一种利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂盒,特别是涉及一种利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统,由4种主要部分组成:纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶、纤溶酶抑制物。当纤维蛋白凝结块形成时,在纤溶酶原激活剂的存在下,纤溶酶原激活转化为纤溶酶,纤维蛋白溶解过程开始,纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段,形成纤维蛋白产物(FDP),FDP由X-寡聚体、D-二聚体、中间片段及片段E(FragmentE)组成。其中,X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位。
人体纤溶系统,它对保持血管壁的正常通透性,维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用。D-二聚体血浆中水平增高说明存在继发性纤溶过程,而先产生凝血酶,后又有纤溶系活化;并且也反映在血栓形成的局部纤溶酶活性或浓度超过血浆2‰—抗纤溶酶活性或浓度。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。一般为投入一种纤溶酶原活化物如尿液酶、链激酶或组织型纤溶酶原活化物(tpA),使大量纤溶酶生成,从而加速已形成血栓的溶解。FDP或D-二聚体生成,表明达到溶栓效果。
纤溶蛋白降解产物中,唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因此,理论上,D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。因此,纤维D-二聚体是深静脉血栓(DVT),肺栓塞(PE),弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。临床上对D-二聚体含量的检测可用于以下疾病的诊断:脑血管疾病、肝脏疾病、外科手术患者、溶栓治疗的监测等。
D-二聚体的测定方法很多,有ELISA、TRIFMA、胶体金,胶乳增强免疫比浊法等。目前在临床上应用较为广泛的是胶体金法,ELISA操作要求严格,比较费时,胶体金作为定性或半定量方法,对于定量,稍有不足。而胶乳增强免疫比浊法有快速,定量和成本低的优势,越来越受到临床医生的关注。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种稳定性好,检测灵敏度高,线性范围广的的D二聚体检测试剂盒,以及D二聚体检测试剂盒的制备方法,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2两种组分,所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、促凝剂和保护剂1组成;所述试剂R2主要由缓冲液2、交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球、稳定剂2、保护剂2、防腐剂2组成,其中聚苯乙烯胶乳微球与D二聚体抗体之间以共价交联或物理吸附方式连接。
优选的,本发明中聚苯乙烯胶乳微球交联两种不同的D二聚体单克隆抗体。
本技术方案中的D二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒,将D二聚体抗体交联在聚苯乙烯胶乳微球表面,当血液中的D二聚体与D二聚体抗体反应时,带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度,而浊度与血液中的D二聚体含量在一定范围成正比,可以用全自动生化仪在400-800nm波长下检测血液中D二聚体的含量。
优选的,所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或几种,其pH为6.0~9.0,浓度为25~500mmol/L;所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种,其pH为7.0~9.0,浓度为25~500mmol/L。
本发明试剂R1中的缓冲液1可使用上述本领域各种常用的缓冲液,但为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,本发明中所述试剂R1中缓冲液1优选为包括下列组分:水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸的水溶液,且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5-7.5g/L,缓冲液的pH值为7.2-7.6。
优选的,各组分在缓冲液1中的浓度为:
所述缓冲液1的溶剂为水。
所述缓冲液1可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
优选的,所述试剂R1中的稳定剂1选自KCl、NaCl、CaCl2中的一种或者几种,其质量浓度为0.5%~10%;所述试剂R2中的稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用;其中离子稳定剂为NaCl、KCl、Na2CO3、Na2SO4或者K2SO4,悬浮稳定剂为PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖。
优选的,所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300;所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。
优选的,所述试剂R1中的促凝剂为PEG8000或者葡聚糖。优选PEG8000,是由于PEG8000属于非离子型水溶性聚合物,在水中的溶解性比较大,可以调节试剂R1的粘度,促进抗原和抗体分子结合为复合物。
优选的,所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基,聚苯乙烯乳胶微球的粒径在100~500nm。优选表面官能团为羧基的聚苯乙烯胶乳微球,这是由于聚苯乙烯胶乳微球表面为羧基的官能团很容易被EDC活化增加偶联效果,保证测试结果的灵敏度及准确性。
优选的,所述试剂R2中的D二聚体抗体为兔抗人D二聚体单克隆抗体、鼠抗人D二聚体单克隆抗体一种或者几种。优选两种鼠单克隆抗体,不要求是配对单抗。
优选的,所述试剂R1中的保护剂1为EDTA,所述EDTA的浓度为10~100mmol/L;所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。
本发明第二方面提供所述利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)试剂R1的制备:
在缓冲液1中加入稳定剂1、促凝剂、防腐剂1、保护剂1,搅拌混合均匀,即得试剂R1;
(2)试剂R2的制备:
用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%,再加入质量浓度为0.01%-0.1%的EDC,在室温下搅拌反应60min,反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC,然后加入D二聚体单克隆抗体,37℃下搅拌反应4h,再加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用包括、稳定剂2、保护剂2、防腐剂2的缓冲液2将胶乳重悬。同样操作标记另一株单抗,两者按1:1混合后超声后即得R2。
本发明第三方面提供所述利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒在D二聚体检测领域的用途。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.采用胶乳增强免疫比浊法,当血液中的D二聚体与D二聚体单克隆抗体反应时,带动了聚苯乙烯胶乳聚集产生一定的浊度,而浊度与血液中的D二聚体含量在一定范围内成正比,可以在400~800nm的波长下进行检测,检测更为方便,容易在临床中应用。
2.聚苯乙烯胶乳微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼或者环氧基等,其表面的官能团可以和抗体表面的氨基等结合形成共价偶联结构,使D二聚体单克隆抗体牢固的结合在胶乳微球表面,保证了R2的稳定性,延长了试剂有效期。
3.采用粒径为100~500nm的两种聚苯乙烯胶乳颗粒,一种具有较大的粒径,增加了血液中D二聚体和D二聚体抗体反应时的浊度,从而增加测试反应的灵敏度;一种粒径较小,保证试剂的线性。
4.在制备过程中,采用改进的一步法交联胶乳与抗体,即保证了抗体的交联效果,又保证抗体的活性,简化了操作方式,有利于生产的进行。
附图说明
