JPH1144688A - 蛍光偏光免疫測定法 - Google Patents
蛍光偏光免疫測定法Info
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- JPH1144688A JPH1144688A JP20058097A JP20058097A JPH1144688A JP H1144688 A JPH1144688 A JP H1144688A JP 20058097 A JP20058097 A JP 20058097A JP 20058097 A JP20058097 A JP 20058097A JP H1144688 A JPH1144688 A JP H1144688A
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- Japan
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛍光偏光免疫測定法の改良。
【解決手段】 検体中の目的物質と目的物質に対する蛍
光物質で標識された低分子化抗体とを反応させ、これに
より生じる蛍光偏光度の変化を利用して目的物質を検出
又は定量する方法。
光物質で標識された低分子化抗体とを反応させ、これに
より生じる蛍光偏光度の変化を利用して目的物質を検出
又は定量する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光偏光免疫測定
に関する。即ち、目的物質が比較的大きな分子量を有す
る抗原であっても、蛍光偏光度の変化として定量的に測
定可能な新規測定法に関するものである。
に関する。即ち、目的物質が比較的大きな分子量を有す
る抗原であっても、蛍光偏光度の変化として定量的に測
定可能な新規測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質、ホルモン、生理活性物質等の生
体物質を測定する方法には様々な方法があるが、その操
作性、感度等の点から免疫（抗原抗体）反応を利用する
免疫測定法が汎用されている。免疫測定法には、放射免
疫測定法、酵素免疫測定法或いは蛍光免疫測定法等があ
り、任意の標識物質で標識された抗体または抗原が一般
的に用いられている。しかし、これらの免疫測定法は、
抗原抗体結合物と非結合物を分離する操作（Ｂ／Ｆ分
離）が必要となるため、簡便性・迅速性の点で問題が残
る。
体物質を測定する方法には様々な方法があるが、その操
作性、感度等の点から免疫（抗原抗体）反応を利用する
免疫測定法が汎用されている。免疫測定法には、放射免
疫測定法、酵素免疫測定法或いは蛍光免疫測定法等があ
り、任意の標識物質で標識された抗体または抗原が一般
的に用いられている。しかし、これらの免疫測定法は、
抗原抗体結合物と非結合物を分離する操作（Ｂ／Ｆ分
離）が必要となるため、簡便性・迅速性の点で問題が残
る。
【０００３】また、このＢ／Ｆ分離を行うためには、別
途機器が必要となり、測定システムも煩雑となるため、
Ｂ／Ｆ分離を必要としない方法が望まれている。蛍光偏
光法は蛍光物質の実効体積の変化を蛍光偏光度の変化と
して直接測定できるため、これを免疫測定法に応用した
蛍光偏光免疫測定法を用いれば、Ｂ／Ｆ分離を必要とせ
ず簡便で迅速な測定が可能となる（蛋白質 核酸 酵素
Ｖｏｌ．４２Ｎｏ．１（１９９７），ｐ．７１−８１参
照）。即ち、蛍光物質で標識した抗体または抗原に抗原
または抗体が結合することでその実効体積が増加するた
め蛍光偏光度が変化してＢ／Ｆ分離を必要とせずに直接
測定することができるため、臨床検査分野で一部実用化
されている。
途機器が必要となり、測定システムも煩雑となるため、
Ｂ／Ｆ分離を必要としない方法が望まれている。蛍光偏
光法は蛍光物質の実効体積の変化を蛍光偏光度の変化と
して直接測定できるため、これを免疫測定法に応用した
蛍光偏光免疫測定法を用いれば、Ｂ／Ｆ分離を必要とせ
ず簡便で迅速な測定が可能となる（蛋白質 核酸 酵素
Ｖｏｌ．４２Ｎｏ．１（１９９７），ｐ．７１−８１参
照）。即ち、蛍光物質で標識した抗体または抗原に抗原
または抗体が結合することでその実効体積が増加するた
め蛍光偏光度が変化してＢ／Ｆ分離を必要とせずに直接
測定することができるため、臨床検査分野で一部実用化
されている。
【０００４】しかし、蛍光偏光免疫測定法で測定可能な
物は、分子量の小さいものが主で、抗体より分子量の大
