JPS60228962A - 複数の抗体を同時に検出する為の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、血清、尿又は体液のようなサンプル中の少
なくとも２つの抗原の量を同時に検出しそして／又は測
定するためのイムノメトリーアッセイに関するものであ
る。この発明は、また、そのようなイムノメトリーアッ
セイを誘導するためのテストキットに向けられている。

〔従来の技術〕

免疫学的検定技法は、血清及び尿のような体液のいろい
ろなタイプの中の、特に生理学上有害であるような抗原
の濃度を測定する診断目的のために、だんだん使用され
るようになってきた。イムノメトリーアッセイと同様に
競争的免疫学的検定を含む免疫検定方法は、論点上の抗
原と、抗原もしくは抗体上にラベルによって検出される
複合体を形成する１つもしくは複数抗体との間の相互作
用になる。

その抗原が複数タイプの結合部位をもつ時、それらは免
疫計量検定によって、有利に検出される。

この方法において、シグナル成分によってラベルされた
可溶性抗体が、テストされる液体中で不溶性である固体
キャリアーに結合されているラベルされていない抗体と
共に用いられる。これらの２つのタイプの抗体は、可溶
性抗体のラベルによって検出される抗原と三元複合体を
形成する。その抗原が異なった位置でその表面上に２つ
の抗体を結合する、このいわゆる“サンドウィッチ′検
定は、ラディオイミュノアセイメソド（Ｒａｄｉｏｌｍ
ｍｕｎｏａｓａａｙＭｅｔｈｏｄｓ）版でワイドによっ
て、〔エディンパーグ：　Ｅ、＆、Ｓ、リビ／ゲストー
ｙ　（Ｅｄｌｎｂｕｒｇｈ：ｇ、＆ｓａ　Ｌｉｖｉｎｇ
ｓｔｏｎ＠）、１９７０　）で１９９〜２０６頁中でカ
ークハムなどによって一般的に詳述されている。アメリ
カの特許第４，３４３．８９６号もまた、液体サンプル
中の少なくとも二価抗原を検出するための免疫計量検定
の使用を詳述している。

アメリカの特許第４，３７６．１１０号は、ひとつのモ
ノクローンナル抗体が可溶性ラベルされた形で存在しそ
してもう−りのモノクローンナル抗体が不溶性キャリア
ーに結合しているワン−ツウ−ワンサンドクイ、チ免疫
計量検定を使用する技法を詳述している。この技法は、
サンドウィッチ検定でポリクローンナル抗体を使用する
進んだ従来技法にもまして利点をもたらす。たとえば、
モノクローンナル抗体を用いる同時的且つ逆検足は、ポ
リクローン抗体を用いる前記検定よりもより敏感でそし
て速い。さらに１可溶性サンドウィッチ複合体の形成は
所望の可溶性複合体の形成を競争しない。国際特許出願
１６　ＷＯ８２１０２６６１は同様の検定を示している
。１９８２年２月３日に公表されたヨーロッパ特許出願
０，０４５，１０３は、少なくとも２つのタイプのモノ
クローンナル抗体が定量されるべき同一の抗原に対して
意図される免疫化学的定量方法を記載している。′異な
ったクラス又はサブクラスのモノクローンナル抗体を用
いるツウ−サイト免疫学的検定及びそれを実施するため
のテストキット”と題名され、１９８３年２月１６日に
出願されたムララドの米国特許出願第４６６．７９８号
は、抗原を検出するのに使用される２つの抗体が異なっ
た免疫グロブリンクラス又はサブクラスに属するサンド
ウィッチ免疫計量検定の他の観点を開示している。イギ
リス特許第２．０７４，７２７号ドイツ特許出願第３２
０゛５β４！９号、並びにヨーロ、ノ臂特許出願第４８
，３５７号及び４４，２１９号は、同様の検定を記載し
ている。

しかしながら、少いサンプル体積、低試薬費、及び短い
全検定時間によって液体中の複数の抗原を同時に検出す
ることが時々所望される。Ｍ、り９９−１０り（１９８
２）は、人間の前立腺−特異起元、すなわち、前立腺酸
性フォスフェイターゼ及び前立腺抗原の２つのタンパク
質の存在を検、出する組織特異的マーカーの組合わせテ
ストを使用するととの利点を記載している。しかしなが
ら、クラヤマなどは、同時的方法によって２つの抗原を
検出するのではなく、むしろ、おのおのの抗原の別々の
測定の結果を組み合わせている。

（１９７２）、ルウングリンなどによるアクタ８１．４
８７−４９４（１９７６）、及びバイン１４．１２−１
５（１９７７）などは、半減期がわずか８日である１３
１１を含む２つの異なったヨウ素アイソトープで抗原を
ラベリングすることによって一つの管内で複数成分を測
定するために間接的競争的放射標識免疫検定を用いた。

ヴイッコなどによるクリニカルケミストリイ（ＣＩｉｎ
ｌｅａｌＣｈｅｍｌｓｔｒｙ）、、２７　、１７４４−
１７４６（１９８１）は、小試験管の異なった部分上に
２つのタイプの抗体を固定しそして１つの複数成分管を
形成するためそれらと合わせることを開示している。７
４ブテンが、１２５１によってラベルされ、そしてそれ
が間接的放射標識免疫検定により検出される＠この方法
は、固相キャリアの分離を含む比較的複雑な手法を提供
している。

アメリカの特許第４，３１５，９０７号及びジャー（１
９７９）は、おのおのの抗原のためのラベルされた結合
剤と共におのおのの抗原に対する別々に分離可能な固相
結合剤）を用いて多数抗原を定量するための特異結合検
定を記載している。おのおのの固相結合種はインキュベ
ーションの後他の種類のすべてから分離される。

（ＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｌｓ＋ｔｒｙ）−＊　２
８　＋　１４６７−１４７３（１９８２）は、安定して
おりそして容易な分離測定をさせることにおいて放射性
アイソトープ以上の利点を持つ２つの甲状腺ホルモンの
同時酵素免疫検定を記載している。この検出においては
、２つの異なった酵素でラベルされた２つの抗合体の混
合物が液体中で両抗原を同時に検出するのに使用される
。この酵素は、吸収測光によって相互に容易に区別でき
る生成物形成する。ブレイクは、両抗原を検出するのに
、単一検定化合物よりもむしろ２つの検定化合物、すな
わち、別別の固体キャリア上に固定された２つの抗体を
使用した。

前立腺抗原（ＰＡ）及び前立腺酸性ホスファターゼ（Ｐ
ＡＰ　）は、ヒト前立腺−特異蔵元の２つの別個の抗原
的タン１４り質である。生化学的に１ＰＡＰがｉｏｏ、
ｏｏｏの分子量及び４．２〜５．５の範囲の複数ｐＩを
もつのに対してＦＡは、６．９のｐＩ、１３３．０００
の分子量の糖タンｔ４り質である。抗血清は、抗原に対
して特異的に反応しそしてお互に交差反応をしない。前
立腺腫瘍へは特別でないけれども、ＰＡＰとＰＡの組み
合せは、前立腺癌を検出するのに有望なマーカーである
。なぜならばそれらは前立腺癌中で新生物性転換（ｎｅ
ｏｐｌａａｔｉｃｔｒａｎ＠ｆｏｒｍａｔｉｏｎの異な
った面を反映するからである。このように、両マーカー
を同時に検出することは、相当重要な診断手段を提供す
る。

〔発明が解決しよりとする問題点〕

従って、この発明は、現存する出版物中に詳述されてい
る検定方法に優る、複数の抗原、すなわち最りとも好ま
しくはＰＡ及びＰＡＰ　、を同時に検出するための改良
された方法を開示する。この方法においては、テスト液
体中の全抗原を検出するために１つのイミーノメトリー
アッセイ物質が使用される。従って、抗原の検定混合物
中で使用されるべき結合物の量の最適化が単純化される
。さらに、この発明の検定においては、測定は間接的競
争免疫検定ではなくむしろ直接的競争免疫検定である。

〔問題点を解決するための手段〕

特に１つの観点においてこの発明はサンプル中の少なく
とも２つの抗原の存在を同時に検出するための改良され
たイミュノメトリーアッセイを提供し、この方法は、サ
ンダルをそれぞれが該サンプル中の異る抗原に向けられ
ておりそしてそれぞれが別々に同一の又は異るシグナル
成分と接合している少なくとも２つのラベルされたモノ
クローンナル抗体と、及びそれぞれが前記サンプル中の
異る抗原に向けられておりそしてそれぞれが同一の支持
体に固定化されている少なくとも２つのモノクローンナ
ル抗体と接触せしめることを含んで〔具体的な説明〕 好ましい態様においては、抗原性物質は前立腺酸性フォ
スファターゼ及び前立腺抗原である。

第２の観点においてこの発明はサンプル中の少なくとも
２つの抗原の存在を同時に検出するだめの直接的イミ瓢
ツメトリーアッセイを提供し、この方法はそれぞれ前記
サンゾル中の異なる抗原に向けられておシそして （ａ）それぞれが同一の支持体く固定されてｂる少なく
とも２つの固定化モノクローナル抗体と共に該サンダル
をインキユベートし； （ｂ）段階（ａ）のインキエペーシ電ン生成物を、それ
ぞれが前記サンプル中の異なる抗原に向けられている少
なくとも２つのラベルされたモノクローンナル抗体とイ
ンキュベートシ； （ｅ）段階（ｂ）のインキ−ベージ言ン生成物と関連づ
けら゛れたラベルされた抗体の量又は関連ずけられてい
ないラベルされた抗体の量を検出し；そして（ａ）段階
（ｅ）からのラベルされた抗体の測定された量を対照又
は既知量の抗原を含有するサンダルと関連づける事忙よ
ってサンプル中に抗原の量を決定する； 第３の観点において、現在の発明はサンゾル中に少なく
とも２つの抗原の存在を検出するための改良されたイミ
ーノメトリーアッセイ方法を提供し、この方法は、（１
１）前記サンプル中の１つの抗原に対するラベルされた
モノクローンナル抗体、該抗原、及び同じ抗原に対する
非ラベルモノクローンナル抗体（この非ラベルモノクロ
ーンナル抗体は、支持体上に固定されておシ、この支持
体にはさらに前記サンプル中の異なる抗原に対する少な
くとも１つの非ラベルモノクローンナル抗体が固定され
ておシ、この非ラベルモノクローンナル抗体は前記の抗
原と複合体を形成し、この抗原は今度はこの抗原に対す
るラベルされたモノクローンナル抗体と複合体を形成す
る）の複合体を形成せしめ；そして（ｂ）前記複合体に
結合したラベルされた抗体の量又は結合していないラベ
ルされた抗体の量を測定すること罠よってす／ｆシル中
抗原の存在を検出する； 段階を含んで成る。

