CN107422129A - 一种超敏的心肌肌钙蛋白i磁微球免疫比浊检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种超敏的心肌肌钙蛋白i磁微球免疫比浊检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及临床试剂盒检测领域，具体涉及一种超敏的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法及检测试剂盒。所述试剂盒包括：反应稀释液试剂、偶联了cTnI抗体的磁微球试剂，cTnI校准品。本发明的心肌肌钙蛋白I检测方法及检测试剂盒与现有cTnI化学发光检测试剂盒的检测结果进行对比，经统计分析相关性良好，无显著差异，可以在临床上推广使用，为心肌肌钙蛋白I的检测提供了一个更好的选择。

Description

一种超敏的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法及检测 试剂盒
技术领域
本发明涉及临床试剂盒检测领域，具体涉及一种超敏的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法及检测试剂盒。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，cTnI具有高灵敏和较好组织特异性，已被临床广泛接受，不仅成为诊断急性心肌梗死的“金标准”，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察及预后评估的最合适标志物。
目前cTnI的检测方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光法、胶体金免疫层析法、金标银染法、胶乳增强免疫比浊等相关方法。胶乳增强免疫比浊法操作简单，成本较低，能够较好的结合全自动生化分析仪进行操作，方便快捷，适用于绝大多数医院，特别是对急诊能实现快速定量检测，为心肌梗死的早期诊断提供了重要依据。但目前产品具有分析灵敏度低的缺陷。
因此，临床需要敏感性高、特异性强、重复性好，高准确度、操作简便快捷，低成本的适合临床推广的心肌肌钙蛋白I的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的问题是进一步提高检测人体血清样本中cTnI含量的分析灵敏度，提供一种超敏的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法，可以用于精确测定血清样本中0～50ng/mL的cTnI含量。
本发明的另一目的是提供一种cTnI定量检测试剂盒。
根据本发明的具体实施方式的心肌肌钙蛋白I的检测方法，包括以下步骤：
⑴以磁性微球为载体，将心肌肌钙蛋白I抗体与磁性微球进行偶联，在相应的检测装置内，使待测样本与偶联有活性分子的磁性微球混合，得到混合物；
⑵对所得混合物进行温育培养，具有免疫特性的组分反应形成心肌肌钙蛋白I-心肌肌钙蛋白I抗体-磁微球复合物；
⑶监测心肌肌钙蛋白I与心肌肌钙蛋白I抗体-磁微球混合物在检测波长下吸光度的改变，吸光度的改变量与待检样本目标蛋白浓度成高度相关性，进而达到检测样本中目标蛋白的目的。
根据本发明的具体实施方式的心肌肌钙蛋白I的检测方法，其中，所述磁微球为超顺磁性纳米微球，粒径为50nm～1000nm。
偶联心肌肌钙蛋白I抗体的磁微球的粒径大小对于检测的灵敏度以及线性范围等有着非常显著的影响。小粒径的磁微球使试剂具有宽的检测范围，可以检测高浓度范围内待检测物的含量，但粒径过小，会造成反应速度变慢，且制备较为复杂，难度较高；而大粒径的磁微粒使试剂具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度范围内待检测物的含量，但粒径过大，会造成偶联物聚集沉降进一步影响测定结果。由此，根据本发明的技术方案，为保证所制备的检测试剂盒实现抗原抗体反应试验能够在一个较宽的范围内进行，并且能够保证有高灵敏度和高准确性，所采用的超顺磁性纳米微球的粒径优选为50nm～1000nm。
根据本发明的具体实施方式的心肌肌钙蛋白I的检测方法，其中，所述的心肌肌钙蛋白I抗体是与cTnI特异性结合的抗体，为单克隆抗体或多克隆抗体中，所述的cTnI单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体；所述cTnI多克隆抗体为含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体。
根据本发明的具体实施方式的心肌肌钙蛋白I的检测方法，其中，所述有活性的分子与磁性微球进行偶联是采用化学交联法制备得到。
