JPH0641172A - ヒト羊水からのca195状物質およびその分離方法 - Google Patents
ヒト羊水からのca195状物質およびその分離方法Info
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Abstract
において、安全かつ安価にCA195 状物質が得られる。 【構成】 適当なヒト羊水試料を選択し、該ヒト羊水か
らCA195 状物質を分離するか、あるいは該ヒト羊水を
分析その他の目的に有用な形態に変換することから成
る。
Description
状物質の分離およびその使用に関する。CA195 状(C
A195 −like)免疫反応性抗原がヒト羊水中に確認され
た。この物質は、CA195 と類似の作用をし、これと極
めて類似した組成を有する。
C195 (Bray等、1987年)によって識別される腫瘍関連
抗原である。正常の被検者は、現行のラジオイムノメト
リック方(Gupta 等、1987年;Sundaram等、1987年;Bh
argavva 等、1987年)では極めて低いか検出できない血
清CA195 レベルを示す。しかしながら、膵臓、胃、肝
臓、結腸、および他の胃腸悪性腫瘍の患者では高レベル
のCA195 がしばしば見られる。Sundaram等(1987年)
は、結腸・がんの検出に、伝統的な腫瘍マーカーCEA
よりCA195 の方が優れていることを見い出した。血清
レベルは、主に病気の予後および経過をみるのに用いら
れる。このマーカーは診断段階で有用性があまりない
が、いまだに付加的手段として使用されている。Hybrit
ech 社は、ヒト結腸腫瘍から膜を用いて腫瘍関連抗原を
検出するためのラジオイムノアッセイを開発した。この
ラジオイムノアッセイはHybritech 社から市販されてい
る。このアッセイのためのキャリブレータおよび対照物
質(Controls)が、種々の悪性腫瘍組織またはヒト結腸
・がん細胞株から得られる(Fukuta等、1987年)。しか
しながら、ヒトがん組織は得るのがむずかしく、高価で
あり、種々の安全性における問題を有する。ヒト細胞株
からCA195 を得るには組織培養設備を必要とし、安全
性の問題を伴い、高価であり、そして比較的少量しか得
られない。
の識別に関する。この物質は、正常ヒト血清中よりも羊
水中にずっと多量に存在し、他の人由来物質を取扱う困
難を伴わずに分離できる。羊水中のCA195 状物質の識
別は、以前の物質および方法より産生がずっと安価であ
り、以前の物質と同じ位有用な物質の分離を可能にす
る。
ず、CA195 状物質の使用および分離の技術をもカバー
するものである。
作用をし、CA195 と同じ組成であると考えられる物
質、CA195 状抗原の新規なソースに関する。
よび使用に関する。
から採集し、これを分析してCA195 状物質が存在する
かどうかを調べる。羊水を分析するために、固相ツーサ
イトイムノラジオメトリックアッセイ(solid phase,tw
o-site immunoradio metricassay )を使用する市販の
ラジオイムノアッセイ技術(Hybritech 社製CA−195
−RIA)を用いる。このアッセイにおいて、試料を、
CA195 抗原に対する抗体でコートしたプラスチックビ
ーズと反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識
化抗体と反応させる。ヒト血清中よりずっと多量のCA
195 状物質が、ヒト羊水中に存在することがわかった。
ヒト羊水中の前記物質のレベルは約800〜1000U/mlで
あり、一方正常なヒト血清中の前記物質のレベルは10U
/ml未満であることがわかった。ヒト血清中のCA195
状物質の濃度が10U/mlを超えるとがん状態に関係する
と思われる(Bhargava等、J.Tumor Marker Oncology ,
2巻(1987年)319 ページ)。このイムノアッセイが羊
水中の物質を検出するという事実は、免疫学的特性にお
いてCA195 状物質が真正CA195 抗原と、同一ではな
いとしても類似するものであることを示している。
いてヒト羊水から前記物質を分離するためにさらなる作
