762B2 JP60129037A JP12903785A JPH0625762B2 JP H0625762 B2 JPH0625762 B2 JP H0625762B2 JP 60129037 A JP60129037 A JP 60129037A JP 12903785 A JP12903785 A JP 12903785A JP H0625762 B2 JPH0625762 B2 JP H0625762B2
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- myosin
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血中の遊離ミオシン軽鎖を免疫学的に測定す
る方法に関するものである。
る方法に関するものである。
La Dueらにより急性心筋梗塞の患者血清においてグルタ
ミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）活
性が上昇することが報告され（J.S.La Due et al,Scien
ce,Vol,１２０，ｐ４９７（１９５４））、その後虚血
による心筋障害によつて心筋細胞から血中に流出する酵
素活性を測定することにより、心筋梗塞を生化学的に診
断する方法が次々と開発されるようになつた。
ミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）活
性が上昇することが報告され（J.S.La Due et al,Scien
ce,Vol,１２０，ｐ４９７（１９５４））、その後虚血
による心筋障害によつて心筋細胞から血中に流出する酵
素活性を測定することにより、心筋梗塞を生化学的に診
断する方法が次々と開発されるようになつた。
なかでも、ＧＯＴ、乳酸脱水素酸素（ＬＤＨ）、クレア
チニンフオスフオキナーゼ（ＣＰＫ）などは活性測定が
比較的容易であり、急性心筋梗塞患者の血清の９０％以
上で酵素活性が上昇することが示されている（Ｎ．Ｓ．
Sarensen,Acta.Med.Scand.,Vol.１７４，ｐ７２５（１
９６３））。また、生化学的診断法は、心筋梗塞の診断
ばかりでなく、治療の評価や予後の判定の観点から梗塞
心筋量を算定する方法としても注目されるようになつ
た。
チニンフオスフオキナーゼ（ＣＰＫ）などは活性測定が
比較的容易であり、急性心筋梗塞患者の血清の９０％以
上で酵素活性が上昇することが示されている（Ｎ．Ｓ．
Sarensen,Acta.Med.Scand.,Vol.１７４，ｐ７２５（１
９６３））。また、生化学的診断法は、心筋梗塞の診断
ばかりでなく、治療の評価や予後の判定の観点から梗塞
心筋量を算定する方法としても注目されるようになつ
た。
しかしながら、これらの生化学的診断法には、標的酵
素には他の臓器から流出してくるアイソザイムが存在す
るために特異性に問題がある、梗塞部心筋からの血中
への酵素の流出率と心筋梗塞の程度との相関が明らかで
ない、最近、心筋梗塞の治療に用いられるようになつ
てウロキナーゼ、テイシユプラスミノーゲンアクテイベ
ーターなどの血栓溶解剤がこれらの細胞質酵素を一度に
血流中に流い出してしまうため（ウオツシユ・アウト効
果）、これらの薬剤使用時には梗塞心筋量との相関がな
くなるなどの問題がある。
素には他の臓器から流出してくるアイソザイムが存在す
るために特異性に問題がある、梗塞部心筋からの血中
への酵素の流出率と心筋梗塞の程度との相関が明らかで
ない、最近、心筋梗塞の治療に用いられるようになつ
てウロキナーゼ、テイシユプラスミノーゲンアクテイベ
ーターなどの血栓溶解剤がこれらの細胞質酵素を一度に
血流中に流い出してしまうため（ウオツシユ・アウト効
果）、これらの薬剤使用時には梗塞心筋量との相関がな
くなるなどの問題がある。
このような従来の生化学的診断法に代りうる心筋梗塞の
診断において新しい指標となりうるマーカーの１つとし
て心筋ミオシンが注目されている。心筋ミオシン分子
は、心筋細胞構成蛋白質の中で最も多量に存在し（約６
０％）、筋肉の収縮機序の中心的役割を担つている分子
量約５０万の構造蛋白質であり、分子量２０万の重鎖、
分子量２万７０００の軽鎖Ｉ（ＬＩ）および分子量２万
の軽鎖II（ＬII）のサブユニツトから構成されている。
心筋ミオシン軽鎖ないしそのフラグメントは、虚血によ
る心筋障害時の細胞膜の破壊に伴い、血中に放出される
ため、虚血による心筋細胞の崩壊過程を直接反映するも
のと考えられる。このことは、心筋ミオシン軽鎖に対す
るウサギ抗血清を用いたラジオイムノアツセイにより証
明され（Ｒ．Nagai et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,Vol.８６，ｐ６８３（１９７９））、臨床的にも心
筋梗塞の特異的な診断法として応用されうることが報告
されている（永井良三ら、日本内科学雑誌，第７０巻、
第１６頁（１９８１）Katus et al,Am.J.Cardiol.,Vol.
５４．ｐｐ９６４−９７０（１９８４））。
診断において新しい指標となりうるマーカーの１つとし
て心筋ミオシンが注目されている。心筋ミオシン分子
は、心筋細胞構成蛋白質の中で最も多量に存在し（約６
０％）、筋肉の収縮機序の中心的役割を担つている分子
量約５０万の構造蛋白質であり、分子量２０万の重鎖、
分子量２万７０００の軽鎖Ｉ（ＬＩ）および分子量２万
の軽鎖II（ＬII）のサブユニツトから構成されている。
心筋ミオシン軽鎖ないしそのフラグメントは、虚血によ
る心筋障害時の細胞膜の破壊に伴い、血中に放出される
ため、虚血による心筋細胞の崩壊過程を直接反映するも
のと考えられる。このことは、心筋ミオシン軽鎖に対す
るウサギ抗血清を用いたラジオイムノアツセイにより証
明され（Ｒ．Nagai et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,Vol.８６，ｐ６８３（１９７９））、臨床的にも心
筋梗塞の特異的な診断法として応用されうることが報告
されている（永井良三ら、日本内科学雑誌，第７０巻、
第１６頁（１９８１）Katus et al,Am.J.Cardiol.,Vol.
５４．ｐｐ９６４−９７０（１９８４））。
心筋ミオシン軽鎖は、虚血による心筋障害時に血中に流
出してくる指標物質として次のような特徴がある。
出してくる指標物質として次のような特徴がある。
心筋ミオシンは心筋細胞内に構造蛋白質とし最も多量
に存在する。
に存在する。
心筋ミオシンは重鎖と軽鎖のサブユニツトからなり、
pHの変化などによりミオシン分子から容易に解離し、分
子量の小さい軽鎖は細胞外に遊離しやすい。
pHの変化などによりミオシン分子から容易に解離し、分
子量の小さい軽鎖は細胞外に遊離しやすい。
心筋ミオシン軽鎖はチオール基の含有量が少なく、生
化学的に安定な蛋白質であり、組織や血清に存在する蛋
白分解酵素の作用も受けにくい。
化学的に安定な蛋白質であり、組織や血清に存在する蛋
白分解酵素の作用も受けにくい。
ウロキナーゼなどの血栓溶解剤を投薬した患者におい
てもＣＰＫなどのようなウツシユ・アウト効果の影響を
受けることがなく、血中濃度の経時的変化と虚血による
心筋細胞の崩壊過程のパターンが一致する。
てもＣＰＫなどのようなウツシユ・アウト効果の影響を
受けることがなく、血中濃度の経時的変化と虚血による
心筋細胞の崩壊過程のパターンが一致する。
心筋ミオシン軽鎖の免疫学的測定法をヒト心筋ミオシン
軽鎖に対する抗血清を用いて行う方法としては、上記の
ほか次のような報告がある。
軽鎖に対する抗血清を用いて行う方法としては、上記の
ほか次のような報告がある。
・Trahern et al,Am.J.Cardiol.,Vol.４１，NO.４，pp6
４１−６４５（１９７８） ・Khaw et al,Circulation,Vol.５８，pp1１３０−１１
３６（１９７９） ・Katus et al,Circulation,Vol,６０（Suppl.II)ｐ１
３９（１９７９） さらに、免疫学的測定法において抗体として心筋ミオシ
ンに対するモノクローナル抗体を応用した方法に関する
報告もなされている。
４１−６４５（１９７８） ・Khaw et al,Circulation,Vol.５８，pp1１３０−１１
３６（１９７９） ・Katus et al,Circulation,Vol,６０（Suppl.II)ｐ１
３９（１９７９） さらに、免疫学的測定法において抗体として心筋ミオシ
ンに対するモノクローナル抗体を応用した方法に関する
報告もなされている。
・Haber et al,J.Mol.Cell.Cardiol.,Vol.１４，Suppl.
3,pp１３９−１４６（１９８２） ・Katus et al,Molecular Immunolgy,Vol.１９，NO.
３，pp4５１−４５５（１９８２） 心筋ミオシン軽鎖の免疫学的測定法において、抗体試薬
として心筋ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体を
用いる方法は、抗血清を用いる方法に比べて、抗体が
心筋ミオシン軽鎖に対して特異性が高く、骨格筋ミオシ
ン軽鎖との交叉反応が少ない、特異性の高い抗体の大
量かつ継続的供給が可能であるなどの利点を有し、心筋
ミオシン軽鎖の測定による心筋梗塞の診断の実用化によ
り適している。
3,pp１３９−１４６（１９８２） ・Katus et al,Molecular Immunolgy,Vol.１９，NO.
