JPH10150999A - ヒト前立腺特異抗原−α１−アンチキモトリプシン複合体に対するモノクローナル抗体及びそれを用いたヒト前立腺特異抗原−α１−アンチキモトリプシン複合体の免疫学的検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ヒト前立腺特異抗原−α₁ −アンチキモ
トリプシン複合体（複合体型ＰＳＡ）と特異的に反応す
るが、ヒト遊離前立腺特異抗原（遊離型ＰＳＡ）及びヒ
ト遊離α₁ −アンチキモトリプシン（α₁ ＡＣＴ）とは
反応しないモノクローナル抗体、及びそれを用いた複合
体型ＰＳＡの免疫学的検出法、並びに該モノクローナル
抗体を生産するためのハイブリドーマ及び方法。 【効果】 複合体型ＰＳＡと特異的に反応するが、遊離
型ＰＳＡ及び遊離α₁ ＡＣＴとは反応しないモノクロー
ナル抗体を提供することができ、該モノクローナル抗体
を用いて複合体型ＰＳＡを検出又は測定することによ
り、前立腺癌の診断を容易に行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト前立腺特異抗
原−α₁ −アンチキモトリプシン複合体の免疫学的検出
法、該検出法に用いるモノクローナル抗体、該モノクロ
ーナル抗体を生産するためのハイブリドーマ及び方法、
並びに該モノクローナル抗体を用いた前立腺癌の検出方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】男性に見られる悪性疾患である前立腺癌
は、加齢とともに発生率が高くなり、前立腺癌であると
診断された男性患者の死亡率は３０％以上であるといわ
れている。腫瘍が原発部位に留まり、転移や湿潤を伴わ
ない早期に前立腺癌が発見されれば、その根治治療の機
会が得られる。腫瘍が前立腺外部に拡大すると、予後不
良で、根治治療は困難である。そのため、前立腺癌患者
の死亡率を下げるためには前立腺癌の早期発見が重要で
ある。

【０００３】また、前立腺癌と同様に、男性の加齢とと
もに多発する前立腺疾患として前立腺肥大症がある。前
立腺肥大症は良性疾患に分類される。悪性疾患である前
立腺癌の早期診断のためには、前立腺癌と前立腺肥大症
との鑑別を簡易に行える診断方法が望まれる。

【０００４】成人男子では通常血清中に少量の前立腺特
異抗原（ＰＳＡ）が検出される。一方、前立腺疾患患者
では、悪性、良性を問わず、一応に著しく多量のＰＳＡ
が血清中に検出される。また、血清中のＰＳＡのほとん
どが、遊離型、又はα₁ −アンチキモトリプシン（α₁
ＡＣＴ）との複合体の形態で存在していることが知られ
ている。そして、悪性の前立腺癌患者においては、複合
体型ＰＳＡが増加するのに対し、良性の前立腺肥大症患
者では、遊離型の割合が多いといわれている。従って、
血清中の総ＰＳＡ、複合体型ＰＳＡ、遊離型ＰＳＡの測
定値より、前立腺癌患者と前立腺肥大症患者との鑑別が
でき、ひいては前立腺癌の早期発見が可能である。

【０００５】このように血清中のＰＳＡは遊離型及び複
合体型として存在し、同様な形で血清中に存在するもの
として甲状腺ホルモンや白血球エラスターゼが知られて
いる。遊離型と複合体型とを分別する測定法としては、
例えば、遊離チロキシンの測定法として特公昭６３−１
１６２７号が知られており、複合体型エラスターゼの測
定法として特公平３−７０１８４号が知られている。こ
れらの遊離型、複合体型の測定法はそのままＰＳＡの測
定法として応用されている (J. Urology, 150,100-105
(1993))。

