CN111999506A - 一种d-二聚体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种D‑二聚体检测试剂盒，涉及医学免疫体外诊断技术领域，本发明包括R1和R2试剂；R1试剂为：30‑150mm/L磷酸盐缓冲液、0.5‑2g/L聚乙二醇‑10000、0.8‑0.9g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；R2试剂为：0.5‑2mg/mL鼠抗人D‑二聚体单克隆抗体胶乳、10‑50mmol/L 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.9‑8g/L氯化钠、1‑5g/L牛血清白蛋白、0.1‑0.3g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。本发明还提供上述试剂盒的制备方法。本发明的有益效果在于：本发明中的试剂盒与现有技术中的试剂盒相比，试剂盒的稳定性明显增加。

Description

一种D-二聚体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断技术领域，具体涉及一种D-二聚体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统，它对保持血管壁的正常通透性，维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用。血液中含有纤维蛋白，当纤维蛋白凝结块形成时，在纤溶酶原激活剂的作用下，纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶降解纤维蛋白和交联纤维蛋白形成各种可溶片段。其中，D-二聚体是交联纤维蛋白特异的降解产物，是最小的降解产物。
在正常生理状态下，人体内的凝血与纤溶系统保持着动态平衡。当平衡被破坏时，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白聚集形成凝结块，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增加。因此D-二聚体的生成或增高反映了凝血与纤溶系统的双重激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一，也是目前鉴别原发性和继发性纤溶以及监测溶栓治疗等方面颇有价值的重要指标。因此，D-二聚体的检测对血栓形成性疾病如：弥散性血管内凝血(DIC)、深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)、脑血管疾病、心肌梗死、重症肝炎等均有重要的诊断价值及临床意义。
目前，D-二聚体的检测方法主要有：乳胶凝集法、酶联免疫吸附(ELISA)法、荧光抗体检测法、胶体金免疫渗透试验(GIA)和乳胶免疫比浊法等。其中，乳胶凝集法操作简便、用时短，但主要依靠肉眼来观察检测的结果，对检测结果的判断具有一定的主观性，只能用于定性或半定量测定，临床上应用范围较小；ELISA法具有定量、高敏感性等优点，但此方法操作复杂，用时较长，不适用于单标本检测；荧光抗体检测法与ELISA法具有一致性，在单个标本的临床检测中极为适用，但是检测时需要昂贵的仪器，在临床使用具有较大限制性；胶体金免疫渗透法具有操作简便、检测用时短、灵敏度高等优点，但此检测方法受类风湿因子、胆红素等干扰影响；乳胶免疫比浊法具有操作简便、快速、定量准确及敏感度高等优点，可满足门急诊等需要，在临床研究中应用越来越广泛。
公开号为CN106093419A的专利申请公开一种测定D-二聚体的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，但是该试剂盒的稳定性较差，限制了D-二聚体试剂盒的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有的D-二聚体的试剂盒稳定性较差，限制了D-二聚体试剂盒的应用。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
本发明提供一种D-二聚体检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂主要由以下浓度的原料制成：30-150mm/L磷酸盐缓冲液、0.5-2g/L聚乙二醇-10000、0.8-0.9g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；
所述R2试剂主要由以下浓度的原料制成：0.5-2mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、10-50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.9-8g/L氯化钠、1-5g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
有益效果：本发明中的D-二聚体的试剂盒与公开号为CN106093419A的专利申请中公开的D-二聚体的试剂盒相比，试剂盒的稳定性明显增加。
本发明中的试剂盒在37℃加速稳定可以保存20天，开瓶后可以保存30天，而公开号为CN106093419A的专利申请中公开的D-二聚体的试剂盒开瓶15天后准确度明显降低。
优选地，所述R2试剂具体由以下浓度的原料制成：0.5mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、8g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、0.1g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
有益效果：采用上述原料配比R2试剂的试剂盒，可以明显提高试剂盒的稳定性。
优选地，所述R1试剂中磷酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
