JPH0313864A - ＴＮＦ―αの測定方法，キット及び診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明はヒトＴＮＦ−αに対する抗体と他のヒトＴＮＦ
−αに対する抗体との組合せを用いて検体中のヒトＴＮ
Ｆ−αの借を免疫学的に測定する方法、キット及び診断
方法に関するものである。

かかる方法、キットを用いて検体中のＴＮＦ−αの吊を
特異的に測定することにより、免疫不全疾患、感染症１
発熱性疾患、腫瘍等の各種炎症性疾患の診断の一助とす
ることができる。

１０発明の背景 ＴＮＦ−αはマクロファージが産生ずるサイト力インの
一種で、カケクチンとも呼ばれ、穫めて多様の生物学的
活性を有する蛋白質である。その活性は、広く体内の免
疫系の活性化に作用する。

ＴＮＦ−αの産生は、マクロファージにエンドトキシン
や細菌国体などが作用し１）、誘導されるが、インター
リウキン１やガンマ・インタフェロンなとサイト力イン
により調節されている２）。

ＴＮＦ−αはクラス■主要組織適合性抗原の特異的発現
を促し３）、グラニ１ロサイトマクロフ７−ジコロニー
刺激因子４）、　　ＩＬ−１５）の産生を誘導し、リボ
蛋白リパーゼ活性を減少させ６）、腫瘍細胞７）及び血
管内皮細胞８）を傷害し、内因性の発熱因子９）として
働くなど多くの活性を有している。

１）　　［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐ　ｒ
ｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Δｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］２）　　［Ｒ、Ｐｈ１ｌｉｐら、
　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３２３．８６（１９８Ｇ）　　
］ ３）　　［Ｔ、　Ｃｏｆｆ１ｎら、　Ｐｒｏｃ、ＮａＮ
、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＬＩＳＡ、■、　　４４６（１９８６）　］
４）［Ｌ、Ｌｕら、　Ｊ　、　　Ｉ　１１１１１１Ｕｎ
ＯＩ、、ユ４１．　２（１１（１９８８）］ ５）　　Ｉ　Ｎ　ａｗｒｏｔｈら、　　Ｊ、　　［ｘｐ
、　　Ｍｅｄ、　　ユ６３．　１３８３（１９８＆）Ｊ ６）　　［Ｂ、　　Ｂｅｕｔｌｅｒら、　　Ｎａｔｕｒ
ｅ　三Ｓ２０．　５８４（１９８７）］ ７）　　［Ｌ、　Ｈｅ１ｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　　
２５８．　７３１（１９７５）］ ８）　　［Ｎ、　５ａｔｏら、Ｊ、Ｎａ口、Ｑ　ａｎｃ
ｅｒ　ｌ　ｎｓｔ。

７６．１１１３（１９８６）］ ９）　　Ｅ　Ｄ　１ｎａｒｅｌｌｏら、　　Ｊ、　　Ｅ
ｘｐ、　　Ｍｅｄ、　　１６３゜１４３３　（１９８６
）　　］ このように多様な活性を有するＴＮＦ−αは、感染に対
する生体防御機構そして各種疾患における免疫系の作動
において中心的役割を果たしている可能性が考えられ、
その血液等体液中の量の測定に大きな関心が寄せられて
いた。

ある種の病態において血液等体液中のＴＮＦα量が増加
しているということは既に報告されはじめている。古川
らは、川崎病において血清中ＴＮＦ−α量が増加してい
るのを認め１０）、（３ｃｕｔｌｅｒらはＴＮＦ−αが
エンドトキシンショックのメデイエータ−であると報告
した１１）。またＳ　ｃｕｄｅｒｉらは原虫感染１２）
　、Ｍａｕｒｙらは腎移植における拒絶反応１３）　、
ＷａａＣＩＱらは髄膜炎１４）、Ｂａｌｋｗｉｌｌらは
悪性腫瘍１５）で、ＴＮＦ−ａの血中レベルが上昇して
いることを報告した。

１０）　　［Ｓ　、　Ｆ　ｕｒｕｋａｗａら、　ＣＩｉ
ｎ、Ｉ　ｍｎ＋ｕｎ。

１＋＋＋ｍｎｏｐａｔｈｏｌ、　４８．　２４７（１９
８８）　］１１）　　［Ｂ　、　　Ｂ　ｅｕｔｌｅｒら
、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３２０．　５８４（１９８
Ｇ）　］ １２）　　［Ｐ、　５ｃｕｄｅｒｉら、　Ｔｈｅ　　ｌ
　ａｎｃｅｔ。

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１３．　　（１９８６）　ｌ）、１
３６４］１３）［Ｐ、Ｊ、Ｍａｕｒｙら、　　Ｊ　、　
　ＥＸ（ｉｉ）、　　Ｍｅｄ、、　　１６６゜１１３７
　（１９８７）　］ １４）　　［Ａ、　　Ｗａａｇｅら、　　Ｔｈｅ　　Ｌ
ａｎｃｅｔ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ１４、１９８７）　ｐ、
３５５　］ １５）　　（Ｆ、　Ｒ，Ｂａｌｋｗｉｌｌ　ら、　Ｔ　
ｈｅ　　Ｌ　ａｎｃｅｔ。

（１９８７）ｉｉ、１２２９］ このようにＴＮＦ−αの血液等体液レベルと病態との関
連は、広く認められるようになり、ＴＮＦ−αの作用が
病態の形成にどのようにかかわるかという作用機序ひい
ては病態の診断、治療方法決定への一助とするための詳
細な解析が待たれるようになった。しかしながら、ヒト
末梢血、尿等体液成分中に含まれるＴＮ　Ｆ１ａ度は極
めて低いため、今まで報告に用いられてきたＴＮＦ−α
の測定方法では、これら詳細な検討を行なうには、測定
系の感度が不充分なため不可能であった。とりわけ健康
な人の血中ＴＮＦ−α量はさらに微量であるため測定不
可能で、正確な病態の比較、ＴＮＦ−α母の変動等を調
べるのは困難な状況にあった。

