CN109061189A - 一种肌钙蛋白i检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种肌钙蛋白i检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种肌钙蛋白I检测试剂盒及其制备方法。本发明所提供的肌钙蛋白I检测试剂盒包括：试剂R1、肌钙蛋白I抗体包被的磁珠、试剂R2和酶标记的检测抗体；试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 300 0.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；试剂R2包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 300 0.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，氯化镁0.3～0.5份，pH6.4～6.6。经过实验检测，本发明所提供的肌钙蛋白I检测试剂盒的血清检测和全血检测结果一致性良好，可应用于cTnI的全血检测。

Description

一种肌钙蛋白I检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种肌钙蛋白I检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，此病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发病人数至少50万，现患至少200万。近年来AMI的临床治疗从消极的保守治疗转为积极的消除血栓或经皮冠状动脉扩张术乃至进行冠状动脉搭桥术治疗，这就对早期准确诊断出AMI提出了很高的要求。然而，AMI发作时敏感性只有50％左右，随着时间的延长，敏感性逐步提高，至6h敏感性可达90％以上，表现出随着时间推移敏感性逐渐升高的趋势，意味着早期准确诊断出AMI的关键问题是提高检测方法的灵敏度。
心肌损伤标志物的检测在诊断AMI时尤为重要。心肌损伤标志物主要为肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及心肌肌钙蛋白(cTnI)。cTnI组织特异性高，是心肌损伤的高敏感性标志物。由于cTnI具有心肌损伤后动态释放迅速、曲线完整、峰值明显、组织特异性强、窗口诊断期长、测定方法快、血中出现早等优点，基于cTnI对AMI的诊断方式优于基于CK-MB对AMI的诊断方式，目前已被临床广泛接受。cTnI不仅成为诊断急性心肌梗死的“金标准”，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察、危险分级及预后评估的最合适标志物。cTn具有相当长的诊断窗口期，cTnI为7至9天，cTnT则更长，因此早期快速检测患者cTn水平非常重要。
目前，临床上用于测定cTnI的方法主要有放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金免疫层析法(ICA)、化学发光法等。化学发光法因其检测时间短、灵敏度高、准确性高，近年来深受广大技术工作者的青睐。中国专利201510590529公开了采用化学发光法检测人肌钙蛋白I的方法，该法基于一种试剂盒，包括：表面上结合有第一抗人肌钙蛋白I单抗的磁珠、表面上结合有第二抗人肌钙蛋白I单抗的磁珠；以及酶标记的第三抗人肌钙蛋白I单抗和/或酶标记的第四抗人肌钙蛋白I单抗；其中，第一、第二、第三和第四单抗分别特异于人肌钙蛋白I的不同表位。检测时，取人体血清待测样本与试剂盒中包被有单抗的磁珠和酶标记的检测抗体混合，然后加入发光底物进行化学发光检测。
血清是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体。相较于血浆(全血)，血清的物质成分较为单一，酸碱环境较为稳定，对磁珠和酶标记的检测抗体的影响较小，因而目前大部分的肌钙蛋白I检测试剂盒的检测对象均为血清。然而，在分离获取血清的过程中，由于人为因素及实验条件的影响，血清内的cTnI含量通常低于全血中的cTnI水平，不能反映患者血液中的cTnI的实际水平，准确性和灵敏度较低，使得临床无法在早期快速准确地诊断出AMI发作，限制了化学发光法在cTnI临床检测方面的进一步应用。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种肌钙蛋白I检测试剂盒，旨在解决现有肌钙蛋白I检测试剂盒无法实现cTnI的全血检测，灵敏度低的技术问题。