根据本发明的心肌肌钙蛋白I的检测方法，在均相条件下，血清中心肌肌钙蛋白I与试剂中的磁微球偶联的特异性心肌肌钙蛋白I抗体相结合，形成抗原-抗体-磁微球复合物并产生混浊，在一定的抗体浓度范围内，其浊度高低与血清中心肌肌钙蛋白I的含量呈正比。通过测定一定波长的吸光度值，根据多点定标cTnI曲线即可求出血清中心肌肌钙蛋白I的含量。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，包括：反应稀释液试剂、偶联了cTnI抗体的磁微球试剂，以及用于形成校准曲线的已知cTnI浓度的校准品。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的反应稀释液试剂是由生物大分子和化学物质配制而成的能够提供本发明所需要的免疫学反应的且具有pH缓冲能力的溶液。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的反应稀释液试剂包含有稳定剂、促凝剂、表面活性剂和防腐剂，其中所述的稳定剂是牛血清白蛋白或明胶；促凝剂是蔗糖、聚蔗糖-400、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000或聚乙二醇20000中的一种或几种；表面活性剂是吐温-20、曲拉通X-100其中一种；防腐剂是Proclin300或叠氮钠；缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或MES溶液。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的反应稀释液试剂含稳定剂牛血清白蛋白，浓度为0.5～20g/L，促凝剂聚乙二醇8000，浓度为2～50ml/L，表面活性剂吐温-20，浓度为0.1～3ml/L，防腐剂Proclin300，浓度为0.5～5ml/L的，磷酸盐缓冲液，浓度为10～50mmol/L，调节试剂的pH值为7.0～9.0。优选的，稳定剂为5g/L的牛血清白蛋白，促凝剂为20ml/L聚乙二醇8000，表面活性剂为1ml/L的吐温20，防腐剂为1ml/L的proclin300，缓冲溶液为25mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述偶联了cTnI抗体的磁微球的粒径为50nm～1000nm，优选粒径100nm。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的cTnI抗体是与cTnI特异性结合的抗体，为单克隆抗体或多克隆抗体中的一种或几种；所述的cTnI单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体；所述cTnI多克隆抗体为含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体。优选cTnI单克隆抗体。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，偶联了cTnI抗体的磁微球的基质溶液中含有稳定剂、促凝剂、表面活性剂和防腐剂，其中所述的稳定剂是牛血清白蛋白、明胶、甘油、酪蛋白其中一种或几种；促凝剂是蔗糖、聚蔗糖-400、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000或聚乙二醇20000中的一种或几种；表面活性剂是吐温-20和/或曲拉通X-100；防腐剂是Proclin300或叠氮钠；缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或MES溶液。
为了达到更好的检测结果，其中所述偶联了cTnI抗体的磁微球的基质溶液包括：稳定剂牛血清白蛋和酪蛋白为0.5g/L～20g/L，促凝剂蔗糖和聚蔗糖-400为2g/L～200g/L，表面活性剂吐温-20和曲拉通X-100 0.1g/L～10ml/L，防腐剂proclin3000.5g/L～5g/L，10～50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～10.0。优选的，稳定剂为5g/L的牛血清白蛋白和5g/L的酪蛋白，促凝剂为100g/L的蔗糖和50g/L的聚蔗糖-400，表面活性剂为1ml/L的吐温-20和1ml/L的曲拉通X-100，防腐剂为1ml/L的proclin300，缓冲溶液为25mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
根据本发明的技术方案，稳定剂主要作用是保护抗体的活性及防止磁微粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。
根据本发明的技术方案，反应稀释液试剂中的稳定剂优选为牛血清白蛋白，偶联了cTnI抗体的磁微球试剂中的稳定剂优选为牛血清白蛋白和酪蛋白。
根据本发明的技术方案，促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于磁微粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明通过筛选实验发现，反应稀释液试剂中添加聚乙二醇8000，偶联了cTnI抗体的磁微球试剂中添加蔗糖和聚蔗糖-400，能够有效提升检测灵敏度和线性范围。
根据本发明的技术方案，表面活性剂主要是促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散以提高检测的精密度，确保测定结果的重现性，同时减少样本浊度对检测结果的影响。因此，只要是具有增溶性质的表面活性剂都可作为本试剂盒中的表面活性剂。本发明的反应稀释液试剂中为吐温20，偶联了cTnI抗体的磁微球试剂中表面活性剂优选吐温-20和曲拉通X-100。防腐剂的作用是为了防止微生物的繁殖对试剂盒的品质带来不良影响，凡是能抑制微生物生长的物质均可作为本发明的防腐剂，经过优化，本发明的试剂盒中的防腐剂均优选为proclin300。