Ｃ０発明の構成 そこで本発明者はＴＮＦ−αを高感度に測定する方法を
鋭意検討した。その結果、Ｆ　ａｂ’　断片化した第２
抗体を用いること、第１抗体を酸処理して担体に担持さ
せること、特定の抗体を組み合せること等の感度を上げ
る手段を発明し、特願平１−１７４９２号（平成元年１
月３０日出願：発明の名称゛酵素抗体複合体、複合体−
抗体の組合せ、キット及び診断方法”）を出願するにい
たった。しかしながらその侵も１２意検討を進めた結果
以下の点に改良を加え、さらに効果的にＴＮＦ−αを測
定することができるようになった。

すなわち、ヒトの血液等体液中には、他の動物種由来の
蛋白質と結合する物質が存在する場合があり、その際に
は酵素免疫測定法における抗原特異的な抗体と、この物
質が結合しあたかも抗原物質が反応したかのような非特
異反応を生せしめる可能性があった（Ｌ、　Ｍ、　Ｂｏ
ｓｃａｔｏらＣｌ１ｎ。

Ｃｈｅｗ、３４　　２７（１９８８）　　Ｂ、　　Ｍｉ
ｎａｒｃｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏ＋ｏｏｙ　　Ｎｅｗｓ
　８　２　（１９８８）　）　。本測定系においても該
物質により、非特異反応が生じる可能性があったため、
この影響を打消すべく検討を行なった結果、測定系に用
いた抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリンを、抗原
抗体の特異的反応時に共存させると、該物質による非特
異反応を打消すことができることを見い出し本発明に至
った。

すなわち本発明は下記の発明を包含する。

（１）サンドイッチ法によるＴＮＦ−αの免疫学的測定
方法において、第１抗体としての、不溶性担体に担持さ
せた抗ＴＮＦ−α抗体がＴＮＦ−αと反応する際に、該
第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリン及び／又
はそれらの断片を存在させることを特徴とするＴＮＦ−
αの免疫学的測定方法。

（２）サンドインチ法によるＴＮＦ−αの免疫学的測定
方法において、第２抗体としての、標識化された抗ＴＮ
Ｆ−α抗体がＴＮＦ−αと反応する際に該第２抗体と同
一の動物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断
片を存在させることを特徴とするＴＮＦ−αの免疫学的
測定方法。

（３１（ｉ）　　第１抗体としての不溶性担体に担持さ
せた抗ＴＮＦ−α抗体に、検体を接触させ、必要に応じ
洗浄し、次いで第２１？Ｌ体としての、標識化された抗
ＴＮＦ−α抗体を接触させるか、あるいは （ｉｌ）　　第１抗体としての不溶性担体に担持させた
抗ＴＮＦ−α抗体、第２抗体としての標識化された抗Ｔ
ＮＦ−α抗体及び検体を同一系に存在せしめることによ
り検体中のＴＮＦ−αを免疫学的に測定する方法であっ
て、該第１抗体及び該第２抗体が検体中のＴＮＦ−αと
反応する際に、該第１抗体及び／又は該第２抗体と同一
の動物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片
を存在せしめることを特徴とするＴＮＦ−αのサンドイ
ッチ法による免疫学的測定方法。

［４）　（＋）　　第１抗体としての、不溶性担体に担
持させた抗ＴＮＦ−α抗体、 （ｉ＋）　　第２抗体としての、標識化された抗ＴＮＦ
−α抗体及び （ｉｉｉ）　該第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロ
ブリン及び／又はそれらの断片、並びに該第２抗体と同
一の動物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断
片の少なくとも一種、より少なくともなるＴＮＦ−αの
免疫学的測定キット。

（５）被験者から採取した体液中のＴＮＦ−αを上記測
定方法を用いて、あるいは上記キットを用いて検出する
ことを特徴とする各種疾患の診断方法。

以下、本発明（測定方法、キット及び診断方法を包含す
る）について更に詳細に説明する。

抗ＴＮＦ−α抗体は常法に準じて作成すればよい。寸な
わら、抗原であるヒトＴＮＦ−αでｖＪ物を免疫しその
動物より血清を得て抗ヒトＴＮＦ−α抗体を精製すれば
よい。またモノクローナル抗体を入手する方法としては
、例えば本発明者らにより先に出願された特許（特願昭
６２−１６２２３３号：昭和６２年７月１日出願：発明
の名称“モノクローナル抗体及びハイブリドーマ細胞″
）などに記載の方法に準じて作成すればよい。すなわち
、免疫した動物体より抗体産生細胞を取得し、適当な動
物由来の骨ｆｆ１ｌｉ腫細胞株と細胞融合を行ない、抗
体産生細胞株を選択し、クロン化し、大量培養して分泌
されたモノクローナル抗体を精製入手すればよい。動物
としてはマウス、ラット、ウーサギ、モルモット、ヒツ
ジ、ヤギ、ウマ、ウシなどが例示される。

抗体はヒトＴＮＦ−αに対する特異性を有する抗体のみ
を含む画分にまで精製した方が望ましい。

抗体の精製についても常法に従えばよく、例えばカラム
クロマトグラフィー、塩析などの方法を用いることがで
きる。

またすでにこのような方法を用いて作成された抗血清、
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が市販され
ていたり（Ｇ　ｅｎｚｙｎ＋ｅ社！１６Ｂｅｈｌｉｎｇ
ｅｒ社製、　　ＬＪｎｉｔｅｄ　Ｂ　ｉｏｌｍｅｄｉｃ
ａｌ　　Ｉ　ｎｃ。

製など）、作成について報告した文献もある（Ｊ。

Ｉ　＋ｕｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　９６．５，１
９８７．　）ｌｙｂｒｉｄｏｍａ　６゜３０５．１９８
７．　Ｈ１／ｂｒｉｄ（１１１８６．３５９，１９８７
．　ｆｌｂｒｉｄｏｍａ６、４８９，１９８７．　Ｊａ
ｐａｎ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、　Ｂｉｏｌ、。

３９、１０５．１９８７）ので、これらの抗体を利用し
てもよい。

本発明のＴＮＦ−αの免疫学的測定及びキットにおいて
は、前述した抗ＴＮＦ−α抗体を組合せて使用されるが
、抗丁ＮＦ−α抗体は、それ自体のみならず、それと同
等のモノクローナル抗体の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）で
も同様に使用し得る。ここで“同等のモノクローナル抗
体の断片”とはモノクローナル抗体と同じような結合特
性を有するか、モノクローナル抗体の本質的結合能が担
持されている断片を意味する。具体的にはユニバレント
抗体、Ｆａｂ、　Ｆａｂ’　　Ｆａｃｂ　、或は（Ｆａ
ｂ’）２を断片の例として示すことができる。