【０００６】ところで、ＰＳＡに対するモノクローナル
抗体としては、遊離型ＰＳＡと複合体型ＰＳＡとを区別
せずに反応するモノクローナル抗体（モノクローナル抗
体「Total 」）（特公平２−５６６３４号）や、複合体
型ＰＳＡとは反応せず遊離型ＰＳＡとのみ反応するモノ
クローナル抗体（モノクローナル抗体「Free」）が知ら
れている（特開平７−１７９４９９号）。しかし、複合
体型ＰＳＡと特異的に反応し、遊離型ＰＳＡとは反応し
ないモノクローナル抗体（モノクローナル抗体「Comple
x 」）は知られていない。

【０００７】前立腺癌患者において高値を示すのは複合
体型ＰＳＡであるため、公知のモノクローナル抗体を用
いて前立腺癌の診断を行うには、別に総ＰＳＡ及び遊離
型ＰＳＡの測定値を求め、その差を複合体型ＰＳＡ値と
する、もしくは総ＰＳＡに対する抗体とα₁ ＡＣＴに対
する抗体をサンドイッチに組合せて複合体型ＰＳＡを測
定する (Cancer Research, 51, 222-226 (1991), Clin.
Chem., 39, 2098-2103(1993))ことが必要である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、複合体型Ｐ
ＳＡと特異的に反応し、遊離型ＰＳＡとは反応しないモ
ノクローナル抗体及びそれを用いた複合体型ＰＳＡの免
疫学的検出法、並びに該モノクローナル抗体を生産する
ためのハイブリドーマ及び方法を提供することを目的と
する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体と特異的に反応す
るが、ヒト遊離ＰＳＡ及びヒト遊離α₁ ＡＣＴとは反応
しないモノクローナル抗体。 （２）ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体で免疫した哺乳動
物の免疫細胞と哺乳動物のミエローマ細胞とを融合して
得られ、前記（１）に記載のモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株。

【００１０】（３）前記（２）に記載のハイブリドーマ
又はそれに由来する細胞株を培養し、前記（１）に記載
のモノクローナル抗体を採取することを特徴とするモノ
クローナル抗体の製造法。 （４）前記（１）に記載のモノクローナル抗体を用いる
ことを特徴とするヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体の検出
法。 （５）前記（１）に記載のモノクローナル抗体と、該モ
ノクローナル抗体とは異なる部位でヒト前立腺特異抗原
−α₁ −アンチキモトリプシン複合体と反応する少なく
とも１種類の第２の抗体とを組み合せて用いる前記
（４）に記載の検出法。

【００１１】（６）前記（１）に記載のモノクローナル
抗体と、第２の抗体のいずれか一方が固相化されてお
り、他方が標識されている前記（５）に記載の検出法。 （７）前記（１）に記載のモノクローナル抗体を用い
て、血液試料中のヒト前立腺特異抗原−α₁ −アンチキ
モトリプシン複合体を免疫学的に測定し、前立腺癌を検
出する方法。 （８）前記（１）に記載のモノクローナル抗体を含む前
立腺癌診断用キット。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体で免疫した哺乳動物の免
疫細胞をもとに公知の方法によって得ることができる。
ここで用いる免疫原としては、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ
複合体であれば特に制限はなく、例えば、H. Lilja et
al., Clin. Chem., 37, 1618-1625(1996) に記載されて
いるように前立腺癌患者血清から精製したり、Z. Chen
et al., Clin.Chem., 41, 1273-1282(1995) に記載され
ているように精製ＰＳＡとヒト血清を混和した後、精製
することによって得ることができる。

【００１３】ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体を免疫原と
して用いる場合、該複合体そのものを抗体産生用免疫原
として動物に免疫してもよいし、該複合体と担体（キャ
リア）を結合させたものを抗体産生用免疫原として動物
に免疫してもよい。担体を使用する場合には、スカシガ
イのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミ
ン、ポリリジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリ
ジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の公知の担体を用
いることができる。

【００１４】そして、前記複合体と担体の結合法は、グ
ルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ−サ
クシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸
法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はジパルミチルリジン
法等の公知の結合法を用いることができる。

【００１５】モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融
合法(G. Koehler et al., Nature,256, 495-497(1975))
によるハイブリドーマにより得ることができる。また、
得られたハイブリドーマを、更に無血清培地や低血清培
地でも増殖可能にした細胞株を抗体産生細胞として用い
ることもできる。細胞融合法によるモノクローナル抗体
の調製は、以下の操作により行うことができる。

