CN104407154B - 一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断试剂领域，特别是涉及一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒。本发明提供一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液，所述胶乳颗粒的粒径为0.2-1.0μm，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液。本发明所提供的提升胶乳增强免疫比浊法灵敏度的方法大大提升试剂的分析灵敏度和精密度，且并未提高检测成本，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，特别是涉及一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒。
背景技术
当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。
但是经典的免疫比浊法，少量的小的抗原抗体复合物极难形成浊度，除非放置较长时间；如形成较大的复合物，则抗原和抗体用量也较大，显然不符合微量化的要求。于是发展了现在广泛应用于生化分析仪的胶乳增强免疫比浊法(PETIA)：以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法，利用基因工程方法将抗体与胶乳颗粒结合，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增强了反应吸光度，反应液在一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，计算标本中抗原的含量。利用生化分析仪进行比浊测定，整个分析过程只需几分钟，该方法与传统免疫比浊法比较其灵敏度更高。
随着检验医学的发展，对于低浓度检测物质的检测越来越多，检测物质的浓度正在从μg/mL级别下降至ng/mL级别，对于诊断试剂的灵敏度要求也越来越高，对于传统的胶乳增强免疫比浊法来说需要进一步的提升检测的灵敏度，以适应检测要求，传统的提升检测灵敏度的方法包括采用亲和力更高的抗体，采用更大颗粒，稳定性更好的胶乳颗粒，选用更好的促进抗原抗体反应的缓冲液体系等，但是这些都会增加试剂的成本，如何提升面对ng/mL级别被分析物的分析灵敏度和精密度，同时不增加成本一直是试剂开发的一大挑战。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于通过反应波长的选择，不仅检测乳抗体抗原复合物的生成，还检测未结合胶乳颗粒的减少，提高检测物质的分析灵敏度和精密度，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种提升胶乳增强免疫比浊法灵敏度的方法，包括如下步骤：
1.选用大粒径的胶乳颗粒与抗体反应，进行抗体包被，大粒径的胶乳颗粒的粒径为0.2-1.0μm；
2.将包被后的胶乳经过清洗和封闭步骤后，分散于缓冲液中，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂2；
3.配置有促进抗原和抗体反应作用的缓冲液，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂1；
4.在全自动生化分析仪上，设置参数，其中，主波长设置为300-500nm，副波长设置为500-800nm，反应方向为负方向；
5.运行生化仪，在使用已知浓度的样品进行定标后，检测待测样本得到吸光度变化值，根据校准曲线，计算出样本中待测物的含量。
优选的，所述步骤3中，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，其配方为：Tris50mmol/L，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L，水苏糖0.8-3g/L；明矾0.1-1g/L；果糖二磷酸钠0.8-3g/L；六偏磷酸钠0.05-0.5g/L，pH＝7.0-7.4。
优选的，所述提升胶乳增强免疫比浊法灵敏度的方法不是以疾病的诊断和治疗为目的的。
更优选的，对待测物含量的测量的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是从人体或动物体获取作为中间结果的信息的方法，或只是对已脱离人体或动物体的组织、体液或排泄物进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法。
本发明第二方面提供所述提升胶乳增强免疫比浊法灵敏度的方法在生物检测领域的用途。
本发明第三方面提供一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液，所述胶乳颗粒的粒径为0.2-1.0μm，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液。
优选的，所述试剂1的配方为：Tris50mmol/L，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L，水苏糖0.8-3g/L；明矾0.1-1g/L；果糖二磷酸钠0.8-3g/L；六偏磷酸钠0.05-0.5g/L。
优选的，所述试剂1中，pH值为中性。
优选的，所述试剂2中，包被的抗体与检测物相对应。
更优选为D-二聚体抗体。
优选的，所述试剂2中，分散液中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L。
本发明第四方面提供所述高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)选用大粒径的胶乳颗粒与抗体反应，进行抗体包被，所述乳胶颗粒的粒径为0.2-1.0μm；
2)将包被后的胶乳经过清洗和封闭步骤后，分散于特定缓冲液中，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂2；
3)配置有促进抗原和抗体反应作用的缓冲液，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂1。
