JPH05203579A - 被分析物の濁度分析または比朧分析のための方法および試薬 - Google Patents
被分析物の濁度分析または比朧分析のための方法および試薬Info
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- JPH05203579A JPH05203579A JP4194017A JP19401792A JPH05203579A JP H05203579 A JPH05203579 A JP H05203579A JP 4194017 A JP4194017 A JP 4194017A JP 19401792 A JP19401792 A JP 19401792A JP H05203579 A JPH05203579 A JP H05203579A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/6857—Antibody fragments
Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗体結合反応を利用して液体中の被分析物の
濁度分析および比朧分析を行うための方法および試薬を
提供する。 【構成】 ポリペプチドを抗体またはそれらのフラグメ
ントと反応させて、得られるカップリング産物を被分析
物とともにインキュベートして、得られる濁度を測定す
ることを特徴とする。
濁度分析および比朧分析を行うための方法および試薬を
提供する。 【構成】 ポリペプチドを抗体またはそれらのフラグメ
ントと反応させて、得られるカップリング産物を被分析
物とともにインキュベートして、得られる濁度を測定す
ることを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体結合反応を利用す
る、液体中の被分析物の濁度分析または比朧分析の方法
および試薬に関する。
る、液体中の被分析物の濁度分析または比朧分析の方法
および試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫濁度分析法および免疫比朧分析法は
ともに検出されるべき抗体と抗原との間の反応に基づい
ている。この反応の結果、入射光を散乱させる中心とし
て作用する高分子量の凝集物が形成される。光の散乱
は、免疫濁度分析における吸光度の増加として、および
免疫比朧分析における入射光に対しての角度＞０°〜≦
９０°における散乱光の強度の増加として記録される。
光散乱の程度は１／λ4にほぼ比例するので、免疫濁度
分析および免疫比朧分析のために一般に選択される波長
は短波長（３２０〜３６０ｎｍ）である。免疫沈降の理
論的根拠は、例えば、Immunology、 32、 445-457 (1977)
に記載されている。
ともに検出されるべき抗体と抗原との間の反応に基づい
ている。この反応の結果、入射光を散乱させる中心とし
て作用する高分子量の凝集物が形成される。光の散乱
は、免疫濁度分析における吸光度の増加として、および
免疫比朧分析における入射光に対しての角度＞０°〜≦
９０°における散乱光の強度の増加として記録される。
光散乱の程度は１／λ4にほぼ比例するので、免疫濁度
分析および免疫比朧分析のために一般に選択される波長
は短波長（３２０〜３６０ｎｍ）である。免疫沈降の理
論的根拠は、例えば、Immunology、 32、 445-457 (1977)
に記載されている。
【０００３】そのような測定を実施するための緩衝液、
界面活性剤、中性塩、促進剤などの最適条件は文献に記
載されているが、それぞれの場合に用いられる抗体およ
び検出されるべき抗原によって僅かに異なる（Ann. Cli
n. Biochem.、 20、 1-14 (1983)）。
界面活性剤、中性塩、促進剤などの最適条件は文献に記
載されているが、それぞれの場合に用いられる抗体およ
び検出されるべき抗原によって僅かに異なる（Ann. Cli
n. Biochem.、 20、 1-14 (1983)）。
【０００４】今日までに記載された免疫濁度分析および
免疫比朧分析の大きな利点は、方法の自動化が比較的簡
単にできることである。免疫濁度分析および免疫比朧分
析は、多くの血清タンパク質について記載されている
（The Plasma Proteins、 Vo. 2、 Academic Press、 New
York、 375-425 (1975)、 Automated Immunoanalysis、 Pa
rt 1+2、 R.F. Ritchie (ed.)、 Marcel Dekker Inc.、 Ne
w York、 Basel (1978)）。
免疫比朧分析の大きな利点は、方法の自動化が比較的簡
単にできることである。免疫濁度分析および免疫比朧分
析は、多くの血清タンパク質について記載されている
（The Plasma Proteins、 Vo. 2、 Academic Press、 New
York、 375-425 (1975)、 Automated Immunoanalysis、 Pa
rt 1+2、 R.F. Ritchie (ed.)、 Marcel Dekker Inc.、 Ne
w York、 Basel (1978)）。
【０００５】従来技術に報告された検出限界は、抗体お
よび抗原によって異なっている。免疫濁度分析の検出限
界は約５ｍｇ／リットル、免疫比朧分析の検出限界は約
１ｍｇ／リットルである。免疫濁度分析および免疫比朧
分析の測定領域の上限は分析の最適化によるが、約２０
０〜５００ｍｇ／リットルである。
よび抗原によって異なっている。免疫濁度分析の検出限
界は約５ｍｇ／リットル、免疫比朧分析の検出限界は約
１ｍｇ／リットルである。免疫濁度分析および免疫比朧
分析の測定領域の上限は分析の最適化によるが、約２０
０〜５００ｍｇ／リットルである。
【０００６】免疫濁度分析および免疫比朧分析によって
より低濃度の被分析物を測定することは可能ではない。
このためには、例えば、分析の目的によって抗体または
抗原で被覆された比較的大きな粒子（直径約０．０５〜
３μｍ）を用いるラテックス凝集が用いられる。ラテッ
クス凝集法によって１μｇ／リットル以下の検出限界を
