JPH01262471A - Ｃｋｍｂ検定及びそれに使用するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 本願発明は、ヒトクレアチンキナーゼの〜ＩＢイソ酵素
の検定法及びその検定に使用するモノクローナル抗体に
関する。

酵素クレアチンキナーゼ〔例えばＡＴＰ　：クレアチン
Ｎ−ホスホトランスフェラーゼ（ｃｒａｔｌｎｅＮ　　
−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅ）　　、　　
　Ｅ　　Ｃ２，７、３，２〕は、２つのＭモノマー（Ｃ
ＫＭＭ）　、２つのＢモノマー（ＣＫＢＢ）、又は１つ
のＭモノマー及び１つのＢモノマー（ＣＫＭＢ）から成
る二量体である。これらのイソ酵素のそれぞれは同一の
分子量を有し、同一の触媒反応をする。例えばそれはク
レアチンの可逆性リン酸化である。これらのイソ酵素は
分子構造が異なり、アルカリ緩衝剤中で電荷が異なるの
で、電気泳動法により分離できる。

（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　　Ｋｌｎａｓｅ、　　Ｌａｃｔａ
ｔｅ　　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　　ａｎｄｔｈｅ
ｉｒ　　１ｓｏｅｎｚｙ＊ｅｓ　　ｉｎ　　Ｃｌ１ｎｉ
ｃａｌ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、　　コーニング　メデ
ィカル　バブリケーション（ＣｏｒｎｌｎｇＭｅｄｉｃ
ａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、
　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ。

（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　Ｋｌｎａｓｃ　ｌ５ｏｃｎｚｙｓ
ｃｓ、　Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｌｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｃ１
１ｎｌｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）　、スブリン
ガーーバーレイグ（Ｓｐｒｌｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１）を参照のこと。

激しい心筋梗塞（Ｍｌ）の正しい診断は、患者の生存を
決定する重大な医学的チャレンジである。

ＣＫＭＢはほとんど心筋のみに存在するので、ＣＫＭＢ
の血清１度が心筋に傷害があるかどうか（つまりＭｌが
起っているかどうか）を決定するために使用し得る。乳
酸デヒドロゲナーゼやアスパラギン酸トランスアミナー
ゼのような他の酵素と比較すると、ＣＫＭＢは心筋によ
り局在するため、Ｍｌのより特定的マーカーである。Ｇ
ａ１ｅｎ。

Ｒ，Ｓ、等の“イソエンザイムス　オブ　ＣＰＫアンド
　ＬＤＨイン　ミオカーデイアル　インファークション
　アンド　サートラン　アザーディジージズ（ｌ５ｏｅ
ｎｚｙｓｅｓ　ｏｒ　ＣＰＫ　ａｎｄ　ＬＤＨＩｎＭｙ
ｏｃａｒｄｌａｌ　Ｉｎ「ａｒｃｔｌｏｎ　ａｎｄ　Ｃ
ｅｒｔａｉｎ　ｏｔｈｅｒＤｉｓｅａｓｅｓ）　”　、
　ｐａｔｈｏｂｌａｌ、　Ａｎｎｕ、、５　：　２８３
−３１５゜１９７５年、及びＬｏｔｔ、　Ｊ、　Ａ、等
の“セラム　エンザイムス　アンド　イソエンザイムス
　イン　ザダイアグノシスアンド　ディファレンシャル
ダイアグツシス　オブ　ミオカーデイアル　インファー
クション（Ｓｅｒｕｍ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｉｓ
ｏｅｎｚｙｍｅｓＩｎ　　ｔｈｅ　　Ｄｉａｇｎｏｓｉ
ｓ　　ａｎｄ　　ＤｉｆＴｅｒｅｎＬｉａｌ　　Ｄｉａ
ｇｎｏｓｉｓｏ１’　　）４ｙｏｃａｒｄｌａｌ　　Ｉ
ｎｌ’ａｒｅｔｌｏｎ）”　　、　　ＣｌＩｎ、　　Ｃ
ｈｅｌｌ、。

２８　：　１２４１．１９１ｉ０年、を参照のこと。更
に、梗塞部からのＣＫ　Ｍ　Ｂの漏出は他の酵素に先ん
じて起るので、より早い診断の機会を与える。Ｋｉｙａ
ｓυ。

Ｊ、　Ｙ、の°カレント　ステータス　オブ　デイチク
ティング　ＣＫ−ＭＢ　　フォーペイシャントマネジメ
ント（Ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓ　ｏｒ　ｏｅｔｃ
ｃｔｊｎｇＣＫ−ＭＢ　ｆｏｒ　Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｍａ
ｎａｇｅｍｅｎｔ）　−、Ａｍｃｒ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｐｒｏｄ、、　４　二２３−３１．１９８５年、を参照
のこと。梗塞部のａ無を示すことの他に、ＣＫ　Ｍ　Ｂ
の血清濃度もまた、Ｍｌの程度や再び梗塞が起るかどう
かを診断するために使用できる。Ｌｏｔｔ、　Ｊ、＾、
、　５ｕｐｒａ：Ｋｏｎｔｔｌ口ｅｎ、＾、の“ジ　イ
ソエンザイムス　オブクレアチン　キナーゼ　イン　ベ
リアス　デイジージズ（丁ｈｅ　１ｓｏｃｎｚｙｓｃｓ
　ｏｒ　Ｃｒｃａｔｌｎ　ＫｉｎａｓｃｌｎＶａｒｉｏ
ｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）　”　、　Ｉｎ　　Ｅｎｚｙ
ｍｅｓ　Ｉｎ　）Ｉｅａｌｔｈａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ
、　　Ｉｎａｕｇ、　　５ｅｌｃｎｔ、　　Ｍｅｅｔ、
　　Ｉｎｔ、　Ｓｏｃ。

ｃｌｉｎ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ、、　Ｌｏｎｄｏｎ、　１
９７７年、　　１４９〜１５３ページ；　［ｕｐｐｅｒ
　Ｎ、及びＢ１１ｅｆ’ｅｌｄ　Ｗ、の“セラムエンザ
イム　チェンジズ　イン　ベイシャンツ　ウィズ　カー
ブイアツク　デイシーズ（Ｓ−ｅｒｕｓ　　Ｅｎｚｙｓ
ｅ　　ｃｈａｎｇｅｓ　　Ｉｎ　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　
　ｗｉｔｈＣａｒｄｌａｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ）’　、　
Ｉｎ　　Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１
ｎｉｃａｌＥｎｚｙ、　１９７９年、１０６〜１２２ペ
ージ；及びｔｌａｅｋｓｈａｖ　Ｂ、のＣｌ１ｎ１ｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３０　：　１２ｇ５゜１９
８４年、を参照のこと。

その診断的重要性の観点から、血清中のＣＫＭＢａ度を
測定するための多くの技術が開発されてきた。＾ｂｂｏ
ｔｔ等の″メソツズ　フォーＣＫ−ＭＢ　　アナリシス
　ユーズド　トウ　モニター　カーブイアツク　ベイシ
ャンツ（Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　　ＣＫ−ＭＢ　　Ａｎ
ａｌｙｓ［ｓ　　Ｕｓｅｄ　　ｔｏ　　Ｍｏｎ１ｔｏｒ
　　ＣａｒｄｌａｅＰａｔｉｅｎｔｓ）　＋、　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｌ’　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ。

８　：　１４７−１５１．１９８５年；　ｃｈａｎ等の
“イムノエンザイメトリック　アッセイ　フォー　クレ
アチンキナーゼ　ＭＢ　　ウィズ　サブユニットースベ
シフィンク　モノクローナル　アンテイボディーズコン
ベアード　ウィズ　アン　イミュノケミカルメソッド　
アンド　エレクトロフオレシス（Ｉｍ＊ｕｎｏｃｎｚｙ
ｍｅｔｒｌｃ　Ａｓ５ａｙｒｏｒ　ＣｒｅａｔｉｎｅＸ
ｌｎａｓｅ　ＭＢ　ｗｉｔｈ　５ｕｂｕｎｉｔ−８ｐｅ
ｃＬｒｉｃ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｌｂｏｄｌｅ
ｓ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　Ｉｍａｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｅａ！Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｓｅｓｌｓ）’　、　Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１ｎ
ｉｃａｌＣｈｅ、　３１　　：　４８５−４８９．１９
８５年；　Ｊａｃｋｓｏｎ等の°トウーサイト　モノク
ローナル　アンティボディ　アッセイズ　フォー　ヒユ
ーマン　ハート−アンド　プレイン−タイプ　クレアチ
ン　キナーゼ（Ｔｗｏ−８ｌｔｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ
＾ｎｔｌｂｏｄｙ＾５ｓａｙｓｒｏｒｌｌｕｓａｎ　　
１ｌｅａｒｔ　　−ａｎｄ　　Ｂｒａｌｎ　　−Ｔｙｐ
ｅ　　ＣｒｅａｔＩｎｅＫｌｎａｓｅ）”　　、Ｃ１１
ｎｆｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０　　：　　１
１５７−１１６２、１９８４年；及び１９１１６２月１
３日公開ＰＣＴ特許公開番号Ｗ　０８６１００９９２．
をり照のこと。残念ながら、可能な検定の方法論は、現
存までのところＣＫＭＢの完全な診断が実現していない
、というような多くの欠点を有している。