【００１６】まず、前記免疫原を哺乳動物（マウス、ラ
ット等、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）に免疫す
る。免疫原の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位
等により適宜決められるものであるが、例えば、マウス
の場合には一匹当たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの
前記免疫原を免疫注射するのが好ましい。なお、免疫原
はアジュバントを添加混合して免疫注射をすることが好
ましい。アジュバントとしては、完全フロイントアジュ
バント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミ
ニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知
なものを用いることができる。

【００１７】免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背
部等の部位に行えばよい。初回免疫後、１〜３週間間隔
で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に免疫原を追
加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜
６回が一般的である。この場合も免疫原はアジュバント
を添加混合して追加免疫注射をすることが好ましい。

【００１８】初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価
の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価が
プラトーに達したら、免疫原を生理食塩水（０．９％塩
化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔
内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日
後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ
球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。

【００１９】この免疫動物より得られた抗体産生能を有
する細胞と哺乳動物（マウス、ラット等）のミエローマ
細胞とを細胞融合させるが、ミエローマ細胞としてはヒ
ポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフ
ェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）
等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株であ
る、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソース
バンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３・ＮＳ−１／１・
Ａｇ４．１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／
Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）などを用いる
ことができる。

【００２０】細胞融合は、各種分子量のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）やリポソーム等の融合促進剤を用い
て行うか、又は電気融合法により行うことができる。ミ
エローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のもの
である場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チ
ミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることに
より、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイ
ブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることがで
きる。

【００２１】このようにして得られたハイブリドーマの
培養上清をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免
疫学的測定法により測定することにより、ヒトＰＳＡ−
α₁ＡＣＴ複合体を特異的に認識する抗体を産生するハ
イブリドーマを選択することができ、この方法と限界希
釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行う
ことにより、本発明のモノクローナル抗体を生産する細
胞株を単離して得ることができる。具体的には、ＰＳＡ
−α₁ ＡＣＴ複合体、遊離ＰＳＡ及び遊離α₁ＡＣＴの
３種の抗原に対する反応性を指標に、目的とする抗体を
産生する細胞をスクリーニングし、クローニングして細
胞株とする。得られた細胞株を適当な培地で培養して、
その培養上清から本発明のモノクローナル抗体を得るこ
とができるが、培地としてはＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１
６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いること
ができる。無血清培地又は低濃度血清培地等を用いても
よく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好まし
い。

【００２２】また、モノクローナル抗体産生細胞株を、
これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した
哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたま
った腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることも
できる。

【００２３】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又は
アフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいは
これらの方法を組み合わせることにより、精製された本
発明のモノクローナル抗体を得ることができる。

【００２４】本発明のモノクローナル抗体を用いること
により、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体を特異的に検出
又は測定することができる。

【００２５】本発明の検出法は、抗体を用いる測定法、
即ち免疫学的測定法であれば、いずれの方法においても
その測定法で使用される抗体として、前記の抗体を用い
ることにより、所期の効果を奏するものであって、例え
ば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫
測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、
免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集反応、ラテ
ックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応又はウエ
スタンブロット法等により本検出法は実施される。

【００２６】本検出法における試料としては、血液、血
清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹
水、又は細胞あるいは臓器の抽出液等のヒトＰＳＡ−α
₁ ＡＣＴ複合体が含まれる可能性のある生体試料であれ
ば対象となる。特に血清のような血液試料において、本
発明のモノクローナル抗体を用いて得られたヒトＰＳＡ
−α₁ ＡＣＴ複合体の測定値は前立腺癌の指標として有
用である。

【００２７】本検出法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定
法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識を用い
た免疫測定法により実施する場合には、サンドイッチ法
又は競合法により行うことができる。競合法の場合には
標識したヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体を測定試料中の
ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体と共に本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応させる。本発明のモノクローナル抗体
はヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体と特異的に反応するの
で、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体の競合法による特異
的な測定が可能である。従来公知のモノクローナル抗体
では遊離ＰＳＡ等とも反応するので競合法によるヒトＰ
ＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体の測定は不可能である。