達成することができる。しかし、測定領域の一般的な上
限は、２００〜１０００μｇ／リットル（０．２〜１ｍ
ｇ／リットル）である。
より低濃度の被分析物を測定することは可能ではない。
このためには、例えば、分析の目的によって抗体または
抗原で被覆された比較的大きな粒子（直径約０．０５〜
３μｍ）を用いるラテックス凝集が用いられる。ラテッ
クス凝集法によって１μｇ／リットル以下の検出限界を
達成することができる。しかし、測定領域の一般的な上
限は、２００〜１０００μｇ／リットル（０．２〜１ｍ
ｇ／リットル）である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、濁度分析ま
たは比朧分析による被分析物の測定のための方法および
試薬を提供することを目的とするもので、これは既知の
方法よりもより感度が高く、濃度領域０．１〜＞１００
ｍｇ／リットルの抗原の検出を可能にする。
たは比朧分析による被分析物の測定のための方法および
試薬を提供することを目的とするもので、これは既知の
方法よりもより感度が高く、濃度領域０．１〜＞１００
ｍｇ／リットルの抗原の検出を可能にする。
【０００８】本発明はさらに、液体中の被分析物の濁度
分析または比朧分析による測定のための方法に関し、こ
れにはポリペプチドおよび抗体またはそれらの断片から
なるカップリング産物を、それと被分析物をインキュベ
ートし、その結果の濁りを計ることからなるものであ
る。本発明は更に、液体中の被分析物の濁度分析または
比朧分析のための試薬に関し、これにはポリペプチドお
よび抗体またはそれらの断片からなるカップリング産
物、好ましくは球状タンパク質およびＦａｂ′断片から
なるカップリング産物が含まれる。
分析または比朧分析による測定のための方法に関し、こ
れにはポリペプチドおよび抗体またはそれらの断片から
なるカップリング産物を、それと被分析物をインキュベ
ートし、その結果の濁りを計ることからなるものであ
る。本発明は更に、液体中の被分析物の濁度分析または
比朧分析のための試薬に関し、これにはポリペプチドお
よび抗体またはそれらの断片からなるカップリング産
物、好ましくは球状タンパク質およびＦａｂ′断片から
なるカップリング産物が含まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】驚いたことに、例えば、
抗血清から酸沈澱で得られた重合した抗体は濁度分析で
は単量体の抗体よりも高い測定値を示すことが見出ださ
れた。しかし、これら抗体の重合の程度は変化し、した
がって保存中では測定値が違ってくる。この欠点を除く
ために、複数の結合部位を有する性質の明かな安定した
複合体を天然ＩｇＧまたは抗体断片、好ましくはＦａ
ｂ′断片、と分子担体とカップリングさせて調製され
た。
抗血清から酸沈澱で得られた重合した抗体は濁度分析で
は単量体の抗体よりも高い測定値を示すことが見出ださ
れた。しかし、これら抗体の重合の程度は変化し、した
がって保存中では測定値が違ってくる。この欠点を除く
ために、複数の結合部位を有する性質の明かな安定した
複合体を天然ＩｇＧまたは抗体断片、好ましくはＦａ
ｂ′断片、と分子担体とカップリングさせて調製され
た。
【００１０】適当な分子担体としては、少なくとも１
０、０００Ｄの分子量を有するタンパク質などのポリペ
プチドである。好ましくは、アルブミン、チログロブリ
ン、トランスフェリン、ヘモシアニンなどの球状タンパ
ク質またはポリリジンなどのポリペプチドが用いられ
る。同様に、既知のアビジン／ビオチンまたはストレプ
トアビジン／ビオチン系を用いることもできるが、この
場合、ビオチン化した抗体またはそれらの断片はアビジ
ンまたはストレプトアビジンと安定した複合体を形成す
る。
０、０００Ｄの分子量を有するタンパク質などのポリペ
プチドである。好ましくは、アルブミン、チログロブリ
ン、トランスフェリン、ヘモシアニンなどの球状タンパ
ク質またはポリリジンなどのポリペプチドが用いられ
る。同様に、既知のアビジン／ビオチンまたはストレプ
トアビジン／ビオチン系を用いることもできるが、この
場合、ビオチン化した抗体またはそれらの断片はアビジ
ンまたはストレプトアビジンと安定した複合体を形成す
る。
【００１１】抗体またはそれらの断片とのカップリング
はいろいろな方法で行うことができる。この目的のため
には、二機能性のヘテロ架橋剤、例えば、サクシニミジ
ルマレイミド架橋剤および関連物質が好ましく用いられ
る。これら架橋剤の利点は、望まないカップリング産物
ができないこと、抗体または抗体断片が段階的に導入さ
れること、抗体または抗体断片が端末部を使ってカップ
リングされること、およびカップリング産物がクロマト
グラフィーで容易に精製されることである。
はいろいろな方法で行うことができる。この目的のため
には、二機能性のヘテロ架橋剤、例えば、サクシニミジ
ルマレイミド架橋剤および関連物質が好ましく用いられ
る。これら架橋剤の利点は、望まないカップリング産物
ができないこと、抗体または抗体断片が段階的に導入さ
れること、抗体または抗体断片が端末部を使ってカップ
リングされること、およびカップリング産物がクロマト
グラフィーで容易に精製されることである。
【００１２】カップリング産物は一般に次のようなステ
ップで調製される。
ップで調製される。
【００１３】 １．例えばペプシンなどを用いての抗体の切断 ２．クロマトグラフィーを用いてのＦ（ａｂ′）2断片
の精製 ３．Ｆ（ａｂ′）2断片の還元 ４．クロマトグラフィーを用いてのＦａｂ′断片の単離 ５．クロスリンカーの担体へのカップリング ６．クロマトグラフィーによる担体−クロスリンカー抱
合体の精製 ７．担体−クロスリンカー抱合体へのＦａｂ′断片のカ
ップリング ８．クロマトグラフィーによるカップリング産物の精製 担体−クロスリンカー抱合体はバッチプロセスによって
問題なく調製することができ、溶液中で凍結させるか凍
結乾燥して保存することができる。Ｆ（ａｂ′）2断片
についても同様で、バッチプロセスで調製して、上記の
ようにして保存することができる。したがって、実際の
調製では、３、４、７および８のステップだけが必要と
される。