複合体は試薬の１段階又は２段階インキ−ページ目ンに
よって形成することができる。

この発明の前記以外の観点は、サンプル中の少なくとも
２つの抗原の存在を決定するためのイミ瓢ツメトリーア
ッセイを実施するためのテストキットを供給する事であ
シ、そしてそのキットは、サンプル中のおのおのの抗原
に対して向はうしてお）そして単一のラベル又は異なっ
たラベルに別々に接合されている少なくとも１つのモノ
クローンナル抗体の有効量、及び前記サンプル中のおの
おのの抗原に対して向けられている少なくとも１つのラ
ベルされな一モノクローンナル抗体の有効量（このラベ
ルされていないモノクローンナル抗体は１つの支持体上
に固定されている）を含んで成る。

このテストキットのもう一つの実施態様においでは、ラ
ベルされていないモノクローンナル抗体が、このラベル
されていない抗体を固体支持体上　（Ｋ固定することが
出来る化合物の効巣量とともに存在する。

テストサンプルの中の複数抗原の存在を定量する為のこ
の明細書に記載されている改良された単一免疫計量検定
を用いることによって、それぞれが１つの抗原に対して
特異的な複数の抗体を有する、２つもしくは複数の固体
支持体よシもむしろ１つの固形支持体を使用しながら２
つもしくは複数抗原を同時に検出することができる。さ
らに、もし異なるラベルが検定のために使用されるなら
、サングル中に存在するおのおのの抗原の正確な量は、
ラベルによって産生される異なったシグナルを別々に計
量することによって定量される。

この明細書に使用される次の言葉は下のように定義され
ている。′エピトープ（・ｐｉｔｏｐｅ）”という言葉
は、ちる一定の抗体だけが結合できる抗原上の特異部位
と解釈する。このように、この言葉は特異抗原決定基を
意味する。

°可溶性″という語は、抗原を含む液体媒体中に１００
％可溶性か又は実質的に（すなわち少なくとも約８０チ
）可溶性である抗体を意味し、そして逆に１不溶性”と
いう語は、液体媒体中に実質的Ｋ（少なくとも約８０チ
）又は完全に不溶性であるキャリアー（又は支持体）及
び抗体を意味している。

この発明の免疫計量検定が使用される対象となるサング
ルとは、検出されるべく複数の抗原を含んでいるか、も
しくは含んでいるかも知れないすべての液体もしくは生
物学的サンプルを意味する。

このす／プルには、ヒトの又は動物の体液、たとえば血
液、血清、尿、羊水１組織抽田物、脳を髄液、及びこれ
に類するものなどのような液体７３ヨ含まれている。そ
のサンプルは、不等定性、凝集。

又は貯蔵容器による吸収に対するサンプル中に含まれる
抗原の傾向に依存して、分析される前に抽出のような特
別の処理を要する。

この発明方法によって測定される抗原又は抗原性物質は
、抗体によって認識されそして結合される物質として広
く定義される。このように１抗原”という言葉は、免疫
性物質（免疫反応を弓１き起こす）及び−ゾテン物質（
免疫反応を引き起こさない）の両方を含んでいるべその
ような物質中の含有物は次のようなものである。たとえ
ばホルモン。

細胞、薬物、酵素、タンバク質、ペプタイド、細胞表面
抗原及び他の細胞構成物１分化抗原、リンＩカイン、増
殖因子、細菌、ビールス、免疫グログリン、アレルゲン
、微生物抗原、毒素たとえば。

破傷風及びヘビの毒と関連しているような毒素。

他の病原菌、及び、これらの抗原の２つもしくはそれ以
上の異なった種類の混合物。検定され得る特異抗原の例
には１次のようなものを含んでいる；免疫グロブリンＥ
、腫瘍マーカー抗原、インク具リン、人間の甲状腺刺激
ホルモン、副甲状腺ホルモン、神経増殖因子、ヒトの成
長ホルモン、破傷風毒素、アルブミン、オパルグミン、
７エリチン。

ＧＦＡタン／４り質、Ｓ−１００タンパク質、血液凝固
因子■１人間の絨毛ゴナドトロピンホルモン。

α−７エトプロライン、癌胎児性抗原、肝炎Ａ及びＢ、
及び前立腺酸性フオスフエイターズ及び前立腺抗原のよ
うなヒトの前立腺組織のタンノｆり質などでｓｂ、そし
てこれらは、ヨーロツ・り特許出願第０，０４２．４２
８及びに、クリヤ１などによる２二９９−１０５（１９
８２）Ｉｃ記載されている。好ましくは、サンプル中に
存在する抗原は、おのおのが複数決定因子である。すな
わち、それらは免疫学的に異なシそして補足的な抗体に
よって認識されそして結合される少なくとも２つのエビ
トーゾを含む。最っとも好ましくは、抗原の混合物は、
前立腺酸性フォスフェイターズ及び前立腺抗原を含んで
成る。

この発明における検定の１つのタイプの例示として、２
つの抗原の同時的２重サンドウィッチ免疫計量検定は１
次のようなモノクローンナル抗体からなる、すなわち１
つの抗原に対して１つのモノクローン抗体及びもう１つ
の抗原に対するもう１つのモノクローンナル抗体、いず
れもポリスチレン♂−ドのような１つの支持体上に固定
化される並びに、１つの抗原忙対して十つのモノクロー
ンナル抗体及び、もう十つの抗原に対するもう１つのモ
ノクローンナル抗体、（これらは別々にラベルとしての
同１の又は異なる検出シグナル、例えば酵素、放射性ラ
ベル又は螢光物質と接合している）を用いる。

この発明の検定で用いられるモノクローンナル抗体は、
メルステインなどによるネイチニア（Ｎａｔｕｒｅ）、
２５６，４９５−４９７（１９７５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ）−、コ５，５１１−５１９（１９７６）などに記
載されている体細胞雑種形成方法に従って一般的に得ら
れる。基本的には、この方法において、マウス又は他の
適当な宿主動物に、免疫原を注射し、そしてそれから殺
す、その得られた抗体産生性細胞（たとえばその肺臓又
はリンパ組織から取られた）は、ハイブリドマ（ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ）を形成する／　ＩＪエチレングリコール
のような適切な融合剤を使用して、適当な撰択可能な癌
（骨髄腫）細胞と融合する。好ましい骨髄腫細胞は、効
果的に融合し、その選ばれた抗体−産生性細胞による抗
体の安定した高いレベルの発現を維持し、そしてＨＡＴ
培地のような培地に対して感受性の細胞である。これら
の内好ましい骨髄腫細胞系は、例えばカリフォルニアの
サンジエイゴのソルクインスティテエートセルディスト
リビューシ冒ンセンターかう入手可能なＭＯＰＣ−２１
及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系である。この
ようにして用意されたハイブリドマは融合剤を取り除く
為に洗浄し、そして次に選択培地、例えばＨＡＴ中に接
種しそして増殖せしめることにより該培地に対して耐性
であ夛そして不死であるハイブリドマを選択する。

このようＫして選択されたハイブリドマを、たとえば放
射免疫検定及び又は酵素免疫検定によって特異抗原に対
して向けられた個々の抗体の産生についてスクリーニン
グ１そして同様の技法忙よって親和性について一般的に
スクリーニングする。

１つの特定の抗原の異なったエビトーゾに結合する抗体
を産生する陽性クロー／を、例えば次のようにして選択
することができる。すなわち抗原をまずクローンの１つ
からの非ラベル抗体とインキ−ベートシ、次に他のクロ
ーンからのラベルされた抗体とインキユベートすること
によシ、罪ラベル抗体の結合によってラベルされた抗体
の結合がブロックされるか否かを決定する。この発明の
ラベルされたモノクローン抗体は、完全免疫グロブリン
のみならずその抗原へ結合する抗体の一価もしくは２価
フラッグメントであってもよいことが注目される。その
ようなフラグメントは、適切な酵素を用いて所望のモノ
クローンナル抗体を消化しそしてこの消化物から所望の
７ラグメントを単離する事によって、調製することがで
きる。

そのハイプリｐマを、その所望の特異性２反応性、及び
親和性を有する抗体を分泌する個々のクローンを単離し
た後そのクローンを制限希釈法によってサツクローンニ
ングしそして既知の方法によ゛って増殖される。そのサ
ブクローン和よって分泌されたモノクローンナル抗体は
、たとえば硫酸アンモニウム沈澱法、ダル電気泳動、透
析、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィ又はアフイニ
テイクロマトグラフィのような常用の免疫グロブリン精
製方法によって培養培地、腹水液又は血清から分離する
ことができる。

次に個々のノーイプリドマ細胞系により産生されそして
分離されたその抗体をその抗体の産生を刺激した免疫原
物質とのそれらの結合についてスクリーニングする。好
のましい実施態様においては、スクリーニングから選択
されたモノクローンナル抗体は、少なくとも約ｘｏ”ｔ
Ａニル・より好ましくは、少なくともｉ　ｏ’ｔ１モル
の親和性を有すだろう。　・以下余白 １つの抗原に対して向けられたラベルされていない固定
モノクローンナル抗体が、その同じ抗原に対して向けら
れたラベルされたモノクローンナル抗体と異なるかどう
かは、主に使用される抗原のタイプに依存するだろう。

たとえば、もしその抗原が、ＰＡＰのように同時に同じ
抗体の結合を許容するのに十分な距離にある２つ又はそ
れ以上のエピトープを含むなら、それからその同じ抗体
をその同じ抗原に対して向けられたラベルされ及びラベ
ルされていない抗体の両者の為に使用可能である。しか
しながら、もしその抗原が、ＰＡＯようＫお互い全く異
なるエピトープを含むなら、その抗体は必然的にお互い
異なる。好ましくは、おのおのの抗原に対して向けられ
たそのモノクローンナル抗体は異なり、そして最っとも
゛好ましくは、その検定に用いられるすべてのモノクロ
ーンナル抗体は、異なった細胞系からのものである。

この発明において検定の為に用いられるおのおのの抗原
に対して向けられた。ラベルされたモノクローンナル抗
体は、テストされる液体に普通可溶性であり、おのおの
の抗体について同じか又は異なるシグナル成分によりラ
ベルされており、このシグナル成分比診断目的の為に便
利に検出することができるものである。

このように、おのおのの抗体は、その同じラベル部分と
別々に結合されるかもしれなく、又は分別計量の容易に
するために異なったラベルへ別々に接合されるかもしれ
ない。そのようなシグナル成分中に含まれるものは、た
とえば、アルカリフオスフェイターゼ、ビオチンアビテ
ィン、β−ガラクトシターゼ又はホースラディシュノ４
−オキシダーゼのような酵素ラベルであり、それらは、
螢−光性ラベル、たとえばフルオレスセインカソチオシ
アン酸エステル又はローダアミンのような分光もしくは
光化学ラベルである基質の添加によって検出可能であり
、たとえば　Ｉ、　３２ｐ　、　１４Ｃ１又は哨のよう
な放射性アイソトープライルであるルシフェリンのよう
な螢光針又は化学発光ラベルによって検出可能であり、
細菌分解ビールスラベルのようなスピンラベルの放射性
手段、及びその他同種類のものによって検出可能である
。さらに、アメリカの特許出願筒４６６，７９８号、ス
プラ（Ｓｕｐｒａ）　に詳述されているように、間接検
定は、ラベルされるべくそのモノクローンナル抗体に対
するラベルされた抗血清が、位置にラベルされた抗体ｔ
−ｆｆ１生する為に、培地に添加される点で用いられる
。