本发明第五方面提供所述高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒在生物检测领域的用途。
本发明根据胶乳增强免疫比浊法的基本原理：即包被有抗体的胶乳与抗原反应，形成较大的胶乳抗原抗体复合物，引起浊度的增加，增强了反应吸光度，反应液在一定波长处测试，与同样处理的标准液比较，计算标本中抗原的含量。本发明人认为在包被抗体胶乳颗粒粒径较大的情况下，胶乳颗粒本身具有一定的浊度，在特定波长具有较大的吸收，而当包被抗体胶乳与抗原形成较大的胶乳抗原抗体复合物后，为反应的包被抗体胶乳颗粒也随之减少根据米氏散射理论，不同直径的微球对于固定波长的光反射能力不同，所以整个反应液在某些波长下吸光度增加，但是在某些波长下吸光度会下降，通过测量上升波长和下降波长的吸光度变化值，并进行加和，可以提升分析灵敏度的1倍以上。
与现有技术相比，本发明具如下优势：
1.大大提升试剂的分析灵敏度和精密度：本发明发明人发现，通过特殊的促进抗原抗体反应的缓冲液，并进一步利用大粒径包被胶乳微球减少所引起的吸光度变化和胶乳抗原抗体复合物增加所引起的吸光度变化(大粒径包被胶乳微球减少所引起的吸光度变化往往大于胶乳抗原抗体复合物增加所引起的吸光度变化)，两者吸光度变化加和后，试剂的分析灵敏度提升一倍或者以上，与此同时分析灵敏度的提升也带来精密度的提升。
2.可以不增加或者是减少成本：首先本发明仅仅是测量方式的改变，可以很容易在全自动生化仪上通过修改参数的方式实现，所以不会增加成本，其次由于大粒径胶乳微球包被所需抗体往往比同质量的小粒径胶乳微球少(表面积较小)，同时使用本发明所需的胶乳浓度较小，所以本发明往往可以减少试剂的成本。
附图说明
图1是实施例1制备的检测试剂盒的反应全波长扫描动力学实验结果。
图2是实施例1制备的检测试剂盒的校准曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
需要具体说明的是，本发明所用的原料基本均可以为市售产品，其中三羟甲基氨基甲烷Tris购自Sigma公司；其中羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒以羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液的形式加入，购自日本JSR公司；D-二聚体抗体和D-二聚体购自芬兰hytest公司。
实施例1
一、定量检测胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备
试剂1的制备：
由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠、2.2g水苏糖、0.6g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠和50gPEG6000制备得到，最终试剂1中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L，水苏糖2.2g/L、明矾0.6g/L、果糖二磷酸钠1.9g/L、六偏磷酸钠0.3g/L；
称取6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3gBSA、50gPEG6000、水苏糖2.2g、明矾0.6g、果糖二磷酸钠1.9g、六偏磷酸钠0.3g、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，用HCl调节pH至7.0，定容至1L即得试剂1。
试剂2的制备：
由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被鼠抗人D-二聚体抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终试剂2中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
①乳颗粒的活化、洗涤：
取质量体积比为10％的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液100μL，向其中加入质量浓度为1％EDAC溶液10μL，置于37℃摇床中反应0.5～1h后，再在12000rmp的转速下离心分离30min，然后倒掉上层清液，再用浓度为50mM、pH为7.2的甘氨酸缓冲液洗涤三次，最后将沉淀分散于1L浓度为50mM、pH为7.2的甘氨酸缓冲液中，使最终溶液中聚苯乙烯胶乳颗粒的浓度(以质量体积比计)为0.5～1％。
②抗体的纯化：
将鼠抗人D-二聚体抗体加入到透析袋中，在100mM、pH为7.2的PBS缓冲液中透析48小时，在透析的过程中换缓冲液3次，得到纯化的鼠抗人D-二聚体抗体。
③抗体胶乳颗粒的偶联：
将经过步骤①活化后的羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液与步骤②纯化后的抗体混合，混匀后置于37℃摇床孵育2h，得到抗体-胶乳颗粒复合物；然后将抗体-胶乳颗粒复合物在12000rpm离心30min，倒掉上清液，再用浓度为100mM、pH为7.2的PBS缓冲液洗涤2次，最后再加入浓度为50mM、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液10ml，搅拌混合均匀即可。其中10ml的Tris-HCl缓冲液中含有0.5mg的牛血清白蛋白BSA和1mg的叠氮钠；所述包被鼠抗人D-二聚体抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.05～0.20％。
校准品的制备：
由浓度为100mM的PBS缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和D-二聚体以制备得到，最终校准品中PBS缓冲液的浓度为100mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
称取35.61Na2HPO4·2H2O、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1L，将D-二聚体溶于上述配制好的溶液中，配制成D-二聚体的浓度分别为0、0.5、1、2、4、8ng/mL的溶液，即得到校准品。