の精製 ３．Ｆ（ａｂ′）2断片の還元 ４．クロマトグラフィーを用いてのＦａｂ′断片の単離 ５．クロスリンカーの担体へのカップリング ６．クロマトグラフィーによる担体−クロスリンカー抱
合体の精製 ７．担体−クロスリンカー抱合体へのＦａｂ′断片のカ
ップリング ８．クロマトグラフィーによるカップリング産物の精製 担体−クロスリンカー抱合体はバッチプロセスによって
問題なく調製することができ、溶液中で凍結させるか凍
結乾燥して保存することができる。Ｆ（ａｂ′）2断片
についても同様で、バッチプロセスで調製して、上記の
ようにして保存することができる。したがって、実際の
調製では、３、４、７および８のステップだけが必要と
される。
【００１４】既知の試薬と比較して、このようにして調
製された試薬によれば濁度分析および比朧分析において
著しく高い測定値が得られ、検出感度を高めることがで
きる。検出感度は既知の促進剤（例えば、ポリエチレン
グリコール）の存在によってさらに高めることができ
る。このようにして調製された試薬は溶液中で安定で、
これらは自動分析機中でも問題なく使用することがで
き、したがって被分析物の自動免疫濁度分析にも適して
いる。
製された試薬によれば濁度分析および比朧分析において
著しく高い測定値が得られ、検出感度を高めることがで
きる。検出感度は既知の促進剤（例えば、ポリエチレン
グリコール）の存在によってさらに高めることができ
る。このようにして調製された試薬は溶液中で安定で、
これらは自動分析機中でも問題なく使用することがで
き、したがって被分析物の自動免疫濁度分析にも適して
いる。
【００１５】免疫濁度分析および免疫比朧分析はともに
３２０〜４００ｎｍ、好ましくは約３４０ｎｍにおいて
行われる。測定は反応速度論的に行うことができるが、
好ましくは終点反応として行う。
３２０〜４００ｎｍ、好ましくは約３４０ｎｍにおいて
行われる。測定は反応速度論的に行うことができるが、
好ましくは終点反応として行う。
【００１６】本発明による方法および試薬は全ての抗
原、すなわち抗体に対する複数の結合部位を有する物質
の測定に用いることができる。このタイプのタンパク質
の例としては、トランスフェリン、ＣＲＰ、α1−ミク
ログロブリン、ＲＦ、ＴＢＧ、ＲＢＰ、Ｃ３、Ｃ４、Ｉ
ｇｓなどがあげられ、これらは体液中に含まれて診断に
関連する。これらタンパク質はさらなる前希釈なしに、
０．０５〜＞１００ｍｇ／リットル、好ましくは０．５
〜１００ｍｇ／リットルの濃度領域で測定される。唯一
の結合部位を有するハプテンは、いわゆるポリハプテン
を用いる競合測定法と同様にして行うことができる。 ［実施例］ 実施例１ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−アルブミン抱合体の調
製 ３．２ｇのヒツジ抗−トランスフェリンＩｇＧを０．９
％ＮａＣｌ溶液１５０ｍｌに溶かす。１Ｍ酢酸を用いて
溶液をｐＨ＝４．５に調整する。８０ｍｇのペプシンを
この溶液に加えて、混合物を３７℃で約１６時間インキ
ュベートする。１Ｍトリス溶液を用いて反応溶液をｐＨ
＝７．０に調整する。反応溶液をヒトトランスフェリン
を共有結合させたセファロースR４Ｂカラムを用いるア
フィニティークロマトグラフィーで精製する。結合した
Ｆ（ａｂ′）2断片を０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ
＝２．８）を用いて溶出する。タンパク質を含むフラク
ションを集めて１Ｍトリス溶液を用いてｐＨ＝７．０に
調整する。溶液を限外濾過セル中で３０ｍｌに濃縮す
る。比色分析後、３７６ｍｇの特異的Ｆ（ａｂ′）2断
片が得られる。
原、すなわち抗体に対する複数の結合部位を有する物質
の測定に用いることができる。このタイプのタンパク質
の例としては、トランスフェリン、ＣＲＰ、α1−ミク
ログロブリン、ＲＦ、ＴＢＧ、ＲＢＰ、Ｃ３、Ｃ４、Ｉ
ｇｓなどがあげられ、これらは体液中に含まれて診断に
関連する。これらタンパク質はさらなる前希釈なしに、
０．０５〜＞１００ｍｇ／リットル、好ましくは０．５
〜１００ｍｇ／リットルの濃度領域で測定される。唯一
の結合部位を有するハプテンは、いわゆるポリハプテン
を用いる競合測定法と同様にして行うことができる。 ［実施例］ 実施例１ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−アルブミン抱合体の調
製 ３．２ｇのヒツジ抗−トランスフェリンＩｇＧを０．９
％ＮａＣｌ溶液１５０ｍｌに溶かす。１Ｍ酢酸を用いて
溶液をｐＨ＝４．５に調整する。８０ｍｇのペプシンを
この溶液に加えて、混合物を３７℃で約１６時間インキ
ュベートする。１Ｍトリス溶液を用いて反応溶液をｐＨ
＝７．０に調整する。反応溶液をヒトトランスフェリン
を共有結合させたセファロースR４Ｂカラムを用いるア
フィニティークロマトグラフィーで精製する。結合した
Ｆ（ａｂ′）2断片を０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ
＝２．８）を用いて溶出する。タンパク質を含むフラク
ションを集めて１Ｍトリス溶液を用いてｐＨ＝７．０に
調整する。溶液を限外濾過セル中で３０ｍｌに濃縮す
る。比色分析後、３７６ｍｇの特異的Ｆ（ａｂ′）2断
片が得られる。
【００１７】この溶液の１６ｍｌを１Ｍ酢酸を用いてｐ
Ｈ＝４．９に調整して、脱気し、アルゴンで覆って、
０．９ｍｌの１１％塩酸システアミン水溶液と混合す
る。３７℃で２時間インキュベートした後、Ｆａｂ′断
片をセファデックスRＧ−２５（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．０）上のゲルクロマ
トグラフィーで精製する。
Ｈ＝４．９に調整して、脱気し、アルゴンで覆って、
０．９ｍｌの１１％塩酸システアミン水溶液と混合す
る。３７℃で２時間インキュベートした後、Ｆａｂ′断
片をセファデックスRＧ−２５（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．０）上のゲルクロマ
トグラフィーで精製する。
【００１８】タンパク質を含むフラクションを集める。
比色定量後、１９０ｍｇのＦａｂ′断片が３４ｍｌ溶液