サンプル中に存在する抗原のおのおののタイプの定性的
測定得る為には、その測定でシグナルラベル成分を用い
れば十分である。しかしながら、もしサンプル中に存在
する、抗原のおのおののタイプの量の定量的測定を実施
する事が望ましい場合、異なった検出シグナルによって
検出可能である異なりたラベルを本つ検定を用いる事が
必要でありそして好ましい。たとえば、２つの別々の酵
素がそれらのおのおのの基質全触媒し、この生成物は異
なった波長で吸収される検定において用１．いられる。

その吸光度ピークの位置及び高さは、サンプル中に存在
するおのおのの抗原のタイプ及び量を決定するだろう。

使用されるシグナル成分もしくは複数部分に関する１つ
の決定因子は、おのおのがそこで作用する最適−である
。たとえば、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリフォス
ファターゼがアルカリ−値で最適に作用する、すなわち
β−ガラクトサイダーゼが８．１の最適−１そしてアル
カリフォスファターゼが１０．２の最適−で作用するの
に対して、ホースラディッシ、／ヤーオキシターゼは、
約６．０の最適−で作用する。もし複数の酵素ラベル成
分が使用されているなら、酵素のだめの基質は、低−で
最適に作用する酵素のための基質が最初に添加されるよ
うに、加えられる。

シグナル成分に抗体を別々に結合させる為に、当業界に
おいて既知の任意の方法を用いることができる。これら
の方法は、アメリカ特許第３．９４０，４７５（螢光）
及び３，６４５．０９０（酵素）；ハンターなどによる
ネイチーアー（Ｎａｔｕｒｅ）１４４、９４５（１９６
２）、デビットなどによるバイオケミストサイ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　ｌＢ　１１０１４−１０２１ザ
　イミュノロジカル　メソド（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ｔｈｅ載されている。現在の発明の検定において、異な
るラベルされた抗体数は、サンプル中の抗原数に依存す
るが、しかし、テストされるサンプルが少なくとも２つ
の抗原を含むので、少なくとも２つの抗体が必要である
。

単一支持体上に共に固定されているおのおのの抗原に対
して向けられたモノクローンナル抗体は、テストされる
液体に一般的に不溶性であり、いかなるシグナル成分に
よってもラベルされなく、そしてサンプルから抗原を物
理的に抽出するのに使用される。抗体がその上に固定上
での支持体、又はキャリアーは、一般的に本質的に水不
溶性であり、そして、たとえば表面、粒子、気孔性細胞
間質などの形での支持体が含まれるイば−ノメトリイア
ッセイに有用であると知られているようヶ支持体である
。普通使用される支持体の例は、ν紙。

セファデックス、ポリビニルクロライド、プラスチック
ビーズ又はポリエチレン、ポリプロピレン。

ポリスチレン、そして同種類のアガローズ、架橋デキス
トラン、他の多糖類などである。この明細書において好
ましいそのような支持体はポリスチレンビードである。

この明細書の検定において、異なる固定された抗体の数
は、ラベルされる抗体と同じように、サンプル中の抗原
の数に依存するが、しかしテストされるべきサンプルが
少なくとも２つの抗原を含むので少なくとも２つの抗体
が必要である。

抗体へ支持体を接合させるための方法は、これは所望に
より検定の前か又はその間に起こるかもしれないが、本
質的に不溶性な表面、マトリクス又は体へ抗体を化学的
に又は物理的接合させる事によって達成される。支持体
へ単一抗体を結合する為ＫＵ、Ｓ、特許第３，６４５，
８５２又はロトマン゛！どによるジル−ナル　オプ　ザ
　イミーノロジカル　メソド（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ｔｈｅ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　
５７．８７−９８　（１９８３）中に記載されている方
法は、次のような特別な修正でもって一般的に使用され
る。支持体は最初に必要なもの（たとえば支持体は、硝
酸及び還元剤でポリスチレンビードを処理する事によっ
て化学的に修飾される）として活性化される。第２に、
その支持体は、それと接結台されるべく抗体とともに混
合させられる。この混合は、適合する声、好ましくはＰ
Ｈ６の２−（Ｎ−モーフォリノ）エテンサルフォンリン
酸での緩衝液中で、そして架橋剤、好ましくけ３−（３
−シメチルアミノグロピル）カル？キジイミド（ＥＤＡ
Ｃ）の存在下で一般的に実施される。おのおのの抗体の
おおよその等量が、おのおのの抗体の濃度がそれらが加
えられる培地のために適切であるようにする為に、この
支持体培地へ加えられる。そして好ましくは、０．００
５　ｗ／ｖ　％のおの訃のの抗体の最終濃度を収量する
ために加えられる。

培養の後、その混合物は緩衝液で洗われそして緩衝液中
に保存される。

順、逆、又は同時検定を含む、既知の検定方法のいずれ
かを使用することができる。順検定において、まず固定
された抗体は最初に、２部分の固定された抗体、すなわ
ち抗原複合体を形成することＫよってそこから抗原を抽
出するために、テストされるサンプルとともにインキ−
ベートされる。

形成された固体複合体は、それからサンプルを取り除く
為洗浄され、そして固定された抗体：抗原ニラベルされ
た抗体の複合体が形成されるまで、ラベルされた抗体の
溶液とともにインキ−ベートされる。この複合体は未反
応のラベルされた抗体を取り除く為洗浄され、そしてそ
れから、たとえば、抗原を含まない標準サンプルと比較
してラベルされた抗体の存在を検出する事によって抗原
の存在の為Ｋ、テストされる。

同時検定においては、ラベルされていない固定された抗
体及びラベルされた抗体の両方は、同時・Ｋテストサン
プルへ加えられそしてひとつの段階でインキ−ベートさ
れる。インキ−ページ、ンの　１後、この得られた固定
された複合体は液体から分離されそして処理される、た
とえば、サンプルの残留及び非特異的に結合し、ラベル
されたモノクローン抗体などを選択的に取シ除く為に適
切な−で洗われる。このように、得られた複合体は上記
に記載されているように抗原の存在の為にテストされる
。

逆検定において、ラベルされた抗体はテストサンプルと
共にインキ−ベートされる。それからラベルされていな
い固定された抗体が加えられそして第２インキユベーシ
ヨンが実施される。この第２インキユページ、ン期間の
後、固相は、サンプル除去のため洗浄されそして抗原の
存在が上記に詳述されているようＫして検出される。

使用されるべき抗体の量は、抗原と検出可能な複合体を
構成する為の有効量である。今度はこれらの量は、たと
えば、ラベルのタイプ、抗原のタイプ、抗体のタイプ及
び検定方法のタイプなどに依存するだろう。たとえば、
順検定方法でなく、同時及び逆検定方法の両者は、サン
プル中に存在する抗原のほとんど又は、すべてを結合す
るのに十分な、おのおののラベルされた抗体の置場上の
固定された抗体の過剰量を要求する。さもなければバイ
ドーズフック効果（Ｈｌｇｈｄｏｓｓ　ｈｏｏｋ　ｅｆ
ｆｅｃｔ）が生じ、ひじょうに抗原がサンプル中に事実
に存在する時に人工的に減少した抗原量が測定されるだ
ろう。

この発明のイムノメトリイーアッセイで使用される、時
間、温度、−などのインキーペーションの為の条件、試
薬添加順序、分離（又は洗浄）、及び他の条件などは、
一般的に既知のイムノメトリーアッセイの為に記載され
たものである。たとえば、類２段階検定方法の為のイン
キーペーション条件は、たとえば０〜２５℃の低下した
温度において抗原と固定されたモノクローン抗体との間
の、そして約Ｏ〜４０℃の温度において、こうして産生
した固定された複合体とラベルされたモノクローン抗体
との間の結合などを助力するだろう。

逆２段階方法においては、反対の条件が要求されるだろ
う。おのおのの方法の為の−は、典型的に約６〜９０間
であシ、好ましくは約７であシ、そして抗原結合反応が
、平衡状態に達する為の時間は、培養温度及び−並びに
使用される抗体及び抗原のタイプに主に依存し、一般的
に約１０分〜２日を要す。

サンプル中の抗原の存在又は不存在は、たとえば、いろ
いろな既知手段によって固定された支持体を検定する事
によって、特に、支持体に結合したおのおののラベルさ
れた抗体量を測定し、そしてこの量を及び、１方又は両
方の抗原の無い対照中に又は、標章曲線でもやで検出さ
れるおのおののラベルされた抗体量へこの量を比較する
事によって決定される。負対照のパックグラウンドレベ
ルよシもかなり高い量のラベルされた抗体を検出する事
が、１方又は両方抗原の存在を定性に示している。もし
、ラベルされた抗体の量が、既知量の抗原の標準サンプ
ルについて得られたものとを比較しそして抗体上のラベ
ルが異なったシグナルを産生ずるならば、おのおのの抗
原量は、定量的に測定することができる。一方、検定さ
れるサンプル中の抗原量は、未会合のラベルされた抗体
量を測定する事によって決定される事ができる、すなわ
ち、これらはインキーペーションの間に複合体を形成し
なく、そして、その結果可溶性形態で残存する。使用さ
れる特定の検出技法は、もちろん、使用されるラベルの
タイプ及び数に依存するだろう。酵素ラベルのようなあ
る種のラベルを使用する場合、その生成物を、それを検
出可能圧する為に、適切な基質又はすがンドと反応させ
る必要があり、そして、それから、これを、たとえば吸
光分光分析にかける。

この発明の１つの好ましい検定方法においては、おの訃
のの抗原、抗原性液体、又はテストされるべく患者のサ
ンゾル（好ましくは緩衝液中に）に対して向けられたラ
ベルされないモノクローンナル抗体、及びおのおのの抗
原（そして緩衝液中Ｋ及び抗原性液体の量へ等しい総量
中に又は使用されるサンプル中に）に対して意図される
ラベルされたモノクローン抗体接合体などを固定する１
つの固体相支持体は、共に混合されそして２５〜３７℃
の温度で約３０分〜約２時間、好ましくは室温で２時間
インキ−ベートされる。この得られた、混合物は、それ
から、添加される特定の成分要素の為に適切な緩衝液に
よって洗浄され、次にその洗われた混合物は、たとえば
放射性アイソトープを検出する為の放射能のようなラベ
ル、たとえばホースラデッシーパーオキシターゼの為の
オルトーフェニレンデアミン、アルカリ性フォスフェハ
ターゼの為のフェノールフサレイン　モノフォスフェイ
ターゼ、又はその吸収性又は目に見える色の変化によっ
て検出される着色された生成物を形成するβ−ガラクト
サイダーズの為のｐ−ナイトロフェニルβ−Ｄガラクト
ピラノサイド、などのような酵素基質の添加、又は、螢
光ラベルの為の螢光などのために、それから、検出方法
へ任せられる。シグナルの量は、サンプル中の抗原の濃
度に直接的に関係するだろう。もし基質が酵素を検出す
るために使用されるなら、基質の溶液は、洗浄された検
定へ添加され、そしてそれから混合物は２５へ３７℃で
１５〜３０分間、好ましくは室温で３０分間インキ−ベ
ートされる。もし複数酵素ラベルが使用されるなら、第
２番目の酵素のための異なった基質が、それから、添加
されそして上記に詳述されるようにその混合物はインキ
−ベートされる。次に酸のような酵素活性を終らせる溶
液が添加されそしてその溶液の吸光度は、結合した抗体
の量を決定するためにすぐその後測定される。