本発明において、抗ＴＮＦ−α抗体をＦ　ａｂ’　フラ
グメントとして使用する場合、それ自体知られた方法で
ｌ”　ａｂ’　フラグメントをＩＭすることができる。

すなわち、抗ＴＮＦ−α抗体をペプシンで分解すること
によってＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを得、次いでこれ
を還元処理することによってＦ　ａｂ’　フラグメント
を得ることができる。

一方、本発明において、第２抗体に結合せざる標識物質
としては、通常免疫学的測定に使用される酵素、蛍光物
質、発光物質または放射性物質がＩ２Ｑ様に用いられる
。これらの具体例を示すと、酵素として例えばリゾチウ
ムマレート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォ
スフェート・デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グ
ルコース・オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
ルシフェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼ等：蛍光物
質として例えばフルオレセイン、ローダミン、ウンブベ
リフエＯン、ランタニド・キレート等１発光物質として
例えばルミノール、アクリニジラム・エステル、ルシフ
エニリン等；また放射性物質として例えばヨウ素−１２
５、ヨウ素−１３１、トリチウム、炭素−１３などを例
示することができる。

これらのなかでも標識物質としては、酵素が好ましい。

これら標識物質と、第２抗体またはその断片とを結合さ
せる方法は、例えばグルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸
法またはマレイミド法などの通常の方法に従って行うこ
とができるが、マレイミド法がより好ましく使用される
。

本発明においては、第２抗体としての標識化された抗Ｔ
ＮＦ−α抗体が、抗ＴＮＦ−α抗体のＦ　ａｂ’断片に
Ｗ９素結合させた複合体を使用することができる。

また抗ＴＮＦ−α抗体をＦ　ａｂ’断片とし、そのヒン
ジ部分のＳＨ基にマレイド基を介して酵素を結合させた
酵素抗体複合体を標識化された抗ＴＮＦ−α抗体（第２
抗体）として使用することが好適である。

酵素抗体複合体は、本発明者らが既に公表している方法
（石川栄冶、用合忠、宮井潔編：酵素免疫測定法第３版
医学書院）に準じて作成すればよい。すなわち抗ＴＮＦ
−α抗体をペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素で
処理し、 Ｆ（ａｔｌ’）２にまで消化する。この際に抗原との結
合部分であるＦａｂ領滅を損わないようにすることが望
ましい。次にこのＦ（ａｔｌ’）２を適当な還元剤を用
いてｌ”　ａｂ’に還元する。すなわちジスルフィド結
合を切断し、チオール基を遊離させた状態にする。一方
、複合体に用いる酵素にマレイミド基を導入する。酵素
は特に限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリカリフォスファ
ターゼ、グルコースオキシダーゼなどが例示される。マ
レイミド基はマレイミド基を有する適当な化合物を酵素
と反応させることにより導入すればよい。その際に酵素
活性を損うような条件に長く置かない方がよく、また導
入されたマレイミド基の数が定量して、一定になってい
るようにすることが望ましい。

次に前述のごとく作成したＦ　ａｂ’　をマレイミド基
を導入しである酵素と共存させ、複合体の形成を促す。

複合体の形成後、酵素抗体複合体を未反応の酵素及び抗
体と分離すればよい。分離する方法は特に限定されるも
のではなく、常法に従って行なえばよい。例えば、高速
液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、
電気泳動などの手段が可能である。その際に酵素活性を
損わないように処理することが望ましい。

本発明においては第１抗体を担体に担持する際に酸処理
することが好ましい。第１抗体を短時間酸処理すること
により固相へのこの抗体の吸着を轟め、抗原との持具的
結合効率を上げ、非特異吸着ないしは血清干渉を抑えら
れることができる。

抗体の酸処理は、抗体の抗原との結合を損わない程度に
低ｐＨ条件下に短時間置くもので、特定の方法に限定さ
れるものではない。例えば抗体溶液をｐＨ２〜３程度の
バッフ１−中に室温で０〜数十分程度置いたのち、中性
のバッファーを用いて中性のｏＨに戻せばよく、用いる
バッファーの種類、添加物等に特に規定すべきものはな
い。また酸処理中の温麿、持続時間等も特に規定すべき
ものはなく、適宜選択が可能である。

本発明の測定方法及びキットにおいては、第１抗体及び
第２抗体として使用する抗ＴＮＦ−αは酵素免疫測定法
でＴＮＦ−αを測定した時にゼロブランクが相対蛍光強
度小さい組合せがよい。蛍光物質を基質とした酵素反応
の測定方法を用いた測定系において、抗体の非特異的吸
着の大きさを示すゼロブランク（以下に詳細に説明する
）の相対蛍光強度の値が小さく（好ましくは１０以下）
なれば健康な人の血液等体液成分中のＴＮＦｉｉ度を測
定するのに必要な測定感度が得られる。この非特異的吸
着の大きさは、二種の抗体を組合せた時に認められる抗
体の持つ性質であり、基本的には非特異吸着が小さく、
したがってゼロブランク値が１０以下になるような抗体
の組合せを選別すればよく、またゼロブランク値が１０
以上であっても相互の非特異吸着成分を除去した両分を
作成し、これを用いて１０以下になる複合体−抗体の組
合せとしてもよい。

本発明における相対蛍光強度とは、励起波長３２０ｎｍ
　、測定波長４０５ｒｖとして０．１Ｍグリシン−Ｎａ
　ＯＨバッファーの蛍光強度をゼロとし、０．２μ９／
ｄｉキニーネ０．ＩＮ　　ＨｚＳＯｔ溶液の蛍光強度を
１００と設定し測定するものである。

このようにして高感度化したＴＮＦ−αの測定系を用い
ると、健康な人の血清中に含まれるＴＮＦ−αが充分測
定できる。したがって、各種病態において血液等体液中
のＴＮＦ−α量が正確に測定可能となり、各種疾患の診
断等に有意義であることがわかった。