优选地，所述R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
优选地，所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合，加入纯化水、牛血清白蛋白和叠氮钠，搅拌后置于37-52℃条件下搅拌封闭1.5h，然后往封闭完成的溶液中加入氯化钠，混合搅拌后即制得R2试剂。
优选地，所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与粒径为180-300nm的羧化改性聚苯乙烯乳胶颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
优选地，所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将粒径为180-300nm的聚苯乙烯微球置于40mL纯化水中，得到终浓度为0.16g/L的微球稀释溶液；
(2)以纯水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到浓度为0.02112mg/mL的碳化二亚胺溶液、0.02112mg/mL琥珀酰亚胺溶液；
(3)以步骤(1)微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按50％的活化比例将EDC/NHS溶液加入微球稀释溶液中，室温搅拌活化15min，磁力搅拌速度为15r/min，得到活化的聚苯乙烯微球溶液；
(4)D-二聚体单抗溶液的制备：将D-二聚体单克隆抗体用pH7.5、浓度5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释至终浓度为0.08mg/mL，溶液体积为40mL；
(5)将D-二聚体单抗溶液加入步骤(3)活化的聚苯乙烯微球溶液中，混合后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为15r/min；
(6)偶联结束后，离心弃去上清，洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
优选地，所述R1试剂的制备方法包括以下步骤：往磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、聚乙二醇-10000、叠氮钠和纯化水，混合后，即制得R1试剂。
优选地，所述D-二聚体检测试剂盒中还包括D-二聚体校准品稀释液和D-二聚体校准品；
所述D-二聚体校准品稀释液主要由以下浓度的原料制成：1-3g/L血清白蛋白、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；
所述D-二聚体校准品包括D-二聚体抗原。
有益效果：校准品在体外诊断临床检测中起到检测和监督检验结果具有准确性和一致性的作用。
本发明还提供一种D-二聚体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)R1试剂制备：往磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、聚乙二醇-10000和叠氮钠，混合后，即制得R1试剂；
(2)R2试剂制备：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合，加入纯化水、牛血清白蛋白和叠氮钠，搅拌后置于37-52℃条件下搅拌封闭1.5h，然后往封闭完成的溶液中加入氯化钠，混合搅拌后即制得R2试剂。
有益效果：R2试剂采用高温封闭法，将添加有牛血清白蛋白和叠氮钠的R2试剂置于52℃磁力水浴箱中封闭1.5h，牛血清白蛋白和叠氮钠可起到降低乳胶颗粒表面张力，保护交联到乳胶颗粒表面的抗体的稳定性，调节胶乳颗粒表面电荷量等作用；高温可改变交联到免疫乳胶颗粒表面的抗体的空间结构，增加牛血清白蛋白、叠氮钠和氯化钠对免疫乳胶试剂的稳定作用。
优选地，所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与粒径为180-300nm的羧化改性聚苯乙烯乳胶颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
优选地，所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将粒径为180-300nm的聚苯乙烯微球置于40mL纯化水中，得到终浓度为0.16g/L的微球稀释溶液；
(2)以纯水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到浓度为0.02112mg/mL的碳化二亚胺溶液、0.02112mg/mL琥珀酰亚胺溶液；
(3)以步骤(1)微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按50％的活化比例将EDC/NHS溶液加入微球稀释溶液中，室温搅拌活化15min，磁力搅拌速度为15r/min，得到活化的聚苯乙烯微球溶液；
(4)D-二聚体单抗溶液的制备：将D-二聚体单克隆抗体用pH7.5、浓度5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释至终浓度为0.08mg/mL，溶液体积为40mL；
(5)将D-二聚体单抗溶液加入步骤(3)活化的聚苯乙烯微球溶液中，混合后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为15r/min；
(6)偶联结束后，离心弃去上清，用50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸储存液洗涤，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
优选地，所述R1试剂中磷酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