本发明的一种肌钙蛋白I检测试剂盒，包括：试剂R1、肌钙蛋白I抗体包被的磁珠、试剂R2和酶标记的检测抗体；
所述试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin300 0.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；
所述试剂R2包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin300 0.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，氯化镁0.3～0.5份，pH6.4～6.6；
其中，所述份数为重量份。
在上述技术方案中，试剂R1作为肌钙蛋白I抗体包被的磁珠的保存试剂，其可减少磁珠上包被的肌钙蛋白I抗体与全血中非特异性物质的结合，提高肌钙蛋白I抗体包被的磁珠的稳定性，进而提升检测的灵敏度及其特异性；试剂R2作为酶标记的检测抗体的保存试剂，其可提高酶标记的检测抗体的稳定性，促进夹心复合物的形成。
经过实验检测，本发明所提供的肌钙蛋白I检测试剂盒的血清检测和全血检测结果一致性良好，可应用于cTnI的全血检测。
另一方面，本发明还提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒的制备方法，至少包括：
将经过平衡处理的磁珠与肌钙蛋白Ⅰ抗体在第一反应液中进行偶联反应；待反应结束后，固液分离，取磁珠加入试剂R1进行磁珠封闭，得到肌钙蛋白I抗体包被的磁珠；
所述第一反应液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)5～15份，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)5～15份，pH9.4～9.6；
所述试剂R1包括：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin3000.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5；
其中，所述份数为重量份。
其中，第一反应液为磁珠与肌钙蛋白I抗体提供了偶联介质，EDC和NHS联用，提高了肌钙蛋白Ⅰ抗体与磁珠的偶联效率，抗体活性稳定，测试灵敏度高；同时，还提供了一个稳定的pH环境以及足够的离子浓度，提高了磁珠的稳定性，并可避免磁珠发生聚集。在本发明制备方法中，联用第一反应液和试剂R1，整体上提高了肌钙蛋白I抗体包被的磁珠的稳定性，保证抗体活性，大大提升了检测的灵敏度及其特异性。
附图说明
图1为本发明测试例中肌钙蛋白I检测试剂盒在血清和血浆检测结果的线性相关性拟合图；
图2为本发明测试例中肌钙蛋白I检测试剂盒在线性测试中的线性拟合图。
具体实施方式
为了解决现有肌钙蛋白I检测试剂盒无法实现cTnI的全血检测，灵敏度低的技术问题。本发明实施例提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒及其制备方法，本发明的检测试剂盒在血清和血浆测试结果的一致性良好，灵敏度高，重复性和稳定性优异。
一种肌钙蛋白I检测试剂盒，包括：试剂R1、肌钙蛋白I抗体包被的磁珠、试剂R2和酶标记的检测抗体；
试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；
试剂R2包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，氯化镁0.3～0.5份，pH6.4～6.6；
其中，所述份数为重量份。
使用时，将上述各组分混合，然后依次加入待测样本和化学发光底物采用化学发光仪检测即可。
在上述技术方案中，试剂R1作为肌钙蛋白I抗体包被的磁珠的保存试剂，其可降低磁珠上包被的肌钙蛋白I抗体与全血中非特异性物质的结合，提升检测的灵敏度及其特异性。试剂R2作为酶标记的检测抗体的保存试剂，其可提高标记酶的检测抗体的稳定性，促进夹心复合物的形成。经过实验检测，本发明所提供的肌钙蛋白I检测试剂盒的血清检测和全血检测结果一致性良好，可应用于cTnI的全血检测。
相较于血清，血浆(全血)所含的物质成分较为复杂，含有多种蛋白酶，会降解与磁珠偶联的抗体，降低检测的灵敏度；其内较多的非特异性物质容易与磁珠抗体结合，检测的特异性较差；全血对反应环境的pH值影响较大，影响磁珠和被标记抗体的稳定性；而且，全血的粘度一般较高，容易导致磁珠聚焦，导致较差的稳定性，进而影响检测的灵敏度。因而，cTnI含量的全血检测难度较高，需要克服全血对检测试剂的多种影响。