前述の如くゼロブランクが相対蛍光強度１０以下である
ような抗体の組合せを選定するには以下の方法を用いる
ことができる。

ポリスチレンボールに第１抗体として利用したい抗ＴＮ
Ｆ−α抗体を固定化し、さらにウシ血清アルブミンでブ
ロッキングする。同ボールを１ｔｔＪｂ６あたり１個ヒ
トＴＮＦ−αを全く含まないバッファー（好ましくは中
性のリン酸バッファーがよい）に該第１抗体と同一の動
物種由来の免疫グロブリン（該免疫グロブリンにアイソ
タイプが存在する場合は、同一のアイソタイプが望まし
い）を一定量（好ましくは１　ｔｕｂｅあたり　１〜１
０μｇ）加えた溶液を入れた試験管の中に入れる。ボー
ルがバッファー中に沈んだ状態で２０℃４時間振鰻した
後、４℃で１６時間整地する。バッファーを除き、洗浄
バッファー（０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ＩＭリ
ン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，０）を試験管に適量
加えては除去するというボールの洗浄を２回繰り返す。

次にこのボールを酵素抗体複合体溶液として、第２抗体
として利用したい抗ＴＮＦ−α抗体をｌ：　ａｂ’化し
、西洋ワサビペルオキシダーゼと前述の方法により形成
した酵素抗体複合体を一定量（好ましくは１　ｔｕｂｅ
あたり５０ｎｇ、酵素ｆｉ　ハ１　ｔｕｂｅあたり約２
５０（１）希釈パンファー（０，１Ｍ塩化ナトリウム、
０．１％牛血清アルブミンを含む１０　ｍＭリン酸ナト
リウムバッファーｐｔ−Ｉ　７．０＞に添加した溶液に
該第２抗体と同一の動物種由来免疫グロブリン（該免疫
グロブリンにアイソタイプが存在する場合は、同一のア
イソタイプが望ましい）を、好ましくは該第２抗体と同
様の処理によりＦ（ａｌｌ’）２化して、一定量（好ま
しくは１ｔｕｂｅあたり　１〜１０μｇ）をさらに加え
た溶液を入れた試験管の中に入れる。ボールが溶液中に
沈んだ状態で２０℃、４時間振盪する。溶液を除き、洗
浄バッファーを用いた洗浄を２〜３回繰り返す。

次にこのボールを０．６％３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー
１）ｌ−１７，０溶液１００μ文の入った試験管の中に
移す。０．（１１５％過酸化水素水水溶液５０μすを添
加してから３０℃で６０分間振盪して、２．５ｄの０．
１Ｍグリシン−Ｎａ　ＯＨバｙ　７　ｐ　−１）Ｈ１０
，３ヲ加えて反応を停止する。この溶液の蛍光強度を以
下の如く測定する。励起波長３２０ｎｌｌｌ　、測定波
長４０５ｎｍとして、上記０．１Ｍグリシン−Ｎａ　Ｏ
Ｈバッファーの蛍光強度をゼロとし、０．２μｇ／ｍ（
キニーネ−０，１Ｎ　　Ｈ２８０４溶液の蛍光強度を１
００と設定する。次にボールを加えないで、０．６％３
−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸溶液に０．
（１１５％過酸化水素水を加えて３０℃、６０分間振盪
し、０．１Ｍグリシン−Ｎａ　ＯＨバッファーｐＨ１０
，３を加えたものの蛍光強度を測定し、この値をリエイ
ジ１ントブランク値とする。つづいて上記の如く処理し
たボールを含んだ溶液の蛍光強度を測定し、その値から
りエイジェントブランク値を差引いた値をゼロブランク
（（ｔｌ）とする。

このように規定した方法で種々のモノクロ−カル抗体の
組合せでゼロブランクを測定し、１０以下となる組合せ
を選択すればよい。このゼロブランクは小さければ小さ
い程よく、それだけ高感度でＴＮＦ−αを測定すること
が可能となる。

またゼロブランクが１０以下とならない組合せにおいて
も、各抗体を相互の固定化カラムを通すことにより非特
異吸着画分をとりのぞいたり、再度ヒトＴＮＦ−αを用
いてアフィニティー精製したり検討することにより、上
記の方法によってゼロブランクが１０以下となるような
画分を作成することが可能で、そのようにゼロブランク
値を１０以下にする抗体画分を得て、これを抗体の組合
せとして測定系に用いることも可能である。

ＴＮＦの測定法はいわゆるサンドインチ法による免疫学
的測定法で、既によく知られている多くの方法に準じて
行なえばよく、上記の方法により選択した抗体の組合せ
において、第１抗体として、前述の酸処理した抗体を用
い、第２抗体として前述の酵素抗体複合体を用いること
及びそれら抗体と抗原との反応時に該抗体と同一の動物
種由来の免疫グロブリンまたはその一部を共存させるこ
とが好適であり、それらの担体との結合、抗原との反応
方法、酵素活性の測定方法などは従来の方法に準じ、ま
た、実施者の創意工夫により自由に選択することができ
る。

例えば第１抗体を固定化する不溶性担体としてはボリス
ヂレン、ポリエチレン、ポリプロピレン。

ポリエステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂。

［ｔデキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、そ
の他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せ
などを例示することができる。また不溶性担体の形状と
しては、例えばトレイ状２球状、繊維状、棒状、盤状、
容器状、セル、試験管などの種々の形状であることがで
きる。第１抗体を固定化した不溶性担体は、第２抗体及
び検体試料の非特異的吸着を防ぐために、適当な物質（
例えば、牛血清アルブミン）で、不溶性担体表面を被覆
する。

本発明免疫グロブリン及び／又はそれらの断片は、第１
抗体がＴＮＦ−αと反応する際あ・るいは第２抗体がＴ
ＮＦ−αと反応する際に存在すればよい。

本発明においては、第１抗体がＴＮＦ−αと反応する際
には、第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリン及
び／又はそれらの断片であればよい。したがって第１抗
体がマウス由来のものであればマウス由来の免疫グロブ
リン及び／又はそれらの断片であればよいし、第１抗体
がウサギ由来のものであればウサギ由ヌの免疫グロブリ
ン及び／又はそれらの断片であればよい。また第２抗体
がＴＮＦ−αと反応する際には第２抗体と同一の動物種
由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片であれば
よい。したがって第２抗体がウサギ由来にものであれば
ウサギ由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片で
あればよい。

通常、ＴＮＦ−αに対する抗体は、マウス、ラット、ウ
サギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウマ。