業を行うことができる。それらの技術には、クロマトグ
ラフィー技術およびイムノメトリック(immunometric)
技術があるが、これらに限定されるものではない。
において悪性腫瘍組織からのCA195 が使用されるよう
な種々の用途に、すなわち、ヒト血清中のCA195 の定
量的および定性的測定のための臨床検定の対照物質(co
ntrols)として使用できる物質を開発するため、分離さ
れたCA195 状物質を用いることができる。
生するための免疫原としても使用できる。ポリクローナ
ル、モノクローナルまたは他の抗体を、CA195 状物質
に対して用いることもできる。抗体(ポリクローナルま
たはモノクローナル)を産生する技術は十分に確立され
ている。ポリクローナル抗体を産生するため、ヒトCA
195 状物質を所望の動物(通常ウサギ)に注射して免疫
反応を生じさせることができる。次に、この動物の血清
をCA195 への抗体のソースとして使用する。動物がC
A195 に対して特異的な抗体のみを産生し、外来性タン
パクに対して特異的な抗体は産生しないように、免疫原
として使用すべく多量の純粋CA195 を有することが特
に有用である。モノクローナル抗体を産生するため、ヒ
トCA195 状物質を所望の系統のマウス(あるいは技術
が確立していれば他の動物でも可)に注射し、不滅の抗
体(immortal antibody )分泌細胞株を産生し、これを
CA195 識別のためスクリーニングすることができる。
ここでも多量の純粋CA195 はスクリーニングの時間を
短縮すると共に、CA195 に対して特異的な抗体を分泌
する細胞株を得る可能性を大幅に向上させる。
その他)を産生するための技術は当業者にとって周知で
ある。例えば、Koehler,G.およびMilstein C.,256 Natu
re(1975年),495 ページ;並びにDavis,B.,R.Dulbecc
o,H.Eisen,H.GinsbergおよびW.Wood,Principles of Mic
robiology and Immunology, 第2巻,Harper Z Row,New
York,1973年を参照のこと。
ための最良の態様を記載している。しかしながら、ラジ
オイムノアッセイ,ELISA および他の分析技術などを加
えた全ての分析法においてCA195 状物質は真性CA19
5 を代替することができることに留意されたい。例え
ば、抗原を検出するためのほとんどのノムノアッセイ
は、標識化抗原か標識化抗体のどちらかを利用する。C
A195 状抗原または抗体は、例えば放射性標識、酵素標
識、蛍光標識、ケミルミネッセント標識あるいは免疫化
学分析法における有用性を付与する他の標識を付加する
などの種々の確立された技術を利用して標識化できる。
これらの標識はノムノアッセイのリポーティング群(rep
orting group)として機能する。既知の濃度の所望の抗
原を含む基準物質(standard)またはキャリブレータもま
た、通常必要である。ヒト羊水からのCA195 状物質あ
るいはそれから産生される抗体は、上記成分の安価なソ
ースを与える。ヒト羊水は、真性CA195 が現在使用さ
れている他の分析法において、濃縮して用いるか、もし
くは濃縮せずに用いることもできる。
抗体は固体支持体上に固定することができる。その支持
体としては種々の支持体が使用できる。例えば、アガロ
ース樹脂(セファロース他)、ガラスビーズその他が支
持体として使用できる。CA195 状物質に対する固定化
抗体は粗ソースから純粋なCA195 状物質を得るための
迅速で有効な純粋ツールとして作用する。同様に、純粋
な抗体が固定化CA状物質を用いて得られる。これらの
イムノアフィニティークロマトグラフ法は文献において
十分確立されている。
れるかの例を示しているが、それは限定的なものではな
い。例えば、固定化CA195 状物質抗体を、CA195 を
含まない血清を得るための除去剤(stripping agent)と
して使用することもできる。
に説明する。
の採集、CA195 状物質の識別、純粋化およびその利用
の種々の面について記載する。
をプールし、チーズクロスを通して濾過して粒子を除去
した。プールのpHを4NHClまたは6NNaOHで6.