例えば、血清中のＣＫＭＢの濃度をｎ１定するために開
発された技術には、ＣＫ画分の電気泳動又はイオン交換
分離の後にＭＢ画分中のＣＫ活性を決定する方法がある
。ラジオイムノアッセイ及びイムノインヒビジョン　ア
ッセイが、ツーサイト　イムノメトリック　アッセイ（
ｔｗｏ−ｓｉｔｅｌｍｓｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａ
ｙｓ）及びイムノインヒビジョン／イムノブレシビテー
シシン　アッセイと共に開発されている。

これらの試みは全て、同じようにしてＣＫＭＢに移動す
る人為構造や変異体（分離型技術）に、又はＣＫＢＢ、
ＣＫＭＭ、マクロＣＫ−１及び他の酵素により生ずるよ
うな干渉（免疫技術）のために正しい結果が得られない
。更に、電気泳動、及び多重定温培養（ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ　１ｎｃｕｂａｔｌｏｎ）／洗浄工程を伴うツーサイ
ト　イムノメトリック　アッセイは長時間を要する。

いままでのＣＫＭＢのツーサイト　イムノメトリック　
アッセイは抗−ＣＫＭＭ及び抗−ＣＫＢＢ抗体間のサン
ドイッチ形成に基づいている。１９８６年２月１３日公
開のＰＣＴ特許公開番号ＷＯ３８１００９９２：　Ｙｏ
ｕｃｎｓ、　Ｊ、　Ｅ、　Ｂ、等の“クリニカルアンド
　アナリティ力ル　バリデーションオブ　アン　エンザ
イモメトリック　アッセイフォー　クレアチン　キナー
ゼ−ＭＢ　　イソエンザイム（ＣＩ　１ｎｉｃａｌ　ａ
ｎｄ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＶａｌｉｄａＬｉｏｎ　ｏ
「ａｎ　　Ｅｎｚ）ｖｏｍｅｔｒｌｅ　　Ａｓ５ａｙ　
　「ｏｒ　　Ｃｒｅａｔｉｎｅ　　にｌ　ｎａｓｅ−Ｍ
ＲＩｓｏｅｎｚｙｓｅ）’　　、　　＾ｎｎ、　　Ｃｌ
Ｉｎ、　　Ｂｌｏｃｈｅｔ、　　２３　　：　　４Ｂ３
−４８９、１９８６年；　Ｍｅｄｅｌｒｏｓ、　Ｌ、　
Ｊ、等の０クアンテイフイケーシヨン　オブ　ＣＫ　−
Ｍ　Ｂ　　バイザ　クイック　ＭＢ　　アンド　タンデ
ム−ＥＣＫ−ＭＢ　　イムノアッセイズ：コンバリスン
トウ　エレクトロフォレシス（Ｑｕａｎｔ　Ｉ　ｒｆｅ
ａｔ　ｔｏｎｏ１’　ＣＫ−ＭＢ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｑｕ
ｉｃｋ　）ＩＢ　ａｎｄ　Ｔａｎｄｅｍ−ＥＣＭ−ＭＢ
　　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　　：　　Ｃｏｍｐａｒ
ｉｓｏｎ　　ｔ。

Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）’　　、　　Ｊ、　
ＣｌＩｎ、　　Ｉ＋ｎｕｎｏａｓｓａｙ。

８　：１５２−１５６．１９８５年；及びＣｈａｎ、　
Ｄ、　Ｗ、等の″イムノエンザイメトリック　アッセイ
　フォー　クレアチン　キナーゼ−ＭＢ　　ウィズ　サ
ブユニットースペシフィク　モノクローナル　アンチイ
ボデイーズ　コンベアード　ウィズ　アン　イムノケミ
カル　メソッド　アンド　エレクトロフオレシス（Ｉｗ
ａｕｎｏｅｎｚｙｍｅＬｒｌｃ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　
ＣｒｅａｔｉｎｅＫｉｎａｓｅ−ＭＢ　　ｖＨｈ　　５
ｕｂｕｎｉｔ−８ｐｅｃｌｒｉｃ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌＡｎｔｌｂｏｄｌｅｓ　　Ｃｏ５ｐａｒｅｄ　　ｖ
ｌＬｈ　　ａｎ　　ＩｍｓｕｎｏｃｈｅｓｌｃａｌＭｅ
ｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
　’　、　ＣｌＩｎ、　Ｃｈｅｗ、。

３１　：　４６５−４６９．１９８５年、を参照のこと
。下記に示すように、この方法はシングル　インキュベ
ーション　アッセイ（ａ　ｓｉｎｇｌｅ　Ｉｎｃｕｂａ
ｔｌｏｎ　ａｓｓａｙ）に使用する時、ＣＫＭＭ及びＣ
ＫＢＢによる干渉に影響されやすい標準曲線となる。

最近、ＣＫＭＢ検定に抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体
を使用することが報告されている。

Ｖａｌｄｙａ等の“ダイレクト　メジャーメント　オン
タレアチン　キナーゼ−ＭＢ　　アクティビティイン　
セラム　アフター　イクストラクションウィズ　ア　モ
ノクローナル　アンティボディースベシフィク　トウ　
ザ　ＭＢ　　イソエンザイム（Ｄｉｒｅｃｔ　　Ｍｅａ
ｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｏｆ’　　Ｃｒｅａｔｉｎｅ　　
Ｋｉｎａｓｅ−ＭＢ　　ＡｃＬＩｖｉＬｙ　　Ｉｎ　　
５ｅｒｕｓ　　ａｌ’Ｌｅｒ　　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｖｉｈｔ　　ａ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　＾ｎｔｉ
ｂｏｄｙ　　５ｐｅｅｌｒ！ｃＬｏ　　ｔｈｅ　　ＭＢ
ｌｓｏｅｎｚｙｓｅ）’　、　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｌｉｓＬｒｙ、　３２　：　６５７−６８３、１９８
６年、を参照のこと。この研究で使用されるモノクロー
ナル抗体はＩｇＧ２ｂ型のマウス抗体であった。抗体は
ポリマービーズに結合され、このビーズは血清試料から
ＣＫＭＢを抽出するために使用された。抽出されたＣＫ
ＭＢの量を、ＣＫ試薬を用いて３７℃で３０分間前記ビ
ーズを定温培養し、前記ビーズを遠心分離機にかけ、上
清部分を除去し、３４００■におけるその部分の吸光度
を測定することにより、酵素によって測定する。

Ｖａｉｄｙａ等の検定法は多くの問題をかかえている。

まず第１に、この検定法は質ｉｉ濃度というよりはＣＫ
ＭＢ活性を測定するのであるから、血液試料を採取した
時点と検定を行った時点との間でのＣＫＭＢ活性の低下
のために不正確性を伴う。

よく知られているように、前記期間中にそれぞれの試料
が置かれている環境条件と同様に、前記期間も臨床上の
条件により試料ごとに大きく変化し得る。一方、試料中
のＣＫＭＢの質ｍｓ度は特定の保存時間や試料が置かれ
ている環境条件に比較的影響を受けない。Ｍｕｒｔｈｙ
等の“アクティビティ　コンセントレージョン　アンド
　マスコンセントレージョン（モノクローナル　アンチ
イボデイ　イムノエンザイオメトリック　メソッド）コ
ンベアード　フォー　クレアチンキナーゼ　ＭＢ　　イ
ソエンザイム　イン　セラム　（Ａｃｔｉｖｉｔｙ　　
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　ＭａｓｓＣ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　　（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　　＾ｎｔｉｂｏｄｙ１ｍｍｕｎｏｅｎｚｙｏｓｅｔｒ
１ｃ　　Ｍｅｔｈｏｄ）　　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　　ｆｏ
ｒＣｒｅａｔｌｎｅ　Ｋｌｎａｓｅ　ＭＢ　１ｓｏｅｎ
ｚｙａｅ　１ｎ　Ｓｅｒｕｍ）　’　。