この発明における、もう１つの好ましい検定方法におい
て、ラベルされていない抗体及びテストされるべき抗原
性液体又は患者のサンプルなどを固定する固相支持体は
共に混合され、同時検定で記載されたように培養され、
そしてそれから吸引される。吸引された混合物Ｋ、それ
からラベルされた抗体接合物が添加されそして、その得
られた混合物は、同時検定で上記で記載されたようにイ
ンキ−ベートされる。それからその混合物は適切な緩衝
溶液でもって洗浄され、そしてその洗浄された混合物は
、それから、上記に記載されたようなラベルのために適
切な検出方法にかける。

さらに次の例が、発明の実施態様をさら扛説明する。例
において、特にことわらなければすべての部分及びパー
センテージは体積につき重量（重量／体ｆｉ）であり、
そしてすべての温度の度はセルジアス（Ｃ）である。

以下余白 例１ 前立腺酸性フォスフェイターゼ（ＰＡＰ　）及び前立膝
抗原（ＰＡ）を検出されるべき抗原として選択した。

これらの抗原のおのおのは少なくとも３つの明確なエビ
ドーグをもつ。この発明で使用する為にＰＡ及びＰＡＰ
は、カリフォルニアのパークレーにあるアルタペーテ病
院の一部でるる生殖診療所の病理研究所からのヒト−前
立腺液体から得られた。

Ａ　精製されたＰＡ及びＰＡＰ抗原の製法下記に詳述さ
れている工程のすべては、４℃で実施した。全工程を３
週間のうちに実施した。

ＰＡＰ及びＰＡの精製の過程で、分子量、酵素活性、及
び／又は商業的に入手可能な抗体への免疫的反応性を用
いて、いろいろな段階及び画分中におけるＰＡＰ及びＰ
Ａの位置を調べた。

この例の序文中に上記したようにして得られたＰＡＰ及
びＰＡを含む約５０の冷凍ヒト−前立腺サンゾルを、垂
直な位置で解凍した。おのおののサ　Ｉンノルに、酢酸
ナトリウム及び塩化ナトリウムを含むｐＨ５，０の５０
ｍＭの酢酸ナトリワム緩衝液５ａを添加した。サンプル
をそれらの容器から取シ出しそして、プールし、空の容
器を２０ＩＩＬｔづつの酢酸す）　ＩＪウム緩衝液です
すぎ、そしてそのゆすぎ液及びサンプルを一緒にした。

この−緒にしたサンプルを１００．００Ｏｒｐｍで２０
分間遠心分離し、ペレットを捨て、セして上清液を集め
そしてその体積を計量した。

最終２０％の飽和状態を収量する為に上清液ｌａにつき
０．１１４．９の硫酸アンモニウムの量によってその上
清液へ、固体硫酸アンモニウムが加えられた。その混合
物をかき回し、そして３０分間静かに放置した。その得
られた溶液を１４　、００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離
し、ペレットを捨て、そしてその上清液を集め、そして
その体積を計量した。最終８０％の飽和状態を収量する
為に上清液ｌ―につき０．４２４１１の硫酸アンモニウ
ムがこの上清液へ加えられた。その混合液を、溶解が完
了するまで攪拌し、そして、そｎから３０分間静かに放
置した。その後、その混合液を１４　、０００ｒｐｍで
２０分間遠心分離し、その上清液を捨て、セしてペレッ
トを、０．５ＭのＮａＣ１ａ　１　ｍＭのＭｎＣｌ２，
１　ｒｎＭのＭｇＣｌ２及び１ｍＭのＣａＣｔ２ｆｆ含
むｐｉ（７，５の２０ｍＭのＴ　ｒ　１５−ＨＣＬから
成るＴｒｉｍ緩衝液の約２００ＩＩｌｔ中に溶解した。

その溶解さｎたペレットを、それから、その緩衝液の３
回交換しながら、同じＴｒｉｍ緩衝液の１）に対して透
析した。そのサンゾルをそｎから、前もってＴｒｉｇ緩
衝液で平衡化したＣｏｎＡ−８ｓｐｈａｒｏｓｅカラム
上に負荷した。七〇カラムを溶出液の２８０　ｎｍでの
吸光度０．０２吸光度単位よシも小さくなるまでＴｒｉ
ｍ緩衝液によ）洗浄した。次にそのカラムを、Ｔｒｉｇ
緩衝液中０．５Ｍのα−メチル−Ｄ−グルコサイドによ
）溶出した。

ＰＡＰ及びＰＡを含む混合画分をゾールしそしてプール
されたす／ノルを、アミコン（Ａｍｉｅｏｎ）濃縮器を
使用して約５０ＩＩＬｔに濃縮した。次にそのサンダル
を７１７のアリクオツドに分割し、そしておのおののア
リクオツドを、分子量マーカーで前もって検定された５
ｅｐｈａｅｒｙｌ　Ｂ−３００カラム上に負荷した。こ
のカラムをＰ）１６．０の上で上記された５〇−の酢酸
ナトリウム緩衝液によル溶出した。

ＰＡＰを含む分子量１００．０００での両分をプールし
、そしてＰＡを含む分子量３３，０００〜３４，０００
での両分をプールした。

めいめいのプールされたサンプルを、その緩衝液を３回
の交換しながらｐＨ７，５の２０　ｍＭ　Ｔｒｌ　ａ−
ＨＣ１緩衝液ＩＪに対して透析し、そしてそれからｐＨ
７，５の２０　ｍＭ　１７）　Ｔｒｉ　ｍ−ＨＣＬ緩衝
液で前もって平衡化されたＤＢＡＥ−Ｂｅ　ｐｈａｒｏ
ａｅカラム上に負荷した。カラムは、それから、溶出液
の２８０　ｎｍにおける吸光度が０．０２吸光度単位よ
ルも小さくなるまで、ｐＨ７，５の２０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｔ緩衝液によシ洗浄した。

ＰＡＰ　？ンノルを含むカラムを、塩ダラディエン）（
ｐＨ７，５の２０ｍＭのＴｒｉａ−ＨＣｔ中７５ｒｒＩ
Ｍ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム〕によシ溶出した。

ＰＡＰを含む両分を、プールした。ＰＡＰは、変性条件
下で、ボリアクリルアミゾダル電気泳動によって１つだ
けのバンドから成ることが示された。この物質をこの明
細書において精製さＡ７’ＣＰＡＰと称する。

ＰＡサンプルを含むカラムは、塩グラディエン）（ｐＨ
７，５の２０ｍＭのＴｒｉｍ−ＨＣｔ中Ｏ〜２００威の
塩化ナトリウム）よシ溶出した。ＰＡを含む両分をプー
ルした。ＰＡは、変性条件下でボリアクリルアミゾダル
電気泳動によって均質である事が示された。この物質を
、この明細書において精製されたＰＡと称する。

Ｂ　抗体の製法 異なる細胞系からＰＡＰに対して向けられた２つのモノ
クローンナル抗体及び異なる細胞系からＰＡに対して向
けられた２つのモノクローンナル抗体を、異なる細胞系
からの骨髄腫細胞を使用する事５１９（１９７６）に記
載さｎた体細胞雑種形成法に根本的に従って調製した。

この発明の検定技法で用いられる抗体を得るために、マ
サテー−セ、ツのケンプリップにあるチャールズ　リバ
ー研究所から購入されたＢＡＬＢ／Ｃマウスに、精製さ
れたＰＡの５０μ！又は精製された５０μｇのＰＡＰ及
び同体積のフロイン“ド完全アジ−バンド（商業的に得
られる）の混合物を腹腔内に最初注射した。２週間後、
そのマウスを、精製された２０μＩのＰＡＰ又は精製さ
れた２０μＩのＰＡ及び同体積のフロインド不完全アジ
ュバント混合物を腹腔内に注射した。

次にこの後これらのマウスに、最初の注射の後、約４９
〜５２日まで、その後数週間の間隔で同じ抗原混合物を
注射した。最後の注射は、精製された１０μｇのＰＡ又
は精製された１０μＩのＰＡＰ及び同体積のフロインド
不完全アジ−バンドから成る混合物を使用して行なった
。

最終免疫化の後２又は３日で、それらのマウスを殺し、
それらの肺臓を取り出した。その肺臓細胞ヲ、ダルベコ
モディファイド　イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）
（Ｄ部Ｍ）中に懸濁しそしてＳＰ２／’ＯＡｇ　１４骨
髄腫細胞（それは商業上入手可能で、ＡＴＣＣＡＣＲＬ
　１５８１として１２３０１　、？−クロウンドライブ
、ロックビル、Ｍｄ。

２０８５２のアメリカン　タイプ　カルチャー　コレク
シ目ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されており、そしてネ
ズミ骨髄腫５Ｐ−２細胞種をクローニングしそしてヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地
に感受性である１つのクローンを選ぶ事によって得られ
たもの）と、融合剤として分子量１０００のポリエチレ
ングリコールを用いて、１：１の骨髄腫細胞に対する肺
臓細胞の細胞数比率で融合せしめた。その融合生成物を
マイクロタイタープレートウェルにプレートし、そして
それららＤ匹Ｍ中１．ＯＸ　１０−４Ｍのヒポキサンチ
ン、４Ｘ１０　Ｍのアミノプテリン及び１．６Ｘ１０−
５Ｍのチミジン（ＨＡＴ）の溶液と接触させた。次忙、
プレートウェル中のクローンを、集団培養の中で増殖せ
しめ、そして遠心分離した。

次にその上清液を、エンザイムーリンクド　イミＳノソ
ーペント　アッセイ［Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ１ｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　（ＥＬＩＳＡ）
］　ｆ使用して陽性クローンについてスクリーンした。

この方法において、ｐＨ７，５のリン酸塩緩衝液（ＰＢ
Ｓ　）の１ａにつき精製さ扛たＰＡＰ又はＰＡの２．５
μ、ｉｉ＋ｉ、ｐＨ９，６ノ０．１Ｍ１７）炭酸ナトリ
ウム中で、それらをひと晩インキーベートすることによ
ってポリステレ　マイクロタイターグレートのおのおの
のウェルに結合させた。グレートに対して弱く反応した
抗体の結合を、トクィーン洗剤合有ＰＢＳ（ｐＨ７，５
）によシ選ばｎた段階間にウェルを洗う事によって弱め
た。