３，pp4５１−４５５（１９８２） 心筋ミオシン軽鎖の免疫学的測定法において、抗体試薬
として心筋ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体を
用いる方法は、抗血清を用いる方法に比べて、抗体が
心筋ミオシン軽鎖に対して特異性が高く、骨格筋ミオシ
ン軽鎖との交叉反応が少ない、特異性の高い抗体の大
量かつ継続的供給が可能であるなどの利点を有し、心筋
ミオシン軽鎖の測定による心筋梗塞の診断の実用化によ
り適している。
一方、多発性筋炎やDuchenne型筋ジストロフイー症など
の骨格筋疾患においても心筋疾患と同様に骨格筋ミオシ
ン軽鎖が患者の血中に流出し、筋組織崩壊の指標となる
ことが骨格筋ミオシン軽鎖との交叉反応性の大きい抗心
筋ミオシン軽鎖抗体を用いたラジオイムノアツセイによ
つて判明している（日本臨牀、第４０巻、秋季臨時増刊
号、第１０７−１１１頁（１９８２））。しかしなが
ら、その免疫学的測定法は確立されていない。
の骨格筋疾患においても心筋疾患と同様に骨格筋ミオシ
ン軽鎖が患者の血中に流出し、筋組織崩壊の指標となる
ことが骨格筋ミオシン軽鎖との交叉反応性の大きい抗心
筋ミオシン軽鎖抗体を用いたラジオイムノアツセイによ
つて判明している（日本臨牀、第４０巻、秋季臨時増刊
号、第１０７−１１１頁（１９８２））。しかしなが
ら、その免疫学的測定法は確立されていない。
従来のモノクローナル抗体を利用した心筋ミオシン軽鎖
の免疫学的測定法においては、精製単離された心筋ミ
オシン軽鎖を用いて取得されるモノクローナル抗体は、
精製単離された心筋ミオシン軽鎖に対しては結合能を示
すが、その多くはヒト心筋梗塞患者の血中に存在する心
筋ミオシン軽鎖とは結合しないことが本発明者らの実験
により確かめられたが、このようなヒト血清中ミオシン
軽鎖における測定可能性の検討がなされていない、標
準物質または標準物質および標識心筋ミオシン軽鎖の心
筋ミオシン軽鎖としてヒト由来のものを用いているた
め、これらの免疫測定系を診断薬として実用化する場
合、心筋ミオシン軽鎖の調製が困難であるなどの問題点
を有していた。
の免疫学的測定法においては、精製単離された心筋ミ
オシン軽鎖を用いて取得されるモノクローナル抗体は、
精製単離された心筋ミオシン軽鎖に対しては結合能を示
すが、その多くはヒト心筋梗塞患者の血中に存在する心
筋ミオシン軽鎖とは結合しないことが本発明者らの実験
により確かめられたが、このようなヒト血清中ミオシン
軽鎖における測定可能性の検討がなされていない、標
準物質または標準物質および標識心筋ミオシン軽鎖の心
筋ミオシン軽鎖としてヒト由来のものを用いているた
め、これらの免疫測定系を診断薬として実用化する場
合、心筋ミオシン軽鎖の調製が困難であるなどの問題点
を有していた。
本発明はこれらのミオシン軽鎖の免疫学的測定法を心筋
梗塞や骨格筋疾患の診断法として確立する上での問題点
を解決しようとするものである。
梗塞や骨格筋疾患の診断法として確立する上での問題点
を解決しようとするものである。
本発明者らは、筋疾患の診断法として実用化しうるミオ
シン軽鎖の免疫学的測定法を確立すべく種々研究を重ね
た結果、抗体試薬としてヒトミオシン軽鎖および一種以
上の異種動物のミオシン軽鎖に反応し、かつヒト血清中
のミオシン軽鎖とも反応するミオシン軽鎖に対するモノ
クローナル抗体を用い、さらに抗原試薬として該モノク
ローナル抗体との反応性がヒトミオシン軽鎖と同等であ
る異種動物のミオシン軽鎖を用いることにより、従来の
モノクローナル抗体を使用したミオシン軽鎖の免疫学的
測定法の問題点を克服し、極めて実用的かつ有意義なミ
オシン軽鎖の免疫学的測定システムを組み立てることが
できることを見いだし、本発明を完成した。
シン軽鎖の免疫学的測定法を確立すべく種々研究を重ね
た結果、抗体試薬としてヒトミオシン軽鎖および一種以
上の異種動物のミオシン軽鎖に反応し、かつヒト血清中
のミオシン軽鎖とも反応するミオシン軽鎖に対するモノ
クローナル抗体を用い、さらに抗原試薬として該モノク
ローナル抗体との反応性がヒトミオシン軽鎖と同等であ
る異種動物のミオシン軽鎖を用いることにより、従来の
モノクローナル抗体を使用したミオシン軽鎖の免疫学的
測定法の問題点を克服し、極めて実用的かつ有意義なミ
オシン軽鎖の免疫学的測定システムを組み立てることが
できることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ヒト血清試料中のミオシン軽鎖を
免疫学的に測定する方法において、抗体試薬としてヒト
ミオシン軽鎖および一種以上の異種動物のミオシン軽鎖
に反応し、かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応する
ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体を用い、抗原
試薬として該モノクローナル抗体との反応性がヒトミオ
シン軽鎖と同等である異種動物のミオシン軽鎖を用いる
ことを特徴とするミオシン軽鎖の測定法を提供するもの
である。
免疫学的に測定する方法において、抗体試薬としてヒト
ミオシン軽鎖および一種以上の異種動物のミオシン軽鎖
に反応し、かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応する
ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体を用い、抗原
試薬として該モノクローナル抗体との反応性がヒトミオ
シン軽鎖と同等である異種動物のミオシン軽鎖を用いる
ことを特徴とするミオシン軽鎖の測定法を提供するもの
である。
なお、本明細書において、「同等に反応する」または
「反応性が同等である」とは、後述の実施例、特に図１
〜３で示されているように、ヒトミオシン軽鎖を用いて
作成した標準曲線とヒト以外の異種動物のミオシン軽鎖
を用いて作成した標準曲線とがほぼ同一になることを意
味するものである。
「反応性が同等である」とは、後述の実施例、特に図１
〜３で示されているように、ヒトミオシン軽鎖を用いて
作成した標準曲線とヒト以外の異種動物のミオシン軽鎖
を用いて作成した標準曲線とがほぼ同一になることを意
味するものである。
「ミオシン軽鎖」とは、心筋（心室筋または心房筋）ミ
オシンの軽鎖Ｉおよび／または軽鎖IIまたはそれらのフ
ラグメント、または骨格筋ミオシンの軽鎖Ｉ、軽鎖IIお
よび／または軽鎖IIIまたはそれらのフラグメントを指
称する。
オシンの軽鎖Ｉおよび／または軽鎖IIまたはそれらのフ
ラグメント、または骨格筋ミオシンの軽鎖Ｉ、軽鎖IIお
よび／または軽鎖IIIまたはそれらのフラグメントを指
称する。
「ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体」とは、心
筋ミオシンの軽鎖Ｉおよび／または軽鎖IIまたはそれら
のフラグメントに結合能を有するモノクローナル抗体、
または骨格筋ミオシンの軽鎖Ｉ、軽鎖IIおよび／または
軽鎖IIIまたはそれらのフラグメントに結合能を有する
モノクローナル抗体を指称する。
筋ミオシンの軽鎖Ｉおよび／または軽鎖IIまたはそれら
のフラグメントに結合能を有するモノクローナル抗体、
または骨格筋ミオシンの軽鎖Ｉ、軽鎖IIおよび／または
軽鎖IIIまたはそれらのフラグメントに結合能を有する
モノクローナル抗体を指称する。
また、「異種動物」とは、ヒト以外のサル、イヌ、ネ
コ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウ
ス、ラツト、モルモツト、ハムスター、リスなどの主と
して哺乳動物を指称する。
コ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウ
ス、ラツト、モルモツト、ハムスター、リスなどの主と
して哺乳動物を指称する。
さらに、本発明方法において「免疫学的測定法」とは、
その測定システムが基本的に測定すべき抗原とそれに特
異的な抗体の結合能を利用して試料中の抗原の存在量に
よる抗原−抗体複合体の生成の相違を化学的または物理
的手段によつて検出し、これを既知量の抗原を含む標準
液のものと対照させて試料中の抗原量を測定するという
原理に基づく方法を総称する。このような免疫学的測定
法は現在まで数多く開発されている。たとえば、測定シ
ステムとしては凝集反応法（免疫比濁法）、凝集阻止
法、免疫拡散法、エーザーネフロメトリー、競合反応性
（液相法、固相法など）、サンドイツチ法、イムノメト
リツク法などに大別される。また標識物質を用いる測定
システムは、標識物質の種類により、125I、131I、3H、14C
などの放射性同位元素を用いたラジオイムノアツセイ
（ＲＩＡ）、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスフアターゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼなどの酵素を用いたエンザイムノアツセイ（ＥＩ
Ａ）、ウムベリフエロン、フルオレセイン、ローダミ
ン、フルオレセインイソシアネート、フイコエリトリン
などの蛍光色素を用いた蛍光イムノアツセイ（ＦＩ
Ａ）、ルミノールなどの化学発光物質を用いた化学発光
イムノアツセイ、金属イムノアツセイ、スピンイムノア
ツセイなどが知られている。これらの各測定法が前述の
測定原理に基いているものであり、ミオシン軽鎖の測定
系に応用可能である限り、本発明方法の適用対象となり
うる。
その測定システムが基本的に測定すべき抗原とそれに特
異的な抗体の結合能を利用して試料中の抗原の存在量に
よる抗原−抗体複合体の生成の相違を化学的または物理
的手段によつて検出し、これを既知量の抗原を含む標準
液のものと対照させて試料中の抗原量を測定するという
原理に基づく方法を総称する。このような免疫学的測定
法は現在まで数多く開発されている。たとえば、測定シ
ステムとしては凝集反応法（免疫比濁法）、凝集阻止
法、免疫拡散法、エーザーネフロメトリー、競合反応性
（液相法、固相法など）、サンドイツチ法、イムノメト
リツク法などに大別される。また標識物質を用いる測定
システムは、標識物質の種類により、125I、131I、3H、14C
などの放射性同位元素を用いたラジオイムノアツセイ
（ＲＩＡ）、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスフアターゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼなどの酵素を用いたエンザイムノアツセイ（ＥＩ
Ａ）、ウムベリフエロン、フルオレセイン、ローダミ
ン、フルオレセインイソシアネート、フイコエリトリン
などの蛍光色素を用いた蛍光イムノアツセイ（ＦＩ
Ａ）、ルミノールなどの化学発光物質を用いた化学発光
イムノアツセイ、金属イムノアツセイ、スピンイムノア
ツセイなどが知られている。これらの各測定法が前述の
測定原理に基いているものであり、ミオシン軽鎖の測定
系に応用可能である限り、本発明方法の適用対象となり
うる。
これらの個々の免疫学的測定法の応用にあたつては、特
に本発明において特別の条件、操作の設定は必要とされ
ない。それぞれの方法における通常の方法、手段、条件
に当業者の通常の技術的配慮を加えて、その方法におけ
る抗体試薬として前記の性質を有するモノクローナル抗
体と、抗原試薬として前記モノクローナル抗体が認識す
