JPH02201162A

JPH02201162A - 酵素抗体複合体、複合体―抗体の組合せ、キット及び診断方法

Info

Publication number: JPH02201162A
Application number: JP1749289A
Authority: JP
Inventors: Kenji Yone; 米　賢二; Eiji Ishikawa; 石川　栄治; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-01-30
Filing date: 1989-01-30
Publication date: 1990-08-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ａ、産業上の利用分野本発明はヒトＴＮＦ−αに対する抗体をＦａｂ　’断片
化し、マレイミド基を介しである種の酵素との複合体と
し、この複合体と他の抗体との組合せを用いてヒト血液
等体液中のＴＮＦ−αの量を特異的に測定することによ
り、免ケ不仝疾患感染症。

発熱性疾患、腫瘍等の各種炎症性疾患の診断の一助とす
るための方法及び免疫学的測定キットに関づるものであ
る。

ｂ０発明の背景Ｔ−Ｎ　Ｆ−αはマクロファージが産生ずるサイト力イ
ンの一種で、カケクチンとも呼ばれ、極めて多様の生物
学的活性を有する蛋白質である。その活性は、広く体内
の免疫系の活性化に作用する。

ＴＮＦ−αの産生は、マクロファージにエンドトキシン
や細菌菌体などが作用し１）、誘導されるが、インター
ワウキン１ヤガンマ・インクフエロンなどのサイト力チ
ンにより調節されている２）。

ＴＮＦ−αはクラス■主要組織適合抗原の特異的発坦を
促し３）、グラニュロサイトマクロファージコロニー刺
激因子４）、ｒＬ　ｉ５）の産生を誘導し、リボ蛋白リ
パーゼ活性を減少させ６）、腫瘍細胞７）及び血管内皮
細胞８）を傷害し、内因性の発熱因子９）として動くな
ど多くの活性を有している。

１）　　［Ｅ、Ａ、　Ｃａｒｓｖｅｌｌ　ら、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａ、ｔｌ、　Ａｃａｄ。

ＳＣｉ、、　　ＵＳＡ、　　７２．　３６６６　（１９
７５）］２）　　［Ｒ，Ｐｈ１ｌｉｐら、　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　３２３．８８　（１９８６）］３）　　　［丁、
　　Ｃｏ１ｔｉｎｓら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、　８３．　４４６　（１９８６）　　］４）［
Ｌ、Ｌｕら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４１．２
０１（１９８８）　］５）　　［Ｎａｖｒｏｔｈら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｈｅ
ｄ、　１６３．　ｔ３８３（１９８６）］６）　　［８，８ｅｕｔｌｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３
２０．５８４　（１９８７）］７）　　（Ｌ、　ｔｌｅ
ｌｓｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ　２５８．７３１　（１９
７５）］８）　　［８，５ａｔｏら、　Ｊ、　Ｎａｔｌ
、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

７６、１１１３　（１９８６）　　］９）　　（ＤｉｎａｒｅｌｌＯら、　Ｊ、　Ｅｘｔ）、
　Ｒｅｄ、　１６３．１４３３（１９８６）］このように多様な活性を有するＴＮＦ−αは、感染に対
する生体防ＷＪ機構そして各種疾患における免疫系の作
動において中心的役割を果たしている可能性が考えられ
、その血液等体液中の量の測定に大きな関心が寄せられ
ていた。

ある種の病態において血液等体液中のＴＮＦ−α吊が増
加しているということは既に報告されはじめている。古
川らは、川崎病において血清中ＴＮＦ−α量が増加して
いるのを認め１０）ＢｅｕｔｌｅｒらはＴＮＦ−αがエ
ンドトキシンショツりのメデイエータ−でおると報告し
た　　。またＳｃｕｄｅｒｉ　らは原虫感染　　、Ｈａ
ｕｒｙらは腎移植における拒絶反応１３）、Ｗａａｇｅ
らは髄膜炎１４）、Ｂａ１ｋＷｉ　ｌ　ｌらは悪性腫瘍
１５）で、ＴＮＦ−αの血中レベルが上昇していること
を報告した。