【００２８】また、サンドイッチ法の場合には固相化抗
体及び標識抗体のうち少なくとも一方が本発明のモノク
ローナル抗体であればよい。固相担体としては、ポリス
チレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロ
ン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガ
ロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セ
ラミックス、又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイ
クロプレート、試験管、スティック、又は試験片等の形
状の不溶性担体を用いることができる。固相化抗体は、
固相担体と抗体を物理的吸着法、化学的結合法又はこれ
らの併用等の公知の方法に従って結合させることにより
調製することができる。

【００２９】標識物質としては、酵素免疫測定法の場合
には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミ
ラーゼ等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチ
オシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又は
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等を、そして放
射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又
はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免
疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ₂ −ルシフェラーゼ
系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウ
ムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いること
ができる。

【００３０】標識物質と抗体との結合法は、酵素免疫測
定法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、
ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方
法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボル
トンハンター法等の公知の方法を用いることができる。

【００３１】測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理
学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行
会，１９８３年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第
３版，医学書院，１９８７年，北川常廣ら編「蛋白質核
酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，
１９８７年，入江實編「ラジオイムノアッセイ」，講談
社サイエンティフィク，１９７４年，入江實編「続ラジ
オイムノアッセイ」，講談社サイエンティフィク，１９
７９年）により行うことができる。

【００３２】例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させて、固相化抗体−ヒトＰＳＡ−α_１ ＡＣＴ
複合体−標識抗体の複合体を形成させる。そして未結合
の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合
標識抗体量より試料中のヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体
量を測定することができる。

【００３３】具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識
酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成
物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法
の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測
定法の場合には放射性物質標識による放射能量を測定す
る。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を
測定する。

【００３４】本検出法を免疫比濁法、ラテックス凝集反
応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反
応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光
を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により
実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン
緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いること
ができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や
非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

【００３５】抗体を固相担体に感作させて用いる場合に
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よ
りなる粒子を使用することができる。この感作の方法と
しては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの方法
の併用等の公知の方法を使うことができる。

【００３６】測定の操作法は公知の方法により行うこと
ができるが、例えば、光学的方法により測定する場合に
は、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体
を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透
過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場合
には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器中
で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集
の状態を目視的に判定する。なお、目視的に測定する代
わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定
を行ってもよい。

【００３７】以下に、本発明の検出法の好ましい実施態
様の一例を示す。本発明のモノクローナル抗体を第１の
モノクローナル抗体として不溶性担体に固定する。この
固定化された第１のモノクローナル抗体と被検試料とを
接触させる。次いで、前記第１のモノクローナル抗体と
異なる部位で、ヒトＰＳＡ−α₁ＡＣＴ複合体と反応す
る、標識を付した第２の抗体とを接触させ、前記標識か
らの信号を検出する。

【００３８】ここで用いる「第１のモノクローナル抗体
と異なる部位で、ヒトＰＳＡ−α₁ＡＣＴ複合体と反応
する第２の抗体」は、第１のモノクローナル抗体と結合
したヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体の該複合体部分で結
合する、即ち、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体における
ＰＳＡとα₁ ＡＣＴとの結合によってマスクされる部位
以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はなく、免
疫原の種類（例えばヒトＰＳＡ、ヒトα₁ ＡＣＴ、ヒト
ＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体）を問わず、ポリクローナル
抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、
またこれらの抗体のフラグメント（Ｆab、Ｆ(ab')₂、Ｆ
ab' 等）を用いることもできる。更に、第２の抗体とし
て複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。

【００３９】またこれとは逆に本発明のモノクローナル
抗体に標識を付して第２抗体とし、本発明のモノクロー
ナル抗体と異なる部位で、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合
体と反応する抗体を第１の抗体として不溶性担体に固定
し、この固定化された第１の抗体と被検試料とを接触さ
せ、次いで、第２の抗体として標識を付した本発明のモ
ノクローナル抗体とを接触させ、前記標識からの信号を
検出してもよい。