ＣｌＩｎ、　Ｃｈｅｓ、、　３２　：　１９５Ｇ、　１
９８６年を参照のこと。

更に、Ｖａｌｄｙａ等の報告に開示されたモノクローナ
ル抗体は実施されている検定法に使用するのに時に適し
ているというわけではない。特に、前述したようにＶａ
ｌｄｙａ等の抗体はＩ　ｇＧ２ｂ型である。

当業者に既知のように、この型の抗体は凍結に敏感で、
低塩濃度の溶液中で沈殿しやすく、他の型のＩｇＧ抗体
、特にＩｇＧ１型抗体よりも蛋白質分解酵素による劣化
に影響されやすい。更に、ＩｇＧ２ｂ型抗体と比較して
、ＩｇＧ１型抗体は通常誘導化しやすい。例えば酵素、
又は化学ルミネセント物質等により標識化しやすい。Ｇ
ｏｄｉｎｇ。

Ｐｒａｃｔｉｃｅ）　、　Ａｃａｄｅｌｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８３年、　１５ページ；及びＰａｒｈａｓ、　Ｐ、
の°オン　ザフラグメンテーション　オン　モノクロー
ナルＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ、アンド　ＩｇＧ２ｂフロム
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃフイス（Ｏｎ　ｔｈｅ　Ｐｒａ
ｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
　ＩｇＧ１．　　ＩｇＧ２ａ、　　ａｎｄ　　ＩｇＧ２
ｂ　　ｆｒｏｍ　　ＢＡｌ、Ｂ／ｅ　Ｍｉｃｅ）　−、
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｙ、　１３
１　：２８９５−２９０２．１９８３年を参照のこと。

（発明の概要） 前述の観点から、生物体液中、特に血清試料中のＣＫＭ
Ｂの濃度を測定するための改良された検定法を提供する
ことが本願発明の目的である。より詳細には、使いやす
く、高い精度を有し、そして血清試料中に見つかるＣＫ
ＭＭ、ＣＫＢＢ、マクロＣＫ−１、又は他の酵素から実
質的に干渉されない改良されたＣＫＭＢ検定法を提供す
ることが本願発明の目的である。

これらの目的と関連して更に実施されているＣＫＭＢ検
定法に使用するのに特に適した抗−ＣＫＭＢモノクロー
ナル抗体を提供することも本願発明の目的である。特に
、ＩｇＧ１型のマウス抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体
を提供することが本願発明の目的である。

前述及び他の目的を達成するために、本願発明は、 （ａ）　（１）生物体液の試料、（ＩＩ）固体支持体に
結合されたＣＫＢに対する抗体、及び（ｉｉｉ）ＣＫＭ
Ｂに対する標識化されたモノクローナル抗体の混合物を
形成し、 （ｂ）前記混合物を定忍培養し、 （Ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離し、そして （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
と、 の各工程から成る、生物体液中のＣＫ　Ｍ　Ｂを検出す
る方法を提供する。

本願発明のいくつかの好ましい実施態様においては、固
体支持体は磁性粒子から成り、そして抗−ＣＫＭＢモノ
クローナル抗体が化学ルミネセント物質で標詭化されて
いるＩ’ｇＧｌ型のマウスモノクローナル抗体である。

前述の方法に加えて、本願発明はまた、ネズミ由来の雑
種株化細胞から産生され、ＩｇＧ１！４２である抗−Ｃ
ＫＭＢモノクローナル抗体を提供する。

このようなモノクローナル抗体は、ＣＫＭＢ検出のため
前述の好ましい方法又は他の既知の方法の実施に使用で
き、その結果この酵素又は他の酵素を検出するよう開発
し得る。

本願発明の原理は、好ましい実施態様と同様に、以下に
示された図面及び実施例により説明され例証される。こ
れらの図面や実施例は、もちろん例証の目的のみに用い
られるものであり、本願発明の範囲を制限するものでは
ない。

（好ましい実施態様の説明） 前述したように、本願発明は、ヒトの血清のような生物
体液の試料中のＣＫＭＢを検出するためのツーサイト（
サンドイッチ）イムノアッセイに関する。特に、この検
定法は固体支持体に結合されたＣＫＢに対する抗体（“
キャプチャー抗体゛）とＣＫＭＢに対する標識化された
抗体く“トレーサー抗体″）を使用する。

キャプチャー抗体は、ＣＫＢＢに対して免疫化された動
物の血清から得られたポリクローナル抗体、又は雑種株
化細胞で産生されたモノクローナル抗体である。モノク
ローナル抗体及び、特にＩｇＧ１型のマウスモノクロー
ナル抗体が好ましい。ＣＫＢＢに対するポリクローナル
抗体は、特にベル　フリーズ社（Ｐｅｌ　Ｐｒｅｅｚ　
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びベントレックス社（Ｖｅ
ｎＬｒｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得られ、こ
の抗原に対するモノクローナル抗体はハイプリチック社
（ＨｙｂｒｌＬｅｃｈ、　Ｉｎｃ、）から得られる。後
述する実施例２で示す通り、抗−ＣＫＢが好ましいキャ
プチャー抗体である。と言うのは、この検定法は、シン
グル　インキュベーション工程（ａ　ｓｉｎｇｌｅ　Ｉ
ｎｃｕｂａｔｌｏｎ　５ｔｅｐ）及び単一分、！Ｉｔ／
洗浄工程を使用する場合においても、このキャプチャー
抗体をＣＫＭＢトレーサー抗体と組合せて使用する時、
ＣＫＭＭ及びＣＫＢＢ両方の干渉の影響を基本的に全く
受けないからである。

キャプチャー抗体は種々の固体支持体によって運ばれる
。例えばガラスやプラスチックビーズ、磁性粒子、棒や
円板又は他の構造物の外表面、試験チューブ又は他の容
器の内表面などである。

同様にして、キャプチャー抗体をその固体支持体に付け
るために当業者に既知の多くの技術が使用できる。その
取りあつかいやすさから、磁性粒子、特に米国特許第４
．５５４．０８８号に開示された型の磁性粒子が本願発
明と共に用いるのに好ましい。キャブチャー抗体は従来
、この型の粒子と結合させるのに、この粒子をシランで
被覆し、グルタルアルデヒドで活性化し、洗浄して抗体
に加える。

１？ｅｌｃｈｌＩｎ、　Ｈ６の°ユーズ　オン　グルタ
ルアルデヒド　アズ　ア　カップリング　エイジェント
　フォー　プロテインズ　アンド　ペブチズ（Ｕｓｅ　
ｏｒ　Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｃ　ａｓ　ａ　Ｃｕ
ｐＨｎｇ＾ｇｅｎｔ　Ｉ’ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａ
ｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）’　、　Ｍｅｔｈｏｄｏｒ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７０　：　１５９−１６５．
１９ｇ０年を参照のこと。

トレーサー抗体はＣＫＭＢに対するモノクローナル抗体
である。前述したように、実施されている検定法に使用
するのに適した抗体を提供するという観点から、ＩｇＧ
１型のマウスモノクローナル抗体が好ましい。この型の
抗体は、例えばＩｇＧ２ｂ型抗体などより安定で！！化
しやすい。

特に、本願発明の検定法にＩｇＧ１）レーサー抗体を使
用することは、同じ条件下でＩｇＧ２ｂ抗体を使用して
得られる結果より優れた結果となることがわかった。更
に、ＩｇＧ１型抗体は実質的な活性のロスを伴うことな
く、凍結したり解凍したりできる。実際のセツティング
において、このように凍結したり解凍したりすることは
、例えば検定用具−式及び部品を輸送したり保管したり
する際に、行われる。

下記実施例１で詳しく述べるように、ＩｇＧ１型のＣＫ
ＭＢに対するマウスモノクローナル抗体は、マウスを純
粋ＣＫＭＢで免疫化し、その免疫化したマウスから肺臓
細胞（ｓｐｌｅｎｏｕｙｔｃｓ）を取出し、この肺臓細
胞をマウス永久増殖株化細胞と融合し、ＣＫＭＢに対す
る抗体を産生ずる細胞を得るため得られたハイブリドー
マをスクリーニングする。選択されたハイブリドーマに
より産生された抗体は更にスクリーニングされ、ＣＫＢ
Ｂ及びＣＫＭＭとの交差反応性や抗体型を調整する。低
い交差反応性、例えばＣＫＢＢ及びＣＫＭＭの相方と１
％未満の交差反応性を有するＩｇＧ１型のものが本願発
明に使用される好ましいトレーサー抗体を形成する。