グレートが抗原によって被覆された後ｍのＭで体積比１
：３に薄められたハイブリドマ上清液を、そのフェルへ
加え、そして１〜２時間室温でインキ−ベートした。次
にそのウェルを上に記載した洗浄液により洗浄した。特
に、結合したＰＡ又はＰＡＰ抗体は、クサイの抗−ｉウ
スＩｇＧ−ボースラデッ７ユノや一オキ７ダーゼをフェ
ルに加えそして３０分間インキエペートすることによっ
て検出さｎた。ウェルを再び上記の洗浄液にょシ洗浄し
、そして０．２　ＩＩＬｔの２．２−アジノージ−（３
−エテルベンズチアゾリンスルホン酸）基′Ｘをそのウ
ェルに加えた。次にそのウェルを分光光度分析のため使
用した。この目的のために、光学濃度（吸光度単位で）
を、４１４ｎｎｚ　においてマイクロエリサリーダー（
Ｍｌｅｒｏ　Ｅｌｉｓａ　ｒｅａｄｅｒ）上で測定した
。

バックグラウンドは約０．１吸光度単位である事がわか
った。そのウェルのひじょうに濃い色が、抗体の高濃度
の強い陽性クロー／を示した。バックグラウンドの濃度
よシもよシ濃い光学濃度を示すフェルを保存した。ＰＡ
Ｐに対する１２３３クローンからの６９クローン及びＰ
Ａに対する５２６クローンからの３３クローンを、この
最初のマイクロタイターグレート検定スクリーニング中
に、陽性として固定した。仁れらの陽性クローンのうち
、１．５吸光度単位よ）も高い光学濃度をもっクローン
が、それらは高反応性を持っている事を示すので、保存
された。ＰＡＰに対する６９陽性クローンからの２７ク
ローン及びＰＡに対する３３陽性クローンから２４のク
ローンが高反応性を持つ事が見出された。　［ このように蓄えられた高反応性クローンを、固相放射免
疫検定（ＲＩＡ　）によ、９ＰＡ又はＰＡＰに対する親
和性についてテストした。このテストは、放射性トレー
サー（ラベルされたＰＡ又はＰＡＰ抗原）を含有する緩
衝液に、第２抗体に結合した固相支持体及び阻害剤（非
ラベル抗原）を加えそして２０℃で２時間インキュベー
トしそして遠心分離した。固相に結合したラベルされた
抗原の放射能を決定した。この実験から、その初期生成
を刺激する抗原についてのおのおのの抗体の平均親和性
が計算された。

使用された精密な競争放射標識免疫検定についての一層
の詳細な記載は、Ｒ，ミュウラーによる。ジャー（１９
８０）に規定されている。上記のテストにおいてＰＡＰ
へ選択的に結合する事が見出された２７クローンのうち
７クローンが、少なくともＩ　Ｘ　１０９ｔ１モルＰＡ
Ｐの親和性をもっていた。上記のテストにおいてＰＡへ
選択的に結合する事が見出された２４クローンのうち９
クローンが、少なくともｌＸ１０モルのＰＡへ親和性を
持っていたりこのようにしてスクリーンさｎた１６クロ
ーンを、遺伝的安定性、アイソタイプ及びＰＡ又はＰＡ
Ｐ検出のための感受性についてテストした。遺伝的安定
性とは、マウスへ注入された場合に腫瘍を生じせしめそ
して組織培養された場合にクローンの初期分離の後６ケ
月間モノクローンナル抗体を産生せしめるクローンの能
力でらる。モノクロって記載さｎたようなＲＩＡによっ
て、又は酵素免疫検定（ＥＩＡ）によって６ケ月間の全
期間にわたって検出さｎた。１６個のクローンのすべて
が遺伝的に安定である。こｎら１６個のクローンをさら
にそれぞれの抗原の特定のエピトープに結合する特異性
について当業界でよく知られている競争的又Ｉ／′ｉ付
加的結合法及び免疫沈殿法にょル、そしてそれらの検出
感度についてこの明細書に記載したＥＬＡ法によってテ
ストした。最後にＰＡＰ又はＰＡへ選択的に結合する１
６のクローンのアイソタイプを、既知方法によって市販
キットを使用決定し、そしてすべてがサブクラスｌのＩ
ｇＧａである事が見出された。

陽性クローンから調製しそして親和性、選択性及び安定
性、並びにアイソタイプ及び感受性についてスクリーニ
ングした、ＰＡに対する９種類のモノクローナル抗体の
内、２種類をＣＥＴＵＳ　ＲＬＳＤＯ６（ＡＮＴｌ−Ｐ
ＡＩ）−及びＣＥＴＵＳ　ＲＬ８ＤＯ９（ＡＮＴＩ−Ｐ
Ａ２）として命名し皮。これらｔ′ｉｐａの２つの異な
るエピトープに対して向けられたものである。陽性クロ
ーンから調製され、そして親和性、選択性及び安定性並
びにアイソタイプ及び感受性についてスクリーニングさ
れた、ＰＡＰに対する７種類のモノクローナル抗体の内
、２種類ｉ　ＣＥＴＵＳ　ＲＬ　ＴＭＯＩ（Ａｎｔｉ−
ＰＡＰＩ）及びＣＥＴＵＳ　ＲＬ　ＴＭ０１（Ａｎｔｉ
−ＰＡＰ２）と命名した。これらはＬ−の２つの異るエ
ピトープに対して向けられたものである。

これら４種類の抗体を産生ずるクローンのサンプルは、
１２３０１　／４−クロラン　ドライブ、ロックビル、
マリ−ランド２０８５２、Ｕ、８．Ａ、　１７）７メリ
カン　タイプ　カルチャー　コレクションに寄託されそ
して、それらへ指定された寄託番号及び寄託臼並びに最
少検出レベル（すなわちよシ高いレベルが検出され得）
及びおのおのの抗体の親和性を下の第１表に示す。

鳳下余白 表１ ＰＡＰ及びＰＡに対するモノクローンナル抗体上に詳述
されたハイブリドマ細胞系のすべては、ロックビル、Ｍ
Ｄ　２０８５２のアメリカンタイプカルチャー　コレク
ション（ＡＴＣＣ）Ｉｃ寄託された。ＡＴＣＣに寄託さ
れたおのおののハイブリドマ細胞系は、ＡＴＣＣとこの
特許出願の出頭人す碌わちシータスコーポレーションと
の間の契約に従りて表１に示されたおのおののＡＴＣＣ
表示をもっている。ＡＴＣＣとの契約は、この寄託を記
載しそして特定している米国特許の許可もしくは公表の
後、又は米国特許出願又は外国特許出願のいずれかが公
衆に最も早く公表された後に、公衆に対してこれらのハ
イツリドーマの子孫の永久的入手可能性を与えそして３
５　Ｕ、８．Ｃ，１２２及びそれに基〈９官規則（８８
６０Ｇ　６３８に特別に関する３７　Ｃｒ２１．１４を
含む）Ｋ従って米国特許商標局長官によシ決定されたも
のに対してこれらのハイブリドマ細胞系の子孫の入手可
能性を与える。この出願の出頭人は、これらの寄託され
たハイブリドマ細胞系のどれかが、適切な条件のもとで
培養された場合、死滅し又は失われもしくは破壊された
なら、通告に基づいて同じハイブリドマ細胞系の生存培
養物によって即座に補充するであろう事を承諾した。

陽性クローンの同定及びスクリーニングの後、細胞を、
数回サブクローニングしてそれらのモノクローン性を確
実にし、そしてそれから集団培養で増殖せしめそして富
抗体腹水を産生ずるためＢａ１ｂ／ｅマウスの腹腔内に
注射した。注射器によってネズミから回収されたこの液
体は、グロブリン及び他のタンパク質と共に、目的とす
るモノクローンナル抗体を含んでいた。

所望する特異的モノクローンナル抗体を、各段階を４℃
で管理し々がら次のように腹水から精製した。ネズミ腹
水の合計ＩＱＭを１４．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心
分離した。

この得られたペレットを捨てそして上清液の体積を決定
した。最終４０％の飽和状態を収量する為、上清液の１
１に対して０．２４３．９の量の固体硫酸アンモニウム
を添ヵロした。その得られた混合物を攪拌しそして次に
３０分間静かに放置した。

次にそれを１４，０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し
た。その上清液を捨てそしてそのペレットを−７，５の
２０ｍＭのリン酸ナトリウムｌＯ縦中に溶解した。この
溶液をＰ）１７．５の２０ｍＭリン酸ナトリウムの１リ
ツターの緩衝液３回でもって透析し、そしてこの得られ
たサングルを集めた。

その後そのサンゾルを１４．００　Ｏｒｐｍ　テ２０　
分間遠心分離しそしてペレットは捨てた。タンパク質濃
度及び上清液の体積を測定しそしてこれを適切な大きさ
のＤＥＡＥ　Ａｆｆｌ　−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅカラム上に
負荷した。それから、そのカラムを、分光光度計によっ
て測定した場合に２８９　ｎｍでのその溶液の吸光度が
０．Ｏ１吸光度単位よシも小さくなるまでＰＨ７，５の
２０ｙｎＭリン酸ナトリウムにより溶出した。初めのひ
じょうに小さなピークを表わしている画分を除外しなが
ら、はとんど１．０吸光度単位の最大吸光度をもつ最初
の吸光度ピークの画分を、プールしそして濃縮器の中で
約１０１＋１Ｊに濃縮した。

この得られたサンプルを、タンパク質含有量について、
そして技術的に既知の放射標識免疫検定によって免疫的
反応性について測定した。この方法で精製されたおのお
ののモノクローン抗体は、純粋であシそして免疫学的に
活性である事が認められた。

Ｃ１固定化支持体へ抗体の接合　Ｉ ＰＡＰ（ＣＥＴＵＳ　ＲＬＴＭＯＩ（Ａｎｔｌ−ＰＡＰ
Ｉ）　Ｋ対する１つの抗体及びＰ　Ａ　（ＣＥＴＵＳ　
ＲＬＳＤＯ６（Ａｎｔｉ−ＰＡＩ））Ｋ対する１つの抗
体を次の２段階法によってポリスチレンビードへ接合せ
しめた： ■、ｆ！リスチレンビードの化学修飾 商業的に得られた６、４　ｎｍの直径の４０００ポリス
チレンビードに氷酢酸中１０係の発煙硝酸の溶液１ノを
添加した。次にこの溶液を５０℃で２時間インキュベー
トしそれから蒸留水で約１ｏ回洗浄した。０．ＩＮの水
酸化ナトリウム中１％の亜ジチオン酸ナトリウム溶液（
還元剤として）の総計１ノをその溶液へ添加しそしてこ
の得られた混合液を５０℃で２時間インキュベートした
。それからそのサングルを蒸留水で１０回洗浄した。