在试剂R1中，Tris可使环境的pH在7.0附近，保持肌钙蛋白I抗体的结构稳定性，而且，Tris缓冲能力较强，可以抵抗全血对试剂反应pH环境的破坏；氯化钠可提高盐离子强度，增加溶液电荷，进而保持磁珠的分散度，提升对全血样本的检测灵敏度；牛血清白蛋白为蛋白质保护剂，全血样本中成分负责，可以抵抗环境中蛋白酶对关键抗体的降解，提升试剂性能稳定性；Proclin300为广谱抗菌剂，可延长试剂的保质期；叠氮化钠为防腐剂，延长试剂保质期；吐温为表面活性剂，提高磁珠分散度，降低磁珠抗体与全血中非特异性物质的结合，提升灵敏度和特异性。
进一步的，试剂R1优选为：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5。
在试剂R2中，MES调节环境pH在6.4～6.6之间，保持标记酶和检测抗体的结构稳定性，而且，MES的缓冲能力较强，可以抵抗全血对试剂反应pH环境的破坏；氯化钠可提高盐离子强度，增加溶液电荷，进而保持磁珠的分散度，提升对全血样本的检测灵敏度；牛血清白蛋白为蛋白质保护剂，全血样本中成分负责，可以抵抗环境中蛋白酶对关键抗体的降解，提升试剂性能稳定性；Proclin300为广谱抗菌剂，可延长试剂的保质期；叠氮化钠为防腐剂，延长试剂保质期；吐温为表面活性剂，提高磁珠分散度，降低磁珠抗体与全血中非特异性物质的结合，提升灵敏度和特异性；氯化镁可提高盐离子强度，增加溶液电荷，并提供Mg2+，起到活性中心的作用，促进夹心复合物的形成。
进一步的，试剂R2优选为：MES 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，氯化镁0.476份，pH6.4～6.6。
在本发明实施例中，在上述肌钙蛋白I抗体包被的磁珠中，磁珠优选为甲苯磺酰基磁珠。
甲苯磺酰基磁珠，内核为环形的Fe3O4(四氧化三铁)，具有均匀的磁性分布，为一种超顺磁预活化功能磁性微球，且其表面包覆修饰有甲苯磺酰基，具有分散度高、粒径均匀和吸水性好等优点。将其与肌钙蛋白I抗体偶联并应用于cTnI含量的全血检测中，检测灵敏度高，稳定性好。
进一步的，本发明实施例的磁珠粒径为10～200nm。当磁珠的粒径大于200nm时，磁珠比表面积减少，试剂灵敏度变小，达不到超敏效果；当磁珠的粒径小于10nm时，影响磁分离效果。
在本发明实施例中，在肌钙蛋白I抗体包被的磁珠中，肌钙蛋白I抗体特异性结合人肌钙蛋白I的N末端的第10～20氨基酸区域。这一区域为裸露区域，可防止因蛋白或多糖覆盖导致抗体无法识别抗原进而出现漏检的情况，可提高检测试剂的灵敏度。
进一步的，肌钙蛋白I抗体优选为肌钙蛋白I单克隆抗体，肌钙蛋白I单克隆抗体具有特异性强和纯度高的特点，可保证较高的灵敏度和特异性。
在本发明实施例中，肌钙蛋白I抗体包被的磁珠与试剂R1的比例优选为(30～35)mg:(8～15)mL；更优选为31.5mg:3mg。磁珠与试剂R1的比例低于30mg:15mL，会降低磁珠封闭的效果；磁珠与试剂R1的比例高于35mg:8mL，会造成生产工艺放大时用于封闭磁珠上未偶联肌钙蛋白I抗体的结合位点的封闭液的体积过量，增加操作难度和不必要的生产成本。
在本发明实施例中，上述肌钙蛋白I抗体包被的磁珠中的肌钙蛋白I抗体与磁珠的质量比为1:(20～50)。
当肌钙蛋白I抗体与磁珠的重量比低于1:50时，会导致磁珠上存在较多的结合位点没有肌钙蛋白I抗体与之结合，试剂灵敏度降低；当高于1:20时，信噪比较低，抗体过度饱和，增加了不必要的成本。
在本发明实施例中，酶标记的检测抗体与试剂R2的比例优选为(0.8～1.5)mg:(180～220)μL。试剂R2的用量过大会额外增加生产成本，用量过低会影响酶标记的检测抗体的效果。
在本发明实施例中，酶标记的检测抗体中的标记酶优选为碱性磷酸酶(ALP)。当化学发光底物为AMPPD时，ALP催化AMPPD化学发光，具有灵敏度好，信号稳定，信号持续时间长等优势，采用该系统可以提升超敏肌钙蛋白I试剂盒的功能灵敏度。
在本发明实施例中，酶标记的检测抗体中的检测抗体为肌钙蛋白I抗体。其中，肌钙蛋白I抗体优选为肌钙蛋白I单克隆抗体，肌钙蛋白I单克隆抗体具有特异性强和纯度高的特点，可保证较高的灵敏度和特异性。
进一步的，碱性磷酸酶与肌钙蛋白I抗体的质量比为(5～20):1。
当碱性磷酸酶与肌钙蛋白I抗体的质量比小于5:1时，灵敏度低；当比例大于20:1时，碱性磷酸酶过于饱和，造成原料浪费。
在本发明实施例中，肌钙蛋白I检测试剂盒还包括：化学发光底物液。