１０）　　［Ｓ、　Ｆｕｒｕｋａｗａら、　ｃ＋　ｉｎ
、　Ｉｍｍｕｒｉ、　ＩｍｍｕｎＯｐａｔｈＯｌ。

４８．２４７　　　　（１９８８）］１１　　　［Ｂ、　　Ｂｅｕｔｌｅｒら、　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　３２０．　５８４　（１９８６）　　３１２　
　［Ｐ、　５ｃｕｄｅｒｉら、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ
、　ｏｅｃｅｍｂｅｒ　１３゜１９８Ｂ）　Ｅ）、１３
６４　］　。

１３　　［Ｐ、Ｊ、　Ｌｌａｕｒｙら、　Ｊ、　　ＥＸ
ｐ、　　）ｉｅｄ、、　　１６６、　１１３７１９８７
）］　。

１４　　［Ａ、　Ｗａａａｅら、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅ
ｔ、　　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１４゜（１９８７）　ｐ、
３５５］　。

１５）　　　［Ｆ、Ｒ，Ｂａｌｋｗｉｌｌら、　　Ｔｈ
ｅ　　ＬａｎＣｅｔ。

］このようにＴＮＦ−αの血液等体液レベルと病態との関
連は、広く認められるようになり、ＴＮＦ−αの作用が
病態の形成にどのようにかかわるかという作用機序ひい
ては病態の診断、治療方法決定への一助とするための詳
細な解析が待たれるようになった。しかしながら、ヒト
末梢血、尿等退役成分中に含まれるＴＮＦ濃度は極めて
低いため、今まで報告に用いられてきたＴＮＦ−αの測
定方法では、これら詳細な検討を行なうには、測定系の
感度が不充分なため不可能であった。とりわけ健康な人
の血中ＴＮＦ−α看はさらに微ｄであるため測定不可能
で、正確な病態の比較、ＴＮＦ−α伍の変動等を調べる
のは困難な状況にあった。

Ｃ０発明の構成そこで本発明者らはＴＮＦ−αを高感度に測定する方法
を鋭意検討した。その結果、抗ＴＮＦ−α抗体をＦａｂ
’断片とし、そのヒンジ部分のＳＨ基にマレイミド基を
介して酵素を結合させた酵素抗体複合体を作成した。こ
の複合体（第２抗体）ともう一種の抗ＴＮＦ−α抗体（
第１抗体）を用いてサンドイッヂ酵素免疫測定法とした
。

次に第１抗体を短時間Ｍ処理することにより同相へのこ
の抗体の吸着を高め、抗原との特異的結合効率を上げ、
非特異吸着ないしは血清干渉を抑えられることを見い出
した。

ざらに以下に詳細な説明を加える蛍光物質を基質とした
酵素反応の測定方法を用いた測定系において、抗体の非
特異的吸着の大ぎさを示すゼロブランク（以下に詳細に
説明する）の相対蛍光強度の値が小さく〈好ましくは１
０以下）なれば健康な人の血液等体液成分中のＴＮＦｌ
！度を測定するのに必要な測定感度が得られることを見
出した。この非特異的吸着の大きさは、二種の抗体を組
合せた時に認められる抗体の持つ性質であり、基本的に
は非特異吸着が小さく、したがってゼロブランク値が１
０以下になるような抗体の組合せを選別すればよく、ま
たゼロブランク値が１０以上であっても相互の非特異吸
着成分を除去した両分を作成し、これを用いて１０以下
になる複合体−抗体の組合Ｕとしてもよい。

本発明における相対蛍光強度とは、励起波長３２０ｎｍ
　、測定波長４０５ｎｍとして０．１Ｈグリシン−Ｎａ
０１−１バツフアーの蛍光強度をゼロとし、０．２μ９
／ｄキニーネ０．１Ｎ　　Ｈ２３Ｏ４溶液の蛍光強度を
１００と設定し測定するものである。

このようにして高感度化したＴＮＦ−αの測定系を用い
ると、健康な人の血清中に含まれるＴＮＦ−αが充分測
定できることとなった。したがって、各種病態において
血液等体液中のＴＮＦ−α量が正確に測定可能となり、
各種疾患の診断等に有意義であることがわかり、本発明
にいたった。

すなわら本発明は下記発明を包含する。

（１）抗ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ“断片に、そのヒンジ
部ジスルフィド結合由来のＳＨ基にマレイミド基を介し
て酵素を結合させた複合体。