【００４０】ところで、ヒトα₁ ＡＣＴを認識する抗体
を第２の抗体として使用する場合は、本発明のモノクロ
ーナル抗体を固相抗体として用い、固相に試料中のヒト
ＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体を補足させ、試料を除去した
後で標識抗体としたヒトα₁ＡＣＴを認識する抗体を反
応させるのが望ましい。試料中には、かなりの量の遊離
α₁ ＡＣＴが存在するので、試料とともにヒトα₁ ＡＣ
Ｔを認識する抗体を反応させると、遊離のヒトα₁ ＡＣ
Ｔが競合的に結合し高い感度を期待できない場合がある
からである。

【００４１】

【実施例】以下、実施例により、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明の範囲はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。本実施例において、ヒト遊離型ＰＳ
Ａ及びヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体は SCRIPPS LABOR
ATORIES INC.より入手し用いた。またヒトα₁ ＡＣＴは
コスモ・バイオ（株）より入手し用いた。また、従来の
モノクローナル抗体として、遊離型ＰＳＡを免疫原とし
モノクローナル抗体「Total 」を２種類（番号４及び
５）とモノクローナル抗体「Free」１種類（番号１）を
自家調製し、本実施例において使用した。

【００４２】なお、本実施例において次の略号を用いる
ことがある。 Ｔ−ＰＳＡ：総ＰＳＡ（遊離型ＰＳＡ及びＰＳＡ−α₁
ＡＣＴ複合体） Ｆ−ＰＳＡ：遊離型ＰＳＡ Ｃ−ＰＳＡ：ＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体

【００４３】（実施例１）モノクローナル抗体「Comple
x 」の調製 （１）ハイブリドーマの作製 ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体１０μg を生理食塩水
０．５ｍｌで希釈し、これを完全フロイントアジュバン
トと等量ずつ混合してエマルジョンとしてＢＡＬＢ／ｃ
マウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に３週間
おきに３回免疫後、更に１カ月おいて前記ヒトＰＳＡ−
α₁ ＡＣＴ複合体１０μg を生理食塩水０．３ｍｌで希
釈して静脈内に注射した。３日後に免疫したマウスから
脾臓を取り出し、脾細胞を分離した。この脾細胞とマウ
スミエローマ細胞株（Ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１
株）を電気融合装置により細胞融合させた。得られた融
合細胞に対し、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体との反応
性試験を行い、反応性の高かったクローンについて、ク
ローニングを行いシングルコロニーであることを確認し
た。

【００４４】次に、ヒト遊離型ＰＳＡ、ヒトα₁ ＡＣ
Ｔ、ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体の３種類の抗原に対
して反応性試験を行った。¹²⁵Ｉ標識した３種類の抗原
に、各クローン同量の抗体を反応させ、どの抗原に特異
的に反応する抗体かを確認した。その結果は表１に示す
とおりであり、以下の３つのグループに大別された。

【００４５】（Ａ）ヒトＰＳＡ（Ｆ−ＰＳＡ）と反応す
るモノクローナル抗体を産生 ２７５−７９ （Ｂ）ヒトα₁ ＡＣＴと反応するモノクローナル抗体を
産生 ７９０−６７、１５５７−３５、１６８５−１７、ＮＲ
１２６−３５ （Ｃ）ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体（Ｃ−ＰＳＡ）と
反応するモノクローナル抗体を産生 ２３１−９３、３１４−６１、１０２１−２３

【００４６】前記ハイブリドーマのうち、ヒトＰＳＡ−
α₁ ＡＣＴ複合体に対するモノクローナル抗体を産生す
る３種のハイブリドーマは、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に平成８年８月７日付けにて寄託さ
れている。ハイブリドーマの名称及び受託番号の関係を
以下に示す。 ＣＰＡ ２３１−９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７２） ＣＰＡ ３１４−６１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７３） ＣＰＡ １０２１−２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５７７４）

