CN109212204A - 一种乳胶免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒 - Google Patents

一种乳胶免疫比浊法测定d-二聚体含量的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乳胶免疫比浊法测定D‑二聚体含量的试剂盒，包括抗人D‑二聚体抗体乳胶，所述乳胶为平均粒径为300nm和60nm的聚苯乙烯乳胶微球按体积比8‑4:1混合而成。所述抗人D‑二聚体抗体乳胶是由聚苯乙烯乳胶与抗人D‑二聚体抗体经化学交联而成。本发明提供的试剂盒检测限低于现有同类试剂盒，检测的线性范围、相关性与灵敏度均高于现有试剂盒，显著提高了D‑二聚体检测的灵敏度，扩大了D‑二聚体测定的线性范围，解决了现有D‑二聚体测定试剂盒检测灵敏度、精密度低，线性范围窄的问题。

Description

一种乳胶免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术及医学检验领域，具体涉及一种测定D-二聚体含量的试剂盒。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统，当纤维蛋白凝结块形成时，在纤溶酶原激活剂的存在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始。纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，其中D-二聚体（D-Dimer）是交联纤维蛋白的特异性降解产物，也是降解产物中最小的片段。血浆中D-二聚体水平增高则说明存在继发性纤溶过程，先生成凝血酶，后又有纤溶系统的活化，也反映出在血栓形成的局部纤溶酶活性或浓度超过血浆2‰抗纤溶酶活性或浓度。D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果，并可用于诊断、筛选新形成的血栓。
在血浆中，采用针对D-二聚体的抗体可以很容易的检测D-二聚体含量，其反映出的特异性并不是指在某一特定的具体疾病中的表现，而是针对有凝血和纤溶过程的这一大类疾病的共同病理特点，其生成或增高反映了凝血和纤溶系统的双重激活，可作为体内血栓形成的重要指标之一，也是目前鉴别原发性和继发性纤溶以及监测溶栓治疗等方面颇有价值的重要指标。因此，D-二聚体（D-Dimer）的测定对血栓形成性疾病如：弥散性血管内凝血（DIC）、深静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）、脑血管疾病、心肌梗死、重症肝炎等均有重要的诊断价值，具有重要的临床意义。
血浆中D-二聚体含量升高可对血栓类疾病进行系统的筛查和治疗监测，及早发现此类疾病，并且越早治疗效果越好，对于预防血栓类疾病，保护身体健康具有极大的实用价值。D-二聚体（D-Dimer）含量检测有着极其重要的意义，体外测定其指标可为相关疾病治疗提供指导数据。
目前，血浆D-二聚体抗原的测定方法主要有胶乳凝集试验法、酶联免疫吸附试验（ELISA）法、光电散射比浊试验法、胶体金免疫渗透试验(GIA )和乳胶免疫比浊法等。ELISA法具有定量、敏感性高等优点，但操作较为繁琐、费时，不适合单份标本测定；光电散射比浊法具有高敏感性和特异性，但需要有大型设备。此外，现有市售D-二聚体测定试剂盒多存在胶乳不稳定，测定灵敏度、精密度低以及线性范围窄的缺陷。
发明内容
针对现有D-二聚体测定试剂盒存在胶乳不稳定，测定灵敏度、精密度低，线性范围窄的缺陷，本发明提供一种双粒径乳胶D-二聚体测定试剂盒，稳定性好，灵敏度、精密度高，线性范围较宽。
本试剂盒使用仪器为全自动凝血分析仪。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种乳胶免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒，包括抗人D-二聚体抗体乳胶，所述乳胶为平均粒径为300nm和60nm的聚苯乙烯乳胶微球按体积比8-4:1混合而成；优选为4:1。
所述抗人D-二聚体抗体乳胶是由聚苯乙烯乳胶与抗人D-二聚体抗体经化学交联而成；包括以下步骤：
（1）先加入NHS（N-羟基丁二酰亚胺）溶液，再加入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液对聚苯乙烯乳胶进行活化；
（2）抗人D-二聚体抗体与步骤（1）获得的活化聚苯乙烯乳胶在缓冲液中反应，获得含包被抗人D-二聚体抗体的聚苯乙烯乳胶的液体；
（3）将乙醇胺加入步骤（2）的液体中反应，然后分离纯化得抗人D-二聚体抗体乳胶。
所述NHS、EDC和聚苯乙烯乳胶的浓度分别为0.02g/L、0.05g/L、5%。
所述抗人D-二聚体抗体和活化聚苯乙烯乳胶的体积比为1:86。
所述乙醇胺和包被抗人D-二聚体抗体的聚苯乙烯乳胶的体积比为1:10。
优选的，上述试剂盒，包括：
试剂R1：0.1-0.3mol/L Tris-HCl缓冲液，0.4-0.6mol/L氯化钠，0.01-0.03%wtProClin300；和
试剂R2：4-6%（w/v）抗人D-二聚体抗体乳胶，0.4-0.6mol/L氯化钠，1-3%wt牛血清白蛋白，0.01-0.03%wtProClin 300；