（２）２種類の異なる抗ＴＮＦ−α抗体の一方から調製
される（１）項に記載の複合体を第２抗体とし、他方の
抗体を第１抗体として用いてＥＬＩＳＡでＴＮＦ−αを
測定した時にゼロブランクが相対蛍光強度１０以下であ
る複合体−抗体の組合せ。

（３）第１抗体としての（２）項に記載の第１抗体を酸
処理をして不溶性担体に担持させた抗ＴＮＦ−α抗体と
（２）項に記載の第２抗体との組合せ。

（４）サンドイッチ法によるＴＮＦ−αの酵素免疫測定
キットにおいて、（ａ）第１抗体としての、不溶性担体に担持させた抗−
ＩＮＦ−α抗体と（ｂ）第２抗体としての、抗ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ’
断片に、そのヒンジ部ジスルフィド結合由来のＳＨ基に
マレイミド基を介して酵素を結合させた複合体とを少なくとも有するサンドイッチ法によるＴＮＦ−α
の酵素免疫測定キット。

（５）該第１抗体が酸処理をして不溶性担体に担持させ
た抗ＴＮＦ−α抗体である（４）項記載のキラｌ〜。

（６）ヒロブランクが相対蛍光強度１０以下である第１
抗体と第２抗体との組合せとから少なくともなる（４）
項記載のキット。

（７）被験者から採取した体液中のＴＮＦ−αを（２）
項記載の組合せによりＥＬＩＳＡ法で検出することを特
徴とする炎症性疾患の診断方法。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

（抗体及びその製造方法）抗ＴＮＦ−α抗体は常法に準じて作成すればよい。すな
わち、抗原であるヒトＴＮＦ−αで動物を免疫しその動
物より血清を得て抗ヒトＴＮＦ−α抗体を精製すればよ
い。またモノクローナル抗体を入手する方法としては、
例えば本発明者らにより先に出願された特許（特願昭６
２−１６２２３３号：昭和６２年７月１日出願：発明の
名称″モノクローナル抗体及びハイプリドーマ細胞パ）
などに記載の方法に準じて作成すればよい。すなわち、
免疫した動物体より抗体産生細胞を取得し、適当な動物
由来の骨髄腫細胞株と細胞融合を行ない、抗体産生細胞
株を選択し、クロン化し、大量培養して分泌されたモノ
クローナル抗体を精製入手すればよい。動物としてはマ
ウス、ラット、ウサギ。

モルモット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシなどが例示され
る。

抗体はヒトＴＮＦ−αに対する特異性を有する抗体のみ
を含む両分にまで精製したある方が望ましい。抗体の精
製についても常法に従えばよく、例えばカラムクロマト
グラフィー、塩析などの方法を用いることができる。

またすでにこのような方法を用いて作成された抗血清、
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が市販され
ていたり（Ｇｅｎｚｙｎｅ社製。

Ｂｅｄ　ｌ　ｉｎｇｅｒ社製、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ、製など）作成について報告し
た文献もある（Ｊ、　Ｉｎｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ
　９６．５７．１９８７．　ＨｙｂｒｉｄｏＩｌｌａ　
６．３０５，１９８７Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６．３５９
．１９８７．　Ｈｙｂｒ＋ｄｏｍａ　６．４８９゜１９
８７、　Ｊａｐａｎ、　Ｊ、　Ｈｅｄ、　Ｓｃｉ、　Ｂ
ｉｏｌ、、　３９．１０５゜１９８７）ので、これらの
抗体を利用してもよい。

（酵素抗体複合体及びその製造方法）酵素抗体複合体は、本発明者らが既に公表している方法
（石川栄冶、用合忠、宮井潔編：酵素免疫測定法第３版
医学書院）に準じて作成すればよい。すなわち抗ＴＮＦ
−α抗体をペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素で
処理し、Ｆ　（ａｂ’）２にまで消化する。この際に抗
原との結合部分であるＦａｂ領域を損なわないようにす
ることが望ましい。次にこのＦ　（ａｂ’）ｚを適当な
還元剤を用いてＦａｂ’に還元する。すなわちジスルフ
ィド結合を切断し、チオール基を遊離させた状態にする
。一方、複合体に用いる酵素にマレイミド基を導入する
。