【００４７】

【表１】

【００４８】表１における略号は以下のことを意味す
る。 PSA-ACT Complex ：¹²⁵Ｉ標識ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ
複合体 ＡＣＴ：¹²⁵Ｉ標識ヒトα₁ ＡＣＴ ＰＳＡ：¹²⁵Ｉ標識ヒト遊離型ＰＳＡ TOTAL C.：TOTAL Count 各反応容器中の総放射能
（Ｔ）、単位ｃｐｍ Count ：それぞれの¹²⁵Ｉ標識抗原が結合した免疫複合
体の放射能（Ｂ）、単位ｃｐｍ Ｂ／Ｔ（％）：総放射能に対する結合放射能の比

【００４９】（２）モノクローナル抗体の産生 （腹水化）ＢＡＬＢ／ｃマウス８週齢メスの腹腔内に
０．５ｍｌのプリスタンを接種した。マウスハイブリド
ーマを予め１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で培養し、２
週後にマウス１匹につき１×１０⁶ 細胞を腹腔内に接種
した。更に１〜２週後に腹水を採取し、１２００ｒｐｍ
の遠心分離により細胞を除去しモノクローナル抗体を得
た。

【００５０】（培養法）マウスハイブリドーマを１０％
ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地で培養し、細胞数が５×１０⁵
細胞／ｍｌに達した後に、ＰＭ−１０００培地（栄研化
学社製）で１２００ｒｐｍの遠心分離にて細胞を１回洗
浄した。洗浄後フレッシュなＰＭ−１０００培地に細胞
を５×１０⁵ 細胞／ｍｌに懸濁し、スピナーフラスコで
１週間培養を続け、抗体培養液を作製した。

【００５１】（３）モノクローナル抗体の精製 前記（２）の腹水については、プロテインＡセファロー
ス（ファルマシア社製）、ＭＡＰＳキット（バイオラッ
ド社製）によりアフィニティー精製した。前記（２）の
培養抗体については、陽イオン交換カラム及び陰イオン
交換カラムにより精製した。

【００５２】（実施例２）サンドイッチ法による測定 （１）実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いて
サンドイッチの測定系が組めるかどうかの検討を行っ
た。標準には０〜１００ｎｇ／ｍｌのヒトＰＳＡ−α₁
ＡＣＴ複合体を用い、標識抗体には「Total 」（従来の
抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体番号４を使用）を用
い、固相抗体には「Total 」（従来の抗ヒトＰＳＡモノ
クローナル抗体番号５を使用）及びヒトＰＳＡ−α₁ Ａ
ＣＴ複合体に対するモノクローナル抗体「Complex 」
（ハイブリドーマ２３１−９３，３１４−５１，１０２
１−２３が産生するモノクローナル抗体を使用）をそれ
ぞれ用い、それぞれの組合せのヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ
複合体との反応性を調べた。

【００５３】なお、ここで用いた従来の抗ヒトＰＳＡモ
ノクローナル抗体「Total 」（番号４及び５）とは、ヒ
トＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体におけるＰＳＡとα₁ ＡＣ
Ｔとの結合によってマスクされる部位以外のヒトＰＳＡ
部分を認識する抗体（遊離型ＰＳＡと複合体型ＰＳＡと
を区別せずに反応するモノクローナル抗体）を意味す
る。測定操作を以下に示す。

【００５４】

【化１】（測定操作） 検体又は標準 １００μｌ 緩衝液 ２００μｌ 固相化抗体（ビーズ） １個 ↓室温１時間攪拌 ↓洗浄¹²⁵ Ｉ標識抗体 ２００μｌ ↓室温１時間攪拌 ↓洗浄 放射能量を測定

【００５５】その結果を表２に示す。表２に示したよう
に、 Total（標識抗体）− Total（固相抗体）の組み合
わせ（Ｔ−ＰＳＡ測定系）では高い反応性を示した。こ
れに対し、 Total（標識抗体）−Complex （固相抗体）
の組み合わせ（Ｃ−ＰＳＡ測定系）においては、Ｔ−Ｐ
ＳＡ測定系より低いＢ／Ｔ値を示したものの、本発明の
モノクローナル抗体がＣ−ＰＳＡの測定に充分に使用可
能であることが判明した。