ウシ等があり、本発明の免疫グロブリン及び／又はそれ
らの断片もこれらの動物由来のものを使用する。代表的
なものとしてＩｇＧ１．１ｇＧ１Ｆ（ａｔｌ’＞ｚがあ
る。

該免疫グロブリンは市販されているものでもよく、また
動物血清よりイオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマ１〜グラフイーなどの手段を用いて免疫グ
ロブリン画分を精製してもよい。該動物種がマウスなど
モノクローナル抗体が入手可能な種である場合、ＴＮＦ
−αに対して特異性のないモノクローナル抗体を利用す
ることもできる。また免疫グロブリン含有画分として該
動物血清を適宜希釈して用いてもよい。このようにして
得られた免疫グロブリンは、その全部もしくは一部分す
なわちＦ（ａｂ’）２もしくはＦ　ａｂ’１”ａｂ、ｌ
”ｃなどを用いることができる。その共存させる囚は、
ヒト血中に含まれる該動物種由来蛋白質との結合する物
質の該第１及び第２抗体への非特異吸着を完全に抑制し
うる示であればよく、その吊を越えて添加されていれば
、特に規定されるものではないが、第１抗体が検体中の
ＴＮＦ−αと反応する際は検体１ｄあたり２〜２００μ
３程度存在させればよい。第２抗体がＴＮＦ−αと反応
する際には第２抗体として使用する抗体自体の重量（酵
素等の標識、リンカ−等の重量を除いた部分の１１）に
対し重量比で１〜２００倍程度存在させるとよい。

通常、第１抗体は検体液中でＴＮＦ−αと反応させるこ
とができる。第２抗体は担体に結合した第１抗体（ＴＮ
Ｆ−αが結合している）を検体液中からとり出して、別
の液中でＴＮＦ−αと結合させることができるし、検体
液中でも反応させることができる。

本願発明のサンドイッチ法による免疫学的方法は以下の
ように行うことができる。

第１抗体としての、不溶性担体に担持させた抗ＴＮＦ−
α抗体を検体と一定時間及び温度で接触させ反応させる
。この間に第１抗体と検体中のＴＮＦ−αが結合する。

次いで適当な洗浄液で洗った榎第２抗体と一定時間及び
温度で反応させる。

この間に第２抗体が第１抗体と結合した検体試料中のＴ
ＮＦ−αにさらに結合する。これら２回の抗原と抗体と
の反応時において少なくとも１回に、該第１及び／又は
第２抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリンを共存さ
せる。

また、第１抗体、検体及び第２抗体を同一系に存在せし
め、その際に第１抗体及び第２抗体と同一の動物種由来
の免疫グロブリンを共存させる方法も可能である。

かくして形成された第１抗体−抗原−第２抗体複合体を
、適当な洗浄液で洗い、第２抗体に結合している酵素に
とって適当な基質を加えることにより酵素活性を検出し
、ひいては不溶性担体上に存在する第２抗体の量が測定
できる。かくしてその埴から検体試料中のＴＮＦ−α量
を算出することができる。Ｗｇ素素質質しては、その酵
素活性が測定できる発色基質及び蛍光基質などが挙げら
れるが、当該酵素活性を介した化学発光を利用する方法
などもあり、特に限定されるものではない。

本発明において、ＴＮＦ−αの免疫学的測定の対象とす
るヒト検体としては、例えば、血清或いは血漿形態の血
液、関節液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、細胞組織
液、骨髄液または尿の如きＴＮＦ−αが含有されている
かまたは含有が予測される体液を挙げることができる。

本発明のキットは、（１）　　第１抗体としての、不溶
性担体に担持させた抗ＴＮＦ−α抗体、（１）　　第２
抗体としての、標識化された抗ＴＮＦ−α抗体及び ＠　該第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリン及
び／又はそれらの断片、並びに該第２抗体と同一の動物
種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片の少な
くとも一種、 より少なくともなる。

このキットを能率よくかつ簡便に利用するために、これ
ら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形成するこ
とができる。かかる補助剤としては、例えば第１抗体又
は第２抗体を含有させるための溶液、あるいは検体を希
釈させるための溶解剤、固体状の試薬を溶解させるため
の溶解剤、不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄
剤、酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤な
どの免疫学的測定キットの一部として通常使用されるも
のが挙げられる。

溶解剤中にあらかじめ第１抗体及び／又は第２抗体と、
同一動物由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片
、を含有させておくことができる。

前記本発明のキットを構成する溶解剤としては、免疫学
的測定において通常使用されるものであればよい。該溶
解剤として免疫反応に悪影響を与えないものであればよ
く、例えば、リン酸緩衝液。

トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などのｆ）Ｈが６．０〜
８．０の範囲のものが主として使用される。

またの洗浄剤としては、同様に免疫学的測定において通
常使用されるものが使用される。その例を示すと、生理
食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩Ｍ緩衡液、酢酸緩衝液
などやこれらに界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００
，ツイーン２０．　Ｂ　ｒｉｇ３５などの非イオン性界
面活性剤やドデシル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面
活性剤を上記緩衝液に溶解したものが用いられる。

さらに前記測定キットにおいて、第２抗体における標識
物質として酵素を使用する場合には、酵素活性を測定す
るための基質及び反応停止剤が組合される。かかる基質
及び反応停止剤は、標識物質としての酵素の種類に対応
して、免疫学的測定において通常知られているものを使
用することができる。その例としては、ペルオキシダー
ゼの基質として２．２′−アジノージ−［３エチルベン
ツチアゾリンスルフオン酸］ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ＞、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３．３’
　、５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等が
あり、停止剤としてはＨ２ＳＯ４、ＨＣｆ、酢酸、グリ
シン緩衝液（Ｄ）−１１０，３＞等がある。

アルカリフォスファターゼの基質としては４−二トロフ
ェニルフォスフエート４−メチルウンベリフェリルフォ
スフェート、ＮＡＤＰ等がある。

停止剤としては１Ｎ　　ＮａＯＨなどがある。

β−ガラストシダーぜの基質としては２−ニトロフェニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−メチルウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド等がある。停止剤としては、
０．ＩＭ　　Ｎ８２　ＧＯ３などがある。

本発明において、診断できる各種疾患とは関節リウマチ
、全身性エリトマト−デスなどの自己免疫疾患、ＡＩＤ
Ｓなどの免疫不全疾患、各種感染症２発熱性疾忠、腫瘍
、ＧＶＨＤなどの移植拒絶反応などをいう。