酵素は特に限定されるものではないが、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーＵ、アルカリフォス
ファターゼ、グルコースオキシダーゼなどが例示される
。マレイミド基はマレイミド基を有する適当な化合物を
酵素と反応させることにより導入すればよい。その際に
酵素活性を損なうような条件に長く置かない方がよく、
また導入されたマレイミド基の数が定量して、一定にな
っているようにすることが望ましい。

次に前述のごとく作成したＦａｂ’をマレイミド基を導
入しである酵素と共存させ、複合体の形成を促す。複合
体の形成後、酵素抗体複合体を未反応の酵素及び抗体と
分離すればよい。分離する方法は特に限定されるもので
はなく、常法に従って行なえばよい。例えば、高速液体
クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィー、電気泳
動などの手段が可能である。その際に酵素活性を損なわ
ないように処理することが望ましい。

（抗体の酸処理）抗体の酸処理は、抗体の抗原との結合を損なわない程度
に低ｐＨ条件下に短時間置くもので、特定の方法に限定
されるものではない。例えば抗体溶液をｐＨ２〜３程度
のバッファー中に室温でＯ〜数十分程度装いたのち、中
性のバッファーを用いて中性のｐＨに戻せばよく、用い
るバッファーの種類。

添加物等に特に規定すべきものはない。また酸処理中の
温度、持続時間等も特に規定すべきものはなく、適宜選
択が可能である。

（好ましい抗体の組合せの選定方法）前述のごとくゼロブランクが相対蛍光強度１０以下であ
るような抗体の組合せを選定するには以下の方法を用い
るべきである。

ポリスチレンボールに第１抗体として利用したい抗Ｔ　
Ｎ　Ｆ−α抗体を固定化し、さらにウシ血清アルブミン
でブロッキングする。同ボールを１ｔｕｂｅあたり１個
ヒトＴＮＦ−αを全く含まないバッファー（好ましくは
中性のリン酸バッファーがよい）を入れた試験管の中に
入れる。ボールがバッファー中に沈んだ状態で２０℃４
時間撮盪した後、４℃で１６時間静＠する。バッファー
を除き、洗浄バッファー（０，１）１塩化ナトリウムを
含む１０ｍＨリン酸ナトリウムバッフバッファｐＨ７，
０）を試験管に適伍加えては除去するというボールの洗
浄を２回繰り返す。次にこのボールを酵素抗体複合体溶
液として、第２抗体として利用したい抗ＴＮＦ−α抗体
をＦａｂ　’化し、西洋ワサビペルオキシダーゼと前述
の方法により形成した酵素抗体複合体を一定ｍ（好まし
くは１　ｔｕｂｅあたり５０ｎｑ、　Ｌｌｉは１　ｔｕ
ｂｅあたり約２５ｎｇ）希釈バッファー（（）、ＩＭ塩
化ナトナトリウ００１％牛血清アルブミンを含む１０Ｉ
Ｉｌ）！リン酸ナトリウムバッファーｐ１１７゜０）に
添加した溶液を入れた試験管の中に入れる。ボールが溶
液中に沈んだ状態で２０℃、４時間Ｊｆｉｌする。溶液
を除き、洗浄バッフ１−を用いた洗浄を２〜３回繰り返
す。次にこのボールを０．６％３−　（４−ヒドロキシ
フェニル）ゾロピオン１０．１ト１リン酸ナトリウムバ
ツフアーｐＨ７゜Ｏ溶液１００μ矛の入った試験管の中
に移す。

０、０１５％過酸化水素水水溶液５０μｌを添加してか
ら３０℃”Ｃ６０分間振盪して、２．５ｍｌのｏ、　ｉ
ｏグリシンＮａＯＨバッフ＞ｉ、、ｐ旧０．３を加えて
反応を停止する。この溶液の蛍光強度を以下の如く測定
する。

励起波長３２０ｎｍ　、測定波長４（）５μｍとして、
上記０、１Ｈグリシン−ＮａＱｌ−（バッファーの蛍光
強度をゼロとし、０．２μｇ／威キニーネー〇−ＩＮＨ
２３０４溶液の蛍光強度を１００と設定する。次にボー
ルをｈＱえないで、０．６％３−（４−ヒドロキシフェ
ニル）プロピオン酸溶液に０．０１５％過酸化水素水を
加えて３０℃、　６０分間振盪し、０．１８グリシン−
ＮａＯＨバッフアール旧０．３を加えたものの蛍光強度
を測定し、この値をリエイジエントブランク値とする。