【００５６】

【表２】

【００５７】次に、標識抗体に抗ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣ
Ｔ複合体モノクローナル抗体「Complex 」（ハイブリド
ーマＣＰＡ２３１−９３が産生するモノクローナル抗体
を使用）を用い、固相抗体には「Total 」（従来の抗ヒ
トＰＳＡモノクローナル抗体番号４又は５を使用）、
「Free」（抗ヒト遊離型ＰＳＡモノクローナル抗体番号
１を使用）を用い、標準にはヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複
合体を用いて組み合わせ試験を行い、その反応性を調べ
た。なお、対照として従来の抗ヒトＰＳＡモノクローナ
ル抗体番号４を固相抗体、番号５を標識抗体とする組み
合わせも行った。結果を表３に示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】表３における略号は以下のことを意味す
る。 ４：抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体「Total 」、番号
４ ５：抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体「Total 」、番号
５ １：抗ヒトＰＳＡモノクローナル抗体「Free」、番号１

【００６０】表３より、抗ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合
体モノクローナル抗体「Complex 」（標識抗体）−「Fr
ee」（固相抗体）の組み合わせはＣ−ＰＳＡを全く検出
できず、抗ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体モノクローナ
ル抗体「Complex 」（標識抗体）− Total（固相抗体）
の組み合わせでは、Total −Total の組み合わせ（４−
５）を対照にしてみると反応性は低いものの、本発明の
抗ヒトＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ複合体モノクローナル抗体
「Complex 」（標識抗体）− Total（固相抗体）の組み
合わせでもＣ−ＰＳＡ測定に充分に使用可能であること
が判明した。

【００６１】（実施例３）血清試料の測定 前立腺癌患者（試料 No.１、３、４、５、６、７、９、
１１）及び前立腺肥大症患者（試料 No.２、８、１０）
の血清試料１１検体につき、モノクローナル抗体「Tota
l 」、「Free」、「Complex 」及び抗ヒトα₁ ＡＣＴモ
ノクローナル抗体「ACT 」を組み合わせてサンドイッチ
法により総ＰＳＡ（Ｔ−ＰＳＡ）、ＰＳＡ−α₁ ＡＣＴ
複合体（Ｃ−ＰＳＡ）及び遊離型ＰＳＡ（Ｆ−ＰＳＡ）
の測定値を求めた。なお、Ｔ−ＰＳＡ測定では「Total
」（固相）−「Total 」（標識）の組合せを用い、従
来法のＣ−ＰＳＡ測定では「Total 」（固相）−「ACT
」（標識）の組合せを用い、Ｆ−ＰＳＡ測定では「Fre
e」（固相）−「Total 」（標識）の組合せを用いた。

【００６２】本発明のＣ−ＰＳＡ測定では「Complex 」
（固相）−「Total 」（標識）を組合せて測定し、結果
はそれぞれのハイブリドーマの番号で表わす。測定は実
施例２と同じ測定操作で行った。個々の測定値を表４に
示す。表５では従来法のＣ−ＰＳＡ測定値とＦ−ＰＳＡ
の測定値を加えたもの（以下「Ｃ＋Ｆ」という）、並び
に本発明によるＣ−ＰＳＡの測定値とＦ−ＰＳＡの測定
値を加えたもの（以下「番号＋Ｆ」という）を計算し、
更にそれらの値をＴ−ＰＳＡ値と比較し（「Ｃ＋Ｆ／
Ｔ」「番号＋Ｆ／Ｔ」）、総ＰＳＡ値＝遊離型ＰＳＡ値
＋複合体型ＰＳＡ値が成り立つことを検討した。