根据本发明的技术方案，缓冲溶液是为了维持反应体系pH值的稳定性，pH值中性的缓冲溶液更接近人体环境，利于抗原抗体的反应，在本发明的检测试剂盒中为了达到更好的检测效果，反应稀释液试剂和偶联了cTnI抗体的磁微球试剂的缓冲液均优选磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的cTnI校准品是由校准品稀释液和cTnI按照一定比例配制得到，其浓度范围为0ng/mL～50ng/mL。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的cTnI校准品重组人源cTnI蛋白或天然人源cTnI蛋白。
根据本发明的具体实施方式的cTnI定量检测试剂盒，其中，所述的校准品稀释液为含有10g/L的牛血清白蛋白和1ml/L的Proclin300的磷酸盐缓冲溶液。
磁性微球相比乳胶微球密度相对大，所以整个体系的稳定性是将磁性微球引入免疫比浊法检测中需要着重解决的问题。本发明中在合适离子强度的缓冲液、稳定剂、表面活性剂的选择上进行了很多尝试，最终得到适合于此体系的稳定剂、表面活性剂的缓冲液组合，从而保证在灵敏高、特异性强、重复性好、线性范围宽的前提下，整个体系稳定性好，操作简便快速，适于临床应用。
本发明的技术方案具有以下优点：
(1)首次将磁性微球引入免疫比浊法检测中，应用超敏磁性微球免疫比浊技术对cTnI蛋白标志物进行检测；
(2)采用超顺磁性微球与cTnI抗体偶联，磁性分离替代了乳胶微球偶联过程中高速离心分离环节，可有效的去除游离抗体，去除其对反应的干扰；标记条件温和，最大可能地保护了抗体活性，相对胶乳增强免疫比浊试剂可以大幅度提高cTnI的检测灵敏度；采用磁性分离，操作简便快速，可大量制备，适合工业化生产。
(3)稳定剂、表面活性剂、促凝剂进行优化选择，对试剂的特异性、敏感性及稳定性有了进一步的提升:加入的牛血清白蛋白和酪蛋白两种物质，能够有效的保护单克隆抗体的活性和效价及防止磁性微球颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后效期；曲拉通X-100和吐温20的加入能促进试剂体系中各组分以及待检样本中各物质的均匀分散，可以提高检测的精密度，确保测定结果的重现性；聚乙二醇-8000、蔗糖和聚蔗糖-400的添加可以促进抗原抗体反应，有利于磁性微球交联复合物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。
根据本发明的心肌肌钙蛋白I的检测方法灵敏度高，最低检测浓度可以达到0.05ng/ml，特异性强、重复性好，能够满足临床检测需要。
根据本发明的心肌肌钙蛋白I试剂盒可以在现有多种生化分析仪上进行血清样本检测，操作简便快速，出具检测结果只需约10～15分钟，便于心肌梗死早期诊断，更适合在各级基层医疗机构普及和应用。
本发明的心肌肌钙蛋白I检测方法及检测试剂盒与现有cTnI化学发光检测试剂盒的检测结果进行对比，经统计分析相关性良好，无显著差异，可以在临床上推广使用，为心肌肌钙蛋白I的检测提供了一个更好的选择。
附图说明
图1显示根据本发明实施例1的心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒的线性范围验证；
图2显示根据本发明实施例1的心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒1与市售cTnI化学发光检测试剂盒检测结果的相关性比较。
具体实施方式
为了能够更清楚的理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。实施例仅是为范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各种仪器设备也是所述领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所述领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
具体步骤如下：
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白5g，聚乙二醇8000 20ml,吐温20 1ml,proclin300 1ml充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000ml，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白5g，酪蛋白5g，蔗糖100g,聚蔗糖-400 50g，吐温-20 1ml,曲拉通X-1001ml，proclin300 1ml充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000ml，即制成的基质液，密封保存备用。
⑶制备cTnI抗体与磁微球偶联物：将磁微球、EDC与NHS的质量比为1：1：1，并加入pH 5.0的50mM的MES溶液，使磁微球浓度为4mg/ml,放置在垂直旋转仪上活化，25℃室温避光反应30min。将活化后的磁微球与cTnI单克隆抗体质量比60：1进行混合，放置在垂直旋转仪上标记，25℃室温避光反应3h。将反应后的磁微球用pH 7.2的25mM的Tris-HCl盐洗液洗涤3次，磁力分离去上清喉，加入含有甘氨酸、5g/L牛血清白蛋白、0.5ml/L曲拉通X-100、pH7.4的磷酸盐缓冲液，是磁微球浓度为4mg/ml,放置在垂直旋转仪上终止，25℃室温避光反应2h。将终止后的磁微球用pH 7.2的25mM的Tris-HCl盐洗液洗涤3次，加入基质液，使偶联了cTnI抗体的磁微球浓度为4mg/ml,2～8℃保存。