优选地，所述R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
本发明的优点在于：
本发明中的D-二聚体的试剂盒与公开号为CN106093419A的专利申请中公开的D-二聚体的试剂盒相比，试剂盒的稳定性明显增加。
本发明中的试剂盒在37℃加速稳定可以保存20天，开瓶后可以保存30天，而公开号为CN106093419A的专利申请中公开的D-二聚体的试剂盒开瓶15天后准确度明显降低。
本发明试剂盒特异性好，不易受干扰；本发明试剂盒灵敏度高、重复性好、定量准确，最低检测限可达到0.03mg/L。
本发明试剂盒操作快速、简单，从检测至采集结果只需5-10分钟，可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，临床应用广泛。
附图说明
图1为本发明实施例1中试剂盒的校准曲线；
图2为本发明实施例1中试剂盒的线性范围相关性图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
D-二聚体检测试剂盒及其制备方法
D-二聚体检测试剂盒包括彼此独立的R1试剂和R2试剂，其中R1试剂为：50mmol/L磷酸盐缓冲液、1g/L聚乙二醇-10000、0.9g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；其中磷酸盐缓冲液的pH值为7。
R2试剂为：0.5mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、8g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、0.1g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
本实施例中鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法包括以下步骤：
(1)将粒径为273nm的聚苯乙烯微球置于40mL纯化水中，得到终浓度为0.16g/L的微球稀释溶液；
(2)以纯水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到浓度为0.02112mg/mL的碳化二亚胺溶液、0.02112mg/mL琥珀酰亚胺溶液；
(3)以步骤(1)微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按50％的活化比例将EDC/NHS溶液加入微球稀释溶液中，室温搅拌活化15min，磁力搅拌速度为15r/min，得到活化的聚苯乙烯微球溶液；
(4)鼠抗人D-二聚体单克隆抗体溶液的制备：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体用pH7.5、浓度5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释至终浓度为0.08mg/mL，溶液体积为40mL；
(5)将D-二聚体单抗溶液加入步骤(3)活化的聚苯乙烯微球溶液中，混合后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为15r/min；
(6)偶联结束后，离心弃去上清，洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
R1试剂的制备方法包括以下步骤：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾加入水中，磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的质量比为10:1，然后加入0.9g/L氯化钠、1g/L聚乙二醇-10000、0.1g/L叠氮钠，然后用5M氢氧化钠调节pH值为7.0。
R2试剂的制备方法包括以下步骤：将0.5mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳与50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合，于1000Kpa40r/min均质两次，加入100mL纯化水中，再加入3g/L牛血清白蛋白、0.1g/L叠氮钠，搅拌混匀后在52℃磁力水浴箱中搅拌封闭1.5h；在封闭完成的溶液中加入8g/L氯化钠混匀，即得R2试剂。
实施例2
本实施例与实施例1的区别之处在于：R1试剂为30mmol/L磷酸盐缓冲液、0.5g/L聚乙二醇-10000、0.8g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；其中磷酸盐缓冲液的pH值为6.5。
R2试剂为0.5mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.9g/L氯化钠、1g/L牛血清白蛋白、0.1g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
实施例3
本实施例与实施例1的区别之处在于：R1试剂为90mmol/L磷酸盐缓冲液、1g/L聚乙二醇-10000、0.85g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；其中磷酸盐缓冲液的pH值为6.5。
R2试剂为1mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、30mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、4.5g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、0.2g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
实施例4