进一步的，化学发光底物液优选为AMPPD(中文全称为：3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二氧乙烷)。AMPPD具有发光效率更高，信号输出更稳定、平台期更长等技术优势。
更进一步的，AMPPD的工作浓度为0.05μg/mL～3μg/mL，浓度过低，检测灵敏度低；浓度过高，原料过饱和，增加成本。
在本发明实施例中，本发明实施例的检测试剂盒还包括：肌钙蛋白I定标品；肌钙蛋白I定标品的浓度为0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、70ng/mL。
基于上述肌钙蛋白I检测试剂盒，本发明还提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒的制备方法，至少包括：
将经过平衡处理的磁珠与肌钙蛋白Ⅰ抗体在第一反应液中进行偶联反应；待反应结束后，固液分离，取磁珠加入试剂R1进行磁珠封闭以封闭磁珠表面未与所述肌钙蛋白I抗体特异性结合的位点，得到肌钙蛋白I抗体包被的磁珠；
第一反应液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐5～15份，N-羟基琥珀酰亚胺5～15份，pH9.4～9.6；
试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；
其中，所述份数为重量份。
上述磷酸钠缓冲液指的是Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O的混合溶液，Na2HPO4·12H2O与NaH2PO4·2H2O的重量比优选为(12～16.5):(1.2～1.8)，更优选为14.5:1.48。
本发明的磷酸钠缓冲液的原材料Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O均为市售产品，使用前按上述比例调配即可，其磷酸根的浓度优选为40～60mM，更优选为50mM。
在上述技术方案中，试剂R1作为肌钙蛋白I抗体包被的磁珠偶联反应的封闭试剂，其可降低磁珠上包被的肌钙蛋白I抗体与全血中非特异性物质的结合，提升检测的灵敏度及其特异性。在本发明肌钙蛋白I检测试剂盒中，试剂R1作为肌钙蛋白I抗体包被的磁珠的保存试剂，因而，本发明实施例中的试剂R1可同时作为磁珠的封闭试剂和保存试剂。
进一步的，试剂R1为：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin3000.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5。
在上述技术方案中，第一反应液为磁珠与肌钙蛋白I抗体提供了偶联介质，EDC和NHS联用，提高了肌钙蛋白Ⅰ抗体与磁珠的偶联效率，抗体活性稳定，测试灵敏度高。并且，提供了一个稳定的pH环境以及足够的离子浓度，提高了磁珠的稳定性，并可避免磁珠发生聚集。
进一步的，本发明实施例的所述第一反应液为：磷酸钠缓冲液15.98份，氯化钠9份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10份，N-羟基琥珀酰亚胺10份，pH9.4～9.6。
在本发明实施例中，偶联反应的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，温度过低降低反应效率，温度过高可引起抗体变性；时间优选为20～28h，更优选为24h。
在本发明实施例中，在偶联反应之前，将经过平衡处理的磁珠先加入第一缓冲液混匀，再加入第一反应液；或者，将经过平衡处理的磁珠直接加入第一缓冲液和第一反应液的混合溶液中。
其中，第一缓冲液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，pH7.4；
经过平衡处理的磁珠与第一缓冲液的比例优选为30mg:3mL。
在本发明实施例中，经过平衡处理的磁珠的平衡处理过程包括：取磁珠于第一缓冲液中进行平衡处理，得到平衡处理后的磁珠。
进一步的，平衡处理的温度为20～28℃，时间为2～5min。
在本发明实施例中，偶联反应在混旋状态下进行，用于加速肌钙蛋白I抗体和磁珠之间的偶联。
进一步的，混旋的转速优选为12～18rpm。转速过低不易混匀，转速过高不利于肌钙蛋白Ⅰ抗体和磁珠之间的偶联。
在本发明实施例中，磁珠封闭的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；时间优选为16～24h，更优选为20h。
在本发明实施例中，为了保证磁珠封闭更加完全，本发明实施例的磁珠封闭具体包括以下步骤：