所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.1-7.7。
更为优选的，上述试剂盒，包括：
试剂R1：0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，0.5 mol/L氯化钠，0.02%wtProClin 300；和
试剂R2：5%（w/v）抗人D-二聚体抗体乳胶，0.5mol/L氯化钠，1%wt牛血清白蛋白，0.02%wtProClin 300；
所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。
本发明具有以下优点：
本发明提供的试剂盒检测限低于现有同类试剂盒，检测的线性范围、相关性与灵敏度均高于现有试剂盒，显著提高了D-二聚体检测的灵敏度，扩大了D-二聚体测定的线性范围，解决了现有D-二聚体测定试剂盒检测灵敏度、精密度低，线性范围窄的问题。
附图说明
图1为实施例1中试剂盒检测D-二聚体的线性回归曲线；
图2为对比例1中试剂盒检测D-二聚体的线性回归曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 试剂盒的配制。
试剂配制
Tris缓冲液浓度为0.1mol/L，用浓盐酸调节pH至7.4。再加入氯化钠、ProClin 300，使其终浓度分别为：0.5mol/L、0.02%。其中，Tris缓冲液起到稳定反应体系pH值的作用，而氯化钠为反应体系提供离子环境，ProClin 300作为防腐剂在反应体系中起作用。
试剂配制
（1）量取纯化水2L，分别称取磷酸二氢钾27.218g和氯化钠58.44g，加入2L纯化水中，室温下充分溶解，得磷酸盐缓冲液。
（2）将100mL磷酸盐缓冲液加入到40mL粒径为300nm的聚苯乙烯乳胶颗粒中，再加入10mL粒径为60nm的聚苯乙烯乳胶颗粒；
（3）加入NHS 0.02g充分溶解，再加入0.05g EDC，室温反应30分钟，不断搅拌；
（4）12000rpm离心30分钟，弃上清，收集离心沉淀；用磷酸盐缓冲液洗涤两次，离心沉淀后，弃上清；
（5）用100mL磷酸盐缓冲液重新悬浮聚苯乙烯乳胶颗粒，超声30分钟使其分散；
（6）将0.581mL抗人D-二聚体抗体溶于磷酸盐缓冲液中，加入上述活化好的聚苯乙烯乳胶颗粒溶液，包被2h；
（7）在包被好的抗体乳胶中，加入5mL乙醇胺，搅拌10分钟；
（8）12000rpm离心30分钟，弃上清。用磷酸盐缓冲液洗涤两次，离心沉淀后，弃上清。用100mL磷酸盐缓冲液重新悬浮抗人D-二聚体抗体乳胶，超声20分钟分散；
（9）加入10g BSA和0.2g ProClin 300，充分溶解后，加入900mL的磷酸盐缓冲液，即得R2试剂。
实施例2 利用试剂盒测定D-二聚体。
采用全自动凝血分析仪进行测定，检测条件如下：检测温度：37℃；检测波长：575nm；反应时间：R1试剂：30s，R2试剂：90s；试剂用量：R1试剂：100µL，R2试剂：100µL；样本用量：30µL。
检测限
实施例1制得的试剂盒测试5%牛血清白蛋白溶液，重复测试20次，计算20次均值为0.05，标准差为0.02，计算得出本试剂盒检测限可达0.09µg/mL FEU，检测灵敏度较高。
表1 实施例1中试剂盒的检测限
。
重复性
用正常质控血浆和异常质控血浆分别加载至检测分析系统上，在重复性条件下测试质控血浆，重复测定10次，分别计算平均值和标准差，计算得出变异系数。所得结果正常质控血浆变异系数为5%，异常质控血浆变异系数为3%。
表2 实施例1中试剂盒的重复性
。
线性相关性
将接近D-二聚体线性范围上限的高浓度样品，用缓冲液将其按1、5/6、1/2、1/4、1/8、1/12稀释，共配制成6个不同浓度的溶液（xi），用检测样品所用方法检测6个不同溶液中D-二聚体含量，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以测定结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程。所得结果线性回归方程为y=32.247x-1.6379，线性回归曲线如图1所示，相关系数r为0.9984，表明实施例1制备的试剂盒在线性范围内相关性较好。
表3 实施例1中试剂盒的线性范围
。
对比例1现有乳胶免疫比浊法D-二聚体含量测定试剂盒。
采用市购乳胶免疫比浊法D-二聚体含量测定试剂盒进行测定，检测限、重复性与线性相关性的测定方法如实施例2所述。
检测限
表4 现有试剂盒的检测限
检测限为0.19µg/mL FEU，大于实施例1制备的试剂盒，检测灵敏度较低。
重复性
表5 现有试剂盒的重复性
现有试剂盒正常质控血浆变异系数（CV）为8.37%，异常质控血浆变异系数（CV）为5.26%，均大于实施例1制备的试剂盒，精密度低于实施例1制备的试剂盒。
线性
表6 现有试剂盒的线性范围
现有试剂盒线性范围为0.25-5.00µg/mL FEU，且线性回归曲线如图2所示，其相关系数为0.9981，比实施例1制备的试剂盒线性范围窄，相关性差。
本发明实施例1制备的试剂盒检测限低于现有D-二聚体含量测定试剂盒，检测灵敏度显著高于现有试剂盒；重复性变异系数（CV）大于现有试剂盒，精密度高；线性范围比现有试剂盒宽，相关性好；表明本发明公开试剂盒显著拓宽了D-二聚体检测的线性范围，提高了其灵敏度及精密度。