抗−ＣＫＭＢ抗体は種々の標識により標識化し得る。そ
れは例えば、放射性標識、螢光性標識、酵素標識、化学
ルミネセント標識その他である。

化学ルミネセント標識、特に化学ルミネセント物質とし
てアクリジニウム　エステルを使用した化学ルミネセン
ト標識が好ましい。

下記の実施例３で示すように、この型の標識を使用する
ことにより、血清試料中のＣＫ　Ｍ　Ｂ濃度は、ただ２
つのキャリブレータ−試料（ｃａｌｌｂｒａｔｏｒ　５
ａｓｐｌｅｓ）を使用するだけで最終ユーザーにより決
定できる。一方、他の標識を使用した場合は通常４つ以
上の標準液を必要とする。

好ましい標識及び抗体に標識を付けるのに適した技術は
、本願発明と同じ譲渡人であって１９８６年１０月６日
に出願された米国特許出願番号９１５，５２７に開示さ
れているが、参考のため本願明細書にも含めた。

好ましい実施態様において、完全な検定法はたかだか次
の４つの工程の実施を必要とするに過ぎない。それは、
ｌ）定温培養、２）分離、３）洗浄及び４）カウンティ
ングである。もちろん、所望ならばさらに定温培養や洗
浄工程を増やすことも本願発明の実施には可能である。

ド記実施例３で示す通り、室温で単に３０分間、又は至
急で検定を行う場合は１０分間でも定温培養は可能であ
る。また、アクリジニウム　エステル標識を使用するこ
とで、ユーザーは患者の試料の測定された光の出力を濃
度値に変換するため、２つのキャリブレータ−試料を操
作するだけでよい。

更に、固体支持体として磁性粒子を使用することで、分
離がじん速に容易に行われる。

これらの要素の相乗効果により、本願発明の検定法は全
てに渡って使用し易く、じん速に行われる。試料を読み
取るのに２時間以上もかかった従来の方法と比較すると
、本願発明の検定法は１時間未満で容易に完了し得る。

心筋梗塞をじん速に診断できることの重要性という観点
から、本願発明による短い全検定時間及び実施の容易さ
が重要な意味を持つ。

前述の記載に基づき、本願発明を、下記の特別な実施例
により更に説明する。

実施例　１ 抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体の調整ヒトＣＫＭＢに
対するモノクローナル抗体を下記の免疫化、融合、スク
リーニング及びインタイプキャラクタリゼーション（１
ｓｏｔｙｐｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の各
工程を用いて２Ｊ整した。

免疫化工程記録：生後６週目のメスのＡ／Ｊマウス、Ｈ
−２ａハブロタイブ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）　（ジャク
ソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）、　Ｂａｒｌｌａｒｂｏｒ、　ＭＥ　０４８０９）
の腹膜組織内に、同量のフロイントの完全アジュバント
（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｃｕｎｄ’５ａｄｊｕｖａｎ
ｔ）　　（ＣＦ　Ａ　）　　（デイフコ研究所（Ｄｌｆ
’ｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　Ｄｃｔｒｏｌｔ、　Ｍ
ｌｃｈｌｇａｎ）中に乳化させた３０ｕｇの純粋ＣＫＭ
Ｂ［スクリップス研究所（Ｓｃｒｌｐｐｓ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｓａｎ　Ｄｌｅｇｏ、　（Ａ））を
０８目と２１日８に注射した。１ケ月後、フロイントの
不完全アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｐｒｅｕ
ｎｄ’５ａｄｊｕｖａｎｔ）中の抗原を同量、前記マウ
スの足に皮下投入した。５週間後、２０ｕｇのＣＦＡを
腹膜組織内に注射した。最後に１９ｕｇの殺菌塩水（ｓ
Ｌｅｒｌ　１ｅｓａｔ　１ｎｅ）を融合の４日前で前記
のＣＡＦの最後の注射後７週間経過後、静脈内に投入し
た。

融合工程記録：免疫化マウスの肺臓細胞（ＩＸ１０８）
とＢａ１ｂ／ｃマウス骨随腫株化細胞〔アメリカン　タ
イプ　カルチャー　コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　
　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）　　。

Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ登録番号＾Ｔ
ＣＣＣＲＩ、−１５８１から得られるＳ　ｐ２１０−Ａ
　ｇ１４細胞〕から得た細胞（２ＸＩＯ７）をポリエチ
レン　グリコール（平均分子ｆｆ１９５０−１０５０）
　　（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ、　ＣｏＩＩｐａｎｙ。

ｐｈｉｌｌｌｐｓｂｕｒｇ、　Ｎ、　Ｊ、　０５１ｔ６
５）の存在下、主にｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｌｎ
　（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　：　４９５−４９７゜１
９７５年）の手順に従って融合した。融合した細胞は、
９６−ウェル　マイクロティター組織培養プレー　ト　
（９Ｂ−ｗｅｌｌ　　ｍ１ｃｒｏｔ１ｔｃｒ　　１ｓｓ
ｕｅ　　ｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｔｅｓ）　（Ｃｏｒｎｌ
ｎｇ　Ｇｌａｓｓνｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｌｎｇ　ＮＹ
）内のウェルに置かれ、５％Ｃ０２雰囲気中３７℃で定
温培養された。２週間後、ＣＫＭＢと反応性のある抗体
を得るためハイブリドーマをスクリーニングした。

スクリーニング工程：ハイブリドーマは、ＣＫＭＢに対
して反応性の抗体を得るためダブル抗体化学ルミネセン
ト検定法（ａ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙｃｈｅ
ｍｌｌｕｍｌｎｅｓｃｅｎｔ　ａｓｓａｙ）を使ってス
クリーニングした。純粋ＣＫＭＢをジメチル　アクリジ
ニウム　エステル（ｎ−ヒドロキシスクシニイミド）（
ＤＭＡＥ−ＮＨ３）で以下のようにｍ識化した。０．１
ｍｌのジメチルホルムアミド中の５ｕｇのＤＭＡＥ−Ｎ
Ｈ３を１ｍｌ標識緩衝剤（０，１Ｍリン酸ナトリウム、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８，０）中の１１００
ｕ純粋ＣＫＭＢに加えた。混合物をかきまぜ、１５分間
室温で定温培養した。この混合物を次に５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　Ｇ−２５（ＰＤ−１０）カラム〔ファーマシア社（
Ｐｈａｒ＊ａｃｌａ　Ｉｎｃ、）　ＰＩｓｃａＬａｖａ
ｙ、　ＮＪ　０８８５４）に入れ、空隙容積を集結した
。標識化したＣＫＭＢは０．１％のウシ血清アルブミン
（ｂｏｖｌｎｅ　ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｌｎ　＜ＢＳ＾
））及びリン酸塩緩衝塩水ｐＨ７，４と０、Ｏ１％チメ
ロサール中で希釈し、４℃で保存する。

スクリーニング工程は１１００ｕのＣＫＭＢ　−ＤＭＡ
Ｅと１００ｕＮのハイブリドーマ培養上清を１２Ｘ７５
ｍｍポリスチレンチューブ（Ｖａｌｔｅｒ　５ａｒｓｔ
ｅｄｔ。

Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ、　ＮＪ　０８５４０）中で混合し
、この溶液を室温で２時間定温培養することにより構成
した。第２の抗体、すなわち磁性粒子〔＾ｄＶａｎｃｃ
’ｄＭａｇｎｅｔｌｃｓ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　：Ｇｒｏｍａｎ
等の“プロダクト　アプリケーションフォーカス、パイ
オマッグーア　ニュー　サポート　フォー　マグネティ
ック　アフィニティ　クロマトグラフ（Ｐｒｏｄｕｃｔ
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｆｏｃｕｓ。

ＢｉｏＭａｇ−−Ａ　Ｎｅｗ　５ｕｐｐｏｒｔ　ｒｏｒ
　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｌｆ’ｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈ）’　、　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ、
　１９８５年３月／り月、ページ１５８−１６０参照〕
に固定されたヤギ抗−マウスｌ　ｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＤＩａｇｎｏｓＬｉｃｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｂ１１１ｅｒｌｃａ、　ＨＡ　０１８６５
）を前記反応チューブに加え、室温で１５分間定温培養
した。

コーニング磁気分離装置（＾Ｃｏｒｎｌｎｇｍａｇｎｅ
ｔｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｕｎｉｔ　：　Ｃｌｂａ
−Ｃｏｒｎｌｎｇ　Ｄｌａｇｎｏｓｔｌｃｓ。