a1)待偶联反应完毕后，静置分离，去上清；然后，往磁珠中加入温度已平衡至室温的试剂R1，置于36～38℃环境中涡旋反应16～24h，进行首次封闭；
a2)对步骤a1)的产物进行磁分离，加入试剂R1，置于36～38℃下涡旋反应2h，如此重复操作至少两遍，进而将磁珠表面上的非特异性结合位点封闭。
其中，步骤a1)和步骤a2)中的涡旋反应还可替换为手动颠倒混匀。
在本发明实施例中，肌钙蛋白I检测试剂盒的制备方法，还包括：
将碱性磷酸酶与肌钙蛋白I抗体在第二反应液中进行交联反应，然后加入试剂R2终止反应；
第二反应液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～9份，Proclin 300 4～9份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐6～10份，pH7.3～7.5。
试剂R2包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，氯化镁0.3～0.5份，pH6.4～6.6。
进一步的，第二反应液优选为：磷酸钠缓冲液15.98份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，防腐剂0.5份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐9份，pH7.3～7.5。
试剂R2优选为：MES 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin 3000.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，氯化镁0.476份，pH6.4～6.6。
更进一步的，肌钙蛋白I抗体与第二反应液的比例为0.2mg:(80～120)μL，更优选为0.2mg:100μL。
在本发明实施例中，在交联反应之前，将肌钙蛋白I抗体加入第二缓冲液混匀，再加入第二反应液；或者，将肌钙蛋白I抗体直接加入第二缓冲液和第二反应液的混合溶液中。
其中，第二缓冲液包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，pH4.9～5.1；肌钙蛋白I抗体与第二缓冲液的比例优选为0.2mg：100μL。
进一步的，交联反应的温度优选为22～28℃，时间优选为2h；终止反应的温度优选为22～28℃，时间优选为1h。
更进一步的，第二缓冲液包括：MES 10.86份，氯化钠9份，pH4.9～5.1。
在本发明实施例中，在加入试剂R2终止反应之后，还包括：脱盐纯化，用于纯化步骤b)的产物，得到不含盐杂质的碱性磷酸酶标记肌钙蛋白I抗体。
在本发明实施例中，上述脱盐纯化具体包括以下步骤：
b1)取脱盐离心柱，离心除去柱内部的保存液；然后，在柱体中心位置缓慢加入纯化水，1000g离心2min，如此重复操作两次；接着，在柱体中心位置缓慢加入第二缓冲液，1000g离心2min，得到平衡好的脱盐离心柱；
b2)在平衡好的脱盐离心柱的柱体中心位置缓慢加入步骤b)的产物，待液体完全进入柱体后加入第二缓冲液，1000g离心2min，收集脱盐离心柱流出来的液体。
本发明实施例的脱盐离心柱为市售产品，也可以为技术人员通过常规技术手段制备得到的脱盐离心柱。
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例的肌钙蛋白Ⅰ抗体购自海肽生物；磁珠为购自Invitrogen的Tosyl磁珠，型号为M-280；标记酶购自Sigma；脱盐离心柱购自赛默飞。
实施例1
本实施例提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其制备具体包括以下步骤：
1、肌钙蛋白Ⅰ抗体包被磁珠
1)平衡：在室温条件下，取30mg磁珠加入包被管中，加入3mL第一缓冲液，涡旋混匀或手动颠倒混匀，然后将其置于磁分离架上静置2min后吸尽液体，得到经过平衡处理的磁珠；
其中，第一缓冲液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，pH7.4。
2)固定：在步骤1)经过平衡处理的磁珠中加入1mL第一缓冲液和0.5mL第一反应液，涡旋混匀后，继续加入1.5mg肌钙蛋白Ⅰ抗体(Anti-cTnI mAb)；之后，在37℃下以转速15rpm涡旋反应24h，进而将肌钙蛋白Ⅰ抗体偶联在磁珠表面；