本实施例与实施例1的区别之处在于：R1试剂为150mmol/L磷酸盐缓冲液、2g/L聚乙二醇-10000、0.9g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；其中磷酸盐缓冲液的pH值为6.5。
R2试剂为2mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、8g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、5g/L吐温20、0.3g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
对比例1
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)。
对比例2
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。
对比例3
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液为-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)。
对比例4
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂中牛血清白蛋白、氯化钠、吐温20的质量体积浓度分别如表1所示，各组分别命名为1组-12组。
表1为本对比例中牛血清白蛋白、氯化钠、吐温20的质量体积浓度
Figure BDA0002642508190000111
对比例5
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂制备过程中，搅拌混匀后在37℃磁力水浴箱中搅拌封闭1.5h。
对比例6
本对比例与实施例1的区别之处在于：R2试剂制备过程中，搅拌混匀后在42℃磁力水浴箱中搅拌封闭1.5h。
实施例5
对实施例1中的D-二聚体检测试剂盒的性能进行测定
(一)样本来源：合肥长征医院检验科收集的若干份枸橼酸钠抗凝新鲜血浆，用本发明D-二聚体检测试剂盒检测出样本值后，按照D-二聚体低、中、高值范围进行混合，其中低值范围的D-二聚体浓度为0.5-2.0mg/L，中值范围的D-二聚体浓度为3.0-5.0mg/L，高值范围的D-二聚体浓度为6.0-12.0mg/L，得到3份枸橼酸钠抗凝的血浆样本。每份样本用冻存管分装，每管150ul，储存在-20℃。
(二)测定方法：全自动生化分析仪参数设置
(1)检测温度：37℃；
(2)检测波长：主波长570nm；
(3)反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(4)反应方向：正反应。
(三)检测步骤
(1)取240μl试剂R1与12μl待测样本混匀；
(2)将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育1min；
(3)加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1。
(4)根据样本中
Figure BDA0002642508190000121
(三)测定项目
(1)定标：使用校准品进行定标，定标方法为别取不同浓度的校准品溶液(12ul)，在37℃反应30秒后加入D-二聚体R1(240ul)，再反应60秒后加入D-二聚体R2(60ul)，测定反应第10秒、第90秒的吸光度值(A1,A2)，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，每管重复测定2次，将各校准管2次测得的吸光度差值ΔA的均值为纵坐标，对应浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线。
(2)线性范围检测：用接近线性区间下限的低浓度样本(L)稀释接近线性区间上限的高浓度样本(H)，混合成至少5个稀释浓度(Xi)。用试剂盒分别测试以上样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出测试结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程，同时计算线性偏差或相对偏差。
(3)重复性测定：对同一待测样本进行多次反复测定，对所得结果进行SD和CV的计算。
(4)检测限测定：检测限是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限或最小检出浓度，有时也称分析灵敏度。实验方法：重复测定空白样本(5％牛血清或人血清白蛋白溶液)20次，计算20次结果的均值
Figure BDA0002642508190000131
与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限
Figure BDA0002642508190000132
(四)测定结果
(1)校准曲线如图1所示，y＝0.0362x+0.0008，相关系数r>0.99。
(2)线性范围如表1和图2所示，该发明试剂盒说明书中的线性范围为0.1-12mg/L。
表1为线性范围测定结果表
Figure BDA0002642508190000133
(3)表2为对高值样本标本、中值样本标本、低值样本标本的重复测定结果，可以看出，本发明试剂盒的精密度较好。
表2为重复性测定结果表
Figure BDA0002642508190000134
Figure BDA0002642508190000141
(4)表3为检测限测定结果，从表3可以看出，本发明试剂盒最低检测限可达到0.03mg/L。
表3为检测限测定结果表
Figure BDA0002642508190000142
实施例6
对实施例1-实施例4、对比例1-6中的D-二聚体检测试剂盒的稳定性进行测定。
(一)样本来源：合肥长征医院检验科收集的若干份枸橼酸钠抗凝新鲜血浆，用本发明D-二聚体检测试剂盒检测出样本值后，按照D-二聚体低、中、高值范围进行混合，其中低值范围的D-二聚体浓度为0.5-2.0mg/L，中值范围的D-二聚体浓度为3.0-5.0mg/L，高值范围的D-二聚体浓度为6.0-12.0mg/L，得到3份枸橼酸钠抗凝的血浆样本。每份样本用冻存管分装，每管150ul，储存在-20℃。