る異種動物由来のミオシン軽鎖を、心筋ミオシン軽鎖測
定系または骨格筋ミオシン軽鎖測定系として適合するよ
うに選択し、測定システムを構成すればよい。これらの
一般的技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる（たとえば、入江實編、「ラジオイ
ムノアツセイ」（株式会社講談社、昭和４９年４月１０
日発行）、入江實編、「続ラジオイムノアツセイ」（株
式会社講談社、昭和５４年５月１日発行）、石川栄治ら
編、「酵素免疫測定法」第２版（株式会社医学書院、昭
和５７年１２月１５日発行）、日本臨牀、第４２巻、春
季臨時増刊（１９８４）「臨床免疫hand-book」（株式
会社日本臨牀社、昭和５９年３月２０日発行）、第１１
９８〜１２２７頁、H.V.ブナキスや著、「Methods in E
nzymology」Vol.７０、「Immunochemical Techniques Pa
rt A」（アカデミツクプレス、１９８０）、J.J.ランゴ
ンら著、「Methods in Enzymology」Vol.７３、「Immuno
chemical Techniques Part B」同書、Vol.７４「Immuno
chemical Techniques Part C」、（アカデミツクプレ
ス、１９８１）など参照）。
に本発明において特別の条件、操作の設定は必要とされ
ない。それぞれの方法における通常の方法、手段、条件
に当業者の通常の技術的配慮を加えて、その方法におけ
る抗体試薬として前記の性質を有するモノクローナル抗
体と、抗原試薬として前記モノクローナル抗体が認識す
る異種動物由来のミオシン軽鎖を、心筋ミオシン軽鎖測
定系または骨格筋ミオシン軽鎖測定系として適合するよ
うに選択し、測定システムを構成すればよい。これらの
一般的技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる（たとえば、入江實編、「ラジオイ
ムノアツセイ」（株式会社講談社、昭和４９年４月１０
日発行）、入江實編、「続ラジオイムノアツセイ」（株
式会社講談社、昭和５４年５月１日発行）、石川栄治ら
編、「酵素免疫測定法」第２版（株式会社医学書院、昭
和５７年１２月１５日発行）、日本臨牀、第４２巻、春
季臨時増刊（１９８４）「臨床免疫hand-book」（株式
会社日本臨牀社、昭和５９年３月２０日発行）、第１１
９８〜１２２７頁、H.V.ブナキスや著、「Methods in E
nzymology」Vol.７０、「Immunochemical Techniques Pa
rt A」（アカデミツクプレス、１９８０）、J.J.ランゴ
ンら著、「Methods in Enzymology」Vol.７３、「Immuno
chemical Techniques Part B」同書、Vol.７４「Immuno
chemical Techniques Part C」、（アカデミツクプレ
ス、１９８１）など参照）。
これらの免疫学的測定法の代表的な方法の測定システム
は次のとおりである。
は次のとおりである。
凝集反応（免疫比濁法） 試料に、測定すべき抗原に対する抗体または赤血球や高
分子ラテツクス粒子などの担体に不溶化した抗体を加
え、抗原抗体反応により生成する抗原抗体複合体の量を
濁度の増加または光散乱の度合を測定して抗原量を測定
する。
分子ラテツクス粒子などの担体に不溶化した抗体を加
え、抗原抗体反応により生成する抗原抗体複合体の量を
濁度の増加または光散乱の度合を測定して抗原量を測定
する。
競合反応法 試料中の抗原と一定量の標識抗原とを抗体に対して競合
反応させ、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体に結合した標
識抗原（Ｂ）とを分離し、（ＢＦ分離）、Ｂ、Ｆいずれ
かの標識量を測定し、試料中の抗原量を定量する。
反応させ、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体に結合した標
識抗原（Ｂ）とを分離し、（ＢＦ分離）、Ｂ、Ｆいずれ
かの標識量を測定し、試料中の抗原量を定量する。
抗体として可溶性抗体を用い、ＢＦ分離を硫酸アンモニ
ウム、ポリエチレングリコール、前記抗体に対する第二
抗体などを用いる液相法、抗体として固相化抗体を用い
るか、第一抗体は可溶性のものを用いて第二抗体を固相
化抗体として用いる固相法がある。
ウム、ポリエチレングリコール、前記抗体に対する第二
抗体などを用いる液相法、抗体として固相化抗体を用い
るか、第一抗体は可溶性のものを用いて第二抗体を固相
化抗体として用いる固相法がある。
サンドイツチ法 試料中の抗原を固相化した第一抗体を反応させ、さらに
抗原の第一抗体との結合部位と別の部位を認識する標識
化第二抗体を反応させ、液相と固相とを分離し、液相ま
たは固相の標識量を測定し、試料中の抗原量を定量す
る。
抗原の第一抗体との結合部位と別の部位を認識する標識
化第二抗体を反応させ、液相と固相とを分離し、液相ま
たは固相の標識量を測定し、試料中の抗原量を定量す
る。
変法として、第二抗体に直接標識化せずに、測定抗原と
は異なる抗原または結合子（ビオチンなどの化合物）を
第二抗体に結合させたものを用い、第二抗体と測定抗原
および第一抗体の反応終了後、第二抗体に結合された抗
原に対する第三抗体または結合子に対する結合性物質
（アビシンなど）の標識化物を反応させ、液相と固相と
を分離していずれかの標識量を測定する間接標識法もあ
る。結合子と結合性物質の組み合わせとしてビオチン−
アビジン系が広く用いられている。
は異なる抗原または結合子（ビオチンなどの化合物）を
第二抗体に結合させたものを用い、第二抗体と測定抗原
および第一抗体の反応終了後、第二抗体に結合された抗
原に対する第三抗体または結合子に対する結合性物質
（アビシンなど）の標識化物を反応させ、液相と固相と
を分離していずれかの標識量を測定する間接標識法もあ
る。結合子と結合性物質の組み合わせとしてビオチン−
アビジン系が広く用いられている。
イムノメトリツク法 試料中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対
して競合反応させ、液相と固相とを分離し、いずれかの
相の標識量を測定し、試料中の抗原量を定量する。
して競合反応させ、液相と固相とを分離し、いずれかの
相の標識量を測定し、試料中の抗原量を定量する。
本発明方法において「抗体試薬」とは、前記のような免
疫学的測定において使用される測定対象の抗原に対する
可溶性抗体、固相化抗体、標識化抗体、間接標識法に用
いられる標識体に対する結合子を有する抗体などを指称
する。
疫学的測定において使用される測定対象の抗原に対する
可溶性抗体、固相化抗体、標識化抗体、間接標識法に用
いられる標識体に対する結合子を有する抗体などを指称
する。
本発明方法において「抗原試薬」とは、前記のような免
疫学的測定法において使用される標準溶液用抗原、固相
化抗原、標識化抗原などの抗原試薬を指称する。
疫学的測定法において使用される標準溶液用抗原、固相
化抗原、標識化抗原などの抗原試薬を指称する。
以下これらの試薬の調製について説明する。
抗原（ミオシン軽鎖）の調製 ミオシンの調製は、ヒトのミオシン軽鎖と共通抗原決定
基を有する（＝免疫化学的に同等な）ミオシン軽鎖を保
有する動物の心筋（心室筋または心房筋）または骨格筋
から常法により抽出し、精製して行うことができる。ミ
オシンの抽出は、通常0.2〜0.6Ｍ塩化カリウムなどの塩
類溶液を用いてpH6.5〜7.0の条件で行う。ミオシン軽鎖
の調製は、ＤＥＡＥ−セフアデクスＡ−２５、ＤＥＡＤ
−セフアデクスＡ−５０などのイオン交換体を用いるイ
オン交換クロマトグラフイー、セフアデクスＧ−２００
などのゲル充填剤を用いるゲル濾過クロマトグラフイ
ー、アフイニテイクロマトグラフイー、キレート剤によ
る沈澱化法、尿素、またはグアニジン塩酸塩処理、分画
電気泳動法、透析法、高濃度塩類溶液処理などの公知の
方法を適宜に応用して実施することができる（「生化学
実験講座１５ 筋肉」（株式会社東京化学同人、昭和５
０年１１月２５日発行）pp３−１２、R.Nagai et al,Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.８６，ｐ６３８（１９
７９）、A.M.Katz et al,Cir.Res.,Vol.１９，pp６１１
−６２１（１９６５）、W.T.Perrie et al,Biochem.J.V
ol.１１９，pp３１−３８（１９７０）など参照）。
基を有する（＝免疫化学的に同等な）ミオシン軽鎖を保
有する動物の心筋（心室筋または心房筋）または骨格筋
から常法により抽出し、精製して行うことができる。ミ
オシンの抽出は、通常0.2〜0.6Ｍ塩化カリウムなどの塩
類溶液を用いてpH6.5〜7.0の条件で行う。ミオシン軽鎖
の調製は、ＤＥＡＥ−セフアデクスＡ−２５、ＤＥＡＤ
−セフアデクスＡ−５０などのイオン交換体を用いるイ
オン交換クロマトグラフイー、セフアデクスＧ−２００
などのゲル充填剤を用いるゲル濾過クロマトグラフイ
ー、アフイニテイクロマトグラフイー、キレート剤によ
る沈澱化法、尿素、またはグアニジン塩酸塩処理、分画
電気泳動法、透析法、高濃度塩類溶液処理などの公知の
方法を適宜に応用して実施することができる（「生化学
実験講座１５ 筋肉」（株式会社東京化学同人、昭和５
０年１１月２５日発行）pp３−１２、R.Nagai et al,Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.８６，ｐ６３８（１９
７９）、A.M.Katz et al,Cir.Res.,Vol.１９，pp６１１
−６２１（１９６５）、W.T.Perrie et al,Biochem.J.V
ol.１１９，pp３１−３８（１９７０）など参照）。
本発明方法においては、心筋ミオシン軽鎖測定系では、
異種動物に由来する心筋ミオシン軽鎖Ｉ、心筋ミオシン
軽鎖IIおよびそれらの結合物のいずれをも抗原として利
用することができる。骨格筋ミオシン軽鎖測定系におい
ても同様である。
異種動物に由来する心筋ミオシン軽鎖Ｉ、心筋ミオシン
軽鎖IIおよびそれらの結合物のいずれをも抗原として利
用することができる。骨格筋ミオシン軽鎖測定系におい
ても同様である。
抗体の調製 本発明方法に使用される前記性質を有するモノクローナ
ル抗体の調製は公知の細胞融合法、ＥＤウイルスなどに
よるトランスフオーメーシヨン法を応用して行うことが
できる。細胞融合法は抗体の大量生産により適してお
り、以下細胞融合法による本発明方法に使用される抗体
の製造工程について説明するが、細胞融合法の一般的な
技術手段のより詳細については成書、報文などの記載を
参照することができる（たとえば、岩崎辰夫ら著、「単
クローン抗体− ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ− 」
（株式会社講談社、昭和５８年２月２０日発行）、G.Ko
hler et al,Eur.J.Immunol.,Vol.６、pp５１１−５１９
（１９７６）、M.Shulman et al,Nature,Vol.２７６、p
p２６９−２７０（１９７８）など参照）。
ル抗体の調製は公知の細胞融合法、ＥＤウイルスなどに
よるトランスフオーメーシヨン法を応用して行うことが
できる。細胞融合法は抗体の大量生産により適してお
り、以下細胞融合法による本発明方法に使用される抗体