8 ±0.1 に調整した。次にこのプールを、3.0 ミクロン
以上の粒子を通過させないカートリッジを通して濾過し
た。次にこのプールを−20℃で冷凍保存した。
ラジオイムノアッセイを用いてCA195 状物質の存在を
確かめるための検定を行った。それは、試料をCA195
抗原に対する抗体でコートしてあるプラスチックビーズ
と反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識化抗
体と反応させる固相ツーサイトアッセイであった。製造
者の支持を正確に守って実行した。このアッセイにおい
て、ビーズを羊水の試料および放射性標識化CA195 抗
体と混合した。次にビーズを洗浄して未結合標識化抗体
を除去した。固相に結合した放射能は試験試料中に存在
するCA195 状物質の濃度に直接比例する。
抗体、抗CA195 抗体でコートされたビーズ、CA195
基準液(0,10,30,60,90および120 U CA195 /
ml)、そして使用上の指示を含んでいた。
指定されたチューブにピペット取りした。次に200 マイ
クロリッターのI−125 標識化抗CA195 抗体を全ての
チューブにピペット取りした。各チューブに1つのビー
ズを入れた。チューブをボルテックスして(vortex)、室
温で2時間、170rpmにセットされた水平ローテーター上
に置いた。次にビーズを2mlの洗浄溶液で3回洗浄し、
適当な井戸型ガンマシンチレーションカウンターで測定
した。
例である。
した。使用時に、所望の重量となる羊水を解凍した。各
容器について満足すべき物性を有しているかどうかを検
査した。必要に応じて全ての設備について清潔さを検査
し、最終濾過の設備を蒸気清浄した。CA195 ラジオイ
ムノアッセイを実施例2のようして実施した。800 U/
mlを超える試料のみを合格とした。羊水をチーズクロス
を通して濾過し、重量を記録した。プールのpHを4NH
Clまたは6NNaOHで6.8 ±0.1 に調整した。次に
プールを少なくとも3.0 ミクロンのカートリッジを通し
て濾過した。次に、濾過を、濃縮装置(例えばYM10膜
を用いたAmicon Stirred Cell Model 8400)を用いて1
0,000ダルトン未満の分子をカットオフして約8000U/m
lまで濃縮した。この濃縮物を、10×10−3Mリン酸カ
リウム緩衝液pH6.9 (100 倍)に一晩(5℃)透析し
た。次にこの透析物を蒸気清浄したタンクへと0.45ミク
ロンのフィルターを通して濾過し、清潔なボトルの所望
のレベルまで満たした。得られた生成物は−20℃で冷凍
保存するか以下の実施例4に従って凍結乾燥した。
651 VC36F40)を凍結乾燥工程に用いた。
emperature) を−29℃以下まで下げた。次に生成物を充
填し、生成物の全温度が−29℃以下になったらシェルフ
温度を+5℃にセットした。生成物の全温度が−1℃に
達するまでシェルフ温度を+5℃に維持した。次にシェ
ルフ温度を+16℃まで上げ、生成物の全温度が+10℃に
なるまでこの温度に保持した。次にシェルフ温度を+27
℃まで上げ、生成物の全温度が+21℃になるまでこの温
度に保持した。次にシェルフ温度を+43℃まで上げ、生
成物の全温度が+38℃になるまでこの温度に保持した。
生成物の全温度が+38℃に達した後、さらに12時間を要
した。乾燥サイクルを完了した後、乾燥機を排気し、生
成物を取り出した。
る手順を示す。
195 状物質を得る工程を実施した。セファデックスG−
200 カラムを用意し、ブルーデキストラン溶液を用いて
ボイド容積を求めた。次に、調製した濃縮物をセファデ
ックスG−200 サイジングカラムに加えた。前記カラム
の(予備較正に基づく)ボイド容積に対応する試料を集
め、実施例2で述べたラジオイムノアッセイを用いてC
A195 活性を検定した。CA195 状物質の正のピークを