⑷偶联了cTnI抗体的磁微球的制备：将偶联了cTnI抗体的磁微球与基质液按照一定比例混合，制成检测试剂盒所需要的偶联了cTnI抗体的磁微球的试剂；
⑸cTnI校准品的制备：
①校准品稀释液的配制：①量取纯化水200ml于配液容器中；②称量磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)1.25g溶于配液容器中，混匀；③称量磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)15.04g溶于配液容器中，混匀；④用0.45um滤膜过滤；⑤加纯化水至所需体积的3/4，混匀；⑥称取牛血清白蛋白(BSA)10g溶于配液容器中，混匀；⑦量取生物防腐剂(Proclin300)1.0ml溶于配液容器中，混匀；⑧用纯化水定容至1000ml；⑨测定pH7.4。
②将市售的人源cTnI蛋白用校准品稀释液配制成不同浓度梯度的校准品，采用药品监管部门批准上市的成熟试剂盒进行标定，每个浓度梯度检测3次，取检测结果的平均值，分别定值为0ng/mL(校准品稀释液，未添加cTnI蛋白)，0.5ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，50ng/mL。
⑹反应稀释液试剂、偶联了cTnI抗体的磁微球的试剂和cTnI校准品的分装:将上述步骤所得组分按照相应规格用合适的容器进行分装、贴签即为半成品。
⑺成品组装:抽出三盒经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒。
实施例2.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 50mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白20g，聚乙二醇8000 50ml,吐温20 3mL,proclin300 5mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 50mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白20g，酪蛋白20g，蔗糖200g,聚蔗糖-400 200g，吐温-20 10mL,曲拉通X-10010mL，proclin300 5mL充分混匀并溶解后用0.45um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
实施例3.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 10mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白0.5g，聚乙二醇8000 2mL,吐温20 0.1mL,proclin300 0.5mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 10mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白0.5g，酪蛋白0.5g，蔗糖2g,聚蔗糖-400 2g，吐温-20 0.1mL,曲拉通X-1000.1mL，proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
实施例4.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 50mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白10g，聚乙二醇8000 20ml,吐温20 2ml,proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 50mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白10g，酪蛋白10g，蔗糖100g,聚蔗糖-400 50g，吐温-20 5ml,曲拉通X-1005ml，proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
实施例5.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 20mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白2g，聚乙二醇8000 20ml,吐温20 0.5ml,proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 20mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白2g，酪蛋白2g，蔗糖100g,聚蔗糖-400 50g，吐温-20 0.5mL,曲拉通X-1000.5ml，proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