の製造工程について説明するが、細胞融合法の一般的な
技術手段のより詳細については成書、報文などの記載を
参照することができる（たとえば、岩崎辰夫ら著、「単
クローン抗体− ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ− 」
（株式会社講談社、昭和５８年２月２０日発行）、G.Ko
hler et al,Eur.J.Immunol.,Vol.６、pp５１１−５１９
（１９７６）、M.Shulman et al,Nature,Vol.２７６、p
p２６９−２７０（１９７８）など参照）。
(a)抗体産生細胞の調製 ヒトを含む動物の心筋から前記の方法と同様に調製した
ミオシン軽鎖を異種動物に免疫し、免疫を獲得した動物
からの脾細胞、リンパ節細胞または末梢血細胞の抗体産
生細胞を常法により取得する。
ミオシン軽鎖を異種動物に免疫し、免疫を獲得した動物
からの脾細胞、リンパ節細胞または末梢血細胞の抗体産
生細胞を常法により取得する。
(b)ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラツト、ウサギ、ヒ
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤
抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地では生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質
を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性
株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−ホスホリ
ボシルトランスフエラーゼ(Hypoxanthine phosphoribos
yl transferase)を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプ
テリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また
細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆ
る非分泌型の細胞株であることが好ましい。
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤
抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地では生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質
を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性
株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−ホスホリ
ボシルトランスフエラーゼ(Hypoxanthine phosphoribos
yl transferase)を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプ
テリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない。また
細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆ
る非分泌型の細胞株であることが好ましい。
ミエローマ細胞株の具体例としては、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−９）（Nature,256,495-497(197
5)）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５９７）（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology,81,1-7(1978)）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）（J.Immuno
logy,123,1548-1550(1979)）、Ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ
４−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）（Europian J.Immun
ology,6,511-519(1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）（Nature,276,269-270(197
8)）などのマウスミエローマ細胞株、２１０．ＲＣＹ．
Ａｇ１．２．３（Ｙ３−Ａｇ１．２．３）（Ａ ＴＣＣ
ＣＲＬ−１６３１）(Nature,277,131-133(1979)）な
どのラットミエローマ細胞株、Ｕ−２６６−ＡＲ１（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,5429(1980)）、ＧＭ１５
００（Nature,288,488(1980)）、ＫＲ−４（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,79,6651(1982)）などのヒトミエロー
マ細胞株を例示することができる。
（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−９）（Nature,256,495-497(197
5)）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５９７）（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology,81,1-7(1978)）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ
８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）（J.Immuno
logy,123,1548-1550(1979)）、Ｐ２／ＮＳＩ／１−Ａｇ
４−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）（Europian J.Immun
ology,6,511-519(1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）（Nature,276,269-270(197
8)）などのマウスミエローマ細胞株、２１０．ＲＣＹ．
Ａｇ１．２．３（Ｙ３−Ａｇ１．２．３）（Ａ ＴＣＣ
ＣＲＬ−１６３１）(Nature,277,131-133(1979)）な
どのラットミエローマ細胞株、Ｕ−２６６−ＡＲ１（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,5429(1980)）、ＧＭ１５
００（Nature,288,488(1980)）、ＫＲ−４（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,79,6651(1982)）などのヒトミエロー
マ細胞株を例示することができる。
(c)細胞融合 細胞融合にあたつては、抗体産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合はイーグル最少基本培地
（ＭＥＭ）、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭＩ１６４０などの動物細胞培養用培地中で
１０7〜１０8のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比
１：４〜１０に混合して行う。細胞融合を促進させるた
めに、融合促進剤として平均分子量１０００〜６０００
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめ、ポリビ
ニールアルコール、ウイルスなどが使用される。
ーマ細胞を選定する。細胞融合はイーグル最少基本培地
（ＭＥＭ）、ダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭＩ１６４０などの動物細胞培養用培地中で
１０7〜１０8のミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比
１：４〜１０に混合して行う。細胞融合を促進させるた
めに、融合促進剤として平均分子量１０００〜６０００
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめ、ポリビ
ニールアルコール、ウイルスなどが使用される。
(d)選択培地におけるハイブリドーマの選別 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択
的増殖を利用する方法が用いられる。たとえば、細胞液
を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０
培地などで適当に希釈し、マイクロプレート上に１０5
〜１０6／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地（たと
えば、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を
交換して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグ
アニン抵抗性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場
合は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目ぐらいま
でに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もin vitroで
は長期間生育できないので、培養１０〜１４日目から生
育してくる細胞としてハイブリドーマを得ることができ
る。
選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択
的増殖を利用する方法が用いられる。たとえば、細胞液
を１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０
培地などで適当に希釈し、マイクロプレート上に１０5
〜１０6／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地（たと
えば、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を
交換して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグ
アニン抵抗性株、選択培地としてＨＡＴ培地を用いた場
合は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目ぐらいま
でに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もin vitroで