中に得られる。溶液を暗所でアルゴンガス下で保存す
る。
比色定量後、１９０ｍｇのＦａｂ′断片が３４ｍｌ溶液
中に得られる。溶液を暗所でアルゴンガス下で保存す
る。
【００１９】４０．５ｍｇのウシ血清アルブミンを７ｍ
ｌの水に溶解して、１ｍｌの３０ｍｇのスクシニイミジ
ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシラート（ＳＭＣＣ）のジオキサン溶液を加え
る。反応溶液を３０℃で１時間インキュベートした後、
セファデックスRＧ−２５上のゲルクロマトグラフィー
で精製する。タンパク質を含むフラクションを合一す
る。比色定量後、３８ｍｇのカップリング産物が１４．
８ｍｌの溶液中に得られる。Ｆａｂ′溶液をアルゴンガ
スの下でカップリング産物の溶液と混合して、室温で１
７時間インキュベートする。
ｌの水に溶解して、１ｍｌの３０ｍｇのスクシニイミジ
ル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシラート（ＳＭＣＣ）のジオキサン溶液を加え
る。反応溶液を３０℃で１時間インキュベートした後、
セファデックスRＧ−２５上のゲルクロマトグラフィー
で精製する。タンパク質を含むフラクションを合一す
る。比色定量後、３８ｍｇのカップリング産物が１４．
８ｍｌの溶液中に得られる。Ｆａｂ′溶液をアルゴンガ
スの下でカップリング産物の溶液と混合して、室温で１
７時間インキュベートする。
【００２０】反応混合物をゲル濾過クロマトグラフィー
（例えば、スーパーデックスR、ファルマシア／ＬＫ
Ｂ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精
製する。目的の生産物を含むフラクションを合わせる。 実施例２ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−アルブミン抱合体を用
いる免疫濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、６％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンRＸ−１００、０．０２％
ＮａＮ3 Ｆａｂ′−アルブミン：実施例１のようにして調製。 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製した。 装置調整：アッセイは臨床化学分析のためのＥＰＯＳ５
０６０自動分析機中で終点アッセイとして行う。まず、
４０μｌの試料（トランスフェリン溶液）および２００
μｌの反応緩衝液をピペットで入れ、混合し、３７℃で
６４秒間プレインキュベートする。次いで、３０μｌの
Ｆａｂ′−アルブミン抱合体をピペットで入れ、混合
し、得られる吸光度を２８８秒後に測定する。装置サイ
クルは１６秒に設定する。開始試薬の添加前のプレイン
キュベーション終了時の吸光度を試料ブランクの測定に
用いる。得られる検量プロット（吸光度／濃度）を第１
図に示す。 実施例３ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体の調製 ２５０ｍｇの凍結乾燥ヒツジ抗−ＣＲＰ ＩｇＧを１５
０ｍＭ ＮａＣｌ溶液２０ｍｌに溶解する。溶液を４ｍ
ｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝４．９、と混合
する。溶液のｐＨを１Ｍ酢酸を用いてｐＨ＝４．３５に
調整する。６．３ｍｇのペプシンを加えて、混合物を３
７℃で約１６時間インキュベートする。得られるＦ（ａ
ｂ′）2断片をゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、
スーパーデックスR、ファルマシア／ＬＫＢ、２０ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭ ＫＣ
ｌ）によって精製する。合わせたフラクションは１２２
ｍｇのＦ（ａｂ′）2断片を含む。合一した全フラクシ
ョンを限外濾過セル中で１２ｍｌに濃縮する（１２．３
ｍｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ′）2）。
（例えば、スーパーデックスR、ファルマシア／ＬＫ
Ｂ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精
製する。目的の生産物を含むフラクションを合わせる。 実施例２ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−アルブミン抱合体を用
いる免疫濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、６％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンRＸ−１００、０．０２％
ＮａＮ3 Ｆａｂ′−アルブミン：実施例１のようにして調製。 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製した。 装置調整：アッセイは臨床化学分析のためのＥＰＯＳ５
０６０自動分析機中で終点アッセイとして行う。まず、
４０μｌの試料（トランスフェリン溶液）および２００
μｌの反応緩衝液をピペットで入れ、混合し、３７℃で
６４秒間プレインキュベートする。次いで、３０μｌの
Ｆａｂ′−アルブミン抱合体をピペットで入れ、混合
し、得られる吸光度を２８８秒後に測定する。装置サイ
クルは１６秒に設定する。開始試薬の添加前のプレイン
キュベーション終了時の吸光度を試料ブランクの測定に
用いる。得られる検量プロット（吸光度／濃度）を第１
図に示す。 実施例３ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体の調製 ２５０ｍｇの凍結乾燥ヒツジ抗−ＣＲＰ ＩｇＧを１５
０ｍＭ ＮａＣｌ溶液２０ｍｌに溶解する。溶液を４ｍ
ｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝４．９、と混合
する。溶液のｐＨを１Ｍ酢酸を用いてｐＨ＝４．３５に