对比实施例1.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入聚乙二醇800020ml,吐温20 1mL,proclin300 1mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入蔗糖100g,聚蔗糖-400 50g，吐温-20 1mL,曲拉通X-100 1mL，proclin3001mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
对比实施例2.制备心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒
⑴制备反应稀释液试剂：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白25g，聚乙二醇8000 20mL,吐温20 4ml,proclin300 5mL充分混匀并溶解后用0.22um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，密封保存备用。
⑵制备偶联了cTnI抗体的磁微球的基质液：取800mL 25mM pH7.4磷酸盐缓冲液加入牛血清白蛋白25g，酪蛋白25g，蔗糖100g,聚蔗糖-400 50g，吐温-20 12ml,曲拉通X-10012mL，proclin300 5mL充分混匀并溶解后用0.45um微孔滤膜过滤，最终用相应的缓冲液定容至1000mL，即制成的基质液，密封保存备用。
其余步骤均与实施例1相同。
实验例1.本发明的心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒的使用方法
心肌肌钙蛋白I定量检测试剂盒检测样品中cTnI含量的检测方法具体操作如下：
1.自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟；
2.设置仪器参数：检测波长500nm，并将试剂和样本放在指定的位置上；
3.向5ul待检样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入240ul的反应稀释液试剂，充分混匀，于37℃温育5分钟；
4.再向混合体系中加入60ul的偶联了cTnI抗体的磁微球的试剂，混匀；
5.37℃温育1分钟后，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算吸光度的差值ΔA＝A2-A1；
6.校准品管重复测定2次，以每管2次测得的吸光度差值的平均值ΔA为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，采用多点非线性校准模式绘出“浓度-吸光度”标准曲线，以各待测血清吸光度变化值在标准曲线上查出该血清样本中心肌肌钙蛋白I的浓度。
实验例2.本发明的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒的性能分析
本发明的试剂盒检测范围为0～50ng/mL，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900.如要准确的测定样品中心肌肌钙蛋白I的含量，样品中心肌肌钙蛋白I的浓度值应不超过0～50ng/mL的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果。
⑴分析灵敏度的检测
用本发明实施例1所制备的检测试剂盒中的校准品稀释液(S0)作为空白样本，按照所述的检测方法重复检测20次，计算空白样本的均值及标准差，以空白样本检测均值加上两个标准差反带入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，其分析灵敏度为0.05ng/mL。
⑵线性范围验证
取一份临床高值混合血清，浓度接近50ng/mL(49.8ng/mL)，用实施例1中的校准品稀释液将高值混合血清样本按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128进行倍比稀释，共同组成9个浓度水平的样本组，用实施例1中的试剂盒进行检测，每个样本检测三次，一次实验内完成，分别计算三次测定结果的平均值。以稀释浓度(X)为横坐标，以测定结果的平均值(Y)为纵坐标，计算线性回归方程及线性回归方程的相关系数(r)，经计算得出线性回归方程为Y＝0.978X+0.019，相关系数r＝0.9999，结果表明本发明的试剂盒在0.5ng/mL～50ng/mL线性范围内相关性较好，如表1和图1。
表1.本发明试剂盒线性范围检测结果
⑶精密性的检测
用本发明的试剂盒对两份不同浓度的血清样本各重复测定10次，分别计算两份样本的均值和标准差，以均值/标准差计算两份样本的变异系数CV，结果显示两份样本的精密度分别为7.83％和5.02％(见表2)
表2.精密性检测结果
⑷方法学比对
用化学发光法原理检测心肌肌钙蛋白I结果准确可靠，已被广泛认可，由于目前市场上没有用磁微球免疫比浊法检测cTnI的市售试剂，所以我们选择采用化学发光法原理检测cTnI的市售进口试剂作为对比试剂。