は長期間生育できないので、培養１０〜１４日目から生
育してくる細胞としてハイブリドーマを得ることができ
る。
(e)抗ミオシン軽鎖抗体産生ハイブリドーマの検索 抗ミオシン抗体産生ハイブリドーマの検索は、酵素標識
免疫定量法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ＥＬ
ＩＳＡ）、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）などに
よつて行うことができる。たとえば、ヒトまたは異種動
物のミオシン軽鎖を吸着させた９６ウエルＥＬＩＳＡ用
マイクロプレートにハイブリドーマを含む培養上清を添
加して特異抗体を反応させ、次いで結合した特異抗体に
酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、ビチオ
ン化抗免疫グロブリン抗体を反応させた後、アビシンＤ
−酵素標識体を反応させ、各ウエルに酵素基質を加えて
発色させる。発色の有無により、ミオシン軽鎖と結合力
を有する抗体を産生するハイブリドーマを含む培養上清
のウエルを判別でき、ハイブリドーマの検索が行える。
免疫定量法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ＥＬ
ＩＳＡ）、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）などに
よつて行うことができる。たとえば、ヒトまたは異種動
物のミオシン軽鎖を吸着させた９６ウエルＥＬＩＳＡ用
マイクロプレートにハイブリドーマを含む培養上清を添
加して特異抗体を反応させ、次いで結合した特異抗体に
酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、ビチオ
ン化抗免疫グロブリン抗体を反応させた後、アビシンＤ
−酵素標識体を反応させ、各ウエルに酵素基質を加えて
発色させる。発色の有無により、ミオシン軽鎖と結合力
を有する抗体を産生するハイブリドーマを含む培養上清
のウエルを判別でき、ハイブリドーマの検索が行える。
本発明方法において使用されるモノクローナル抗体の特
性の有無を試験して、最終的にそのような抗体を生産す
るハイブリドーマを選択することができる。
性の有無を試験して、最終的にそのような抗体を生産す
るハイブリドーマを選択することができる。
(f)クローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フイブリンゲル法、蛍光励起セルソータ法などによ
り行うことができる。
法、フイブリンゲル法、蛍光励起セルソータ法などによ
り行うことができる。
(g)抗体の生産 このようにして取得された抗ミオシン軽鎖抗体産生ハイ
ブリドーマから抗ミオシン軽鎖モノクローナル抗体を生
産する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法な
どが採用されうる。
ブリドーマから抗ミオシン軽鎖モノクローナル抗体を生
産する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法な
どが採用されうる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜１５％
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、無血清培地などの動
物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗体
を取得することができる。
ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、無血清培地などの動
物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗体
を取得することができる。
腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物に、プリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物を腹腔内
に投与した後、ハイブリドーマを約１０7個腹腔内投与
する。ハイブリドーマは１０〜１８日ほどで腹水腫瘍を
形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体を生産する。
適合性が一致する動物に、プリスタン（２，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物を腹腔内
に投与した後、ハイブリドーマを約１０7個腹腔内投与
する。ハイブリドーマは１０〜１８日ほどで腹水腫瘍を
形成し、血清および腹水中に高濃度の抗体を生産する。
抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、ＤＥ
ＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフイー、ミオシン軽鎖を結合させたセ
フアロース４ＢやプロテインＡ−セフアロースなどを用
いるアフイニテイクロマトグラフイー、分子ふるいクロ
マトグラフイーなどの方法を適宜に選択し、組合せるこ
とによつて精製を行うことができる。
ＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフイー、ミオシン軽鎖を結合させたセ
フアロース４ＢやプロテインＡ−セフアロースなどを用
いるアフイニテイクロマトグラフイー、分子ふるいクロ
マトグラフイーなどの方法を適宜に選択し、組合せるこ
とによつて精製を行うことができる。
本発明方法において、筋疾患一般の一次的診断法として
または心筋疾患と骨格筋疾患が併発していない症例の診
断法としてミオシン軽鎖を測定する場合は、心筋ミオシ
ン軽鎖および骨格筋ミオシン軽鎖の両者と交叉反応性を
有する抗体を使用することができる。
または心筋疾患と骨格筋疾患が併発していない症例の診
断法としてミオシン軽鎖を測定する場合は、心筋ミオシ
ン軽鎖および骨格筋ミオシン軽鎖の両者と交叉反応性を
有する抗体を使用することができる。
標識化試薬の調製 標識化ミオシン軽鎖または標識化抗ミオシン軽鎖モノク
ローナル抗体の調製は、使用する標識もしくは標識系に
おいて確立された公知の方法を応用することができる。
たとえば、放射性同位元素を標識化する場合は、クロラ
ミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法などが適用でき
る。酵素標識する場合は、酸無水物法、カルボジイミド
法、グルタルアルデヒド架橋法、過ヨウ素酸架橋法、マ
レイミド架橋法などが適用できる。
ローナル抗体の調製は、使用する標識もしくは標識系に
おいて確立された公知の方法を応用することができる。
たとえば、放射性同位元素を標識化する場合は、クロラ
ミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法などが適用でき
る。酵素標識する場合は、酸無水物法、カルボジイミド
法、グルタルアルデヒド架橋法、過ヨウ素酸架橋法、マ
レイミド架橋法などが適用できる。
固相化試薬の調製 ミオシン軽鎖または抗ミオシン軽鎖モノクローナル抗体
の固相化試薬の調製も、採用される測定システムに適合
した担体を選択し、公知の方法により固相化を行えばよ
い。
の固相化試薬の調製も、採用される測定システムに適合
した担体を選択し、公知の方法により固相化を行えばよ
い。
たとえば、担体の材質としては、多糖類（たとえば、セ
ルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ｐ−アミノフエノキシヒド
ロキシプロピルデキストラン、アガロース、セフアデツ
クスなど）のハロゲン化シアン活性化物（特公昭４５−
３８５４３号公報参照）、多糖類のメタ過ヨウ素酸ナト
リウム活性化物（特開昭５８−７５６号公報参照）、セ
ルロースまたはその誘導体のアミノエチルもしくはアミ
ノプロピル化物（特開昭５９−４２４５２号公報参
照）、セルロースまたはその誘導体のメルカプト化物
（特開昭５８−８０５５８号公報参照）、多糖類のシア
ネート化物（特公昭４９−２８０３１号公報参照）、多
糖類のエピクロルヒドリン−ｐ−アミノフエノール処理
物（特開昭５４−１５８９９４号公報参照）、芳香族ア
ミノ基を含む多糖類誘導体のジアゾ化物（希塩酸、亜硝
酸ナトリウム処理）、セルロースカルボナート誘導体、
酢酸セルロース、天然繊維（綿、麻、ウールなど）など
の天然高分子誘導体担体、エチレン、プロピレン、スチ
レン、ビニルアルコール、アクリルアミド、アクリロニ
トリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、無水マレイン
酸などの重合体もしくは共重合体担体、またはこれらに
公知の手段によりアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキ
シル基、スルホン基、チオール基、アジド基、イソシア
ノ基などの反応性官能基を導入したものなどが挙げられ
る。
ルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ｐ−アミノフエノキシヒド
ロキシプロピルデキストラン、アガロース、セフアデツ
クスなど）のハロゲン化シアン活性化物（特公昭４５−
３８５４３号公報参照）、多糖類のメタ過ヨウ素酸ナト
リウム活性化物（特開昭５８−７５６号公報参照）、セ
ルロースまたはその誘導体のアミノエチルもしくはアミ
ノプロピル化物（特開昭５９−４２４５２号公報参
照）、セルロースまたはその誘導体のメルカプト化物
（特開昭５８−８０５５８号公報参照）、多糖類のシア
ネート化物（特公昭４９−２８０３１号公報参照）、多
糖類のエピクロルヒドリン−ｐ−アミノフエノール処理
物（特開昭５４−１５８９９４号公報参照）、芳香族ア
ミノ基を含む多糖類誘導体のジアゾ化物（希塩酸、亜硝
酸ナトリウム処理）、セルロースカルボナート誘導体、
酢酸セルロース、天然繊維（綿、麻、ウールなど）など
の天然高分子誘導体担体、エチレン、プロピレン、スチ
レン、ビニルアルコール、アクリルアミド、アクリロニ
トリル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、無水マレイン
酸などの重合体もしくは共重合体担体、またはこれらに
公知の手段によりアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキ
シル基、スルホン基、チオール基、アジド基、イソシア
ノ基などの反応性官能基を導入したものなどが挙げられ
る。
さらに担体の形状としては、チユーブ状、テストプレー
ト状、ビーズ状、デイスク状、球状、ステイツク状、ラ
テツクス状などが例示できる。
ト状、ビーズ状、デイスク状、球状、ステイツク状、ラ
テツクス状などが例示できる。
固相化法としては、物理的吸着法、共有結合法、架橋
法、包括法のいずれも適用することができる。このよう
な固相化法の詳細については、固定化酵素における方法
を応用すればよく、たとえば千畑一郎編、「固定化酵
素」（昭和５０年３月２０日、株式会社講談社発行）第
９〜７５頁などの成書や総説を参照すればよい。
法、包括法のいずれも適用することができる。このよう
な固相化法の詳細については、固定化酵素における方法