調整する。６．３ｍｇのペプシンを加えて、混合物を３
７℃で約１６時間インキュベートする。得られるＦ（ａ
ｂ′）2断片をゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、
スーパーデックスR、ファルマシア／ＬＫＢ、２０ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０、１５０ｍＭ ＫＣ
ｌ）によって精製する。合わせたフラクションは１２２
ｍｇのＦ（ａｂ′）2断片を含む。合一した全フラクシ
ョンを限外濾過セル中で１２ｍｌに濃縮する（１２．３
ｍｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ′）2）。
【００２１】この溶液の６ｍｌ（７３．３ｍｇＦ（ａ
ｂ′）2）を１ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
＝４．９、と混合する。ｐＨを１Ｍ酢酸で５．０に調整
する。この溶液に０．３５ｍｌの１１％塩酸システアミ
ン水溶液を加える。反応混合物をアルゴンガスで覆っ
て、３０℃で２時間インキュベートする。得られるＦａ
ｂ′断片をセファデックスRＧ−２５上のゲル濾過によ
って精製する。５３ｍｇのＦａｂ′断片が得られる。
ｂ′）2）を１ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
＝４．９、と混合する。ｐＨを１Ｍ酢酸で５．０に調整
する。この溶液に０．３５ｍｌの１１％塩酸システアミ
ン水溶液を加える。反応混合物をアルゴンガスで覆っ
て、３０℃で２時間インキュベートする。得られるＦａ
ｂ′断片をセファデックスRＧ−２５上のゲル濾過によ
って精製する。５３ｍｇのＦａｂ′断片が得られる。
【００２２】１４．６ｍｇのウシ血清アルブミンを１．
８ｍｌの水に溶解する。０．１８ｍｌのジオキサンに溶
かした７．２ｍｇのＳＭＣＣをこの溶液に加えて、３０
℃で１時間インキュベートする。得られるＢＳＡ−ＳＭ
ＣＣ抱合体をセファデックス RＧ−２５上のゲルクロマ
トグラフィーによって精製する。１４．３ｍｇのＢＳＡ
−ＳＭＣＣ抱合体が得られる。Ｆａｂ′断片の溶液をア
ルゴンガスの下でＢＳＡ−ＳＭＣＣ抱合体溶液と合わせ
て、室温で１８時間インキュベートする。次いで、０．
２５ｍｌの１１％塩酸システアミン溶液を加える。反応
混合物を限外濾過セル中で８ｍｌに濃縮する。反応混合
液をゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、スーパーデ
ックスR、ファルマシア／ＬＫＢ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、
２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％
ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精製する。目的の生産物を
含むフラクションを合わせる（２１ｍｌ）。 実施例４ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を用いる免疫
濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、６％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンRＸ−１００、０．０２％
ＮａＮ3 Ｆａｂ′−アルブミン：実施例３のようにして調製。 ＣＲＰ：ヒトＣＲＰを０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ＝７．６、に溶解する。１００ｍｇ／リットルまでの
濃度領域のＣＲＰを連続希釈で調製する。 装置調整：アッセイは臨床化学分析のためのＥＰＯＳ５
０６０自動分析機中で終点アッセイとして行う。まず、
２０μｌの試料（ＣＲＰ溶液）および２２０μｌの反応
緩衝液をピペットで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プ
レインキュベートする。次いで、３０μｌのＦａｂ′−
アルブミン抱合体をピペットで入れ、混合し、得られる
吸光度を２８８秒後に測定する。装置サイクルは１６秒
に設定する。開始試薬の添加前のプレインキュベーショ
ン終了時の吸光度を試料ブランクの測定に用いる。
８ｍｌの水に溶解する。０．１８ｍｌのジオキサンに溶
かした７．２ｍｇのＳＭＣＣをこの溶液に加えて、３０
℃で１時間インキュベートする。得られるＢＳＡ−ＳＭ
ＣＣ抱合体をセファデックス RＧ−２５上のゲルクロマ
トグラフィーによって精製する。１４．３ｍｇのＢＳＡ
−ＳＭＣＣ抱合体が得られる。Ｆａｂ′断片の溶液をア
ルゴンガスの下でＢＳＡ−ＳＭＣＣ抱合体溶液と合わせ
て、室温で１８時間インキュベートする。次いで、０．
２５ｍｌの１１％塩酸システアミン溶液を加える。反応
混合物を限外濾過セル中で８ｍｌに濃縮する。反応混合
液をゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、スーパーデ
ックスR、ファルマシア／ＬＫＢ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、
２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％
ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精製する。目的の生産物を
含むフラクションを合わせる（２１ｍｌ）。 実施例４ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を用いる免疫
濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、６％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンRＸ−１００、０．０２％