其中，第一反应液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10份，N-羟基琥珀酰亚胺10份，pH9.4～9.6。
3)封闭：静置2min后吸尽液体，加入温度已平衡至室温的3mL试剂R1，置于37℃环境中并以转速15rpm涡旋反应16～24h；然后，磁分离，加入3mL试剂R1，置于37℃环境中以转速15rpm涡旋反应2h，如此重复操作两遍，进而将磁珠表面上的非特异性结合位点封闭；
其中，试剂R1为：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin3000.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5。
4)封闭完成后，磁分离，加入12mL试剂R1于4℃保存，待用。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记肌钙蛋白Ⅰ抗体
1)酶标记：取0.2mg cTnI mAb溶液、100μL第二缓冲液和100μL第二反应液于冻存管中，涡旋混匀；之后，加入100μL ALP溶液(10mg/mL)，涡旋混匀，并于25℃中反应2h；
其中，第二缓冲液为：MES 10.86份，氯化钠9份，pH4.9～5.1；
第二反应液为：磷酸钠缓冲液15.98份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，防腐剂0.5份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐9份，pH7.3～7.5。
2)终止标记：在步骤1)的反应液中加入200μL的试剂R2进行涡旋混匀，避光并在25±3℃环境下，反应1h；
其中，试剂R2为：MES 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin 300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，氯化镁0.476份，pH6.4～6.6。
3)脱盐：
取脱盐离心柱，离心除去柱内部的保存液；然后，在柱体中心位置缓慢加入纯化水，1000g离心2min，如此重复操作两次；接着，在柱体中心位置缓慢加入第二缓冲液，1000g离心2min，得到平衡好的脱盐离心柱；
在平衡好的脱盐离心柱的柱体中心位置缓慢加入步骤2)的产物，待液体完全进入柱体后加入第二缓冲液，1000g离心2min，收集脱盐离心柱流出来的液体；之后，往脱盐离心柱流出来的液体加入酶标记缓冲液，并于4℃保存，待用。
3、化学发光底物液
化学发光底物液选为二氧杂环乙烷，工作浓度为2.5μg/mL。
4、肌钙蛋白I定标品
浓度为0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、70ng/mL。
实施例2
本实施例提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其制备具体包括以下步骤：
1、肌钙蛋白Ⅰ抗体包被磁珠
1)平衡：在室温条件下，取30mg磁珠加入包被管中，加入3mL第一缓冲液，涡旋混匀或手动颠倒混匀，然后将其置于磁分离架上静置5min后吸尽液体，得到经过平衡处理的磁珠；
其中，第一缓冲液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，pH7.4。
2)固定：在步骤1)经过平衡处理的磁珠中加入1mL第一缓冲液和0.5mL第一反应液，涡旋混匀后，继续加入1mg肌钙蛋白Ⅰ抗体(Anti-cTnI mAb)；之后，在37℃下以转速15rpm涡旋反应27h，进而将肌钙蛋白Ⅰ抗体偶联在磁珠表面；
其中，第一反应液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10份，N-羟基琥珀酰亚胺10份，pH9.4～9.6。
3)封闭：静置2min后吸尽液体，加入温度已平衡至室温的3mL试剂R1，置于37℃环境中并以转速15rpm涡旋反应24h；然后，磁分离，加入3mL试剂R1，置于37℃环境中以转速15rpm涡旋反应2h，如此重复操作两遍，进而将磁珠表面上的非特异性结合位点封闭；
其中，试剂R1为：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin 300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5。