二、检测试剂盒的反应全波长扫描动力学实验
将校准品与试剂1混合均匀，37℃孵育5min后，加入试剂2，37℃孵育10S后使用紫外分光光度计全波长扫描反应液(第一次)，37℃反应4min50S后使用紫外分光光度计全波长扫描反应液(第二次)，计算吸光度变化值△A＝A2-A1；全波长扫描的波长范围为200-800nm。表1所示为全波长扫描动力学实验结果。
表1
可以看到，反应液在340nm处的吸光度减少值，大于其在600nm处的吸光度增加值，如果将两个波长处的吸光度变化加和，可以大大提升试剂的分析灵敏度。
三、定量检测胶乳增强免疫比浊试剂盒的使用方法
检测仪器：OLYMPUSAU640全自动生化分析仪
根据本发明设置的参数为：检测方法：END.测定波长：主波长340nm，负波长600nm；样本量：25μL；试剂1：240μL；试剂2：80μL；校准方式：多点校准；反应方向：负。
试剂1的制备：
由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠、2.2g水苏糖、0.6g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠和50gPEG6000制备得到，最终试剂1中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L，水苏糖2.2g/L、明矾0.6g/L、果糖二磷酸钠1.9g/L、六偏磷酸钠0.3g/L；
称取6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3gBSA、50gPEG6000、水苏糖2.2g、明矾0.6g、果糖二磷酸钠1.9g、六偏磷酸钠0.3g、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，用HCl调节pH至7.0，定容至1L即得试剂1。
试剂2的制备：
由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、5g的牛血清白蛋白BSA、1g的叠氮钠和包被鼠抗人D-二聚体抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒制备得到，最终试剂2中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L；
对比参数为：检测方法：END.测定波长：主波长600nm，负波长无；样本量：25μL；试剂1：240μL；试剂2：80μL；校准方式：多点校准；反应方向：正。
对比试剂1的制备：
由浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液、3g牛血清白蛋白BSA、1g叠氮钠和50gPEG6000制备得到，最终试剂1中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L；
称取6.06g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3gBSA、50gPEG6000、1g叠氮钠溶于0.8L去离子水中，用HCl调节pH至7.0，定容至1L即得试剂1。
试剂2与上述相同。
将校准品与试剂1混合均匀，37℃孵育5min后，加入试剂2，37℃孵育10S后读取吸光度值A1，反应4min50S后读取吸光度值A2，计算吸光度变化值△A＝A2-A1；然后以△A值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制校准曲线，校准曲线如图2所示。
四、胶乳增强免疫比浊试剂盒的分析灵敏度和精密度对比实验
根据校准曲线，计算试剂的分析灵敏度结果见表2。表所示为本发明设置参数和对比参数的分析灵敏度。
表2
精密度实验，采用高中低值样本重复测试10次，以测试结果的不精密度来表征试剂的精密度，结果看表3。
表3
本发明参数的试剂的分析灵敏度和精密度都明显优于对比参数，但是成本并没有增加。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液，所述胶乳颗粒的粒径为0.2-1.0μm，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液，所述试剂1的配方为：Tris50mmol/L，牛血清白蛋白BSA的浓度为3g/L，叠氮钠的浓度为1g/L，PEG6000的浓度为50g/L，水苏糖0.8-3g/L；明矾0.1-1g/L；果糖二磷酸钠0.8-3g/L；六偏磷酸钠0.05-0.5g/L。
2.如权利要求1所述的一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述试剂1中，pH值为中性。
3.如权利要求1所述的一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述试剂2中，包被的抗体与检测物相对应。
4.如权利要求1所述的一种高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述试剂2中，分散液中Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，牛血清白蛋白BSA的浓度为5g/L，叠氮钠的浓度为1g/L。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述的高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)选用大粒径的胶乳颗粒与抗体反应，进行抗体包被，所述胶乳颗粒的粒径为0.2-1.0μm；
2)将包被后的胶乳经过清洗和封闭步骤后，分散于特定缓冲液中，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂2；
3)配置有促进抗原和抗体反应作用的缓冲液，制得胶乳增强免疫比浊法试剂盒试剂1。
6.如权利要求1-4任一权利要求所述的高灵敏度胶乳增强免疫比浊法试剂盒在生物检测领域的用途。
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