ＮａＮ3 Ｆａｂ′−アルブミン：実施例３のようにして調製。 ＣＲＰ：ヒトＣＲＰを０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ＝７．６、に溶解する。１００ｍｇ／リットルまでの
濃度領域のＣＲＰを連続希釈で調製する。 装置調整：アッセイは臨床化学分析のためのＥＰＯＳ５
０６０自動分析機中で終点アッセイとして行う。まず、
２０μｌの試料（ＣＲＰ溶液）および２２０μｌの反応
緩衝液をピペットで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プ
レインキュベートする。次いで、３０μｌのＦａｂ′−
アルブミン抱合体をピペットで入れ、混合し、得られる
吸光度を２８８秒後に測定する。装置サイクルは１６秒
に設定する。開始試薬の添加前のプレインキュベーショ
ン終了時の吸光度を試料ブランクの測定に用いる。
【００２３】得られる検量プロット（吸光度／濃度）を
第２図に示す。 実施例５ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−チログロブリン抱合体
の調製 抗−トランスフェリンＩｇＧ（ヒツジ）を実施例１と同
様にペプシンで処理する。Ｆ（ａｂ′）2断片をゲル濾
過クロマトグラフィーで精製する。これらＦ（ａｂ′）
2断片の４１．５ｍｇを１．３ｍｌの燐酸塩緩衝液（２
０ｍＭ燐酸塩、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．０）に
溶解して、０．２ｍｌの１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ＝５．
０、と混合して、アルゴンガスで覆う。脱気した０．１
ｍｌの１１％塩酸システアミン水溶液を加えて、３７℃
で２時間インキュベートする。得られるＦａｂ′断片を
セファデックスRＧ−２５上のゲルクロマトグラフィー
によって精製する。２ｍｌの溶出緩衝液中に３４．６ｍ
ｇのＦａｂ′断片が得られる。 ２５ｍｇのチログロブ
リン（ブタ）を３ｍｌの燐酸塩緩衝液（２０ｍＭ燐酸
塩、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．０）に溶解する。
０．１ｍｌの２７ｍｇ／ｍｌＳＭＣＣジオキサン溶液を
加えて、混合物を３０℃で３０分間インキュベートす
る。反応混合物をセファデックスRＧ−２５上のゲルク
ロマトグラフィーによって精製する。Ｆａｂ′断片の溶
液を分けてカップリング産物に加えて、室温で一晩イン
キュベートする。
第２図に示す。 実施例５ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−チログロブリン抱合体
の調製 抗−トランスフェリンＩｇＧ（ヒツジ）を実施例１と同
様にペプシンで処理する。Ｆ（ａｂ′）2断片をゲル濾
過クロマトグラフィーで精製する。これらＦ（ａｂ′）
2断片の４１．５ｍｇを１．３ｍｌの燐酸塩緩衝液（２
０ｍＭ燐酸塩、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．０）に
溶解して、０．２ｍｌの１Ｍ酢酸塩緩衝液、ｐＨ＝５．
０、と混合して、アルゴンガスで覆う。脱気した０．１
ｍｌの１１％塩酸システアミン水溶液を加えて、３７℃
で２時間インキュベートする。得られるＦａｂ′断片を
セファデックスRＧ−２５上のゲルクロマトグラフィー
によって精製する。２ｍｌの溶出緩衝液中に３４．６ｍ
ｇのＦａｂ′断片が得られる。 ２５ｍｇのチログロブ
リン（ブタ）を３ｍｌの燐酸塩緩衝液（２０ｍＭ燐酸
塩、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ＝７．０）に溶解する。
０．１ｍｌの２７ｍｇ／ｍｌＳＭＣＣジオキサン溶液を
加えて、混合物を３０℃で３０分間インキュベートす
る。反応混合物をセファデックスRＧ−２５上のゲルク
ロマトグラフィーによって精製する。Ｆａｂ′断片の溶
液を分けてカップリング産物に加えて、室温で一晩イン
キュベートする。
【００２４】得られるチログロブリン−（Ｆａｂ′）n
抱合体をゲル濾過クロマトグラフィー（１５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０２％ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精製する。目的の生
産物を含むフラクションを合わせる（２４ｍｌ）。 実施例６ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−チログロブリン抱合体
を用いる免疫濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR、０．０２％ＮａＮ3 Ｆａｂ′−チログロブリン：実施例５のようにして調
製。 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製する。 装置調整：アッセイはＥＰＯＳ５０６０分析機中で終点
アッセイとして行う。まず、１５μｌの試料（トランス
フェリン溶液）および２３５μｌの反応緩衝液をピペッ
トで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プレインキュベー
トする。次いで、６０μｌのＦａｂ′−チログロブリン
抱合体をピペットで入れ、混合し、得られる吸光度を２
８８秒後に測定する。装置サイクルは１６秒に設定す
る。開始試薬の添加前のプレインキュベーション終了時
の吸光度を試料ブランクの測定に用いる。
抱合体をゲル濾過クロマトグラフィー（１５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、２０ｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０２％ＮａＮ3、ｐＨ＝７．０）で精製する。目的の生
産物を含むフラクションを合わせる（２４ｍｌ）。 実施例６ 抗−トランスフェリンＦａｂ′−チログロブリン抱合体
を用いる免疫濁度測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR、０．０２％ＮａＮ3 Ｆａｂ′−チログロブリン：実施例５のようにして調