きい物質については見かけ上の分子量変化が小さいた
め、測定が困難であった。この問題を解決するために、
抗体と比較して分子量の大きな担体に抗体または抗原を
固定化し、結合後の分子量変化を大きくする方法が取ら
れたが、前処理が必要となるため汎用されるに至ってな
い。また、この方法では蛍光標識した抗原または抗体を
測定対象となる抗体または抗原と競合反応させるため、
操作も煩雑である（特開平３−１０３７６５）。
物は、分子量の小さいものが主で、抗体より分子量の大
きい物質については見かけ上の分子量変化が小さいた
め、測定が困難であった。この問題を解決するために、
抗体と比較して分子量の大きな担体に抗体または抗原を
固定化し、結合後の分子量変化を大きくする方法が取ら
れたが、前処理が必要となるため汎用されるに至ってな
い。また、この方法では蛍光標識した抗原または抗体を
測定対象となる抗体または抗原と競合反応させるため、
操作も煩雑である（特開平３−１０３７６５）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の問題を解決するた
めに、本発明では抗原と抗体の結合後の分子量変化を相
対的に大きくすることを目的とし、鋭意研究した結果、
蛍光物質で標識された低分子化抗体を用い、目的物質と
の複合体を生成させ、蛍光偏光度の変化を利用して目的
物質を検出又は定量する方法を提供する。
めに、本発明では抗原と抗体の結合後の分子量変化を相
対的に大きくすることを目的とし、鋭意研究した結果、
蛍光物質で標識された低分子化抗体を用い、目的物質と
の複合体を生成させ、蛍光偏光度の変化を利用して目的
物質を検出又は定量する方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明は検体中の目的物質と目的
物質に対応する蛍光物質で標識された低分子化抗体とを
反応させ、これによって生じる蛍光偏光度の変化を利用
して目的物質を定量的に検出可能な蛍光免疫測定法に関
するものである。ここで言う低分子抗体とは、通常の抗
体の少なくとも抗原認識部位が残るように、抗原認識部
位以外の部分を一部又は全部除去したものである。その
一例としては、Ｆｃ部分を削除したＦａｂフラグメン
ト、Ｆａｂ′フラグメント或いはＦａｂ部分の可変部の
みを結合させたｓｃＦｖ抗体等がある。このような低分
子化した抗体を得る手段としては、該当する抗体を化学
的又は酵素的に切断する方法、該当する抗体の結合部位
を遺伝子工学的に調製する方法等がある。
物質に対応する蛍光物質で標識された低分子化抗体とを
反応させ、これによって生じる蛍光偏光度の変化を利用
して目的物質を定量的に検出可能な蛍光免疫測定法に関
するものである。ここで言う低分子抗体とは、通常の抗
体の少なくとも抗原認識部位が残るように、抗原認識部
位以外の部分を一部又は全部除去したものである。その
一例としては、Ｆｃ部分を削除したＦａｂフラグメン
ト、Ｆａｂ′フラグメント或いはＦａｂ部分の可変部の
みを結合させたｓｃＦｖ抗体等がある。このような低分
子化した抗体を得る手段としては、該当する抗体を化学
的又は酵素的に切断する方法、該当する抗体の結合部位
を遺伝子工学的に調製する方法等がある。
【０００７】抗体の供給源としては、測定する物質に対
して調製された抗体であれば感作する動物種には限定さ
れず、また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗
体でもよい。目的物質は抗原性を有するものであれば何
であってもよく、例えば人血清アルブミン、免疫グロブ
リン、各種のペプチドホルモン、トランスフェリン、補
体、ハプトグロビン、Ｃ反応蛋白等があげられる。これ
らの目的物質は任意の検体に含まれており、例えば、血
清、尿、痰、唾液等の体液をあげることができるが、こ
れに限定されるものではない。
して調製された抗体であれば感作する動物種には限定さ
れず、また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗
体でもよい。目的物質は抗原性を有するものであれば何
であってもよく、例えば人血清アルブミン、免疫グロブ
リン、各種のペプチドホルモン、トランスフェリン、補
体、ハプトグロビン、Ｃ反応蛋白等があげられる。これ
らの目的物質は任意の検体に含まれており、例えば、血
清、尿、痰、唾液等の体液をあげることができるが、こ