を応用すればよく、たとえば千畑一郎編、「固定化酵
素」（昭和５０年３月２０日、株式会社講談社発行）第
９〜７５頁などの成書や総説を参照すればよい。
本発明方法を実施するにあたり、血清試料の調製には特
別の前処理は必要とされず、血清をそのままアツセイに
供することができる。抗原抗体反応の安定化や非特異的
反応を防止するなどの目的のために、たとえば最終濃度
５〜１０ｍＭのＥＤＴＡなどを添加してもよい。
別の前処理は必要とされず、血清をそのままアツセイに
供することができる。抗原抗体反応の安定化や非特異的
反応を防止するなどの目的のために、たとえば最終濃度
５〜１０ｍＭのＥＤＴＡなどを添加してもよい。
本発明方法は、抗体試薬としてヒトミオシン軽鎖およ
び一種以上の異種動物のミオシン軽鎖と同等に反応し、
かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応するミオシン軽
鎖に対するモノクローナル抗体を用い、抗原試薬とし
て該モノクローナル抗体との反応性がヒトミオシン軽鎖
と同等である異種動物のミオシン軽鎖を用いることを特
徴とするものである。
び一種以上の異種動物のミオシン軽鎖と同等に反応し、
かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応するミオシン軽
鎖に対するモノクローナル抗体を用い、抗原試薬とし
て該モノクローナル抗体との反応性がヒトミオシン軽鎖
と同等である異種動物のミオシン軽鎖を用いることを特
徴とするものである。
すなわち、ヒトミオシン軽鎖と異種動物のミオシン軽鎖
との交差反応性を調べることにより、ヒト血清中のミオ
シン軽鎖と反応するモノクローナル抗体を効果的にスク
リーニングすることができ、実際の心筋梗塞などの筋疾
患の診断に有用な測定系の構築を初めて可能とした。さ
らに、抗体試薬としてヒトミオシン軽鎖および一種以上
の異種動物のミオシン軽鎖と同等に反応するものを用い
ることにより、標準物質、標識ミオシン軽鎖などの従来
ヒト由来のものに限定されていた抗原試薬をヒト以外の
異種動物から調製したものに代替えすることができ、抗
原試薬の大量供給を可能とした。このような代替えは、
使用する抗体試薬がヒトミオシン軽鎖と異種動物のミオ
シン軽鎖とに単に反応するだけでは不十分であり、その
反応性がほぼ同等であることにより初めて達成されるも
のである（このことは抗原試薬にも当てはまり、異種動
物から調製した抗原試薬の抗体試薬との反応性は、ヒト
ミオシン軽鎖と同等であることが肝要である）。これら
の効果により、はじめてミオシン軽鎖の免疫学的測定に
よる実用的な心筋梗塞などの筋疾患の診断法が確立され
た。
との交差反応性を調べることにより、ヒト血清中のミオ
シン軽鎖と反応するモノクローナル抗体を効果的にスク
リーニングすることができ、実際の心筋梗塞などの筋疾
患の診断に有用な測定系の構築を初めて可能とした。さ
らに、抗体試薬としてヒトミオシン軽鎖および一種以上
の異種動物のミオシン軽鎖と同等に反応するものを用い
ることにより、標準物質、標識ミオシン軽鎖などの従来
ヒト由来のものに限定されていた抗原試薬をヒト以外の
異種動物から調製したものに代替えすることができ、抗
原試薬の大量供給を可能とした。このような代替えは、
使用する抗体試薬がヒトミオシン軽鎖と異種動物のミオ
シン軽鎖とに単に反応するだけでは不十分であり、その
反応性がほぼ同等であることにより初めて達成されるも
のである（このことは抗原試薬にも当てはまり、異種動
物から調製した抗原試薬の抗体試薬との反応性は、ヒト
ミオシン軽鎖と同等であることが肝要である）。これら
の効果により、はじめてミオシン軽鎖の免疫学的測定に
よる実用的な心筋梗塞などの筋疾患の診断法が確立され
た。
参考例１（ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体の
調製） 公知の方法（Biochem.J.,Vol.113、pp31-38(1970)）によ
り調製されたヒト心室筋ミオシン軽鎖（１mg／ml）を生
理食塩水に溶解させ、完全フロインドアジユバンドと
１：１で混合してエマルジヨンとしたものをＢＡＬＢ／
ｃマウス（雌、６週令）に２週間おきに数回ミオシン軽
鎖として５０μｇ腹腔内投与し、最後に１０〜３０μｇ
を静注した。
調製） 公知の方法（Biochem.J.,Vol.113、pp31-38(1970)）によ
り調製されたヒト心室筋ミオシン軽鎖（１mg／ml）を生
理食塩水に溶解させ、完全フロインドアジユバンドと
１：１で混合してエマルジヨンとしたものをＢＡＬＢ／
ｃマウス（雌、６週令）に２週間おきに数回ミオシン軽
鎖として５０μｇ腹腔内投与し、最後に１０〜３０μｇ
を静注した。
最終免疫から３日後にマウスの脾細胞を摘出し、ＭＥＭ
で洗浄した。マウスミエローマＰ３Ｕ１をＭＥＭで洗浄
し、脾細胞とＰ３Ｕ１を１０：１で混合して遠心分離
し、ペレツトに５０％ＰＥＧ1,000ＭＥＭ溶液１ｍを
徐々に加えて細胞融合を行つた。さらにＭＥＭ溶液を加
えて１０ｍとし、遠心分離し、ペレツトを１０％ＦＣ
Ｓ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ３Ｕ１として３×１０
4cell／0.1ｍとなるように懸濁させ、９６ウエルマイ
クロプレートに各ウエル0.1ｍずつ分注した。
で洗浄した。マウスミエローマＰ３Ｕ１をＭＥＭで洗浄
し、脾細胞とＰ３Ｕ１を１０：１で混合して遠心分離
し、ペレツトに５０％ＰＥＧ1,000ＭＥＭ溶液１ｍを
徐々に加えて細胞融合を行つた。さらにＭＥＭ溶液を加
えて１０ｍとし、遠心分離し、ペレツトを１０％ＦＣ
Ｓ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ３Ｕ１として３×１０
4cell／0.1ｍとなるように懸濁させ、９６ウエルマイ
クロプレートに各ウエル0.1ｍずつ分注した。
１日後、ＨＡＴ培地を0.1ｍずつ添加し、その後３〜
４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換し、
ハイブリドーマの生育が認められたウエルの上清５０μ
ずつをそれぞれ予めヒト心室筋ミオシン軽鎖でコート
した９６ウエルマイクロプレートに添加した。アビシン
Ｄ−酵素結合体としてアビシンＤ−ペルオキシダーゼ
（ベクター社製）、基質および発色剤として過酸化水
素、４−アミノアンチピリン−フエノールを用いた前記
したＥＬＩＳＡ法によりヒト心室筋ミオシン軽鎖と反応
する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈
法によりクローニングを行つた。
４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換し、
ハイブリドーマの生育が認められたウエルの上清５０μ
ずつをそれぞれ予めヒト心室筋ミオシン軽鎖でコート
した９６ウエルマイクロプレートに添加した。アビシン
Ｄ−酵素結合体としてアビシンＤ−ペルオキシダーゼ
（ベクター社製）、基質および発色剤として過酸化水
素、４−アミノアンチピリン−フエノールを用いた前記
したＥＬＩＳＡ法によりヒト心室筋ミオシン軽鎖と反応
する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈
法によりクローニングを行つた。
取得されたハイブリドーマが生産するモノクローナルに
ついて、抗体のサブクラスを決定し、ヒト、イヌ、ブタ
およびウシから調製したミオシン軽鎖および心筋梗塞患
者血清中の心筋ミオシン軽鎖との交叉反応性を上述のハ
イブリドーマの選択と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて試験
した。その結果を第１表および第２表に示す。
ついて、抗体のサブクラスを決定し、ヒト、イヌ、ブタ
およびウシから調製したミオシン軽鎖および心筋梗塞患
者血清中の心筋ミオシン軽鎖との交叉反応性を上述のハ
イブリドーマの選択と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて試験
した。その結果を第１表および第２表に示す。
サブクラスの決定は、心室筋ミオシン軽鎖をコートした
９６ウエルマイクロプレートに各モノクローナル抗体を
添加し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ
でブロツキングした後、ＭＯＮＯＡＢ１Ｄ−ＥＩＡキツ
ト（ＺＹＭＥＤ社製）を用いて行つた。
９６ウエルマイクロプレートに各モノクローナル抗体を
添加し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ
でブロツキングした後、ＭＯＮＯＡＢ１Ｄ−ＥＩＡキツ
ト（ＺＹＭＥＤ社製）を用いて行つた。
特異性の指標は、ＭＬＭ５２７抗体の一定量のヒト心室
筋ミオシン軽鎖に対する結合量を１００とした場合の相
対的結合量を表わし、（）は１００〜８０％、（）
は８０〜５０％、（＋）は５０〜１０％、（−）は１０
〜０％のランクを示す。
筋ミオシン軽鎖に対する結合量を１００とした場合の相
対的結合量を表わし、（）は１００〜８０％、（）
は８０〜５０％、（＋）は５０〜１０％、（−）は１０
〜０％のランクを示す。
本発明方法に使用する上で好適な抗体例としては、ＭＬ
Ｍ−５０８、ＭＬＭ−５２０、ＭＬＭ−５２７、ＭＬＭ
−５３６、ＭＬＭ−５４４、ＭＬＭ−５８２などが挙げ
られる。
Ｍ−５０８、ＭＬＭ−５２０、ＭＬＭ−５２７、ＭＬＭ
−５３６、ＭＬＭ−５４４、ＭＬＭ−５８２などが挙げ
られる。
参考例２（ブタ心室筋ミオシン軽鎖の調製） ブタ心臓の心室筋を細断し、１０倍重量の１ｍＭＥＤＴ
Ａ含有５０ｍＭりん酸緩衝液（pH6.85）で洗浄した。こ
の組織片に0.6Ｍ塩化カリウム0.15Ｍりん酸緩衝液（pH
6.85、１ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭピロりん酸カリウム含
有）を加え、１５分間攪拌してミオシンを抽出後、１３
倍重量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え、濾過し、濾液に２
４倍重量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加えて４℃で１晩静置
した。上清を吸引除去し、沈澱を8,500r.p.m、２０分、
４℃で遠心分離し、沈澱を回収し、秤量した。１Ｍ塩化
カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、４０ｍＭアデノシン三りん
酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム含有２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）を２倍量、蒸留水を等量加え、氷冷下
２回ホモジナイズした。100,000ｇ、１時間超遠心分離
し、上清液に９倍量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え、メル
カプトエタノールを１滴加えて４℃で１晩静置した。沈
澱を8,500r.p.m、２０分、４℃で遠心分離し、得られた
沈澱にグアニジン塩酸塩を最終濃度５Ｍになるように加
え、メルカプトエタノールを加えて室温で３時間攪拌
し、等量の冷水、４倍量のエタノールを加え、10,000r.