製。 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製する。 装置調整：アッセイはＥＰＯＳ５０６０分析機中で終点
アッセイとして行う。まず、１５μｌの試料（トランス
フェリン溶液）および２３５μｌの反応緩衝液をピペッ
トで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プレインキュベー
トする。次いで、６０μｌのＦａｂ′−チログロブリン
抱合体をピペットで入れ、混合し、得られる吸光度を２
８８秒後に測定する。装置サイクルは１６秒に設定す
る。開始試薬の添加前のプレインキュベーション終了時
の吸光度を試料ブランクの測定に用いる。
【００２５】得られる検量プロット（吸光度／濃度）を
第３図に示す。 実施例７ トランスフェリンを測定する比較実験 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR−Ｘ−１００、０．０２
％アジ化ナトリウム Ｆａｂ′−アルブミン：実施例１のようにして調製。 抗−トランスフェリンＩｇＧ：実施例１の出発材料 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製する。 装置調整：アッセイはＥＰＯＳ５０６０分析機中で終点
アッセイとして行う。まず、２０μｌの試料（トランス
フェリン溶液）および２３５μｌの反応緩衝液をピペッ
トで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プレインキュベー
トする。次いで、５０μｌのＦａｂ′−アルブミン抱合
体または抗−トランスフェリンＩｇＧをピペットで入
れ、混合し、得られる吸光度を２８８秒後に測定する。
装置サイクルは１６秒に設定する。開始試薬の添加前の
プレインキュベーション終了時の吸光度を試料ブランク
の測定に用いる。
第３図に示す。 実施例７ トランスフェリンを測定する比較実験 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR−Ｘ−１００、０．０２
％アジ化ナトリウム Ｆａｂ′−アルブミン：実施例１のようにして調製。 抗−トランスフェリンＩｇＧ：実施例１の出発材料 トランスフェリン：ヒトトランスフェリンを０．１Ｍト
リスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．６、に溶解する。１００
ｍｇ／リットルまでの濃度領域のトランスフェリンを連
続希釈で調製する。 装置調整：アッセイはＥＰＯＳ５０６０分析機中で終点
アッセイとして行う。まず、２０μｌの試料（トランス
フェリン溶液）および２３５μｌの反応緩衝液をピペッ
トで入れ、混合物を３７℃で６４秒間プレインキュベー
トする。次いで、５０μｌのＦａｂ′−アルブミン抱合
体または抗−トランスフェリンＩｇＧをピペットで入
れ、混合し、得られる吸光度を２８８秒後に測定する。
装置サイクルは１６秒に設定する。開始試薬の添加前の
プレインキュベーション終了時の吸光度を試料ブランク
の測定に用いる。
【００２６】Ｆａｂ′−アルブミン抱合体および抗−ト
ランスフェリンＩｇＧについて得られる検量プロット
（吸光度／濃度）を第４図に示す。第５図は、低トラン
スフェリン濃度におけるこれら検量プロットを示す。Ｆ
ａｂ′−アルブミン抱合体について得られた測定値は、
天然の抗−トランスフェリンＩｇＧについて同じ条件下
で得られたものに比べて明らかに高い。 実施例８ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を用いる免疫
比朧測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR−Ｘ−１００、０．０２
％アジ化ナトリウム Ｆａｂ′−アルブミン：実施例３のようにして調製。 ＣＲＰ：ヒトＣＲＰを０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ＝７．６、に溶解する。７７．５ｍｇ／リットルまで
の濃度領域のＣＲＰを連続希釈で調製する。 装置調整：アッセイは蛍光スペクトル光度計（日立Ｆ４
０００）中でマニュアル終点アッセイとして行う。装置
は拡散光の強度を９０°の角度で測定する。強度は任意
単位（a.u.）として報告される。励起および放出の波長
は３４０ｎｍに設定する。スリット幅は３ｍｍに設定す
る。ゼロ点調整をした後、展開範囲０〜９９９９a.u.を
選択する。
ランスフェリンＩｇＧについて得られる検量プロット
（吸光度／濃度）を第４図に示す。第５図は、低トラン
スフェリン濃度におけるこれら検量プロットを示す。Ｆ
ａｂ′−アルブミン抱合体について得られた測定値は、
天然の抗−トランスフェリンＩｇＧについて同じ条件下
で得られたものに比べて明らかに高い。 実施例８ 抗−ＣＲＰ Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を用いる免疫
比朧測定 反応緩衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．
６、５％ポリエチレングリコール６０００、０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ、０．１％トリトンR−Ｘ−１００、０．０２
％アジ化ナトリウム Ｆａｂ′−アルブミン：実施例３のようにして調製。 ＣＲＰ：ヒトＣＲＰを０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ＝７．６、に溶解する。７７．５ｍｇ／リットルまで
の濃度領域のＣＲＰを連続希釈で調製する。 装置調整：アッセイは蛍光スペクトル光度計（日立Ｆ４
０００）中でマニュアル終点アッセイとして行う。装置
は拡散光の強度を９０°の角度で測定する。強度は任意
単位（a.u.）として報告される。励起および放出の波長
は３４０ｎｍに設定する。スリット幅は３ｍｍに設定す
る。ゼロ点調整をした後、展開範囲０〜９９９９a.u.を
選択する。
【００２７】２００μｌの試料および２５００μｌの反