收集进口心肌肌钙蛋白I化学发光试剂盒检测过的血清样本100例，其中阳性反应样本48例，阴性反应样本52例。用本发明的试剂盒对样本进行测定，对所有样本结果进行线性回归分析，计算本发明试剂盒与对比试剂盒检测结果的相关系数。结果显示，两种试剂盒检测结果的相关系数R＝0.9915，线性回归方式为y＝0.985x+0.254(见图2)。
(5)稳定性
将本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒与对比实施例1-2所制备的检测试剂盒分别置于37℃热处理15天后取出，在生化分析仪上按照检测方法检测市售进口cTnI化学发光试剂盒定值为1和2的两份血样，每份血样重复测定三次，计算检测结果与市售进口试剂定值结果的相对偏差以及测值变化率，试验结果见表3。从试验结果可见，本发明检测试剂盒的热稳定较好，且要优于对比实施例检测试剂盒。
表3.各检测试剂盒稳定性比对实验结果
本发明的目的就是为了解决上述胶乳增强免疫比浊技术中检测心肌肌钙蛋白I分析灵敏度低的问题，为临床提供一种敏感性高、特异性强、重复性好，高准确度、操作简便快捷，低成本的适合临床推广的心肌肌钙蛋白I的检测方法。同时本发明还解决了现有胶乳增强免疫比浊试剂生产制备工艺复杂的问题，更适合大量制备及工业化生产。本发明的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊法检测试剂盒检测结果与现有进口心肌肌钙蛋白I化学发光试剂盒具有很好的一致性。说明本试剂盒性能可靠，并且操作简便快速，适合临床推广，特别适合在各级基层医疗机构普及和应用，为我国农村心血管病诊疗的提供了一种有效的诊断手段。

Claims (8)

1.心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
⑴以磁性微球为载体，将心肌肌钙蛋白I抗体与磁性微球进行偶联，使待测样本与偶联有心肌肌钙蛋白I抗体的磁性微球混合，得到混合物；
⑵对所得混合物进行温育培养，形成心肌肌钙蛋白I-心肌肌钙蛋白I抗体-磁微球复合物；
⑶监测心肌肌钙蛋白I与心肌肌钙蛋白I抗体-磁微球混合物在检测波长下吸光度的改变，绘制标心肌肌钙蛋白I曲线，确定待测样本中的血清中心肌肌钙蛋白I的含量。
2.根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测方法，其特征在于，所述磁微球为超顺磁性纳米微球，粒径为50nm～1000nm。
3.心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：反应稀释液试剂、偶联了心肌肌钙蛋白I抗体的磁微球试剂，心肌肌钙蛋白I校准品。
4.根据权利要求3所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的反应稀释液试剂包含稳定剂、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲溶液，其中，所述的稳定剂为牛血清白蛋白和/或明胶；所述促凝剂为蔗糖、聚蔗糖-400、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000和/或聚乙二醇20000；所述表面活性剂为吐温-20或曲拉通X-100；所述防腐剂为Proclin300和/或叠氮钠；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或MES溶液。
5.根据权利要求4所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的反应稀释液试剂含稳定剂牛血清白蛋白，浓度为0.5～20g/L；促凝剂聚乙二醇8000，浓度为2～50mL/L；表面活性剂吐温-20，浓度为0.1～3mL/L；防腐剂Proclin300，浓度为0.5～5mL/L；磷酸盐缓冲液，浓度为10～50mmol/L；调节试剂的pH值为7.0～9.0。
6.根据权利要求5所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述稳定剂为5g/L的牛血清白蛋白，所述促凝剂为20ml/L聚乙二醇8000，所述表面活性剂为1ml/L的吐温20，所述防腐剂为1ml/L的proclin300，所述缓冲溶液为25mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值7.4。
7.根据权利要求3所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述偶联了心肌肌钙蛋白I抗体的磁微球的粒径为50nm～1000nm，优选粒径100nm。
8.根据权利要求3所述的心肌肌钙蛋白I磁微球免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述的心肌肌钙蛋白I抗体是与心肌肌钙蛋白I特异性结合的抗体，为单克隆抗体或多克隆抗体，所述的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体；所述心肌肌钙蛋白I多克隆抗体为含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体。
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