p.m、２０分、４℃で遠心分離した。上清を冷え１ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液に対して数回透析し、透析内液を回収して
ブタ心室筋ミオシン軽鎖１００mgを得た。
Ａ含有５０ｍＭりん酸緩衝液（pH6.85）で洗浄した。こ
の組織片に0.6Ｍ塩化カリウム0.15Ｍりん酸緩衝液（pH
6.85、１ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭピロりん酸カリウム含
有）を加え、１５分間攪拌してミオシンを抽出後、１３
倍重量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え、濾過し、濾液に２
４倍重量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加えて４℃で１晩静置
した。上清を吸引除去し、沈澱を8,500r.p.m、２０分、
４℃で遠心分離し、沈澱を回収し、秤量した。１Ｍ塩化
カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、４０ｍＭアデノシン三りん
酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム含有２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）を２倍量、蒸留水を等量加え、氷冷下
２回ホモジナイズした。100,000ｇ、１時間超遠心分離
し、上清液に９倍量の１ｍＭＥＤＴＡ溶液を加え、メル
カプトエタノールを１滴加えて４℃で１晩静置した。沈
澱を8,500r.p.m、２０分、４℃で遠心分離し、得られた
沈澱にグアニジン塩酸塩を最終濃度５Ｍになるように加
え、メルカプトエタノールを加えて室温で３時間攪拌
し、等量の冷水、４倍量のエタノールを加え、10,000r.
p.m、２０分、４℃で遠心分離した。上清を冷え１ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液に対して数回透析し、透析内液を回収して
ブタ心室筋ミオシン軽鎖１００mgを得た。
参考例３（ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの精製） 抗心筋ミオシン軽鎖IIモノクローナル抗体ＭＬＭ５１５
をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフイーにて精
製後、１００mgの抗体をアフイゲル１０(Bio Rad社製）
５ｍに結合させ（結合率４２％）、１Ｍエタノールア
ミンでブロツク後、ゲルをカラムに充填し、0.2Ｍグリ
シン塩酸緩衝液（pH2.5）およびりん酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）で洗浄した。参考例２で調製したブタ心室筋
ミオシン軽鎖１１mgをカラムに負荷し、ＰＢＳで溶出
し、ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉ精製標品3.7mgを得た。
をＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフイーにて精
製後、１００mgの抗体をアフイゲル１０(Bio Rad社製）
５ｍに結合させ（結合率４２％）、１Ｍエタノールア
ミンでブロツク後、ゲルをカラムに充填し、0.2Ｍグリ
シン塩酸緩衝液（pH2.5）およびりん酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）で洗浄した。参考例２で調製したブタ心室筋
ミオシン軽鎖１１mgをカラムに負荷し、ＰＢＳで溶出
し、ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉ精製標品3.7mgを得た。
実施例１ 〔125I〕標識モノクローナル抗体（〔125I〕−抗体）
の作成 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
０８をマウス腹水より硫安分画、ＤＥＡＥセルロースイ
オン交換カラムクロマトグラフイー、ＡｃＡ４４ゲルロ
過カラムクロマトグラフイーにより精製した。
の作成 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
０８をマウス腹水より硫安分画、ＤＥＡＥセルロースイ
オン交換カラムクロマトグラフイー、ＡｃＡ４４ゲルロ
過カラムクロマトグラフイーにより精製した。
この精製抗体を１mg／ｍ溶液とし、その４０μを２
００μCiのヨウ化ナトリウム（〔125I〕）でクロラミン
Ｔ法により125I標識化した(Hunter et al,Nature,Vol.
１９４、pp４９５−４９６（１９６２））。これをセフ
アデクスＧ２５カラムクロマトグラフイーにより遊離の
放射性ヨウ化ナトリウムと分離し、〔125I〕−抗体とし
た。
００μCiのヨウ化ナトリウム（〔125I〕）でクロラミン
Ｔ法により125I標識化した(Hunter et al,Nature,Vol.
１９４、pp４９５−４９６（１９６２））。これをセフ
アデクスＧ２５カラムクロマトグラフイーにより遊離の
放射性ヨウ化ナトリウムと分離し、〔125I〕−抗体とし
た。
抗体コートチユーブの作製 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
４４を前記と同様に精製した。精製抗体をＰＢＳ（pH7.
4）に５０μｇ／ｍとなるように溶解させ、ポリスチ
レンチユーブに0.5ｍずつ加え、４℃で１晩放置して
コートした。チユーブから溶液を除去し、１％ＢＳＡ、
0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳを加え、室温で２時
間放置してブロツクした。ＢＳＡ溶液を除去し、蒸留水
で２回洗浄した後、凍結乾燥し、使用時まで４℃で乾燥
状態で保存した。
４４を前記と同様に精製した。精製抗体をＰＢＳ（pH7.
4）に５０μｇ／ｍとなるように溶解させ、ポリスチ
レンチユーブに0.5ｍずつ加え、４℃で１晩放置して
コートした。チユーブから溶液を除去し、１％ＢＳＡ、
0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳを加え、室温で２時
間放置してブロツクした。ＢＳＡ溶液を除去し、蒸留水
で２回洗浄した後、凍結乾燥し、使用時まで４℃で乾燥
状態で保存した。
測定 抗体コートチユーブに、精製ヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉ
および精製ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉをそれぞれ１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳで1,000ng／ｍから１ng／ｍまで段
階希釈した標準液を２００μずつ加え、次いで
〔125I〕−抗体を50,000c.p.m.／２５０μとなるよう
に希釈して２５０μずつ加えた。
および精製ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉをそれぞれ１％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳで1,000ng／ｍから１ng／ｍまで段
階希釈した標準液を２００μずつ加え、次いで
〔125I〕−抗体を50,000c.p.m.／２５０μとなるよう
に希釈して２５０μずつ加えた。
室温で１６時間反応させ、上清をアスピレーターにより
吸引除去し、蒸留水で２回洗浄後、各チユーブの放射能
量をガンマ−カウンターで測定した。
吸引除去し、蒸留水で２回洗浄後、各チユーブの放射能
量をガンマ−カウンターで測定した。
その結果、第１図に示すように、１ng／ｍから１００
ng／ｍまでヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液および
ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液についてほぼ同一の
標準曲線が作成できた。
ng／ｍまでヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液および
ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液についてほぼ同一の
標準曲線が作成できた。
したがつて、適当なフアクターを乗じれば、ブタ心室筋
ミオシン軽鎖Ｉの標準曲線からヒト心室筋ミオシン軽鎖
Ｉの量を換算できることが明らかとなつた。
ミオシン軽鎖Ｉの標準曲線からヒト心室筋ミオシン軽鎖
Ｉの量を換算できることが明らかとなつた。
実施例２ 健常人２１人、急性心筋梗塞患者９人から採取して調製
した血清試料各５０μを前記と同様に抗体コートチユ
ーブに加え、次に１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え〔125I〕
−抗体溶液２５０μを加えた。室温で１６時間インキ
ユベーシヨンした後、上清をアスピレーターにより吸引
除去し、蒸留水で２回洗浄後、オートガンマーカウンタ
ーにて放射能を測定した。ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉを
標準物質として作成した標準曲線に基づいて、血清中の
ミオシン軽鎖を定量した。
した血清試料各５０μを前記と同様に抗体コートチユ
ーブに加え、次に１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え〔125I〕
−抗体溶液２５０μを加えた。室温で１６時間インキ
ユベーシヨンした後、上清をアスピレーターにより吸引
除去し、蒸留水で２回洗浄後、オートガンマーカウンタ
ーにて放射能を測定した。ブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉを
標準物質として作成した標準曲線に基づいて、血清中の
ミオシン軽鎖を定量した。
その結果、健常人の血清試料中のミオシン軽鎖含量は0.