ｎ、修ａされたポリスチレンビートへのモノクローン抗
体の共有結合 上記のように修飾されたポリスチレンピードＫｐＨ６の
１０ｍＭ　２−（Ｎ−−ｒ−ルホｌＪ／　）エタｙｘル
ホン酸緩衝液及び３−（３−ジメチルアミノゾロピル）
カルデジイミド（ＥＤＡＣ）を０．１％の最終濃度にな
るように次々と加えた。それから両モノクローンナル抗
体（それぞれ０．００５ｑｂの最終濃度になるようＫ）
を添加した。溶液の総量は６００１であった。この混合
物を室温で１時間インキュベートしそしてそれからＰ）
１７．　ｓの５０ｍＭＴｒｉｍ　−ＨＣＬで５回洗浄し
た。ｐｌ（７，５の５０ｍＭＴｒｌｓ　−ＨＣＬ、　０
．１　ＭのＮａＣｔ及び０．０５％の防腐剤から成るＴ
ｒｉｓ緩衝液中１係のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）
の混合液を、それから洗浄されたその混合物に加えそし
てこの得られた混合物を使用まで４℃で保存した。

この方法において記載する工程のすべては、もし違った
やシ方で丞相されなければ４０℃で実施した６その方法
で使用される緩衝液及び試薬のすべては窒素でフラッシ
ュし、そしてそれからパラフィンで封止した。ホースラ
ディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）酵素を検定シグ
ナルとして使用した。

１、ホースラディシュノ４−オキシダーゼ酵素留分液の
製法 商業的に得られた、使用されるホースラディシェノセー
オキシダーゼは、４０．０００の分子量をもチ。

そして０．１Ｍのリン酸ナトリウム及びｐＨ７，５で０
．１Ｍの塩化ナトリウムの結合緩衝液中１　ｗｌにつき
２５．５１１Ｉｇの濃度をもった。そのＨＲＰ溶液を同
じ接合緩衝液に対して透析し、そして約１．７Ｍの量に
回収した。

５ＰＤＰ　：ノぐ−オキシターゼの比が１２，６００Ｍ
Ｍ：６３０．５μＭ（２０：１のモル比）となるように
、１００係エタノール中Ｎ−サクシナイミティルー３−
　（２−／４’イリディルーデイサイオ）ゾロノ等イオ
ネイト（ＳＰＤＰ　）の４〇−溶液の３１５μノが、そ
のＨＲＰ溶液へ加えられた。その混合物を、それから、
攪拌しそして室温で３０分間インキュベートし、そして
それから、０．１Ｍの酢酸ナトリウム及びＰＨ４，ｓの
０．１Ｍ塩化ナトリウムから成るクエン酸ナトリウム緩
衝液で前もって平衡化された５Ｃ）ｌｌぺｙド体積を含
む８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５カラム上に負荷した。

ゲイドデリウムピークを約８〜１３画分に集め、そして
次に約１．５計に濃縮し、そして濃縮器を０．５１の酢
酸ナトリウム緩衝液でゆすいだ。それから、還元段階に
おいて、クエン酸ナトリウム緩衝液中０．５Ｍのジチオ
スレイトールから成る新たに用意されたストック緩衝液
をディサイオスレイトールの最終濃度が５０ｍＭとなる
ように加えた。その混合物を、それから攪拌しそして室
温で２０分間インキ−ベートしインキュベーションの直
後にその混合物を、リン酸ナトリウムで前もって平衡化
された５０継のベッド体積を有する５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ　−２５カラムに負荷した。

ボイド？リウムピークを約８〜１２画分からプールしそ
して２．５　ａｔに濃縮した。

■、モノクローンナル抗体画分の調製 上記のようにしてスクリーンされそして精製され、そし
て上記の接合緩衝液１Ｎにつき１０〜の濃度にされた所
望のモノクローンナル抗体（（ＪＴＵＳ　ＲＬＴＭＯ２
（Ａｎｔｉ　−ＰＡＰ　２　）及びＣＥＴＵＳＲＬ８Ｄ
Ｏ９（Ａｎｔｉ　−ＰＡ−２）　）　’ｔ、同じ接合緩
衝液に対して透析しそして約１．２５１１［の量で回収
した。

各精製された抗体（免疫グロブリン）に、１００％エタ
ノール中４０　ｍＭの５ＰＤＳ溶液７．９μノを加えて
、抗体と５ＰＤＰのモル比を１．５とした。おのおのの
混合物をそれから、かきまぜそして室温で３０分間培養
しそしてそれからリン酸ナトリウム緩衝液で前もって平
衡化された５０酎のベッド体積を含む５ｅｐｈａｄｅｘ
　Ｇ　−２５カラムに負荷した。

おのおのの抗体くついてゲイトぎリウムピーク画分をプ
ールし、そして２．５Ｎへ濃縮した。

■、抗体と酵素の接合 この工程は２つの異なった抗体を使用して２度実施され
た。上のステップＩ及び■から別々に得られたＨＲＰ酵
素画分及び抗体画分を一緒にしそして攪拌し、そしてそ
の混合物を室温で２２時間インキュベートした。その混
合物ｋｐ８７．５で０．０５Ｍ、　ＰＨ８溶液で前もっ
て平衡化された５００μのベッド体積を含むＢｌｏ−１
”ルＰ−３００カラム上に負荷し、そして約３〜４日間
ＰＢＳによυ溶出した。

酵素：抗体接合物を含むその画分（２３８，０００の分
子量位置で）をプールし、そして下に記載するように感
受性についてテストした。

上清液の１　ｙにつき０．４２４１！の硫酸アンモニウ
ムの混合物を１４，０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離
しそしてその上清液をすてる段階（この段階を含む）ま
でセクションＡに記載した方法を用いた。

このように回収された滅レットを、ホモジナイザーでゆ
っ〈シと４〜５ストロークで約２００ｍ１のＰＢＳ中に
溶解した。

その溶解されたペレットを、それから、ＰＨ８’ｌ（３
回取りかえながら４１に対して透析した。そのサンプル
を、それから１４，０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離
しそしてそのベレッ）１−捨てた。

ＰＡＰ及びＰＡを含むその上清液（３００■７２０ｍｇ
）をさらに８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｓ　−３００カラムに通
し、そしてｐｉ（７，５のＰＢＳにより溶出した。ＰＡ
Ｐ抗原標準を分子量１００，０００の画分からゾールし
そしてＰＡ抗原標準を、分子量３４，０００での両分か
らプールした。そのプールされたＰＡＰ及びＦＡ抗原標
準からの小アリコートを、標準として精製されたＰＡ及
びＰＡＰ又は市販キット標準を用いながら、ＲＩＡ又は
ＩＩＡによって抗原濃度について分析した。

重量によるＰＡ及びＰＡＰの５０　：　５０混合物は、
２つの別々のＰＡＰ及びＰＡ抗原標準を共に混合する事
によって調製した。

Ｆ、同時酵素イムノメトリーアッセイ 以下の記載において、Ａｂ名称は、次のようにおのおの
の接合した抗体のための略号である：接合物　種　別 ■、検定ＰＡＰ　＋　ＰＡと命名されたタイｆＡｂ１：
ＰＡＰ：Ａｂ２ 二ＰＡ：Ａｂ３のサンドウィッチイムノメトリーアッセ
イを次のような方法で評価した： 固定化モノクローンナル抗体（Ａｂｌ）の接合物をＢＡ
Ａ及びＴｒｌｓ緩衝液の懸濁液から取り出した。

セクションＥに記載した抗原標準としてのＰＡＰ及びＰ
Ａの５０　：　５０混合物を、ＰＡ及びＰＡＰの２００
μｌの全混合物を得るためにｐＨ７，５の５０ｍＭ　Ｔ
ｒｌｓ−ＨＣｔ、　０．１　ＭのＮａＣ１及び０．０５
％の防腐剤を含むＴｒｉｍ緩衝液中５　％　ＢＡＡ溶液
に添加した。ＨＲＰ酵素へ結合したモノクローンナル抗
体（Ａｂ２及びＡｂ３　）のそれぞれを、Ｔｒｉｓ緩衝
液中５％ＢＳＡＫ加えて、各接合体の溶液２００μＬを
得た０ Ａｂｌを、　ＰＡＰ／ＰＡ抗原標準２００μｔとともに
Ａｂ２及びＡｂ３のこれらの溶液と一緒にし、そしてそ
の得られた混合物を室温で２時間インキュベーションし
た。それからその混合物をｐＨ７，５の０．０１　ＭＴ
ｒｌｓ　−ＨＣＬ　、　０．１５　Ｍの塩化ナトリウム
。

０．１％のＢＳＡ、０．０５％の非イオン洗浄液、及び
０．０５％の防腐剤の溶液で各回４酩で３回洗った。

この洗浄された混合物に０．０５Ｍのクエン酸ナト１、
つ４、。１、ッ。ＩＪ　７ｒｌｌｆ　）　ＩＪつ４、。

、。３％。　１尿素過酸化水素及び０．０５％のチメロ
サールから成るＰＨ６，０の緩衝液１００ｍＪ中に基質
パウダーの０．２５．９を溶解する事によって作られた
オルトーフェニイレンディアミン（ＨＲＰへの基質とし
て作用する）溶液の０．５　ｄを加えた。

この得られた混合物を攪拌し、そして室温で３０分間イ
ンキュベートし、そしてそれからＩＮのＨＣ１溶液１　
ｍｌを酵素活動を止めるために添加した。ＨＣｌの添加
の後６０分以内Ｋ、４９２　ｎｍでその溶液の吸光度を
計った。その吸光度は、結合した抗原量を示す。サンプ
ル中のＰＡ及びＰＡＰ。

量は、精製された種々の濃度のＰＡＰ及びＰＡを使用し
、同じ方法で構成された標準カーブから決定することが
できる。その結果をテスト溶液中のＰＡＰ及びＰＡ（お
のおの同量）の合計量をＯ〜２００　ｎＪ／Ｕに変化さ
せる事によりくり返した。

ｎ、検定ＰＡと命名された、タイプＡｂ１：ＰＡ：Ａｂ
３のサンドウィッチイムノメトリーアッセイは、ＰＡＰ
ではなくＰＡの２００μｔが抗原標準として使用されそ
してＡｂ２溶液でな（Ａｂ３浴液の２００μＬが使用さ
れたという事を除いては、上記のセクションＦＩで記載
された方法によって対照標準として評価された。その吸
光度分析は、テスト溶液のＩＪにつきＰＡＪｉｌをＯ〜
１００ｎＪに変える事によって〈シ返えされた。