れに限定されるものではない。
【０００８】また、抗原抗体反応を行うときの反応条件
は特に限定されないが、望ましくは一定の温度条件での
反応が好ましい。また、検出に要する時間は数分から２
０分程度である。反応は緩衝液、例えばリン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液等の中で行うのが好ましい。抗原抗体
反応開始後、通常の蛍光偏光法と同様に反応混合物の蛍
光偏光度を計時的に測定し、蛍光偏光度の変化を求める
ことによって検体中の目的物質を定量することができ
る。この様な蛍光偏光免疫測定法の基本操作は蛍光偏光
法、に従い行うことができる（蛋白質 核酸 酵素、vo
l.４２ No. １（１９９７），７７〜８１参照）。
は特に限定されないが、望ましくは一定の温度条件での
反応が好ましい。また、検出に要する時間は数分から２
０分程度である。反応は緩衝液、例えばリン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液等の中で行うのが好ましい。抗原抗体
反応開始後、通常の蛍光偏光法と同様に反応混合物の蛍
光偏光度を計時的に測定し、蛍光偏光度の変化を求める
ことによって検体中の目的物質を定量することができ
る。この様な蛍光偏光免疫測定法の基本操作は蛍光偏光
法、に従い行うことができる（蛋白質 核酸 酵素、vo
l.４２ No. １（１９９７），７７〜８１参照）。
【０００９】
【実施例】次に本願発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例１ ヒト血清アルブミンの測定 ａ）Ｆａｂフラグメントの調製 ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）2 の調製は常法に従って実施
できるが、簡便にはPierce社のImmunoPure Fab Prepara
tion Kitを使用できる。抗ヒト血清アルブミンモノクロ
ーナル抗体（ＴＨＳＡ−７）を２０mMリン酸、１０mM
ＥＤＴＡを含む緩衝液（pH７．０）で透析した後セント
リカットＵ−５０（バイオフィールド）で１０mg／mlま
で限外濃縮した。この抗体液１mlをPierce社のFab Prep
arationKit 付属のDigestion Buffer（システイン３．
５mgを含む）１mlと合わせた。
る。実施例１ ヒト血清アルブミンの測定 ａ）Ｆａｂフラグメントの調製 ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）2 の調製は常法に従って実施
できるが、簡便にはPierce社のImmunoPure Fab Prepara
tion Kitを使用できる。抗ヒト血清アルブミンモノクロ
ーナル抗体（ＴＨＳＡ−７）を２０mMリン酸、１０mM
ＥＤＴＡを含む緩衝液（pH７．０）で透析した後セント
リカットＵ−５０（バイオフィールド）で１０mg／mlま
で限外濃縮した。この抗体液１mlをPierce社のFab Prep
arationKit 付属のDigestion Buffer（システイン３．
５mgを含む）１mlと合わせた。
【００１０】これにＫｉｔ付属のImmobilized Papainの
２mlを添加して３７℃で一夜反応した。反応終了後全量
を付属のProtein A カラムにかけて素通り画分を回収し
た。これをセントリカットＵ−１０で濃縮した後Sephac
ryl S-200 (Pharmacia) カラム（１×４５cm）で分画
し、小分子断片を除去してＦａｂ画分を回収した。これ
を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（pH９．０）に対して
透析後セントリカットＵ−１０で１．７mg／mlまで濃縮
した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこ
なったところ約４．６KDにバンドを認めＦａｂ化されて
いることが確認できた。
２mlを添加して３７℃で一夜反応した。反応終了後全量
を付属のProtein A カラムにかけて素通り画分を回収し
た。これをセントリカットＵ−１０で濃縮した後Sephac
ryl S-200 (Pharmacia) カラム（１×４５cm）で分画
し、小分子断片を除去してＦａｂ画分を回収した。これ