62±0.67ng／ｍであつた。一方、急性心筋梗塞患者で
は発作当日において11.7±14.3ng／ｍと高く、発作後
３〜６日目にピークとなつた。ピーク時の値は23.3±1
3.8ng／ｍであり、その後減少して１週間から２週間
後には正常値に戻る例が多かつた。
62±0.67ng／ｍであつた。一方、急性心筋梗塞患者で
は発作当日において11.7±14.3ng／ｍと高く、発作後
３〜６日目にピークとなつた。ピーク時の値は23.3±1
3.8ng／ｍであり、その後減少して１週間から２週間
後には正常値に戻る例が多かつた。
実施例３ ビオチン化抗体の作製 抗ヒト心筋ミオシン軽鎖Ｉモノクローナル抗体ＭＬＭ５
０８を実施例１と同様にＤＥＡＥセルロースイオン交換
クロマトグラフイー、ＡｃＡ４４ゲルロ過カラムクロマ
トグラフイーで精製し、これを0.1Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム水溶液に対して透析し、透析内液を同溶液で抗体濃度
が１mg／ｍになるように調製した。0.75ngのＮ−ハイ
ドロキシサクシニルビオチンをジメチルホルムアミド１
ｍに溶解させ、これを0.1ｍ抗体溶液１ｍに加え
て混合し、室温で４時間放置した。混合液を0.1％ナト
リウムアジド含有ＰＢＳに対して透析し、0.1％ＢＳ
Ａ、0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ溶液としてビオ
チン化抗体を調製した。
０８を実施例１と同様にＤＥＡＥセルロースイオン交換
クロマトグラフイー、ＡｃＡ４４ゲルロ過カラムクロマ
トグラフイーで精製し、これを0.1Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム水溶液に対して透析し、透析内液を同溶液で抗体濃度
が１mg／ｍになるように調製した。0.75ngのＮ−ハイ
ドロキシサクシニルビオチンをジメチルホルムアミド１
ｍに溶解させ、これを0.1ｍ抗体溶液１ｍに加え
て混合し、室温で４時間放置した。混合液を0.1％ナト
リウムアジド含有ＰＢＳに対して透析し、0.1％ＢＳ
Ａ、0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ溶液としてビオ
チン化抗体を調製した。
測定 実施例１と同様にして調製した抗体コートチユーブにヒ
ト心筋ミオシン軽鎖Ｉまたはブタ心筋ミオシン軽鎖Ｉを
それぞれ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで1,000ng／ｍから１n
g／ｍまで段階希釈した標準液を１００μずつおよ
び１％ＢＳＡ、0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳを１
５０μずつ加え、室温で1.5時間反応させた後、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。希釈したビオチン化抗体を２５０μ
ずつ各チユーブに加え、室温で1.5時間放置後、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。アビシンＤ−ペルオキシダーゼ（ベ
クター社製）を１％ＢＳＡ、0.01％エチルマルキリチオ
サリチル酸ナトリウム含有ＰＢＳ溶液で希釈して２５０
μずつ各チユーブに加え、室温で１５分放置した後、
ＰＢＳで３回洗浄した。０−フエニレンジアミン２mgを
クエン酸緩衝液（pH5.0）１０ｍに溶解させて発色試
薬を調製し、各チユーブに発色試薬１ｍおよび３４０
ｍＭ過酸化水素５０μをそれぞれ加えて室温で２０分
反応させた後、１Ｎ硫酸を１ｍずつ加えて反応を停止
し、各チユーブ溶液のＯ．Ｄ．４９０nmの吸光度を測定
した。
ト心筋ミオシン軽鎖Ｉまたはブタ心筋ミオシン軽鎖Ｉを
それぞれ１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで1,000ng／ｍから１n
g／ｍまで段階希釈した標準液を１００μずつおよ
び１％ＢＳＡ、0.1％ナトリウムアジド含有ＰＢＳを１
５０μずつ加え、室温で1.5時間反応させた後、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。希釈したビオチン化抗体を２５０μ
ずつ各チユーブに加え、室温で1.5時間放置後、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。アビシンＤ−ペルオキシダーゼ（ベ
クター社製）を１％ＢＳＡ、0.01％エチルマルキリチオ
サリチル酸ナトリウム含有ＰＢＳ溶液で希釈して２５０
μずつ各チユーブに加え、室温で１５分放置した後、
ＰＢＳで３回洗浄した。０−フエニレンジアミン２mgを
クエン酸緩衝液（pH5.0）１０ｍに溶解させて発色試
薬を調製し、各チユーブに発色試薬１ｍおよび３４０
ｍＭ過酸化水素５０μをそれぞれ加えて室温で２０分
反応させた後、１Ｎ硫酸を１ｍずつ加えて反応を停止
し、各チユーブ溶液のＯ．Ｄ．４９０nmの吸光度を測定
した。
その結果、第２図に示したように、１ng／ｍから１０
０ng／ｍまでヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液およ
びブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液についてほぼ同等
の標準曲線が作成できた。
０ng／ｍまでヒト心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液およ
びブタ心室筋ミオシン軽鎖Ｉの標準液についてほぼ同等
の標準曲線が作成できた。
実施例４ 参考例２と同様にブタ、ウシ、イヌ、ラツト心室筋より
ミオシンを抽出し、５Ｍグアニジン塩酸塩処理によりミ
オシン軽鎖を単離した。次にこれらをそれぞれ１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳで段階希釈して標準液を作成し、実施例１
と同一の抗体コートチユーブに２５μずつ加え、次い
でＰＢＳを７５μ、実施例１と同一の〔125I〕−抗体
を２５０μずつ加えて室温で１晩放置した。上清を除
去し、洗浄した後、各チユーブの放射能量をオートガン
マーカウンターで測定した。
ミオシンを抽出し、５Ｍグアニジン塩酸塩処理によりミ
オシン軽鎖を単離した。次にこれらをそれぞれ１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳで段階希釈して標準液を作成し、実施例１
と同一の抗体コートチユーブに２５μずつ加え、次い
でＰＢＳを７５μ、実施例１と同一の〔125I〕−抗体
を２５０μずつ加えて室温で１晩放置した。上清を除
去し、洗浄した後、各チユーブの放射能量をオートガン
マーカウンターで測定した。
その結果は第３図に示したとおりであり、ブタ、ウシ、
イヌ、ラツトの各心室筋ミオシン軽鎖の標準液による標
準曲線はヒト心室筋ミオシン軽鎖によるものとほぼ一致
し、これら異種動物の心筋ミオシン軽鎖をヒト心筋ミオ
シン軽鎖を測定する際の標準物質として使用できること
が確かめられた。
イヌ、ラツトの各心室筋ミオシン軽鎖の標準液による標
準曲線はヒト心室筋ミオシン軽鎖によるものとほぼ一致
し、これら異種動物の心筋ミオシン軽鎖をヒト心筋ミオ
シン軽鎖を測定する際の標準物質として使用できること
が確かめられた。
実施例５ 急性心筋梗塞患者の血清を発作直後より経時的にサンプ
リングし、実施例１のＲＩＡサンドイツチ法および実施
例３のＥＬＩＳＡ法により心筋ミオシン軽鎖の測定を行
つた。
リングし、実施例１のＲＩＡサンドイツチ法および実施
例３のＥＬＩＳＡ法により心筋ミオシン軽鎖の測定を行
つた。
その結果は第４図に示したとおりであり、ＥＬＩＳＡ法
により得られた測定値がＲＩＡサンドイツチ法により得
られたものよりもやや高めであるが、両者とも良い相関
を示した（相関計数0.92）。
により得られた測定値がＲＩＡサンドイツチ法により得
られたものよりもやや高めであるが、両者とも良い相関
を示した（相関計数0.92）。
したがつて、両法ともに心筋梗塞の診断に有用であるこ
とが明らかになつた。
とが明らかになつた。
第１図は本発明方法の実施例１において、第２図は実施
例３において、第３図は実施例４において作成された標
準曲線である。第４図は実施例５における心筋梗塞患者
血清中の経時的な心筋ミオシン軽鎖含量の変化を示すも
のである。
例３において、第３図は実施例４において作成された標
準曲線である。第４図は実施例５における心筋梗塞患者
血清中の経時的な心筋ミオシン軽鎖含量の変化を示すも
のである。
Claims (5)
- 【請求項１】ヒト血清試料中のミオシン軽鎖を免疫学的
に測定する方法において、抗体試薬としてヒトミオシン
軽鎖および一種以上の異種動物のミオシン軽鎖と同等に
反応し、かつヒト血清中のミオシン軽鎖とも反応するミ
オシン軽鎖に対するモノクローナル抗体を用い、抗原試
薬として該モノクローナル抗体との反応性がヒトミオシ
ン軽鎖と同等である異種動物のミオシン軽鎖を用いるこ
とを特徴とするミオシン軽鎖の測定法。 - 【請求項２】ミオシン軽鎖が、心筋ミオシン軽鎖である
請求項１記載のミオシン軽鎖の測定法。 - 【請求項３】ミオシン軽鎖が、心筋ミオシン軽鎖Ｉであ
る請求項１記載のミオシン軽鎖の測定法。 - 【請求項４】ミオシン軽鎖が、心筋ミオシン軽鎖IIであ
る請求項１記載のミオシン軽鎖の測定法。 - 【請求項５】異種動物が、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスター及びリスよりなる群から選ばれたもので
ある請求項１記載のミオシン軽鎖の測定法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129037A JPH0625762B2 (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | ミオシン軽鎖の測定法 |
| CA000511364A CA1289870C (en) | 1985-06-13 | 1986-06-11 | Method of assaying myosin light chain |
| DE19863686599 DE3686599T2 (de) | 1985-06-13 | 1986-06-12 | Verfahren zur bestimmung der leichten kette von myosin. |
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| EP19860108038 EP0205177B1 (en) | 1985-06-13 | 1986-06-12 | Method of assaying myosin light chain |
| JP1157516A JPH02211896A (ja) | 1985-06-13 | 1989-06-20 | ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129037A JPH0625762B2 (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | ミオシン軽鎖の測定法 |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP1157516A Division JPH02211896A (ja) | 1985-06-13 | 1989-06-20 | ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体 |
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP60129037A Expired - Lifetime JPH0625762B2 (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | ミオシン軽鎖の測定法 |
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| JP1157516A Expired - Lifetime JPH02211896A (ja) | 1985-06-13 | 1989-06-20 | ミオシン軽鎖に対するモノクローナル抗体 |
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-
1989
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