Ｗａｌｐｏｌｅ、　ＨＡ　０２１３５）を、抗原／二重
抗体混合物を溶液の残りの部分から分離するために使用
した。

この混合物を蒸留水で一度に洗浄し、フォトンカランタ
ー（ａ　ｐｈｏｔｏｎ　ｃｏｕｎｔｅｒ　：　ｇｔｏ　
Ｌｕｍ１ｎｏｓｃｔｃｒ。

Ｃ１ｂａ−Ｃｏｒｎｌｎｇ　Ｄｌａｇｎｏｓｔｌｃｓ、
　Ｗａｌｐｏｌｃ、　ＨＡ　０２１３５）を用いてカウ
ントした。１ｌｌｅｅｋｓ等の″ケミルミネセンス　イ
ムノアッセイ（ｃｈｅｗ　Ｉ　Ｉ　ｕｓ　ｉ　ｎｅｓｃ
ｃｎｃｅＩｍａｕｎｏａｓｓａｙ）’　、　Ｊ、　ｏ「
Ｃｌ１ｎ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏａｓｓａｙ、　７：８２−
８８．１９８４年を参照のこと。

ハイブリドーマ上清は、グロース　ネガティブウェイ（
ｇｒｏｗｔｈ　ｎｅｇａＬｉｖｅ　ｗｅｌｌ）から得ら
れるネガティブ　コントロール上清（ｎｅｇａＬＩｖｅ
　ｃｏ口ｔ「０１ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ）の３倍以
上のカウント数であればポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ
）であると考えられた。ポジティブ　ハイブリドーマが
選択され、株化細胞が増殖できる場である。２４−ウェ
ル組織培養プレート（ａ　２４−ｗｅｌｌ　ｔｌｓｓｕ
ｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ　：Ｃｏ５ｔａｒ、　
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＨＡ　０２１３９）に移植した
。

培養上清を２４−ウェル　プレートから採集し、ＣＫＭ
Ｂに対する抗体の再試験をした。

イソタイプ　キャラクタリゼーション工程：モノクロー
ナル抗体のイ、ツタイブはモノーＡＢＩＤ酵素イムノア
ッセイ　キット（Ｚｙｓｃｄｌ、ａｂｏｒａｔｏｒｌｅ
ｓ、　Ｓａｎ　Ｐｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃ＾９４０８０
）を用いて決定した。

前述の工程に従って、本願発明の検定法に使用するのに
基本的に適した２つの抗−〇ＫＭＢモノクローナル抗体
（抗体“００７″及び“１３Ｇ１″）を確認した。どち
らの抗体もＩｇＧ１型でカッパライト　チエイン（ｋａ
ｐｐａ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎｓ）を有していた。融
合により、抗−ＣＫＭＢ抗体の産生に加えて抗−ＣＫＭ
及び抗−ＣＫＢ抗体も産生ずることがわかった。

００７及び１３Ｇ　１抗体を産生ずるノ〜イブリドーマ
は、安定したモノクローナル抗体株化細胞を確保するた
めに、希釈を制限することによりクローン化した。Ｇｏ
ｄｌｎｇ、　５ｕｐｒａ、ページ８５を参照のこと。

どちらの株化細胞とも安定であることがわかった。

更に詳しい評価をするため、株化細胞から産生された抗
体は次のようにして純化した。５０ｍ１の培養上清をア
ミコン　コンセントレータ−（ａｎ＾ｍ１ｃｏｎ　　Ｃ
ｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ：＾−１ｃｏｎ　　Ｃｏｒｐｏ
ｒａＬｉｏｎ。

Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＨＡ）を使用して濃縮化した。濃縮
物は次にａｎ　Ａｒｒｌ−Ｇｅｌ　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＭＡＰＳＩＩ旧Ｔ（Ｂｌｏ−Ｒａｄ
　　１．ａｂｏｒａＬｏｒｌｅｓ、　　Ｒ１ｃｈ＊ｏｎ
ｄ、　　Ｃ＾　９４８０１）を使って純化した。最後に
、抗体は０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム、ｐＨ８，０に透析した。抗体の純度は、高分
解ゲル電気泳動法（ｈｌｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　
ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｂｏｒｅｓｌｓ）を行なうこ
とにより確認した。

２つの抗−ＣＫＭＢモノクローナルのツーサイト　イム
ノアッセイに対する適合性を評価するために、種々の濃
度のＣＫＭＢ、ＣＫＢＢ及びＣＫＭＭの標準曲線を、６
■能な抗−ＣＫＭＢ抗体、及び抗−ＤＫＭＢ抗体を産生
ずるために使用される手順と類似であるが抗原としてＣ
ＫＭＭ及びＣＫＢＢを使用する手順により産生された抗
−ＣＫＭ及び抗−ＣＫＢモノクローナル抗体（それぞれ
抗体”ＡＨ６″及び“ＣＡ８°）を用いて作成した。特
に、標準曲線は、トレーサー抗体をＤＭＡＨにより標識
化し、キャプチャー抗体を磁性粒子に結合させることに
より作成した（＾ｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｌｃｓ
、　５ｕｐｒａ）。

トレーサー抗体の標識化は次のように行った。０．２　
ｍｌジメチルホルムアミド中のＤＭＡＥ−Ｎ　ＨＳ　４
０マイクログラムを１ｍｌ標鷹緩衝液（０，１Ｍリン酸
ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐｌ＋８．０
）中の抗体０．２５ｍｇに加えた。室温で１５分間経過
した後、０．５ｍｌ標識緩衝液中のＤＬ−リジン５ｍｇ
を加えて反応を停止させた。反応混合物を小さな５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５カラム（Ｐ　Ｄ　−１０）に入
れ、空隙堆積を集めた。クロマトグラフィー及びトレー
サーの保存用の緩衝系は“トレーサー緩衝液°で、ｐＨ
は７．４であり、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．
１　Ｍの塩化ナトリウム、０．２５％のＢＳＡ。

ｏ、＋ｏ６のアジ化ナトリウムより構成された。

５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００のクロマトグラフィー
によりトレーサーのより純化を行った。３ｍｌのトレー
サーを５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００カラムに入れ、
“トレーサー緩衝液″中で色層分析した。１０＋ｎｌ、
　２０ｍ１及び２００ｍ１Ｏカラムが試験された。大き
なカラムはより大きな集塊からトレーサーを分離し、ト
レーサーピークの後に抽出されるいくつかの小さなピー
クを示した。小さなカラムはひとつの主要なピークを示
した。しかし、どちらの場合でもシグナル／ノイズ比の
１０倍の増加がバックグラウンドの減少により見られた
。５ｃｐｈａｃｒｙｔカラムは未確認の汚染物質を吸着
によって取り除いた、と考えられている。

標準曲線を作成するのに使用される検定法の形式は次の
ようであった（形式は実験ごとに少しずつ異なるが、最
終結果に影響を与える程異なることはなかった）。０．
１ｍｌの標準液を０．１ｍｌのトレーサー抗体に加え、
かくはんした。それぞれの実験により、０．１ｍｌ、　
　０．２ｍｌ又は０．５ｍｌのキャプチャー抗体を加え
、混合物を室温で再びそれぞれの実験により１０分間、
３０分間又は１時間定温培養した。この混合物をコーニ
ング磁気分離装置を用いて分離し、蒸留水で洗浄した。

検定は、８１０ルミノメータ−（ａｎ　８１０　Ｌｕｓ
ｉｎｏｇｅｔｅｒ）によりカウントして行った。

その結果を第１図に示す。ここに示されているように、
モノクローナル００７及び１３Ｇ　１は抗−ＣＫＭ及び
抗−ＣＫＢの相方とＣＫＭＢ　“サンドイッチ゛相溶性
を示したが、００７と１３６１との相溶性は示さなかっ
た。抗−ＣＫＭ　（ＡＨ６）及び抗−ＣＫＢ　（ＣＡ８
）抗体もまたＣＫＭＢ　“サンドイッチ０相溶性を示し
た。ＣＫＭＭ及びＣＫＢＢ抗原（１，０００ｕｇ　／ｌ
まで）と“サンドイッチ”形成をしないことが００７．
　ＡＨ６及びＣＡ８抗体の高い特異性（９９，９％より
大）を示している。

１３Ｇ　１抗体は、ＣＫＢＢと若干交差反応性を示した
。従って、１３Ｇ　１抗体はＣＫＭＢ検定法に使用する
のに適すると考えられるが、００７抗体よりは好ましく
ないと判断された。