■、検定ＰＡＰと命名された、タイプＡｂｌ：ＰＡＰ：
Ａｂ２のサンドウィッチイムノメトリーアッセイは、Ｐ
Ａではな（ＰＡＰの２００μｔが抗原標準として使用さ
れセしてＡｂ３溶液でなくＡｂ２溶液の２００μｔが使
用されたという事を除いては、上記のセクションＦｌで
記載された方法によって対照標準として評価された。そ
の吸光度分析をテスト溶液の１１につきＰＡＰ量を０〜
１’００　ｎ、９に変える事によってくり返えした。検
定Ｐ　Ａ　、　ＰＡＰ　、及びＰＡＰ　＋　Ｐ　Ａの為
に、ＰＡ、ＰＡＰ及びＰＡＰ　＋　Ｐ　Ａの濃度対吸光
度の図が、それぞれ図１に与えられている。図１は、検
定ＰＡＰ　＋Ｆ　Ａ、すなわち２つのラベルされた抗体
を含んでいるこの発明の代表的検定が、その単一抗原に
対するただ１つのラベルされた抗体を含む両対照標準検
定よりも複数抗原に対して非常にすぐれた感度を現すこ
とを示している。さらに、この発明の検定はｌ　ｍｌに
つき１ｎｌよりも少い総量の抗原の存在を検出するのに
十分に敏感である。

Ｇ、２段階酵素イミュノメトリーアッセイ以下の記載に
おいて使用されたＡｂ表示はセクションＦで使用された
ものと同じである。

セクションＦに記載したのと同じサンドウィッチイミュ
ノメトリーアッセイすなわち ：ＰＡＰ：ＡＰ２ Ａｂｌ、ＰＡ：Ａｂ３．を次のような複数段階方法によ
って行なった： 接合体ＡｂｌをＢＳＡ及びＴｒ１ｇ緩衝液の懸濁液から
取シ出した。セクションＥで詳述された抗原標準として
のＰＡＰ及びＰＡの５０：５０混合液を、ＰＡ及びＰＡ
Ｐの２００μｔの総理合物を収量する為に、−７，５で
５０ｍＭのＴｒｉｍ　−ＨＣｌ　、　０．１　Ｍの塩化
ナトリウム及び０．０５９６の防腐剤などを含むＴｒ１
ｍ緩衝液中での５俤のＢＳＡに添加した。

接合体Ａｂｌは抗原混合物と一緒にし、そしてその混合
物を攪拌しそして室温で１時間インキユベートシた。ｌ
　ｍｌの水の総量が、それから加えられそしてその混合
液は、溶液を除くため吸い出された。

ＨＲＰ酵素ラベルを含む接合体Ａｂ２及びＡｂ３は、お
のおのの接合体の２００μを溶液を収量する為上記のＴ
ｒ１ｇ緩衝液中の５係のＢＳＡに、おのおの加えられた
。おのおのの接合体を、Ａｂｌ及び抗原標準の吸引され
た混合物に加えた。この得られた混合物を攪拌しそして
室温で１時間インキュベートした。それからその混合物
を蒸留水又はセクシ目ンＦで使用された洗浄Ｔｒｉｍ緩
衝液の４ｎｌで３回洗った。

０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１Ｍのリン酸す
）　ＩＪウム、０．０３％の尿素過酸化水素及び０、０
．５　％のチメロサールから成るＰＩ−１６，４の緩衝
液　゛の１２＋１１Ｊ中に基質錠剤の３０１ｎ９を溶解
することによって作られたオルトーフェニレエンディア
ミン溶液（Ｉ（ＲＰに基質としての作用）の０．３１Ｍ
’ｉ上記の洗浄された混合物に添加した。その得られた
混合物を攪拌し、そして室温で３０分間インキュベート
し、そしてそれからＩＮの塩酸溶液を酵素活動を止める
為に添加した。塩酸の添加の後６０分以内に結合したＰ
Ａ及びＰＡＰＯ量を決定する為に４９２　ｎｍでその溶
液の吸光度を検定した。

この検定の結果は、セクションＦの同時酵素イミュノメ
トリーアッセイが使用された時得られた結果と本質的に
は、同じであるという事がわかった。

風下余白 列２ この列は、この発明のイミュノメトリーアッセイ法を行
なう上で２つの異なったラベルを持つテストキットの使
用を説明している。

ＰＪＩＫ前記したすべての段階を用いてＰＡ及びＰＡＰ
に対するテストキットを調製した。但しラベルされた抗
体接合体の１つ（ＣＥＴＵＳ　ＲＬＴＭＯ２（Ａｎｔｉ
−ＰＡＰ２）を含んでいる）がラベルとしてβ−がラク
トシダーゼを含みそして他方のラベルされた抗体接合体
（（ＪＴＵＳ　ＲＬＳＤＯ９（Ａｎｔｉ−ＰＡ　２　）
を含んでいる）がラベルとしてアルカリ性ホスファター
ゼを含み、これらの接合を次の方法で実施した。すなわ
ち、他の丞相がなければすべての工程は４℃で実施しそ
して使用されるすべての緩衝液及び試薬を窒素によシ７
ラッシしそしてそれからパラフィンで密封した。

Ａ、アルカリ性フォスフェイターゼ酵素の抗体の接合 ■、アルカリ性フォスフェイターゼ酵素画分の調商業的
に得られる、使用されるアルカリフォスフェイターゼは
、１４０．０００の分子量及び０．１ＭのＴｒｉａ−Ｈ
Ｃｔ及びｐＨ７，４で０，１Ｍ塩化ナトリウムの接合緩
衝液中１９■／ｄの濃度を持った。そのアルカリ性フォ
スフェイターゼ溶液を上記の同じ結合緩衝液に対して透
析しそして約１．７−の量で回収した。１ｏｏｎ工タノ
ール中４０ｍＭのＳ　ＰＤＰ溶液８５μｔを２５：１の
５ＰＤＰ　：アルカリフォス７エイターゼのモラー比率
を得るためにアルカリ性フォスフェイターゼ溶液に加え
られた。それからその混合物を攪拌【７そして室温で３
０分間インキエペートし、そしてそれから、ＰＨ４，５
で０．１Ｍの酢酸ナトリウム及び０．１Ｍの塩化ナトリ
ウムから成る酢酸ナトリウム緩衝液で前もって平衡化し
た５Ｑｓｔ／のベッド体積を含む５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
　−２５に負荷した。ゲイトポリウムピークを約８〜１
３画分に集めそしてそれから約１．５ｄに濃縮し、そし
て濃縮器を０．５ｄの酢酸す）　ＩＪウム緩衝液ですす
いだ。それから、還元段階においては、酢酸ナトリウム
緩衝液中０．５Ｍのブチオスレイトール（ＤＴＴ）から
成る新たに調製したストック緩衝液を５０ｍＭＤＴＴの
最終濃度にするため加えた。それからその混合物を攪拌
しそして室温で２０分間インキ−ベートした。インキュ
ベーションの後直ちにその混合物を、Ｔｒｉｍ−ＨＣＬ
で前もって平衡化された５０ｍのベッド体積を含む５ｅ
ｐｈａｄｅｘＧ　−２５カラム上に負荷した。ボイドゾ
リウムピークを約８〜１２画分からプールしそして２．
５Ｎに濃縮した。

■、モノクローン抗体画分の調製 Ｐｏｌに記載したようにしてスクリーニングされそして
精製され、そして上記の接合緩衝液中４．３ｍｙ／ｃｄ
の濃度にした所望のモノクローンナル抗体、すなわちＣ
ＥＴＵＳ　ＲＬＳＤＯ９（ＡｎＴｉ　−ＰＡ　２　）を
同じ接合緩衝液に対して透析しそして約１．２５１ｄの
量で回収した。１：１０の５ＰＤＰに対する抗体のモラ
ー比率を得る為に１００チエタノール中４０ｍＭのＳ　
ＰＤＰ溶液の６．８μｔを、精製された抗体（免疫グロ
ブリンＧ）に添加した。それからこの混合物を攪拌しそ
して室温で３０分間インキ−ベートし、そ　１してそれ
からＴｒｉｓ−ＨＣｔで前もって平衡化された５０＃＋
７！のベッド体積を含む５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラ
ム上に負荷した。ゲイトポリウムピーク画分をプールし
そして２．５　ＩｒＬｔに濃縮した。

■、抗体と抗原の接合 アルカリ性フォスフェイターゼ酵素画分及び上の段階Ａ
Ｉ及びＡＩから得られた抗体画分を一緒にしそして攪拌
しそしてその混合物を室温で２２時間インキュベートし
た。それからその混合物を、０．１ＭのＴｒｉｍ−ＨＣ
ｌ、０．１Ｍの塩化ナトリウム、…７．４で１０ｍＭの
塩化マグネシウム、及び１ｍＭの塩化亜鉛から成る緩衝
液で前もって平衡化された５ｏｏｔ／のベッド体積を含
むＢｉｏ−Ｇ＠ｔＰ　−３００カラム上に負荷した。そ
のカラムを約３〜４日間同じ緩衝液によって溶出した。

酵素：抗体接合体（４３０，０００の分子量位置で）を
含む両分をプールしてそして例Ｉにおいて記載した感受
性の為に試験した。

Ｂ、β−ガラクトサイダーゼへの抗体の接合！、モノク
ローン抗体画分の製法 例１に記載したようにしてスクリーニングされそして精
製され、そして０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５
）及び０．１Ｍ塩化ナトリウムの接合緩衝液中ＩＱダ／
ａ／の濃度にした所望のモノクローンナル抗体、すなわ
ちＣＥＴＵＳ　ＲＬＴＭＯ２（Ａｎｔｉ　−ＰＡＰ２）
を、同じ結合緩衝液に対して透析しそして分子量１５８
，０００の精製された免疫グロブリンＧとして回収した
。１：５の５ＰＤＰに対する抗体のモラー比率を得るた
めに、１００％のエタノール中４０　ｍＭの５ＰＤＰ溶
液７．９μｔをこの溶液に添加した。それからその混合
物を攪拌し室温で３０分間インキュベートしそしてそれ
から、接合緩衝液で前もって平衡化された５０ｒＩＬｌ
のベッド体積を含む８ｓｐｈａｄ＠ｘ　Ｇ　−２５カラ
ム上に負荷した。そのカラムを接合緩衝液で溶出しそし
てゲイトポリウムピーク画分をプールしそして２５ｄに
濃縮した。

■、酵素と抗体の接合 インディ゛アナ州、インディアナポリスの？ヒリンガー
ヌンハイムから商業的に得られた分子量５４０．０００
のβ−がラクトサイダーズの結合緩衝液の１１につき合
計３４■と、上の段階、１から得られた抗体画分の結合
緩衝液のｌ　ｔｎｌにつき１０ｍ９とを、−緒圧しそし
て攪拌して、抗体と酵素のモル比を１：１とし、そして
その混合物を室温で２２時間インキュベートした。それ
から、その混合物を、セクションＢＩで記載された接合
緩衝液により前もって平衡化された５００ｄのベッド体
積を含むＢｌｏ−Ｇｅｔ　Ｐ−３００カラム上に負荷し
た。そのカラムは約３〜４日間同じ緩衝液によって溶出
された。酵素：抗体接合体を含む両分をプールしそして
例１で記載された感受性について試験した。