を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（pH９．０）に対して
透析後セントリカットＵ−１０で１．７mg／mlまで濃縮
した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこ
なったところ約４．６KDにバンドを認めＦａｂ化されて
いることが確認できた。
【００１１】ｂ）Ｆａｂフラグメント及び未処理ＩｇＧ
のＦＩＴＣ標識 上記の様にして作製した抗ヒト血清アルブミン抗体（Ｔ
ＨＳＡ−７）のＦａｂフラグメント０．８ml（１．３６
mg）に１mg／mlのＦＩＴＣ（Pierce）２７μｌを添加し
４℃で一夜反応した。反応終了後、全量をＰＤ−１０カ
ラム（Pharmacia ）に通し未反応のＦＩＴＣを除去し
た。これを６７mMリン酸緩衝液（pH７．０）に対して透
析してＦＩＴＣ標識Ｆａｂフラグメント（ＦＩＴＣ−Ｆ
ａｂ）を得た（０．８５mg）。同様にして未処理のＴＨ
ＳＡ−７抗体１．７mgを用いてＦＩＴＣ標識を行い１．
１７mgのＦＩＴＣ標識ＴＨＳＡ−７抗体（ＦＩＴＣ−Ｔ
ＨＳＡ−７）を得た。
のＦＩＴＣ標識 上記の様にして作製した抗ヒト血清アルブミン抗体（Ｔ
ＨＳＡ−７）のＦａｂフラグメント０．８ml（１．３６
mg）に１mg／mlのＦＩＴＣ（Pierce）２７μｌを添加し
４℃で一夜反応した。反応終了後、全量をＰＤ−１０カ
ラム（Pharmacia ）に通し未反応のＦＩＴＣを除去し
た。これを６７mMリン酸緩衝液（pH７．０）に対して透
析してＦＩＴＣ標識Ｆａｂフラグメント（ＦＩＴＣ−Ｆ
ａｂ）を得た（０．８５mg）。同様にして未処理のＴＨ
ＳＡ−７抗体１．７mgを用いてＦＩＴＣ標識を行い１．
１７mgのＦＩＴＣ標識ＴＨＳＡ−７抗体（ＦＩＴＣ−Ｔ
ＨＳＡ−７）を得た。
【００１２】４９５nmでの吸光度と２８０nmでの吸光度
の比（Ｆ／Ｐ比）から蛋白当たりのＦＩＴＣ結合比を調
べたところＦＩＴＣ−Ｆａｂでは０．９、未処理のＦＩ
ＴＣ−ＴＨＳＡ−７では１．７であった。
の比（Ｆ／Ｐ比）から蛋白当たりのＦＩＴＣ結合比を調
べたところＦＩＴＣ−Ｆａｂでは０．９、未処理のＦＩ
ＴＣ−ＴＨＳＡ−７では１．７であった。
【００１３】ｃ）ヒト血清アルブミンの測定（Ｆａｂフ
ラグメントの効果） 前記ｂ）で調製したＦＩＴＣ−Ｆａｂを用いてヒト血清
アルブミンを測定する例を示す。まず蛍光標識した０．
１μＭのＦＩＴＣ−Ｆａｂまたは０．１３７μＭのＦＩ
ＴＣ−ＴＨＳＡ−７それぞれ４００μｌを蛍光セルに入
れ自動偏光解消装置（ＡＤＰ−３０１）を備えた分光蛍
光光度計（ＦＰ−７７７；日本分光）に設置した。測定
温度は３６℃に設定した。このセルに各種の濃度のヒト
血清アルブミン８０μｌを添加して測定を開始し、５
分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。計４回の測
定を平均して図１に示す。
ラグメントの効果） 前記ｂ）で調製したＦＩＴＣ−Ｆａｂを用いてヒト血清
アルブミンを測定する例を示す。まず蛍光標識した０．
１μＭのＦＩＴＣ−Ｆａｂまたは０．１３７μＭのＦＩ
ＴＣ−ＴＨＳＡ−７それぞれ４００μｌを蛍光セルに入
れ自動偏光解消装置（ＡＤＰ−３０１）を備えた分光蛍
光光度計（ＦＰ−７７７；日本分光）に設置した。測定
温度は３６℃に設定した。このセルに各種の濃度のヒト
血清アルブミン８０μｌを添加して測定を開始し、５
分、８分、１０分の蛍光偏光度を測定した。計４回の測
定を平均して図１に示す。
【００１４】図１に示したごとくＦａｂ化することによ
りヒト血清アルブミン測定における蛍光偏光度の変化量
は１．７倍以上大きくなり測定範囲が主として低濃度側
に拡大され精度が向上した。併せて検量線の傾きが大き
くなり測定のバラツキも減少した。この結果、低濃度領
域での測定可能範囲が増加しＩｇＧそのものを用いた場
合よりも１０倍程度感度が増加し、ヒト血清アルブミン
の濃度で２〜３×１０ -8Ｍ（１〜２μｇ／ml）程度まで
測定可能となった。
りヒト血清アルブミン測定における蛍光偏光度の変化量
は１．７倍以上大きくなり測定範囲が主として低濃度側
に拡大され精度が向上した。併せて検量線の傾きが大き
くなり測定のバラツキも減少した。この結果、低濃度領
域での測定可能範囲が増加しＩｇＧそのものを用いた場
合よりも１０倍程度感度が増加し、ヒト血清アルブミン
の濃度で２〜３×１０ -8Ｍ（１〜２μｇ／ml）程度まで