つづいて上記の如く処理したボールを含んだ溶液の蛍光
強度を測定し、その値からりエイジェントブランク値を
差引いた値をゼロブランク（値）とする。

このように規定した方法で種々のモノクローナル抗体の
組合せでゼロブランクを測定し、１０以下となる組合せ
を選択すればよい。このゼロブランクは小さければ小さ
い程よく、それだけ高感度て丁ＮＦ−αを測定すること
が可能となる。

またゼロブランクが１０以下とならない組合せにおいて
も、各抗体を相互の固定化カラムを通すことにより非特
異吸着画分をとりのぞいたり、再度ヒトＴＮＦ−αを用
いてアフィニティー精製したり検討することにより、上
記の方法によってゼロブランクが１０以下となるような
両分を作成するεとが可能で、そのようにＵロブランク
値を１０以下にする抗体画分を得て、これを抗体の組合
せとして測定系に用いることも可能である。

（ＴＮＦの酵素免疫測定法）ＴＮＦの測定法はいわゆるサンドイッチ酵素免疫測定法
で、既によく知られている多くの方法に準じて行なえば
よく、上記の方法により選択した抗体の組合せにおいて
、第１抗体として、前述の酸処理した抗体を用い、第２
抗体として前述の酵素抗体復合体を用いることを特長と
し、それらの担体との結合、抗原との反応方法、酵素活
性の測定ブＪ法などは従来の方法に準じ、また、実施者
のＭｉＩ夫により自由に選択することができる。

例えば第１抗体を固定化する不溶性担体としてはポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン。

ポリエステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂。

架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、そ
の他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せ
などを例示することができる。また不溶性担体の形状と
しては、例えばトレイ状１球状、　ｇＡｍ状、棒状、盤
状、容器状、セル、試験管などの種々の形状であること
ができる。第１抗体を固定化した不溶性担体は、第２抗
体及び検体試料の非特異的吸着を防ぐために、適当な物
質（例えば、生血清アルブミン）で、不溶性担体表面を
被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定された不溶性担
体を検体試料と一定時間及び温磨で接触させ反応させる
。この間に第１抗体と検体試料中のＴＮＦ−αが結合す
る。次いで適当な洗浄液で洗った後第２抗体と一定時間
及び温度で反応させる。この間に第２抗体が第１抗体と
結合した検体試料中のＴＮＦ−αにざらに結合する。こ
れを適当な洗浄液で洗い、第２抗体に結合している酵素
にとって適当な基質を加えることにより酵素活性を検出
し、ひいては不溶性担体上に存在する第２抗体の量が測
定できる。かくしてその値から検体試料中のＴＮＦ−α
量を算出することができる。

酵素基質としては、その酵素活性が測定できる発色基質
及び蛍光基質などが挙げられるが、当該酵素活性を介し
た化学発光を利用する方法などもあり、特に限定される
ものではない。

かくして本発明の測定キットは、第１抗体が不溶性担体
に結合した固定化抗体と酵素標識化された第２抗体とよ
り主として構成される。このキツトを能率よくかつ簡便
に利用するために、これら抗体以外に種々の補助剤を含
めてキットを形成することができる。かかる補助剤とし
ては、例えば固体状の試薬を溶解させるための溶解剤、
不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄剤、酵素活
性を測定するための基質、その反応停止剤などの免疫学
的測定キットの一部として通常使用されるものが挙げら
れる。