００７抗体はその特異性により更に特徴づけられた。特
に、ｌＯｕｇ／ｍｌまでの純粋ＣＫＢＢ。

ＣＫＭＭ及びＣＫＭＢ　Ｃ３ｃｒＩｐｐｓ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ。

Ｓａｎ　Ｄｌｅｇｏ、　ＣＡ）の存在下で、この抗体に
ＣＫ　ＦｖＩ　Ｂ−ＤＭＡＥを結合させることにした。

イソ酵素標準液は５０％のグリセロール中に一２０℃で
保存されているストック溶液から調製された。それぞれ
のイソ酵素は５０ｍＭ　　Ｐ　Ｉ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、　　１
００ｍＭ塩化ナトリウム、５％ＢＳＡ、０．１％アジ化
ナトリウム１ｍＭ　　ＥＤＴＡ及び１ｍＭジチオトレイ
トール（ｄｌｔｈｌｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）　　（ｐＨ８
，７）中で所望する′ａ麿に希釈した。１００ｕｆＩ　
ＣＫＭＢ　−ＤＭＡＥ及び１００ｕＩイソ酵素標準液を
１００ｕ＃の培養上清制限希釈液、すなわち５０％の最
大結合度を与える希釈液に加えた。この溶液を室温で２
時間定温培養した。ヤギ抗−マウスＩｇ磁性粒子（Ａｄ
ｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｌｃｓ、　５ｕｐｒａ）を加
え、室温で１５分間定温培養した。混合液を分離し、ス
クリーニング工程に関連して前述した方法で洗浄した。

カウントの阻害がモノクローナル抗体のイソ酵素に対す
る反応性を示した。

第２図に結果を示しであるが、この図に示されているよ
うに、００７抗体はｌＯｕｇ／ｍｌの濃度までのＣＫＭ
Ｍ又はＣＫＢＢと実質的に交差反応性を示さなかった。

００７抗−ＣＫＭＢ抗体を産生ずる雑種株化細胞はアメ
リカン　タイプ　カルチャー　コレクション（＾ｍｅｒ
ｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、　Ｍａｒｌｙａｎｄ）に寄託され
、登録番号（ａｃｃｅｓｓｌｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ）　Ｈ
Ｂ　９３８９を与えられている。ＣＡ８抗−ＣＫＢ抗体
を産生ずる雑種株化細胞もまたＡＴＣＣに寄託され、登
録番号ＨＢ９３８８を与えられている。００７抗体と同
様に、ＣＡ８抗体もＩｇＧ１型であり、カッパ　ライト
チェーン　（ｋａｐｐａ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎｓ）
を有する。

同様にして、ＣＡ８抗体を産生ずる株化細胞は安定な株
化細胞である。

実施例　２ 検定形式 この実施例は、ＣＫＭＭ又はＣＫＢＢによる干渉に影響
されにくく、ただ１つの定温培養工程で済むＣＫＭＢ検
定法の型の開発を説明している。

ＣＫＭＢ標準曲線は、５，０００ｕｇ／Ｎ　ＣＫＭＭ又
はｔ、ｏｏｏυｇ／１）ＣＫＢｓのどちらかの存在下及
び不存在下で４つの異なる検定の型〔すなわちキャプチ
ャー抗体として抗−ＣＫＭ　（ＡＨ６）をトレーサー抗
体として抗−ＣＫＢ　（ＣＡ８）又は抗−ＣＫＭＢ　（
００７）のどちらかと共に用いること、及びキャプチャ
ー抗体として抗−ＣＫＢ　（ＣＡ８）をトレーサー抗体
として抗−ＣＫＭ　（ＡＨ６）又は抗−ＤＫＭＢ　（０
０７）のどちらかと共に用いること〕を使用して作成し
た。この標準曲線は実施例１の標準曲線と同様の方法で
作成した。

固ｔＵ抗体が抗−ＣＫＭである場合、標鷹化した抗−Ｃ
ＫＢがトレーサー抗体であれば標準曲線はＣＫＢＢによ
り阻害されたが（第３Ａ図）、抗−ＣＫ　Ｍ　Ｂがトレ
ーサーとして加えられると阻害されなかった（第３Ｂ図
）。ＣＫＢＢによる阻害は、標識化抗−ＣＫＢを加える
前に洗浄工程を行なうか、又はトレーサーの量をなん倍
かに増加することによりとり除くことができた。しかし
、トレーサーの量を増加させると高い割合で非特定シグ
ナル（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｇｎａｌ）を発
生させた。キャプチャー抗体として抗−ＣＫＭを使用す
ると、どのトレーサーを用いるかに係りなく標準曲線は
ＣＫＭＭにより低下した（第３Ａ図及び第３Ｂ図）。

固相抗体が抗−ＣＫＢでトレーサー抗体が抗−ＣＫＭの
場合、ＣＫＭＭによる標準曲線の強い阻害が見られた（
第３Ｃ図）が、ＣＫＢＢによる阻害は見られなかった（
第３Ｃ図）。トレーサー添加前の洗浄工程はＣＫＭＭ阻
害を防止するのに効果があった。

最後に、固相抗体が抗−ＣＫＢでトレーサー抗体が抗−
ＣＫＭＢの場合、ＣＫＭｋｉ又はＣＫＢＢによる干渉の
どちらも起らなかった（第３Ｄ図）。

従って、この方法は干渉を起さず、ただ１回の定温培養
工程で済むため、他の方法より優れている。

実施例　３ 検定の最適化と試験 この実施例は、抗−ＣＫＢ　（ＣＡ８）及び抗−ＣＫＭ
Ｂ　（００７）をそれぞれキャプチャー抗体及びトレー
サー抗体として使用している実施例２の好ましいＣＫＭ
Ｂ検定法の最適化と試験に関する。

００７抗体をトレーサー抗体として使用することにより
作成された標準曲線は中程度のｐＨに対して敏感である
ことがわかった。特に、ｐｌｌが６．５から８．０に上
昇するにつれてシグナルが徐々に減少するが、９１１７
．４のシグナルはＩ）１１６．５の場合より４０％低か
った。その結果、この検定法に使用する試薬は０．１Ｍ
　　ＰＩＰＥＳ緩衝液を用いｐＨＧ、５で緩衝し、血清
試料が異常なｐＨ値を有するために生じる潜在約定誤差
（ｐｏｔｅｎｔｌａｌ　ｂｉａｓ）を防止するため媒体
／試料比７が使用された。

最近の種々の刊行物には、マウス　モノクローナル抗体
に利用されるイムノアッセイにおける異種親和性、おそ
らく抗−マウス抗体による干渉が開示されている。Ｔｈ
ｏｓｐｓｏｎ、　ｔ？、　Ｊ、等の゛サーキュレーティ
ング　アンティボディーズ　トウマウス　モノクローナ
ル　イムノグロブリンズイン　ノーマル　サブジエクツ
ーインシデンス。

スピーシズ　スペシフィシティ、アンド　イフェクツ　
オン　ア　ツーサイト　アッセイフォー　クレアチン−
キナーゼ−Ｍ　Ｂ　　イソエンザイム（Ｃ１ｒｅｕｌａ
目ｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔ。

Ｍｏｕｓｅ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ｉ−繻ｕｎｏ
ｇｌｏｂｕｌｌｎｓ　　ｉｎ　　ＮｏｒｍａｌＳｕｂｊ
ｅｃｔｓ　−−Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ、　５ｐｅｃｉｅｓ
　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ。

ａｎｄ　Ｅ「ｒａｃｔｓ　ｏｒ　ａ　Ｔｗｏ−８ｉｔｅ
　Ａｓ５ａｙ　「ｏｒＣｒｅａｔｉｎｅ−Ｋｌｎａｓｅ
−ＭＢ　　ｌｓｏｅｎｚｙｍｅ）”　　、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｗ、、　３２　：　４７Ｇ−４８１，１９８６年
；及びＭｕｒＬｈｙ。

Ｖ、　Ｖ、等の“アクティビティ　コンセントレージョ
ン　アンド　マス　コンセントレージョン（モノクロー
ナル　アンティボディー　イムノエンザイモメトリック
　メソッド）コンベアード　フォークレアチン　キナー
ゼ　ＭＢ　　インエンザイム　イン　セラム（Ａｃｔｉ
ｖｉｔｙ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ　Ｍａｓ
ｓ　Ｃｏｎｃｃｎｉｒａｔｉｏｎ　（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙｌｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｏｍｅ
Ｌｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ）　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｒｏｒ
Ｃｒｅａｔｉｎｅ　Ｋｌｎａｓｅ　ＭＢ　ｌ５ｏｅｎｚ
ｙａｃ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ）−。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３２　：　１９５［１−１
９５９，１９８８年を参照のこと。従って、０．　Ｉ　
９ｆｉ　（ｖ／ｙ）非免疫マウス血清を検定媒体に加え
た。これによる標準曲線への明らかな効果はなかった。