測定可能となった。
【図１】図１は、未処理の抗体を使用した場合と、Ｆａ
ｂ断片を使用した場合の、アルブミン濃度と蛍光偏光度
との間の関係を比較した図である。
ｂ断片を使用した場合の、アルブミン濃度と蛍光偏光度
との間の関係を比較した図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 検体中の目的物質と目的物質に対応する
蛍光物質で標識された低分子化抗体とを反応させ、これ
によって生じる蛍光偏光度の変化を利用して目的物質を
検出又は定量する方法。 - 【請求項２】 低分子抗体が少なくとも抗原認識部位を
含む抗体フラグメントである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 抗原認識部位を含む抗体フラグメントが
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ′フラグメント或いはｓｃ
Ｆｖ抗体である請求項２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20058097A JPH1144688A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | 蛍光偏光免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20058097A JPH1144688A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | 蛍光偏光免疫測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1144688A true JPH1144688A (ja) | 1999-02-16 |
Family
ID=16426711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20058097A Pending JPH1144688A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | 蛍光偏光免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1144688A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002335978A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-11-26 | Toto Ltd | ヒトアルブミン結合活性を有する単鎖Ｆｖポリペプチド及びその製造方法 |
| JP2007520700A (ja) * | 2004-01-07 | 2007-07-26 | ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 集積されたエミッションサイトを有するタンパク質インプリントポリマー |
| WO2021070884A1 (ja) * | 2019-10-07 | 2021-04-15 | ナノティス株式会社 | 試料中の被検出物質を検出する方法 |
-
1997
- 1997-07-25 JP JP20058097A patent/JPH1144688A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002335978A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-11-26 | Toto Ltd | ヒトアルブミン結合活性を有する単鎖Ｆｖポリペプチド及びその製造方法 |
| JP2007520700A (ja) * | 2004-01-07 | 2007-07-26 | ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 集積されたエミッションサイトを有するタンパク質インプリントポリマー |
| WO2021070884A1 (ja) * | 2019-10-07 | 2021-04-15 | ナノティス株式会社 | 試料中の被検出物質を検出する方法 |
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