本発明において、炎症性疾患とは間接り［クマヂ。

仝身エリスマト−デスなどの自己免疫疾患、／ＭＤＳな
どの免疫不全疾患、各種感染症１発熱性疾患腫瘍、ＧＶ
ＨＤなどの移植拒絶反応などをいう。

また川崎病、髄膜炎、腎不全、尿細管性蛋白尿。

紫斑病ｉ生腎炎などをいう。

ｄ、′Ｒ明の効果以上本発明によれば、良好な測定精度を提供することが
可能になり、溶液（例えば血液、尿などのヒト体液）中
のＴＮＦ−αの量を正確かつ高感度に測定することが可
能となる。本発明によれば、正常人血清中のＴＮＦ−α
量の測定も可能で、正常人ＴＮＦ−α値と比較して、間
接リウマチ（全身性エリスマトーデス）などの自己免疫
疾患、ＡＩＤＳなどの免疫不全疾患、各種感染症、Ｒ熱
性疾患、腫瘍、　ＧＶＨＤ　（Ｇｌａｆｔ　ｖｅｓｕｓ
　ｈｏｓｔｄｉｓｅａｙ）などの移植拒絶反応など広く
各種の炎症性症状をともなう疾患におけるＴＮＦ−α値
の変動が測定可能となり、また病態の進行のモニタリン
グがＴＮＦ−αを指標として可能となり、それら疾患の
診断の一部となりうろことがわかった。

ｅ、実施例以下実施例を掲げて、本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（酵素抗体複合体の作成）ヤギ抗ヒトＴＮＦ−α抗血清よりイムノグロブリン分画
を調製し、ブタ胃粘膜由来のペプシンで消化し、Ｆ　（
ａｂ’）；＋を旧ｔｒａｇｅｌ　ＡｃＭ４　（）カラム
を用いて分離精製した。このＦ　（ａｂ’）２をファイ
ナル１０ｍ）ｆの２−メルカプトエチルアミン還元した
。この分画をゲル）濾過カラムにかけ、ｒ’ａｂ’分画
を得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼにＮ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエイトを加えてマレイミド
基を導入し、ゲル）濾過カラムをとおして未反応のマレ
イミド化合物を除いた。

このマレイミド基を導入したペルオキシダーゼと抗体Ｆ
　（ａｂ’）２を還元して、そのヒンジ部に生成したチ
オール基と反応させて酵素抗体複合体を作成した。

実施例２（抗体の酸処理と固定化）抗ヒトＴＮＦーαモノクローナル抗体Ｃ　Ｉ　ＯｎｅＥ
４３，ＵＢＩ社（オリンパス光学＞　８５３−００２０
Ｔを１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン塩酸バ
ッファー１）８　２．５溶液中で室温で１０分間放置し
た。

その１１　２　Ｍ　トリス塩酸バッファーｐＨ８．０を
用いて抗体溶液のｐＨを７．５に調製した。０．１Ｍリ
ン酸すｌ・リウムバッファーｐＨ７．５を用いて、抗体
濃度を０、１　ｍＭｍに調製したのら、この抗体溶液中
に充分洗浄したポリスチレンボール（プレシジョン社製
）を沈めボールの表面に抗体を吸着，固定化させた。抗
体が吸着したボールは０．１％ウシ血清アルブミン（ア
ーマ社”）　、　０．１　Ｍ塩化ナトリウム。

０、１％アジ化ナトリウムを含む１０＋ｎＨリン酸ナト
リウムバツフアーｐＨ７．０溶液中に移した。

実施例３（抗体の組合せの選定）前述の方法に基づいて種々の抗体の組合せにＪ′３いて
Ｌロブランクを測定した。表１はその結果の一部である
。表１の結果より、ゼロブランクが１０以下であり、か
つヒトＴＮＦ−αに対する特異的反応も他の抗体の組合
せと比してさほど悪くない以下の組合せを選定した。

第１抗体：　Ｃｌｏｎｅ　Ｅ４３　　Ｕ　Ｂ　Ｉ社（オ
リンパス光学＞　８５３−００２０丁第２抗体：　Ｃｌ
ｏｎｅ　Ｆ１２　　Ｕ　Ｂ　１社（オリンパス光学）　
）１５４−００２０１表１　抗体の組合せの選定抗体のゼロブランクヒト１ＮＦ−α １０４ｎｏｌｅ／Ａ：第１抗体：マウスモノクローナル抗体ＮＣ−９第２抗体：マウスモノクローナル抗体ＮＤ−１１Ｂ：第１抗体：マウスモノクローナル抗体ＴＮＤ−１１
第２抗体：ヤギ抗ＴＮＦポリクローナル抗体Ｃ：第１抗
体：　Ｃ１ｏｎｅ　Ｅ４３　ＵＢＩ社　）１５３−００
２０Ｔ第２抗体：　Ｃ１ｏｎｅ　Ｆ１２υＢ１社　）１
５４−００２０ＴＤ：第１抗体：　Ｃ１ｏｎｅ　Ｅ４３
υ８１社　）１５３−００２０ｒ第２抗体：マウスモノ
クローナル抗体ＮＤ−１１Ｆ：第１抗体：マウスモノクローナル抗体ＮＤ−１１第２抗体：　　　同　上実施例４（ヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ−αの酵素免疫測定法）実
施例３の如く選定した抗体の組合せに基づいて作成した
ポリスチレンボールをヒトＴＮＦ−αの標準溶液もしく
は検体試料中に加え、２０℃で４時間撮盪したのち４°
Ｃで１６時間静置した。溶液を除き０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む１０１１１）１リン酸ナトリウムバックァ−
０１１７゜Ｏを用いて洗浄し、次にポリスチレンボール
を実施例１の如く作成した酵素抗体複合体溶液（５０ｎ
１１５０μｉ）中に移し２０℃で４時間１辰盪した。反
応後ポリスチレンボールを前述の如く洗浄し、ボールに
結合しているペルオキシダーゼ活性を測定した。