图1为本发明D二聚体检测试剂盒实施例的校准曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,Secondedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates;theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego,1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999等。
实施例1:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取1.9g水苏糖、0.5g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠、1.8g甘氨酸、27gNaCl、35gPEG8000、0.5g叠氮钠、10g牛血清白蛋白和1.42gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.4,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为7.4、浓度为50mmol/L的PBS缓冲液将上述洗涤过的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.01g的EDC,在室温下搅拌反应60min,反应结束后离心并用PBS缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,37℃下搅拌反应4h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
实施例2:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取1.9g水苏糖、0.5g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠、1.8g甘氨酸、30gNaCl、50gPEG8000、0.5g叠氮钠、50g牛血清白蛋白和7.1gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.4,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为6.5、浓度为100mmol/L的MES缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为3%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.01g的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后离心并用PBS缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,室温下搅拌反应8h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
实施例3:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取1.9g水苏糖、0.5g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠、1.8g甘氨酸、15gNaCl、24gPEG8000、0.5g叠氮钠、10g牛血清白蛋白和7.1gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.4,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为6.0、浓度为100mmol/L的MES缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为2%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.02g的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后离心并用PBS缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,室温下搅拌反应8h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
实施例4:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取1.9g水苏糖、0.5g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠、1.8g甘氨酸、9gNaCl、50gPEG8000、0.5g叠氮钠、5g牛血清白蛋白和1.42gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.6,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为6.5、浓度为100mmol/L的MES缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为3%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.03g的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后离心并用MES缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,室温下搅拌反应4h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
实施例5:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取1.9g水苏糖、0.5g明矾、1.9g果糖二磷酸钠、0.3g六偏磷酸钠、1.8g甘氨酸、27gNaCl、15gPEG8000、0.5g叠氮钠、5g牛血清白蛋白和1.42gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.0,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为7.5、浓度为100mmol/L的mops缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为0.5%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.03g的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后离心并用mops缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,室温下搅拌反应8h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
对比例:
一种D二聚体胶乳增强免疫比浊检测试剂盒,包含如下制备步骤:
(1)试剂R1的制备:
称取19gMops、27gNaCl、15gPEG8000、0.5g叠氮钠、5g牛血清白蛋白和1.42gEDTA溶于0.8L蒸馏水中,调节pH至7.0,定溶1L即得试剂R1。
(2)试剂R2的制备:
用pH为7.5、浓度为100mmol/L的mops缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为0.5%。向1L上述胶乳稀释液中加入0.03g的EDC,在室温下搅拌反应30min,反应结束后离心并用mops缓冲液洗涤除去未反应的EDC,然后加入D二聚体抗体,室温下搅拌反应8h后,加入终止液4h终止反应,将得到的反应液15000rpm离心、洗涤,最后用40g/LNaCl、50g/LPEG8000、0.5g/L叠氮钠、50g/L牛血清白蛋白、25mM甘氨酸,pH=7.4的缓冲液2(水溶液)将胶乳重悬,超声后即得R2。
测试结果:
对上述5个实施例及对比例制备的试剂用贝克曼AU480全自动生化仪进行测试,测试波长为6000nm,取样本或校准品4uL,再加入120uL的试剂R1,37℃恒温5min,然后加入40ul试剂R2,20s后读取吸光度A1,37℃孵育4分40秒后读取吸光度A2,则反应吸光度ΔA=A2-A1;首先使用标准品进行多点定标,并用样条函数进行计算,得到定标曲线,如图1所示。样本通过其吸光度变化,与标准曲线进行对比即可得到样本中PCT浓度。对上述5个实施例和对比例进行了分析灵敏度、准确度、精密性以及稳定性等进行了验证,验证结果如表1所示:
表1
根据其测试结果可知,在本发明参数范围内制得的检测试剂,均能够具备较好的分析灵敏度、准确度、精密性和稳定性,其中实施4为最优实施例,可以最好地提高试剂测试效果。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。