応緩衝液を１ｃｍの蛍光キュベットにピペットで入れ、
混合し、室温で９０秒間プレインキュベートする。次い
で、３００μｌのＦａｂ′−アルブミン抱合体をピペッ
トで入れて混合し、拡散光強度の増加を１０分間モニタ
ーする。得られる測定値をＣＲＰ濃度にたいしてプロッ
トする。
応緩衝液を１ｃｍの蛍光キュベットにピペットで入れ、
混合し、室温で９０秒間プレインキュベートする。次い
で、３００μｌのＦａｂ′−アルブミン抱合体をピペッ
トで入れて混合し、拡散光強度の増加を１０分間モニタ
ーする。得られる測定値をＣＲＰ濃度にたいしてプロッ
トする。
【００２８】検量プロット（a.u.／濃度としての拡散光
強度）を第６図に示す。
強度）を第６図に示す。
【図１】トランスフェリンの濃度と吸光度の関係を示す
説明図である。抱合体はＦａｂ′−アルブミンを用い
る。
説明図である。抱合体はＦａｂ′−アルブミンを用い
る。
【図２】ＣＲＰの濃度と吸光度の関係を示す説明図であ
る。
る。
【図３】トランスフェリンの濃度と吸光度を示す説明図
である。抱合体はＦａｂ′−チログロブリンを用いる。
である。抱合体はＦａｂ′−チログロブリンを用いる。
【図４】トランスフェリン測定の比較実験の説明図であ
る。図中、白丸は抗−トランスフェリンＩｇＧ、黒丸は
Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を示す。
る。図中、白丸は抗−トランスフェリンＩｇＧ、黒丸は
Ｆａｂ′−アルブミン抱合体を示す。
【図５】トランスフェリン測定の比較実験の説明図であ
る。図４の低濃度部分を示す。
る。図４の低濃度部分を示す。
【図６】ＣＲＰ比朧測定を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミヒァエル ドレーヘア ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタットフランクフルター シュトラーセ 250 (72)発明者 ヴィンフリート リンクスヴァイラー ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタットフランクフルター シュトラーセ 250 (72)発明者 ジークフリート ノイマン ドイツ連邦共和国 デー−6100 ダルムシ ュタットフランクフルター シュトラーセ 250
Claims (7)
- 【請求項１】 抗体−結合反応を利用する液体中の被分
析物の濁度分析または比朧分析のための方法であって、
ポリペプチドを抗体またはそれらの断片と反応させて、
その結果として得られるカップリング産物を被分析物と
インキュベートして、得られる濁度を測定することを特
徴とする、濁度分析または比朧分析測定法。 - 【請求項２】 ポリペプチドとして少なくとも１０、０
００Ｄの分子量を有するタンパク質を用いることを特徴
とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ポリペプチドとして球状タンパク質を用
いることを特徴とする、請求項１〜２に記載の方法。 - 【請求項４】 ポリペプチドとしてアルブミン、チログ
ロブリン、トランスフェリン、ヘモシアニンを用いるこ
とを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項５】 断片としてＦａｂ′断片を用いることを
特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】 ポリペプチドおよび抗体またはそれらの
断片からなるカップリング産物を含む、液体中の被分析
物の濁度分析または比朧分析のための試薬。 - 【請求項７】 球状タンパク質およびＦａｂ′断片から
なるカップリング産物を含む、請求項６に記載の試薬。
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|---|---|---|---|
| DE4124324A DE4124324A1 (de) | 1991-07-23 | 1991-07-23 | Verfahren und mittel zur turbidimetrischen oder nephelometrischen bestimmung von analyten |
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|---|---|---|---|
| JP4194017A Pending JPH05203579A (ja) | 1991-07-23 | 1992-07-21 | 被分析物の濁度分析または比朧分析のための方法および試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0524583B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05203579A (ja) |
| CA (1) | CA2074345A1 (ja) |
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| GB9713559D0 (en) * | 1997-06-26 | 1997-09-03 | Axis Biochemicals Asa | Assay |
| WO2002046755A1 (fr) * | 2000-12-04 | 2002-06-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Procede pour determiner la concentration d'une solution et procede d'analyse de l'urine |
| WO2004036214A2 (en) * | 2002-10-18 | 2004-04-29 | Pfizer Products Inc. | Automated kinetci solubility assay apparatus and method |
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