【００６３】

【表４】

【００６４】

【表５】

【００６５】表４及び表５における略号は以下のことを
意味する。 Total ：総ＰＳＡ値（Ｔ−ＰＳＡ） Complex ：従来法（「Total 」−「ACT 」の組合せ）に
より測定した複合体型ＰＳＡ値（Ｃ−ＰＳＡ） Free：遊離型ＰＳＡ値（Ｆ−ＰＳＡ）

【００６６】表４は、Ｃ−ＰＳＡの測定値が従来法及び
本法のどちらの測定法を用いてもほぼ同じ値を示し、し
かも、Ｔ−ＰＳＡ値、Ｆ−ＰＳＡ値の間にあることを示
している。図１は、従来法のＣ−ＰＳＡ値（Complex ）
と本発明のＣ−ＰＳＡ値（231-93）の相関図である。ｒ
＝０．９８１、ｙ＝１．０２ｘ−０．１６５と本法と従
来法がよく相関することを示している。

【００６７】表５は、Ｔ−ＰＳＡ値＝Ｆ−ＰＳＡ値＋Ｃ
−ＰＳＡ値が成り立つことを示しており、本発明のモノ
クローナル抗体を用いた測定法の変動係数（ＣＶ）が
５．５％前後と従来法と大きな差はなく、当該測定系が
信頼できるものであること、及び本発明のモノクローナ
ル抗体を用いるとＣ−ＰＳＡを特異的に測定できること
を証明している。

【００６８】

【発明の効果】本発明によれば、複合体型ＰＳＡと特異
的に反応するが、遊離型ＰＳＡ及び遊離α₁ ＡＣＴとは
反応しないモノクローナル抗体を提供することができ、
該モノクローナル抗体を用いて複合体型ＰＳＡを検出又
は測定することにより、前立腺癌の診断を容易に行うこ
とができる。

【００６９】本発明のモノクローナル抗体は遊離α₁ Ａ
ＣＴとは反応しないため感度の向上に貢献する。公知の
複合体型ＰＳＡ測定法ではα₁ ＡＣＴに対するモノクロ
ーナル抗体を用いていたため、血清中に遊離α₁ ＡＣＴ
が多量に存在する時には、複合体型ＰＳＡとの競合が生
じ、結果として反応が阻害されることがあり、血清試料
が直接抗α₁ ＡＣＴ抗体と接触する免疫測定法、例えば
１ステップサンドイッチ法ではこの影響が無視できな
い。これに対し、本発明のモノクローナル抗体は遊離α
₁ ＡＣＴの影響を受けることなく、試料中の複合体型Ｐ
ＳＡを特異的に測定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来法（Complex ）と本発明の方法（231-93）
とで求めた前立腺癌患者血清中のＣ−ＰＳＡ測定値の相
関図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト前立腺特異抗原−α₁ −アンチキモ
   トリプシン複合体と特異的に反応するが、ヒト遊離前立
   腺特異抗原及びヒト遊離α₁ −アンチキモトリプシンと
   は反応しないモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒト前立腺特異抗原−α₁ −アンチキモ
   トリプシン複合体で免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳
   動物のミエローマ細胞とを融合して得られ、請求項１記
   載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ又は
   それに由来する細胞株。
3. 【請求項３】 請求項２記載のハイブリドーマ又はそれ
   に由来する細胞株を培養し、請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗
   体の製造法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
   いることを特徴とするヒト前立腺特異抗原−α₁ −アン
   チキモトリプシン複合体の検出法。
5. 【請求項５】 請求項１記載のモノクローナル抗体と、
   該モノクローナル抗体とは異なる部位でヒト前立腺特異
   抗原−α₁ −アンチキモトリプシン複合体と反応する少
   なくとも１種類の第２の抗体とを組み合せて用いる請求
   項４記載の検出法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のモノクローナル抗体と、
   第２の抗体のいずれか一方が固相化されており、他方が
   標識されている請求項５記載の検出法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
   いて、血液試料中のヒト前立腺特異抗原−α₁ −アンチ
   キモトリプシン複合体を免疫学的に測定し、前立腺癌を
   検出する方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載のモノクローナル抗体を含
   む前立腺癌診断用キット。