前述の試薬を使用し、本願発明の検定法と既存のＣＫＭ
Ｂ検定法を比較するのに次の検定法＝１″画案を用いた
。

１、　ＬＯＯｕｇの試料、対照標準液、標準液又はキャ
リブレータ−（ｃａｌｌｂｒａｔｏｒ）を試験チューブ
に加える。（５００ｕｇ／Ｎより大きいＣＫ　Ｍ　Ｂ　
４度を何する試料をまず希釈する。好ましい希釈剤はフ
ォトン測定値を濃度値に変換するために使用されるロー
　キャリブレータ−（１０ｖｅａｌｌｂｒａｔｏｒ）で
ある。下記の説明を３照のこと。） ２、１１００ｕの抗−ＣＫＭＢトレーサー抗体を次にチ
ューブに加える。

３、形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間
かくはんする。

４、磁性粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｃｔｌｃｓ
）に結合された抗−ＣＫＢキャプチャー抗体を５０（ｌ
ｕＩ、それぞれのチューブに加える。

５、形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒間
かくはんする。

Ｂ、チューブを３０分＋７−１分間、室温（１５℃ない
し３０℃）で定温培養する。

７、固相をコーニング磁気分離装置で３分間かけて分離
する。

８、チューブの水分を取り、３分間水気を切って次にプ
ロット（ｂｌｏｔ）する。

９、１．０　ｍｌの蒸留水又は脱イオン水をチューブに
加える。

１０、形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒
間かくはんする。

Ｉｌ、同相を磁気分離装置で３分間かけて分離する。

１２、チューブの水分を取り、３分間水気を切って次に
プロット（ｂｌｏｔ）する。

１３、１００ｕ、ｌ！の蒸留水をチューブに加える。

１４、形成物を最小限にしながらチューブを３回、５秒
間かくはんする。

１５、チューブ内のフォトン出力を、チバ　コーニング
　ダイアグツティック社発売のマジックライト　アナラ
イザー（ａ　Ｍａｇｉｃ　Ｌｉｔｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ
ｓｏｌｄ　　ｂｙ　　Ｃ１ｂａ　　Ｃｏｒｎ！ｎｇ　　
Ｄｌａｇｎｏｓｉｌｃｓ−νａｌｐｏｌｃ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて２，０秒間ＡＩ
定する。

フォトン出力から濃度値への変換は、ふたつのギヤリプ
レークー、すなわちハイキャリブレータ−（ａ　ｈｉｇ
ｈ　ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）及びローキャリブレータ−
（ａ　ｌｏｗ　ｃａｌｌｂｒａｔｏｒ）を用いて行なう
。特に、全標準曲線は、前述の手法を、既知のＣＫＭＢ
Ｉｍを有する一連の標準液について行なうことにより、
試薬のそれぞれのロフトについて得られる。この標準曲
線はユーザーに供給され、ユーザーはこの標準曲線をマ
ジックライトアナライザー（ＭａｇｉｃＬＩＬｅ　Ａｎ
ａｌｙｚｅｒ）にプログラムする。ノ１イ及びローキャ
リブレータ−は、標準曲線をユーザが検定を行なう際に
用いる特定の条件に適合させるため、アナライザーによ
り使用される。

検定のために求められる値は、検定を下記のカテゴリー
による８２１の診断された患者の試料について行なうこ
とにより決定された。そのカテゴリーは非加療の正常の
人（２２８）、診断されたＭｌ、患者（１１１０）、及
び病院加療の非心臓疾患関連の患者（２１３）である。

この研究に基づき、非加療正常人に対する０から７回ｇ
／Ｉの規定範囲、及び病院加療の非心臓疾患関連の患者
に対する０からＩＯｕｇ／ｇの規定範囲が最も良好な診
断効果を与えることがわかった。この研究に基づき、更
に、ｌＯｕｇ／Ｎより大きいピーク血清ＣＫＭＢ値は通
常、心筋傷害を示していると言えることが結論づけられ
た。

しかし、当業者に既知のように、この大きさの血清ＣＫ
ＭＢ高濃度はＭｌ（例えば充血性心臓疾患、心筋炎及び
乏血）以外の心臓疾患状態又は非心臓組織（例えば骨格
筋）から起こり得る。ＬＯｌｔ等の“セラム　エンザイ
ムス　アンド　イソエンザイムス　イン　ザ　ダイアグ
ツシス　アンド　ディファレンシャル　ダイアグツシス
　オン　ミオカーデイアル　イスキーミア　アンド　ネ
クロシス　（Ｓｅｒｕｍ　　Ｅｎｚ＞ｖｅｓ　　ａｎｄ
　　ｌ５ｏｅｒ＋ｚｙａｅｓ　　ｉｎ　　ＬｉｆｅＤｉ
ａｇｎｏｓｉｓ　　ａｎｄ　　ＤＩＩＴｅｒｅｎｔｉａ
ｌ　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　ｏｒＭｙｏｃａｒｄ［ａ
ｌ　Ｉｓｃｈｅｍｌａ　ａｎｄ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）　
’　、　ＣｌＩｎ。

Ｃｈｅ＋ｓ、、　２Ｂ　＋　１２４１．１９８０年、を
参照ノコと。

前述の“標準“検定計画案に加えて、“至急″検定計画
案もまた開発された。この計画案は、室温培養時間を３
０分から１０分（＋　／　−３０秒）に短縮すること以
外はｔ１１！ｆＩ計画案と同一であった。至急検定法と
標準検定法との相関関係は、回帰方程式至急−〇、９６
標準−３．５　ｕｇ／ｌによる７　”０．９９８である
ことがわかった。

標準検定法の典型的標準曲線は第４図に示されている。

標準液は最大トレーサー結合度２５９６で１−７００　
ｕｇ／Ｎ　ＣＫＭ　Ｂの範囲であった。１．０００ｕｇ
／ＲＣＫＭＢまで１フツク　イフエクト（ｈｏｏｋｅｆ
Ｔｅｃｔ）″は現れず、１２０までの検定チューブが“
エンド　オプ　ラン（ｅｎｄ　ｏｆ　ｒｕｎ）　”効果
を起さず一度に操作できた。

標準検定法の最小検出適用量は０．８５ｕｇ／ｊ７であ
り、非特定結合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉ［’ｌｃ　ｂｉｎ
ｄｉｎｇ）は、加えられた標ぷの０．０７％であった。

キャプチャー及びトレーサー抗体の結合活動性（ｂｉｎ
ｄｉｎｇ　ｋｉｎｅｓｉｃｓ）を比較すると、１０分間
の定温培養後、９０％より大きい割合のＣＫＭＢが同相
に結合していたことが観察された。しかし、トレーサー
は平衡に達していなかった。その結果、１０分間の定温
培養による検定法、すなわち至急検定法において、標準
曲線は、３０分間の定温培養によるものより約５０％低
かった。これらの条件下では、最小検出適用量は１ｕｇ
／Ｎであった。

標準検定法の正確さと精度は下記のように試験された。

■、１４から２８３ｕｇ／Ｄの範囲の１５４の血清試料
を、本願発明の方法及び既存の電気泳動技術を用いて検
定した。本願発明の検定法は前記電気泳動法とよく相関
しくγ−０，９３８）、−次回帰方程式ＣＫＭＢ　（本
願発明）　−１，０３ｃＫＭＢ　（電気泳動法）　−０
，７１９ｕｇ／ｇ（第５図参照）であった。

同様にして、０．１から３４０ｕｇ／ｊ！までの範囲の
１６８の試料について、標準検定法は／％イブリテ・ツ
ク社（ｌｙｂｒｌｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、）販売のタンデ
ム−ＥＣＫＭＢ　　イムノエンザイマティック　アッセ
イ（Ｔａｎｄｅ＊−Ｅ　ＣＫＭＢｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙ
ｍａｔｌｃ　ａｓｓａｙ）と良く相関しくγ−０，９４
２）、回帰方程式はＣＫＭＢ　（本願発明）−１，１６
ｃＫＭＢ　（タンデム−Ｅ）　＋７．５ｕｇ／ｌであっ
た。

更に本検定法の正確さを評価するために、３つの血清試
料（１，７−１０５ｕｇ／ｌ）　）を最も低い標準液で
１：２及び１：４に希釈し、ＣＫＭＢについて検定した
。リカバリー（ｒｃＩＣＯＶＱｒＩＱＳ）は８％から１
１０％、平均９３％の範囲であった。

マクロ−ＣＫ−１（ｓａｃｒｏ−ＣＫ−１）を用いた数
個の試料からは正確な結果が古られた。同様にして、溶
血、高脂血症、及び３０ｍｇ／ｄｌまでの濃度のビリル
ビンは本検定に重大な影響を与えないことがわかった。