(二)测定方法：采用实施例5中的测定方法和检测步骤。
(1)加速破坏稳定性研究：取足量R1试剂和R2试剂分别置于37℃、恒温水浴箱中水浴若干天进行加速稳定性实验，分别在第1、3、5、7、10、17、20天取出水浴箱中的R1和R2试剂，在日立7180全自动生化分析仪分别对上述冻存的3份高中低值混合血浆及试剂配套质控品进行测定，每个样本测定2次，以所得数据的均值作为此时间点的测定结果。
(2)开瓶稳定性研究：取足量R1试剂和R2试剂，开盖置于7180全自动生化分析仪试剂仓中若干天进行开瓶稳定性实验，分别在第1、3、6、9、13、16、20、25、30天在日立7180全自动生化分析仪上对开盖的R1和R2试剂进行混合血浆及试剂配套质控品测定，每个样本测定2次，以所得数据的均值作为此时间点的测定结果，其中质控品为已知的浓度含量，用仪器测量来鉴定该仪器测量结果是否准确。
(3)稳定性评价及统计学分析：采用微软Excel2003软件进行统计学分析。根据中国医药行业标准及企业内部产品技术要求：加速破坏稳定性实验37℃水浴加热7天，测量结果的相对偏差小于10％，则可判为试剂较为稳定，通常相当于试剂在4℃冷藏储存的有效期时长在8个月到一年；开瓶稳定性要求试剂开盖15天，测定结果相对偏差要小于10％。
(三)测定结果：表4为实施例1、对比例1-对比例3中试剂盒的加速稳定性测定结果。
表4为实施例1、对比例1-对比例3中R2试剂的加速稳定性测定结果
Figure BDA0002642508190000151
Figure BDA0002642508190000161
从表4可以看出，实施例1中采用20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)，经过稳定性加速试验后，对试剂盒的测定结果影响最小。
表5为对比例4中各组的稳定性测定结果
Figure BDA0002642508190000162
Figure BDA0002642508190000171
从表5可以看出，第11组R2试剂的37℃加速稳定性最佳，其中第11组中氯化钠的质量体积比为8g/L、吐温-20的质量体积比为0.1g/L、牛血清白蛋白的质量体积比为3g/L。
表6为实施例1、对比例5和对比例6中R2试剂的加速稳定性测定结果
Figure BDA0002642508190000172
从表6可以看出，试剂R2在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲体系下，添加稳定剂成分为牛血清白蛋白、吐温-20和氯化钠，质量体积比分别为8g/L、0.1g/L和3g/L，并且通过52℃高温封闭，可以得到稳定性佳的胶乳试剂盒。其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液是一种两性离子有机化学缓冲剂，属于"Good"缓冲液，pKa值介于6.0和8.0之间，具有高溶解性，耐化学作用等特点；而稳定剂成分中的牛血清白蛋白能够对胶乳颗粒表面交联的抗体起到很好的胶体保护作用，且可与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成的影响；表面活性剂吐温-20可吸附在胶乳颗粒的表面，降低胶乳颗粒表面张力，使胶乳颗粒不易聚集；无机盐氯化钠可能调节胶乳颗粒表面电荷量，改变溶液的热力学性质，使得偶联在胶乳颗粒表面的抗体的稳定性得到增强；另外高温可改变交联到免疫乳胶颗粒表面的抗体的空间结构，增加稳定剂对免疫乳胶试剂的稳定作用。
表7为公开号为CN106093419A的专利申请中公开的试剂盒开瓶稳定性测定结果
Figure BDA0002642508190000181
从表7可以看出，随着开瓶时间的增加，试剂盒测定的相对偏差结果随之增大，且从开瓶第13天开始，相对偏差结果明显增加，表明试剂盒的稳定性较差。随着加速破坏时间的延长，试剂盒测定的相对偏差结果随之增大，同样表明试剂盒的稳定性较差。
表8为本发明实施例1中试剂盒稳定性的测定结果
Figure BDA0002642508190000191
从表8可以看出，本发明中的相对偏差测定结果均小于10％，表明本发明试剂盒较为稳定，其中相对偏差＝(37℃加速第n天的吸光度值—第1天的吸光度值)/第1天的吸光度值*100％。
实施例7
对R2试剂中的稳定剂的成分进行筛选
表9为稳定剂成分筛选表
Figure BDA0002642508190000201
其中1％BSA是指BSA的浓度为1g/L，0.1％吐温-20是指吐温-20的浓度为0.1g/L，其余类推。
测定结果如表10所示，表10为稳定剂部分筛选结果。
表10为稳定剂筛选结果表
Figure BDA0002642508190000202
从表10可以看出，当R2试剂中的稳定剂为8g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、0.1g/L吐温20时，试剂盒的稳定性最佳。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (11)

1.一种D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂主要由以下浓度的原料制成：30-150mm/L磷酸盐缓冲液、0.5-2g/L聚乙二醇-10000、0.8-0.9g/L氯化钠、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水；