Claims (8)

1.一种乳胶免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒，其特征在于，包括抗人D-二聚体抗体乳胶，所述乳胶为平均粒径为300nm和60nm的聚苯乙烯乳胶微球按体积比8-4:1混合而成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述乳胶为平均粒径为300nm和60nm的聚苯乙烯乳胶微球按体积比4:1混合而成。
3.根据权利要求1或2任一所述的试剂盒，其特征在于，抗人D-二聚体抗体乳胶是由聚苯乙烯乳胶与抗人D-二聚体抗体经化学交联而成，包括以下步骤：
（1）依次加入NHS和EDC对聚苯乙烯乳胶进行活化；
（2）抗人D-二聚体抗体与步骤（1）获得的活化聚苯乙烯乳胶在缓冲液中反应，获得含包被抗人D-二聚体抗体的聚苯乙烯乳胶的液体；
（3）将乙醇胺加入步骤（2）的液体中反应，然后分离纯化得抗人D-二聚体抗体乳胶。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，NHS、EDC和聚苯乙烯乳胶的浓度分别为0.02g/L、0.05g/L和5%。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，抗人D-二聚体抗体和活化聚苯乙烯乳胶的体积比为1:86。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，乙醇胺和包被抗人D-二聚体抗体的聚苯乙烯乳胶的体积比为1:10。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括：
试剂R1：0.1-0.3mol/L Tris-HCl缓冲液，0.4-0.6mol/L氯化钠，0.01-0.03%wtProClin 300；和
试剂R2：4-6%（w/v）抗人D-二聚体抗体乳胶，0.4-0.6mol/L氯化钠，1-3%wt牛血清白蛋白，0.01-0.03%wtProClin 300；
所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.1-7.7。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括：
试剂R1：0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，0.5 mol/L氯化钠，0.02%wt ProClin 300；和
试剂R2：5%（w/v）抗人D-二聚体抗体乳胶，0.5mol/L氯化钠，1%wt牛血清白蛋白，0.02%wt ProClin 300；
所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4。
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