ペルオキシダーゼ活性の測定は３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸を基質として過酸化水素水を加え
、３０℃で６０分反応させてその蛍光強度を励起光３２
０ｎｍ　、測定波長４０５０ｍとして０．２ｍＱ／ｍｌ
キニーネ硫酸溶液の蛍光強度を指標に蛍光光度計（島津
ＲＦ−５１０）で測定した。

添付図面第１図は、ヒトＴＮＦ−α標準液を用いた検措
線を示した。ヒトＴＮＦ−Ｃ１，７ＤＱ／ｒｄまでｔ検
定で有意に蛍光が認められ、この濃度を検出限界とした
。

表２は血清試料中へのヒトＴＮＦ−αの添加回収試験の
結果である。添加された丁ＮＦ−αは検１線上の各濃度
範囲で、良好に回収され血清中での王ＮＦ−αの測定が
充分可能であることがわかった。

表表３は、検体測定の同時及び日差再現性試験の結果であ
る。表２に示すように再現性よく血清中ＴＮＦ−αの測
定が可能であることがわかった。

表　　３表　　４実施例５（正常人血清中ＴＮＦ−αの測定）表４は健康
な人２０名の血清中の−ｒＮＦ−αｍを測定した結果で
ある。男性の場合１８．４±１９．１（３Ｄ　）ｔ）Ｏ
／ｄ　（２，２〜６４゜７ｏｔａ／ｄ、　ｎ＝１３）　
、女性の場合１３．３±１４．７　（Ｓ　Ｄ　）　Ｄ（
Ｊ／ｍｊ！　（２，７−４３，３ｐｑ／ｍＬｎ＝７）と
いう結果となった。この値をもとに各種疾患患者血中の
ＴＮＦ−α量を測定することは極めて有意義なことであ
ると考えられるつ実０ｉｌｉ例６（炎症［生疾患患者血
清中ＴＮＦ−αの測定）表５は、炎症性疾患の一例として、川崎病、腎炎、髄膜
炎の患者血清中のＴＮＦ−αの量を測定し・た結果であ
る。この結果から、これら疾患では健１よな人と比較し
て明らかに有意に血中のＴＮＦαの濃度が上昇している
ことを認めた。このことは、これら疾患とＴＮＦ−αと
の関連性を示し、丁ＮＦ−αの測定が、これら疾患の診
断や病状の把握に有効であることがわかった。