所述R2试剂主要由以下浓度的原料制成：0.5-2mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、10-50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、0.9-8g/L氯化钠、1-5g/L牛血清白蛋白、0.1-0.3g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述R2试剂具体由以下浓度的原料制成：0.5mg/mL鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳、50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、8g/L氯化钠、3g/L牛血清白蛋白、0.1g/L吐温20、0.1g/L叠氮钠，溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
4.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合，加入纯化水、牛血清白蛋白和叠氮钠，搅拌后置于37-52℃条件下搅拌封闭1.5h，然后往封闭完成的溶液中加入氯化钠，混合搅拌后即制得R2试剂。。
5.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与粒径为180-300nm的羧化改性聚苯乙烯乳胶颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
6.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将粒径为180-300nm的聚苯乙烯微球置于40mL纯化水中，得到终浓度为0.16g/L的微球稀释溶液；
(2)以纯水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到浓度为0.02112mg/mL的碳化二亚胺溶液、0.02112mg/mL琥珀酰亚胺溶液；
(3)以步骤(1)微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按50％的活化比例将EDC/NHS溶液加入微球稀释溶液中，室温搅拌活化15min，磁力搅拌速度为15r/min，得到活化的聚苯乙烯微球溶液；
(4)D-二聚体单抗溶液的制备：将D-二聚体单克隆抗体用pH7.5、浓度5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释至终浓度为0.08mg/mL，溶液体积为40mL；
(5)将D-二聚体单抗溶液加入步骤(3)活化的聚苯乙烯微球溶液中，混合后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为15r/min；
(6)偶联结束后，离心弃去上清，洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
7.根据权利要求1所述的D-二聚体检测试剂盒，其特征在于：所述R1试剂的制备方法包括以下步骤：往磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、聚乙二醇-10000、叠氮钠和纯化水，混合后，即制得R1试剂。
8.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)R1试剂制备：往磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、聚乙二醇-10000和叠氮钠，混合后，即制得R1试剂；
(2)R2试剂制备：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液混合，加入纯化水、牛血清白蛋白和叠氮钠，搅拌后置于37-52℃条件下搅拌封闭1.5h，然后往封闭完成的溶液中加入氯化钠，混合搅拌后即制得R2试剂。
9.根据权利要求8所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法包括以下步骤：将鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与粒径为180-300nm的羧化改性聚苯乙烯乳胶颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
10.根据权利要求8所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将粒径为180-300nm的聚苯乙烯微球置于40mL纯化水中，得到终浓度为0.16g/L的微球稀释溶液；
(2)以纯水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到浓度为0.02112mg/mL的碳化二亚胺溶液、0.02112mg/mL琥珀酰亚胺溶液；
(3)以步骤(1)微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按50％的活化比例将EDC/NHS溶液加入微球稀释溶液中，室温搅拌活化15min，磁力搅拌速度为15r/min，得到活化的聚苯乙烯微球溶液；
(4)D-二聚体单抗溶液的制备：将D-二聚体单克隆抗体用pH7.5、浓度5mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液稀释至终浓度为0.08mg/mL，溶液体积为40mL；
(5)将D-二聚体单抗溶液加入步骤(3)活化的聚苯乙烯微球溶液中，混合后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为15r/min；
(6)偶联结束后，离心弃去上清，洗涤后，即制得鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳。
11.根据权利要求8所述的D-二聚体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述R2试剂中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的pH值为6.5-8.5。
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