また川崎病、髄膜炎、腎不全、尿ＩＩＩ管性蛋白尿。

紫斑病性腎炎、原虫感染、劇症肝炎などをいう。

ｄ０発明の効果 以上本発明によれば、良好な測定精度を提供することが
可能になり、溶液（例えば血液、尿などのヒト体液）中
のＴＮＦ−αの１を正確かつ高感度に測定することが可
能となる。また、本発明の測定方法及びキットはＴＮＦ
−β、ＩＬ−１α。

β、］Ｌ−２，１ＦＮ−γの妨害を受けずに血清中のＴ
ＮＦ−αを特異的に定量測定可能である。

本発明によれば、正常人血清中のＴＮＦ−αＭの測定も
可能で、正常人ＴＮＦ−α値と比較して、関節リウマチ
（全身性エリトマト−デス）などの自己免疫疾患、ＡＩ
ＤＳなどの免疫不全疾患、各種感染症１発熱性疾患、腫
瘍、　ＧＶＨＤ　（Ｇｌａｆｔｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ
　ｄｉｓｅａｓｅ）などの移植拒絶反応など広く各種の
炎症性症状をともなう疾患におけるＴＮＦ−α値の変動
が測定可能となり、また病態の進行のモニタリングがＴ
ＮＦ−αを指標として可能となり、それら疾患の診断の
一助となりうることがわかった。

ｅ、実施例 以下実施例を掲げて、本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（酵素抗体複合体の作成） ヤギ抗ヒトＴＮＦ−α抗血清よりイムノグロブリン分画
を調製し、ブタ胃粘膜由来のペプシンで消化し、Ｆ（ａ
ｂ’）２をＵ　Ｉｔｒａａｅｌ、Ａ　ｃ　Ａ　４４　（
ＩＢ　Ｆ　　Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）カラムを用い
て分離精製した。コノＦ（ａｂ′）２をファイナル１０
−Ｍの２−メチルカプトエチルアミンで還元した。この
分画をゲル濾過カラムにかけ、ｌ”　ａｂ’分画を得た
。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼにＮ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドベサノエイドを加えてマレイミド基
を導入し、ゲル濾過カラムをとおして未反応のマレイミ
ド化合物を除いた。

このマレイミド基を導入したペルオキシダーゼと、抗体
Ｆ（ａｔｌ’）２を還元して作成した、そのヒンジ部に
生成したヂオール基を有する抗体１”　ａｂ’　とを反
応させた酵素抗体複合体を作成した。

実施例２（抗体の酸処理と固定化） 抗体ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体Ｃ１ｏｎｅ［４
３，ｔＪＢＩ社（オリンパス光学）　Ｍ　５３−００２
０Ｔを１Ｍ塩化ナトリウムを含む０，１Ｍグリシン塩酸
バッファーｐＨ２，５溶液中で室温で１０分間放置した
。その後２Ｍトリス塩酸バッファー１）Ｈ８，０を用い
て抗体溶液のＤＨを７．５に調製した。０．１Ｍリン酸
ナトリウムバッフｙ−ｐＨを用いて、抗体濃度を０．１
ｊ１９／Ｉｄに調製したのち、この抗体溶液中に充分洗
浄したポリスチレンボール（プレシジョン社製）を沈め
ボールの表面に抗体を吸着、固定化させた。抗体が吸着
したボールは０．１％ウシ而面アルブミン（アーマ−社
）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウ
ムを含む１０　ａ＋Ｍリン酸ナトリウムバッファー　ｐ
Ｈ７，０溶液中に移した。

実施例３（抗体の組合せの選定） 下記抗体の組合せＡ−Ｅの抗体について実施例１と同様
な方法で酵素抗体複合体（第２抗体）を作成し、実施例
２と同様な方法で酸処理、固定化（第１抗体）し種々の
抗体の組合せにおいてゼロブランクを測定した。表１は
その結果の一部である。表１の結果より、ゼロブランク
が１０以下であり、かつヒトＴＮＦ−αに対する特異的
反応も他の抗体の組合せと比してさほど悪くない以下の
２種類の組合せを選定した。

組合せＣ 第１抗体：ＣＩｏｎｅ　　Ｅ４３　　　Ｕ［３１社（オ
リンパス光学）　Ｍ　５３−００２０Ｔ第２抗体：ＣＩ
ｏｎｅ　　Ｆ１２　　　ＵＢＩ社（オリンパス光学）　
Ｍ　５４−００２０７組合せＡ 第１抗体：マウスモノクローナル抗体 ０４Ｇ５ 第２抗体： （特願昭６３−１０（１１８６号記載）マウスモノクロ
ーナル抗体 １１Ｄ　７　Ｇ　４ （特願昭６３−１０（１１８６＠記載）表１ 抗体の組合せの選定 第２抗体：マウスモノクローナル抗体 Ｂ：第１抗体：マウスモノクローナル抗体第２抗体：マ
ウスモノクローナル抗体 Ｃ：第１抗体：Ｃ１ｏｎｅ　　Ｅ４３　　ＵＢＩ社第２
抗体：ＣＩｏｎｅ　　Ｅ１２　　ＵＢＩ社１Ｄ７Ｇ４ Ｃ４Ａ９ １Ｄ７Ｇ４ Ｍ５３−００２０Ｔ Ｍ５４−００２０Ｔ Ｄ：第１抗体二Ｃ１ｏｎｅ　　Ｅ４３　　ＬＪＢ１社　
Ｍ５３−００２０Ｔ第２抗体：マウスモノクローナル抗
体　ＴＮＤ−１１Ｅ：第１抗体：マウスモノクローナル
抗体　ＴＮＤ−１１第２抗体：ヤギ抗ＴＮＦポリクロー
ナル抗体実施例４ また、実施例に３において選定した組合せのうら組合せ
Ｃすなわち第１抗体：　Ｍ　５３−００２０Ｔ　、第２
抗体：　Ｍ　５４−００２０Ｔを使用した測定系の特異
製を確認するために以下の実験を行なった。検体試料と
して２５Ｕのリンフォトキシン（ＴＮＦ−β）あるいは
７５ＬＪのインターリウキン１−αあるいは７５ｔＪの
インターリウキン１−βあるいはγ５０Ｕのインターリ
ウキン２あるいは７，５Ｘ１０’　ｔＪのインターフェ
ロン−γをチューブにとり、測定を行なった。その結果
、これらはいづれもゼロブランクより高い蛍光を示さな
かった。すなわち、これらの物質は、ＴＮＦ−αを測定
する水系において何ら干渉しなかった。これらの物質の
ｅは、血清試料５０ｔｌｌ中に存在したと考えるとそれ
ぞれ、リンフォトキシン５．ＯＸ　１０５　Ｕ　／　ｌ
　、インターリウキン１αおよびβ　１．５ｘ　１０’
　ＩＪ　／交、インターリウキン２　　１．５ｘ１０’
ＬＪ／ｕ、インターフェロンγ１．５ｘ１０９　Ｕ／交
に相当する。これらの濃度はこれらの物質が血清中や培
養細胞の上清中で認められた最高濃度よりさらに数十倍
から数千倍高く、このことは検体試料中に存在するこれ
らの物質によって本測定系が何ら干渉をうける可能性は
ほとんどないといえる。