【図面の簡単な説明】

添付第１図は本発明によるヒトＴＮＦ−α測定の検量線
図を示すものである、白玉角で示したのは測定に用いた
液量を０．１５ｄとした場合、白丸で示したのは同液量
を０．９ｍとした場合の検量線であり、黒丸で示したの
は同液量を０．１５ｄとして、ＴＮＦ−αを含む血清の
希釈曲線である。手続補正書１、事件の表示特願平２゜発明の名称明細書の「発明の詳細な説明」の欄。（自発）（１）明細書第３頁４行の「免疫不全疾患感染症Ｊを［
免疫不全疾患、感染症」と訂正する。（２）同第３頁１６行の「サイト力チンＪを「サイト力
イン」と訂正する。（３）同第３頁１７行の「主要組織適合抗原」を［主要
組織適合性抗原」と訂正する。（４）同第６頁２〜３行のｒ　［Ｆ、　Ｒ，Ｂａｌｋｗ
ｉｌｌら、Ｔｈｅ　　Ｌａｎｃｅｔ、　　　　　　　　
　］　　Ｊ　　を　ｒ　　［Ｆ、　　Ｒ，Ｂａｌｋｗｉ
ら、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　　（１９８７）　ｉｉ、
　１２２９　］と訂正する。（５）同第６頁１０行の１退役酸分」を「体液成分Ｊと
訂正する。（６）同第１１頁１３行のｒ　Ｇｅｎｚｙｎｅ社製」を
ｒ　Ｇｅｎｘｙｍｅ社製」と訂正する。（７）同第１１頁１４行のｒＢｅｄｌｉｎｇｅｒ社製」
をｒ　Ｂｅｈ　ｉ　ｌｎｇｅｒ社製」と訂正する。（８）同第１１頁１６行の’ＨｙｂｒＩｄｏｍａ　（５
，Ｊをｒ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６．　Ｊと訂正する。（９）同第１９頁９行の「間接リウマチ」を［関節リウ
マチＪと訂正する。（１０）同第１９頁１０行の「全身エリスマトーデス」
を「全身性エリスマトーデス」と訂正する。（１１）同第１９頁１１〜１２行の「発熱性疾患腫瘍」
を「発熱性疾患、腫瘍」と訂正する。（１２）同第２０頁１行の「間接リウマチ」を「関節リ
ウマチ」と訂正する。（１３）同第２０頁４〜５行のｒＧｌａｆｔ　ｖｅｓｕ
ｓ　ｈｏＳｔｄｉｓｅａｙ」をｒＧｌａｆｔ　ｖｅｒｓ
ｕｓ　ｈｏｓｔ　ｄｉｅａｓｅＪと訂正する。（１４）同第２０頁１７行のｒＡｃＡ４４　　（）　Ｊ
をｒＡｃＡ４４　　（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔｅｃｈｏｉｃｓ
）」と訂正する。（１５）同第２１頁３〜４行の「Ｎ−サクシニミジル」
を［Ｎ−サクシニミジル」と訂正する。（１６）同第２１頁８行の「還元して、」を「還元して
作成した」と訂正する。（１７）同第２１頁９行の「チオール基と反応させて」
を［チオール基を有する抗体Ｆａｂ’とを反応させて」
と訂正する。（１８）同第２２頁４行の「アーマ社」を「アーマ−社
」と訂正する。（１９）同第２３頁の表１の「と訂正する。」と訂正する。（２０）同第２８頁の表４中の［表４

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ′断片に、そのヒンジ
部ジスルフィド結合由来のＳＨ基にマレイミド基を介し
て酵素を結合させた複合体。
（２）２種類の異なる抗ＴＮＦ−α抗体の一方から調製
される請求項１記載の複合体を第２抗体とし、他方の抗
体を第１抗体として用いてＥＬＩＳＡでＴＮＦ−αを測
定した時にゼロブランクが相対蛍光強度１０以下である
複合体−抗体の組合せ。
（３）第１抗体としての請求項２記載の第１抗体を酸処
理をして不溶性担体に担持させた抗ＴＮＦ−α抗体と請
求項２記載の第２抗体との組合せ。
（４）サンドイッチ法によるＴＮＦ−αの酵素免疫測定
キットにおいて、（ａ）第１抗体としての、不溶性担体に担持させた抗Ｔ
ＮＦ−α抗体と（ｂ）第２抗体としての、抗ＴＮＦ−α抗体のＦａｂ′
断片に、そのヒンジ部ジスルフィド結合由来のＳＨ基に
マレイミド基を介して酵素を結合させた複合体とを少なくとも有するサンドイッチ法によるＴＮＦ−α
の酵素免疫測定キット。
（５）該第１抗体が酸処理をして不溶性担体に担持させ
た抗ＴＮＦ−α抗体である請求項４記載のキット。
（６）ゼロブランクが相対蛍光強度１０以下である第１
抗体と第２抗体との組合せとから少なくともなる請求項
４記載のキット。
（７）被験者から採取した体液中のＴＮＦ−αを請求項
２記載の組合せによりＥＬＩＳＡ法で検出することを特
徴とする炎症性疾患の診断方法。