4)封闭完成后，磁分离，加入15mL试剂R1于4℃保存，待用。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记肌钙蛋白Ⅰ抗体
1)酶标记：取0.2mg cTnI mAb溶液、100μL第二缓冲液和120μL第二反应液于冻存管中，涡旋混匀；之后，加入300μL ALP溶液(10mg/mL)，涡旋混匀，并于23℃中反应2h；
其中，第二缓冲液为：MES 10.86份，氯化钠9份，pH4.9～5.1；
第二反应液为：磷酸钠缓冲液15.98份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，防腐剂0.5份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐9份，pH7.3～7.5。
2)终止标记：在步骤1)的反应液中加入180μL的试剂R2进行涡旋混匀，避光并在28℃环境下，反应1h；
其中，试剂R2为：MES 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin 300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，氯化镁0.476份，pH6.4～6.6。
脱盐、化学发光底物液和肌钙蛋白I定标品同实施例1。
实施例3
本实施例提供了一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其制备具体包括以下步骤：
1、肌钙蛋白Ⅰ抗体包被磁珠
1)平衡：在室温条件下，取30mg磁珠加入包被管中，加入3mL第一缓冲液，涡旋混匀或手动颠倒混匀，然后将其置于磁分离架上静置3min后吸尽液体，得到经过平衡处理的磁珠；
其中，第一缓冲液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，pH7.4。
2)固定：在步骤1)经过平衡处理的磁珠中加入1mL第一缓冲液和0.5mL第一反应液，涡旋混匀后，继续加入0.6mg肌钙蛋白Ⅰ抗体(Anti-cTnI mAb)；之后，在37℃下以转速15rpm涡旋反应28h，进而将肌钙蛋白Ⅰ抗体偶联在磁珠表面；
其中，第一反应液为：Na2HPO4·12H2O 14.5份，NaH2PO4·2H2O 1.48份，氯化钠9份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10份，N-羟基琥珀酰亚胺10份，pH9.4～9.6。
3)封闭：静置2min后吸尽液体，加入温度已平衡至室温的3mL试剂R1，置于37℃环境中并以转速15rpm涡旋反应24h；然后，磁分离，加入3mL试剂R1，置于37℃环境中以转速15rpm涡旋反应2h，如此重复操作两遍，进而将磁珠表面上的非特异性结合位点封闭；
其中，试剂R1为：Tris 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin3000.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，pH7.3～7.5。
4)封闭完成后，磁分离，加入8mL试剂R1于4℃保存，待用。
2、碱性磷酸酶(ALP)标记肌钙蛋白Ⅰ抗体
1)酶标记：取0.2mg cTnI mAb溶液、100μL第二缓冲液和80μL第二反应液于冻存管中，涡旋混匀；之后，加入400μL ALP溶液(10mg/mL)，涡旋混匀，并于25℃中反应2h；
其中，第二缓冲液为：MES 10.86份，氯化钠9份，pH4.9～5.1；
第二反应液为：磷酸钠缓冲液15.98份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，防腐剂0.5份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐9份，pH7.3～7.5。
2)终止标记：在步骤1)的反应液中加入220μL的试剂R2进行涡旋混匀，避光并在23℃环境下，反应1h；
其中，试剂R2为：MES 6.05份，氯化钠9份，牛血清白蛋白5份，Proclin 300 0.5份，叠氮化钠0.9份，吐温1份，氯化镁0.476份，pH6.4～6.6。
脱盐、化学发光底物液和肌钙蛋白I定标品同实施例1。
测试例
取本发明实施例1～3制备的肌钙蛋白I检测试剂盒，采用化学发光法进行检测，分析其血清和血浆测试结果的一致性，线性测试，以及考察其全血检测结果的重复性、准确性。
1、血清和血浆测试结果的一致性考察