実施例５（ヒトＴＮＦ−αの酵素免疫測定法）実施例３
の如く選定した抗体の組合せに基づいて作成したポリス
チレンボールをマウスＩｇＧ１３μｇ　／　ｔｕｂｅを
含むヒトＴＮＦ−αの標準溶液もしくは検体試料中に加
え、２０℃で４時間振盪したのも４℃で１６時間整地し
た。溶液を除き０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０　ｍ
Ｍリン酸ナナトリウムバッファーｐＨ７，０を用いて洗
浄し、次にポリスチレンボールをマウスｒｇＧｌ　　Ｆ
　（ａｂ’　）２３１１９／　ｔｕｂｅを含む実施例１
の如く作成した酵素抗体複合体溶液（５０ｎｇ／　１５
０μ塁）中に移し２０℃で４時間振盪した。反応後ポリ
スチレンボールを前述の如く洗浄し、ボールに結合して
いるペルオキシダーゼ活性を測定した。

ペルオキシダーゼ活性の測定は３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸を基質として過酸化水素水を加え
、３０℃で６０分反応させてその蛍光強度を励起光３２
０ｎｌ　、測定波長４０５ｎｍとして０．２Ｒｇ／ｄ！
キニーネ硫酸溶液の蛍光強度を指標に蛍光光度計（日立
Ｆ−４（１１０）で測定した。

添付図面第１図及び第２図は、それぞれ抗体の組合せＣ
及びＡを用いて、ヒトＴＮＦ−αの標準液による検！ｌ
線を示した。ヒトＴＮＦ−Ｇ１　、７ｐ（Ｊ／ｄまでも
検定で有意に蛍光が認められ、この濃度を検出限界とし
た。

血清試料中へのヒトＴＮＦ−αの添加回収試験を行った
結果、添加されたＴＮＦ−αは検量線上の各淵度鞘囲で
、良好に回収され血清中でのＴＮＦ−αの測定が充分可
能であることがわかった。

検体測定の同時及び日差再現性試験を行ったところ再現
性よく血清中ＴＮＦ−αの測定が可能であることがわか
った。

実施例６（マウス抗体を用いた非特異反応の防止効果） マウス血清（日本バイオテスト研究所）よりプロティン
Δセファロース０Ｌ−４Ｂ　（ファルマシア）カラムを
用いてＩｌ：ｌＧ１画分を調製した。該画分を非特異反
応の強い２例の血清試料の特異抗体の測定系において抗
原抗体反応時に該両分の添加量を変えて非特異反応の防
止の程度をみたのが添付図面第３図である。

実施例３において選定した組合せのうち組合せＣすなわ
ち第１抗体：　Ｍ　５３−００２０Ｔ　、第２抗体二Ｍ
　５４−００２０Ｔを使用した測定系を用い、ボールに
固定した第１抗体と血清試料との反応時に該１（ｌ　Ｇ
１画分を共存させた。

ｍ清Ｘｉｃ料Ｂテハ０．０３　μｇ／１ｕｂｅ、血清試
料Ａでは３μｇ／１ｕｂｅのマウス■ｇＧ１両分の添加
によりほぼ１００％非特異反応を防止することができた
。

ブタ胃粘膜由来のペプシンで消化しＦ（ａｂ′）２をＵ
　Ｉｔｒｏａｅｌ　Ａｃ　Ａ４４　（Ｉ　Ｂ　Ｆ　　Ｂ
　ｔｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）カラムを用いて分離精製した
。該Ｆ（ａｂ’）ｚ画分を非特異反応の強い２例の血清
試料の特異抗原の測定系において、抗原抗体反応時に該
Ｆ（ａｌｌ’）ｚ画分の添加量を変えて非特異反応の防
止の程度をみたのが添付図面第４図である。

実施例３において選定した組合せＣすなわち第１抗体；
　Ｍ　５３−００２０Ｔ　、第２抗体：　Ｍ　５４−０
０２０ＴによるＴＮＦの測定系を用い、ボールに固定し
た第１抗体と血清試料を反応させ、洗浄後酵素抗体複合
体である第２抗体との反応時に該 Ｆ（ａｌ）’）ｚ画分を共存させた。血清試ｆｉＡ、　
Ｂとも３　ｕ　ｇ／　ｔｕｂｅのマウスＩＯＧＩ　Ｆ　
（ａｂ’　）２画分の添加によりほぼ１００％非特異反
応を防止することができた。

実施＠７（マウス抗体Ｆ　（ａｌｌ’、　　）　２断片
を用いた　　実施例８（マウスモノクローナル抗体を用
いた非非特異反応の防止効果）　　　　　　　　　　　
　　　特異反応の防止効果）実施例６の如く調製したマ
ウスＩＣ１Ｇ１画分を　　　マウスモノクローナル抗体
ＪＴＣ−１（Ｋ。

Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ、　２６１．　ＮＱ２４１１０９７　１９８６
）を用い、実施例３において選定した組合せＣすなわち
第１抗体：　Ｍ　５３−００２０Ｔ　、第２抗体；　Ｍ
　５４−００２０Ｔを用いたＴＮＦの測定系においてボ
ールに固定した第１抗体と血清試料との反応時に該モノ
クローナル抗体を添加思を変えて共存させ、非特異反応
の防止の程度をみたのが添付図面第５図である。３μ９
　／　ｔｕｂｅの該モノクローナル抗体の添加によりほ
ぼ１００％非特異反応を防止することができた。