２６の検定（Ｎ−９６）のそれぞれについて３〜５回検
定した３つの試料から得られたイントラ−アッセイＣＶ
値（Ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ　ＣＶ　ｖａｌｕｅｓ）は
、それぞれ２．５．４．１　、及び２１０ｕｇ／ｇのＣ
ＫＭＢを含有する患者の血清について、１２．７％、　
　８．１％、及び４．１０６であった。同じ試料につい
て、インター−アッセイＣＶ値（Ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａ
ｙ　ＣＶ　ｖａｌｕｅｓ）は１４．４％、　　ｔｔ、’
ｙ％、及び６．８％であった。

試薬の安定性に関して、磁性粒子に結合した抗−〇ＫＢ
抗体及びＤＭＡＥで標識化された抗−ＣＫＭＢ抗体は、
４℃の水性媒体に保存した場合少くとも６ケ月間は安定
であった。重要なことに、前述したｖａｌｄｙａ等の方
法に関して、ＣＫＭＢ標準　４液の酵素活性は、２５℃
の水性媒体に１日保存した場合、４０％減少することが
観察された。一方、同じ標準液のＣＫＭＢ塊（ＣＫ　Ｍ
　Ｂ　ｍａｓｓ）は、同じ条件下に２日間保存した場合
、完全に安定であることがわかった。

先に示すように、抗−ＣＫＭＢをアクリジニウム　エス
テルで標識化し、抗−ＣＫＢを磁性粒子上に固定するこ
とにより、本願発明はＣＫＭＢに対する迅速で高感度の
検定法を与える。同検定法は、室温でたかだか１０分間
の定温培養に対して少くともｌｕｇ／ｉ）ＣＫＭＢの最
小検出適用量を達成し、また標準曲線は７００ｕｇ／　
ｉｔ　ＣＫ　Ｍ　Ｂまで白°効である。血清試料に適用
する場合、同検定法は既存の方法と良く相関し、患者試
料中のマクロ−ＣＫ−１、又は高いレベルのＣＫＭＭ及
びＣＫＢＢの存在による干渉の影響を受けない。要約す
ると、本願発明の検定法は、早く、容易に使用でき、従
来の検定法より干渉を受けず、さらにこれら従来の検定
法の感度を保持しているものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は次の抗−ＣＫ抗体の特異性及び″サンドイッチ
゛相溶性を示した表である。抗−ＣＫ抗体：ＡＨ６−抗
−ＣＫＭ、ＣＡ３−抗−ＣＫＢ：１３Ｇ　１−一抗−Ｃ
ＫＭＢ：及び００７−抗−ＣＫＭＢ。 標準曲線（０−１，０００ｕｇ／ｉ）　）は表に示され
たキャプチャー／トレーサー抗体を使用したＣＫＢＢ。 ＣＫＭＭ及びＣＫ　Ｍ　Ｂのそれぞれについて作成され
た。相溶性の組合せ（＋″組合せ）は１　ｕｇ／ρ以上
の感度を有した。非相溶性の組合せ（“−組合せ）は０
゜１％未満の免疫反応性をＨした。 １０００抗体はＣＫＢＢ　（約１％）と“トレース“交
差反応性を有することがわかった。 第２図は００７抗体の特異性を示している。特に、この
図は種々の濃度の純粋ＣＫＭＢ　（Δ印）、ＣＫＭＭ　
（ｘ印）、及びＣＫＢＢ（Ｏ印）存在下で００７抗体に
１ｊＡ３化したＣＫＭＢを結合させることを示している
。数値は０標準液（Ｂｏ）のカウントと比較した拮抗剤
の存在下での結合したカウントの百分率と加えられた拮
抗剤の濃度（ｕｇ／　ｍｌ　）の関係としてプロットし
である。 第３図は、各種の検定法を行なう際に含まれるＣＫＭＭ
及びＣＫＢＢによる阻害に対するＣＫＭＢ標弗曲線の感
受性を示している。黒丸はＣＫＭＢのみを含む標準曲線
を示し、白丸は５．０００　ｕｇ／ｉ）のＣＫＭＭを加
えた標準曲線を示し、そして三角はｌ　、　０００ｕｇ
／　１１のＣＫＢＢを加えた標準曲線を示している。 第４図は、抗−ＣＫＢ抗体（ＣＡ８）をキャプチャー抗
体として、抗−ＣＫＭＢ抗体（００７）をトレーサー抗
体として使用することにより得られる典型的標準曲線を
示す。 第５図は、本願発明に従って行われたＣＫＭＢ検定法（
抗−ＣＫＢ　（ＣＡ８）をキャプチャー抗体とし、抗−
ＣＫＭＢ　（００７）をトレーサー抗体とした）と、従
来の電気泳動分離技術に従って行われた検定法との間の
相関関係を示している。患者の血清は双方の方法で２度
テストされた。 軸のｌγ−１嗜内８１こノ更なし） −／？　　芋　品　に　ｊ　δ　４　ぢ　と　ピ　リ７
Ｎ２、（Ｔ）−）１「＆＆ノー１（）の−リ四四囚（〜
−一一一 −エーロ＜ノＬ：　？’ｌｌＴ　　ｃＬ　ｔＪＡ　　　
（７’ｊ−’、「Ｅ　　）Ｖｇｎ庁長官　吉田文毅殿 １、　事件の表示 昭＄１１６３　　年　Ｍ　　ｎ　　ｍｌ　　　　ｆＴＯ
８２，８６９ｇ２、　発明の名称 ＣＫＭＢ検定及びそれに使用するモノクローナル抗体３
、　補正をする者 ＩＩｉ件どの関係　　　　　特許出願人名　称　コーニ
ング　グラス　ワークス４゜代理人 （１所　東京都港区六本木５−２−１　　　　　　はう
らいやビル７階５、　　？ｉ１正命令の日付 昭和６３　年０６　月　２８　日　　（光送口）６１４
正の対象　　図面 ７　補正の内容 １）図面中第２図を添付の通り補正する。（内容に変更
なし）８、添付書類

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物体液中のクレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素
   を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）生物体液の試料、 （ｉｉ）クレアチンキナーゼのＢモノマーに対する抗体
   であって、固体支持体に結合したもの、及び （ｉｉｉ）クレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素に対する
   、標識化されたモノクローナル抗体、の混合物を形成し
   、 （ｂ）前記混合物を定温培養し、 （ｃ）前記混合物から前記固体支持体を分離し、そして （ｄ）前記固体支持体に結合した標識の量を検出するこ
   と、の各工程から成る方法。
2. （２）クレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素に対するモノ
   クローナル抗体がＩｇＧ１型のマウスモノクローナル抗
   体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. （３）クレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素に対する抗体
   が化学ルミネセント物質で標識化されていることを特徴
   とする請求項１記載の方法。
4. （４）化学ルミネセント物質がアクリジニウムエステル
   であることを特徴とする請求項３記載の方法。
5. （５）化学ルミネセント物質がジメチルアクリジニウム
   エステルであることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. （６）固体支持体が磁性粒子から成ることを特徴とする
   請求項１記載の方法。
7. （７）固体支持体が磁性粒子から成り、クレアチンキナ
   ーゼのＭＢイソ酵素に対するモノクローナル抗体がジメ
   チルアクリジニウムエステルで標識化されているＩｇＧ
   １型のマウスモノクローナル抗体であることを特徴とす
   る請求項１記載の方法。
8. （８）更に、既知のＭＢイソ酵素濃度を有する試料につ
   いて（ａ）から（ｄ）の各工程を実施することによって
   標準曲線を作成し、その標準曲線を使って標識の検出さ
   れた量を濃度値に変換することにより試料中のクレアチ
   ンキナーゼのＭＢイソ酵素の濃度を決定する付加的工程
   を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
9. （９）ネズミ由来の雑種株化細胞から産生されるモノク
   ローナル抗体であって、ヒトクレアチンキナーゼのＭＢ
   イソ酵素の抗原性決定子の１種類以上と特異的に結合し
   、ＩｇＧ１型から成るモノクローナル抗体。
10. （１０）ネズミ由来の雑種株化細胞が寄託登録番号ＨＢ
    ９３８９の株化細胞であることを特徴とする請求項９記
    載のモノクローナル抗体。
11. （１１）寄託登録番号がＨＢ９３８８のネズミ由来の雑
    種株化細胞。
12. （１２）請求項１１記載の雑種株化細胞の変異体であっ
    て、ヒトクレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素の１種類以
    上の抗原性決定子に特異的に結合しそしてＩｇＧ１型か
    ら成る抗体を産生する変異体。