取人体血浆和血清作为待测样本，采用实施例1～2的肌钙蛋白I检测试剂盒分别检测血浆和血清中的cTnI含量，表1为检测结果。对表1数据进行线性相关性分析，结果如图1，发现其线性相关性系数为0.9940，斜率为1.01，表明本发明检测试剂盒的血清和血浆测试结果的一致性良好。
表1
2、线性测试
取cTnI含量约为0.53～0.54ng/mL的血浆样本作为待测样本，然后依次稀释至原来浓度的1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00倍，接着分别采用实施例1～3的肌钙蛋白I检测试剂盒进行检测，表2为检测结果。
对表2的检测数据进行分析，得到如图2所示的线性拟合图，其线性拟合方程为Y＝53.37x-0.131，相关系数为0.9990。说明本发明的肌钙蛋白I检测试剂盒在0～0.50ng/mL浓度范围内重现性良好。
表2
3、重复性考察
如表3结果所示，本发明实施例检测试剂盒的变异系数CV小于15％，重复性良好。
表3
4、准确度考察
如表4结果所示，本发明实施例检测试剂盒的回收率在90％～106％之间，准确度良好。
表4
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂R1、肌钙蛋白I抗体包被的磁珠、试剂R2和酶标记的检测抗体；
所述试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；
所述试剂R2包括：MES 8～12份，氯化钠8～12份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，氯化镁0.3～0.5份，pH6.4～6.6；
其中，所述份数为重量份。
2.根据权利要求1所述的肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，在所述肌钙蛋白I抗体包被的磁珠中，所述磁珠为甲苯磺酰基磁珠。
3.根据权利要求1至2任一项所述的肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，所述肌钙蛋白I抗体包被的磁珠与所述试剂R1的比例为(30～35)mg:(8～15)mL。
4.根据权利要求1至2任一项所述的肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的检测抗体与所述试剂R2的比例为(0.8～1.5)mg:(180～220)μL。
5.根据权利要求1至2任一项所述的肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，在所述肌钙蛋白I抗体包被的磁珠中，所述肌钙蛋白I抗体与所述磁珠的质量比为1:(20～50)；和/或
所述磁珠的粒径为10～200nm。
6.根据权利要求1至2任一项所述的肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于，在所述酶标记的检测抗体中，标记酶为碱性磷酸酶；和/或
检测抗体为肌钙蛋白I抗体。
7.一种肌钙蛋白I检测试剂盒的制备方法，其特征在于，至少包括：
将经过平衡处理的磁珠与肌钙蛋白Ⅰ抗体在第一反应液中进行偶联反应；待反应结束后，固液分离，取磁珠加入试剂R1进行磁珠封闭，得到肌钙蛋白I抗体包被的磁珠；
所述第一反应液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐5～15份，N-羟基琥珀酰亚胺5～15份，pH9.4～9.6；
所述试剂R1包括：Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，Proclin 3000.4～0.6份，叠氮化钠0.8～1.2份，吐温0.8～1.2份，pH7.3～7.5；
其中，所述份数为重量份。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为36～38℃，时间为20～28h；和/或
所述磁珠封闭的温度为36～38℃，时间为16～24h。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应在混旋状态下进行；
所述混旋的转速为12～18rpm。
10.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述平衡处理包括：取磁珠于第一缓冲液中进行平衡处理，得到平衡处理后的磁珠；
所述第一缓冲液包括：磷酸钠缓冲液13.2～18.3份，氯化钠8～12份，pH7.4。
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