実施例９（正常人血清中ＴＮＦ−αの測定）表２は健康
な人２０名の血清中のＴＮＦ−α聞を測定した結果であ
る。２０名中１５名（７５％）の血清中ＴＮＦ−αの量
が測定限界よりも大きい値として測定できた。健康な男
性のＴＮＦ−αの量は、０−１１，４１）Ｍ　ｄ　、女
性はＯ−２１，６１）ｉｌｌ／　＃！！の範囲であると
いう結果になった。この値を目安として各種疾患患者血
中のＴＮＦ−α量を測定することは極めて有意義なこと
であると考えられる。

表　２　健印な人血清中のＴＮＦ−α囚男性 男性 男性 男性 男性 男性 男性 男性 男性 男性 男性 〈３４ 〈３４ 〈３４ ９ ９ １ 〈３４ １４ ９ 〈３４ ＜３４ ３．３ ３．２ 〈１．７ ＜１．７ 〈１．７ ２．７ 女性 女性 女性 女性 女性 女性 女性 女性 女性 ９ 〈３４ １６ 〈３４ ＜３４ 〈３４ 〈３４ ＜３４ ＜３４ ２．２ １．８ ＜１．７ ２．９ ＜１．１ ２．５ ３．３

【図面の簡単な説明】

添付第１図及び第２図は本発明によるヒトＴＮＦ−α測
定の検量線図を示すものである、白三角で示したのは測
定に用いた液】を０．１５　ｄとした場合、白丸で示し
たのは同液量を０．９ｍとした場合の検量線であり、黒
丸で示したのは同液量を０．１５　ｄとして、ＴＮＦ−
αを含む血清の希釈曲線である。 添付第３図は、本発明によるマウスＩ［ｌ　Ｇ１画分の
添加による非特異反応の防止効果を示すものである。黒
丸は血清試料Ａ、白丸は血清試料Ｂによる非特異反応の
程度を添加１ａ　Ｇ１画画分１１度を変えてプロットし
たものである。 添付第４図は、本発明によるマウス１ｏＧＦ（ａｂ’）
ｚ画分の添加による非特異反応の防止効果を示すもので
ある。黒丸は血清試料Ａ、白丸は血清試料Ｂによる非特
異反応の程度を添加１ｏＧ　　Ｆ（ａｂ’＞ｚ１度を変
えてプロットしたものである。 添付第５図は、本発明によるマウスモノクロ−ｌル抗体
の添加による非特異反応の防止の効果を示すものである
。血清試料による非特異反応の程度を添加モノクローナ
ル抗体温度を変えてプロプ］・シたらのである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）サンドイッチ法によるＴＮＦ−αの免疫学的測定
   方法において、第１抗体としての、不溶性担体に担持さ
   せた抗ＴＮＦ−α抗体がＴＮＦ−αと反応する際に、該
   第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロブリン及び／又
   はそれらの断片を存在させることを特徴とするＴＮＦ−
   αの免疫学的測定方法。 （２）サンドイッチ法によるＴＮＦ−αの免疫学的測定
   方法において、第２抗体としての、標識化された抗ＴＮ
   Ｆ−α抗体がＴＮＦ−αと反応する際に該第２抗体と同
   一の動物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断
   片を存在させることを特徴とするＴＮＦ−αの免疫学的
   測定方法。 （３）（ｉ）第１抗体としての不溶性担体に担持させた
   抗ＴＮＦ−α抗体に、検体を接触させ、必要に応じ洗浄
   し、次いで第２抗体としての、標識化された抗ＴＮＦ−
   α抗体を接触させるか、あるいは （ｉｉ）第１抗体としての不溶性担体に担持させた抗Ｔ
   ＮＦ−α抗体、第２抗体としての標識化された抗ＴＮＦ
   −α抗体及び検体を同一系に存在せしめることにより検
   体中のＴＮＦ−αを免疫学的に測定する方法であつて、
   該第１抗体及び該第２抗体が検体中のＴＮＦ−αと反応
   する際に、該第１抗体及び／又は該第２抗体と同一の動
   物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片を存
   在せしめることを特徴とするＴＮＦ−αのサンドイッチ
   法による免疫学的測定方法。 （４）第２抗体としての、標識化された抗ＴＮＦ−α抗
   体が、抗ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ’断片に酵素を結合さ
   せた複合体である請求項２又は３記載の方法。 （５）免疫グロブリン及び／又はそれらの断片を検体１
   ｍｌあたり２〜２００μｇ存在させることを特徴とする
   請求項１記載の方法。 （６）該第２抗体の抗ＴＮＦ−α抗体部分の重量に対し
   、免疫グロブリン及び／又はそれらの断片を重量比で１
   〜２００倍、存在せしめることを特徴とする請求項２記
   載の方法。（７）（ｉ）第１抗体としての、不溶性担体
   に担持させた抗ＴＮＦ−α抗体、 （ｉｉ）第２抗体としての、標識化された抗ＴＮＦ−α
   抗体及び （ｉｉｉ）該第１抗体と同一の動物種由来の免疫グロブ
   リン及び／又はそれらの断片、並びに該第２抗体と同一
   の動物種由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片
   の少なくとも一種、 より少なくともなるＴＮＦ−αの免疫学的測定キット。 （８）さらに溶解剤及び／又は洗浄剤を有する請求項７
   記載のキット。 （９）該免疫グロブリン及び／又はそれらの断片がマウ
   ス、ラット、ウサギ、モルモツト、ヒツジ、ヤギ、ウマ
   及びウシから選ばれた動物からのものである請求項７記
   載のキット。 （１０）該免疫グロブリン及び／又はそれらの断片がマ
   ウス由来のＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ１Ｆ（ａｂ’）＿
   ２である請求項７記載のキット。 （１１）溶解剤中に該第１抗体及び第２抗体と同一動物
   由来の免疫グロブリン及び／又はそれらの断片を含有さ
   せた請求項７又は８記載のキット。 （１２）被験者から採取した体液中のＴＮＦ−αを請求
   項１〜３の測定方法あるいは請求項７記載のキットを用
   いて検出することを特徴とする各種疾患の診断方法。