Ｃ，２段階酵素イミュノメトリーアツセイ以下の記載に
おいて、Ａｂ名称は、次のようなおのおのの結合抗体の
為の略号である： 接合体　種　別 Ａｂ　Ｉ　ＣＥＴＵＳ　ＲＬＴＭＯ１（Ａｎｔ　ｉ　−
ＰＡＰ　１　）そしてポリスチレンビードに別々に 結合したＣＥＴＵＳ　ＲＬＳＤＯ６（Ａｎｔｉ　−ＰＡ
Ｉ） 以下余白 Ａｂ４　β−ガラクトサイダーゼに別々に結合したＣＥ
ＴＵＳ　ＲＬＴＭＯ２（Ａｎｔｉ　−ＰＡＰ２） Ａｂ５　アルカリフォスフェイターゼに別別に結合した
ＣＥＴＵＳ　ＲＬＳＤＯ９（Ａｎｔｉ−ＰＡ２　） 検定ＰＡＰ’　＋　ＰＡ’と命名された。タイプＡｂｌ
アッセイを次のような方法で評価した：例１からの固定
されたモノクローン抗体（Ａｂｌ）の接合体を、ＢＳＡ
及びＴｒｌｓ緩衝液の懸濁液から取シ出した。例１のセ
クションＥで記載されたＰＡＰ及びＰＡ抗原基準液を、
２００μｔのＰＡＰ基準液及び２００μｔのＰＡ基準液
の合計を得るためＫｐ８７．５で５０圃のＴｒ　ｉ　５
−４（Ｃｔ、　０．１　Ｍの塩化ナトリウム及び０．０
５％の防腐剤を含むＴｒｉｇ緩衝液中５％のＢＳＡに添
加した。それらのおのおのの酵素（Ａｂ４及びＡｂ　５
　）によってラベルされたモノクローンナル抗体の接合
体を、おのおのの接合体の２００μを溶液を得るためＶ
Ｃｓ　Ｔｒｉｓ緩衝液中５チのＢＳＡＫ添加した。Ａｂ
ｌをこれらの抗原溶液と一緒にしそして得られた混合液
をかきまぜそして室温で２時間インキュベートした。そ
れからその混合物を吸引して溶液を除去した。それらの
おのおのの酵素（Ａｂ４及びＡｂ５）ＶＣよって２ベル
されたモノクローンナル抗体の接合体を、おのおのの結
合物の２００μを溶液を得るためにＴｒｉｇ緩衝液中５
％のＢＳＡに添加した。Ａｂ４接合体の溶液及びＡｂ５
接合体の溶液を、吸引された、Ａｂｌ及び抗原の混合物
に添加した。その得られた混合物を攪拌し室温で１時間
インキニ−トした。それからその混合物を、例１のセク
ションＦＩで記載されたＴｒｉｓ−ＨＣ１洗浄緩衝液の
各回４ばで３度洗った。

その洗浄された混合物に、５％のエタノール、１０ｍＭ
の塩化マグネシウム及び０．１ｍＭの塩化ナトリウムを
含むｐＨ８，１で１０ｒｒＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、中ｐ
−ナイトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトパイラノサイド（
β−ガラクトサイダーゼに基質として作用する）の２．
５ｍＭ溶液Ｑ、５ＩＬｌを添加した。それから、その得
られた混合物を攪拌しそして室温で３０分間インキュベ
ートしたｐ）１１０．２の０．ＩＭのジェタノールアミ
ン中フェノルサレインモノフォスフエイト（アルカリフ
ォスフェイターゼに基質として作用する）の８　ｍＭ溶
液０．５Ｍをその混合物に添加した。その得られた混合
物を攪拌しそして室温で３０分間インキュイードした。

それから、０．１ＭのＥＤＴＡを含むｐＨ１０，２で０
．５Ｍのリン酸ナトリウム溶液から１　ｍｌを酵素作用
を停止するために添加した。その停止溶液を添加した後
６０分以内に、４０５　ｎｍでその溶液の吸光度がβ−
ガラクトサイダーゼそれに従ってサンプル中にＰＡＰの
存在及び濃度を検出するために計られた。それから、５
５０ｎｍでその溶液の吸光度が、アルカリフォスフェイ
ターゼそしてたとえば、サンプル中にＰＡの存在及び濃
度を検出するため計られた。

図２は、４０５　ｎｍ　（ＰＡＰ濃度についての検定）
での及び５５０ｎｍ（ＰＡ濃度についての検定）での晒
光度の図、すなわち検定ＰＡＰ’＋ＰＡ’を図解してい
る。その結果は、サンプル中のＰＡＰ及びＰＡの存在及
び濃度を抗体に接合した２つの異なった酵素２−！ルを
持つ、この発明の検定を使用して同時に決定することが
できることを示している。４０５ｎｍでの読みはβ−ガ
ラクトサイダーゼの活性を計シそして従ってＰＡＰ　濃
度を割出し、そして５５０ｎｍでの読みは、アルカリ性
フォスフェイターゼの活性を計シそして従ってサンプル
中のＰＡ濃度を割出す。上の方法は、もし酵素ラベル及
び抗体を交換しても、うま〈実施されるだろう事を示し
ている。その上に、例１のセクションＦＩで記載された
同時醇素イミュノメトリーアッセイをこの例の接合体を
もちいながら行なった時、好結果が得られた。この発明
は、１つの接合体（少なくとも２つの抗原に対して向け
られた少なくとも２つのモノクローン抗体が固体支持体
上に固定されている）をテストキットとして使用して複
数抗原を検出する為の改良されたイミュノメトリーアッ
セイを提供するように見られる。

【図面の簡単な説明】

・　図１は、前立腺抗原（ＰＡ）、前立腺酸性フォスフ
ァターゼ（ＰＡＰ　）及びＰＡとＰＡＰとの組み合せに
ついての４９２　ｎｍの波長における分光吸収をこれら
の抗原のそれぞれに対する３つのサンドウィッチイミュ
ノメトリーアッセイ（例１に記載）を使用して測定し、
サンプル中の前記抗原又は抗原混合物の関数としてプロ
ットしたグラフを表す。 検定ＰＡＰ及びＰＡとして命名されたカーブはそれぞれ
ＰＡＰ及びＰＡに対する対照検定を表わす。使用された
ＰＡＰ及びＰＡの両者に対するイミュノメトリーアッセ
イは１つの単独タイプのラベルを含み、そしてその検定
はこの発明の例であシそして検定ＰＡＰ　十Ｐ　Ａのカ
ーブとして命名されている。 図２はＰＡ及びＰＡＰを含有するサンプル液についての
４０５　ｎｍ及び５５０　ｎｍにおける分光吸収を、こ
れらの抗原に対する例２に記載したサンドウィッチイミ
ュノメトリーアッセイを用いてめ、サンプル中の各抗原
の量の関数としてプロットしたグラフを示す。使用され
たＦＡ及びＰＡＰの両者に対するイミーノメトリーアッ
セイは、２つの異な　１つだタイプのラベルを含み、そ
してその検定は、この発明の例であシ、そして検定ＰＡ
Ｐ’　＋　Ｐ　Ａ’のカーブとして命名されている。 特許出願人 シタス　コーポレイシ、ン 特許出願代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 ｌＱ　１ ｒｓｒ　ＰＡ　（ｎｇ／ｍυ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンプル中の少なくとも２つの抗原の存在を検出す
   る為のイミュノメトリーアッセイであって該サンプルを
   それぞれが該サンプル中の異なる抗原に向けられている
   少なくとも２つのラベルされたモノクローナル抗体と、
   及びそれぞれが該サングル中の異なる抗原に向けられて
   おりそしてそれぞれが同一の支持体上に固定化されてい
   る少なくとも２つの固定化モノクローンル抗体と接触せ
   しめることを含んで成る方法。 ２、サンプル中の少なくとも２つの抗原の存在を検出す
   る為の直接的イミュノメトリーア、セイであって、 （−）　それぞれが前記サンプル中の異なる抗原に向け
   られておりそしてそれぞれが同一の支持体に固定化され
   ている少なくとも２つの固定化モノクローンナル抗体と
   共に該サンプルをインキュベートシ； （ｂ）　段階（ａ）のインキュベーション生成物ヲ、そ
   れぞれが前記サンプル中の異なる抗原に向けられている
   少なくとも２つのラベルさされたモノクロ−′ンナル抗
   体トインキュヘートシ；（ｃ）　段階（ｂ）のインキュ
   ベーション生成物と関連づけられたラベルされた抗体の
   量又は関連づけられていないラベルされた抗体の量を検
   出し；そして （ｄ）　段階（、）から検出されたラベルされた抗体の
   量から前記サンプル中の抗原の量を決定する；ことを特
   徴とする方法。 ３、サンプル中の少なくとも２つの抗原の存在を検出す
   る為のイミュノメトリックアッセイであって； （、）　前記サンプル中の１つの抗原に対するラベルさ
   れたモノｊ゛ローンナル抗体該抗原及び同じ抗原に対す
   る非ラベルモノクローンナル抗体（この非ラベルモノク
   ローンナル抗体は支持体上に固定されてお゛りこの支持
   体には、さらに前記サンゾび前立腺抗原である特許請求
   の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の測定方法
   。 ５、前記ラベルが酵素、放射性アイソトープ又は螢光物
   質である特許請求の範囲第１項〜３項のいずれか１項に
   記載の測定方法。 ６、それぞれの抗体が、そのそれぞれの抗体に対して少
   なくとも約１０８ＡＩ／％ルの親和性を持ち、そして固
   定された抗体、抗原、及びラベルされた抗体を同時にイ
   ンキュベートして複合体を形成せしめる特許請求の範囲
   第３項忙記載の測定方法。 ７、サンプル中の少なくとも２つの抗原の存在を検出す
   るためのイムノメトリーアッセイを実施するためのテス
   トキットであって、そのサンプ１４間昭ＧＯ−２２８９
   ６２（２） ル中のおのおのの抗原に対して向けられておりそして単
   一ラベル又は異なった複数のラベルに別々に接合されて
   いる少なくとも１つのモノクローンナル抗体の有効量、
   及び、前記サンプル中のおのおのの抗原に対して向けら
   れている少なくとも１つのラベルされていない、モノク
   ローンナル抗体の有効量（このラベルされていないモノ
   クローンナル抗体は１つの支持体に固定されている）に
   より特徴付けられているキット。 ８、サンプル中の少なくとも２つの抗原の存在を検出す
   るだめのイムノメトリーアッセイを実施するテストキッ
   トであって、そのサンプル中のおのおのの抗原に対して
   向けられておりそして単一ラベル又は異なりた複数のラ
   ベルへ別々に接合されている少なくとも１つのモノクロ
   ーンナル抗体の有効量、そのサンプル中のおのおのの抗
   原に対して向けられた少なくとも１つのラベルされてい
   ないモノクローンナル抗体の有効量、及び固体支持体上
   にラベルされていない抗体を固定することができる化合
   物の有効量によって特徴づけられたキット。 ９、前記抗原が前立腺酸性フォスフェイターゼ及び前立
   腺抗原である特許請求の範囲第７項又は第８項に記載の
   テストキット。 １０、少なくとも１つのラベルが、酵素、放射性アイソ
   トープ、又は螢光性物質である特許請求の範囲第７項又
   は第８項に記載のテストキット。