プールし、10,000未満の分子量カットオフによって約80
00U/mlまで濃縮し、0.45ミクロンフィルターを通して
濾過した。得られた生成物をボトルの所望のレベルまで
満たし、冷凍保存するか実施例4のように凍結乾燥し
た。
ーカー対照物を調製する方法を示す。
解凍した。全タンパク質は5.0 〜6.0g/dlであった。こ
のヒト血清はバクテリアの混入を示す目に見える兆候を
全く示さなかった。血清と未純粋化ストック溶液につ
き、いかに示す全成分の内因性レベルを試験した。血清
のpHを4NHClを用いて6.1 に調整し、pHが約6.8 に
達するまでかくはんした。この溶液をヘペス(Hepes) 緩
衝液中で1.5 ×10−2Mとし、pHを6.8 〜7.0 に調整し
た。0.1 〜0.5 %のセライト(Celite) をプールした血
清に加え、混合し、少なくとも0.5 ミクロンのパッドを
通して濾過した。次に下記の成分を、中程度の速度でプ
ールを混合しながら所望のレベルまで加えた:α−フェ
トプロテイン、がん胎児抗原、CA125 、CA19−9 、
CA50、CA15−3 フェリチン、β−hCG、免疫エラ
スターゼ、前立腺酸ホスファターゼ、組織ポリペプチド
抗原、およびCA195 状物質(ヒト羊水由来)。プール
を0.45ミクロンのフィルターで濾過し、各ガラスビン当
り5.2ml とした。得られた生成物は実施例4のようにし
て凍結乾燥した。
Claims (16)
- 【請求項1】 ヒト羊水から分離されたCA195 状物
質。 - 【請求項2】 前記CA195 状物質を変更して免疫化学
アッセイに有用なものとしたことを特徴とする請求項1
記載の物質。 - 【請求項3】 前記変更が、免疫化学アッセイに有用な
マーカーを加えることを含むことを特徴とする請求項2
記載の物質。 - 【請求項4】 ヒト羊水からCA195 状物質を分離する
方法であって、 a) 適当なヒト羊水試料を選択し、 b) 該ヒト羊水からCA195 状物質を分離するかあるい
は該ヒト羊水を分析その他の目的に有用な形態に変換す
る、各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項5】 前記選択がイムノメトリック法の使用を
含むことを特徴とする請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 前記分離がカラムクロマトグラフィー技
術の使用を含むことを特徴とする請求項4記載の方法。 - 【請求項7】 前記ヒト羊水の変換がCA195 状物質の
濃度を高めることを含むことを特徴とする請求項4記載
の方法。 - 【請求項8】 請求項1記載の物質をCA195 状物質に
対する抗体の産生に使用する方法。 - 【請求項9】 請求項8に記載の抗体。
- 【請求項10】 ポリクローナル抗体技術により産生さ
れた請求項9記載の抗体。 - 【請求項11】 モノクローナル抗体技術により産生さ
れた請求項9記載の抗体。 - 【請求項12】 ヒト羊水からのCA195 状物質を含む
分析対照物質。 - 【請求項13】 対照物質に加える前にまずCA195 状
物質をヒト羊水から分離することを特徴とする請求項1
2記載の分析対照物質。 - 【請求項14】 ヒト羊水のアリコットを用いてCA19
5 状物質が導入されることを特徴とする請求項12記載
の分析対照物質。 - 【請求項15】 請求項1〜3のいずれかあるいは請求
項9〜14のいずれかに記載の物質または請求項4〜8
のいずれかに記載の方法により得られた物質を1つ以上
含む診断キット。 - 【請求項16】 ヒト羊水からのCA195 状物質を含む
分析対照物質を含むことを特徴とする請求項15記載の
診断キット。
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