CN112710855A - Bnp检测试剂盒和bnp的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种BNP检测试剂盒和BNP的检测方法。其中，所述BNP检测试剂盒包括磁微粒混悬液和酶结合物缓冲液，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液。本发明的技术方案能够解决因BNP分子易被裂解而导致其检测准确度较差的问题。

Description

BNP检测试剂盒和BNP的检测方法

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种BNP检测试剂盒和BNP的检测方法。

背景技术

B型尿钠肽(BNP)，又叫脑钠肽，主要来源于心室。BNP由32个氨基酸残基组成，是一种多肽类神经激素。一般情况下BNP在心脏内的储备量较少，但在受到外界刺激时，通过基因的表达调控，会合成产生大量的BNP。BNP可作为心衰定量标志物，可以反应左室收缩和舒张功能障碍、瓣膜功能障碍和右室功能障碍。在急性呼吸困难患者中有30-40％存在急诊医生难以确诊而影响预后，以BNP100pg/ml作为临界值的阴性预测值达到90％，可以减少74％的临床不确定性；而BNP超过400pg/ml提示患者存在心力衰竭的可能性达95％。而BNP在100-400pg/ml时可能由肺部疾病、右心衰、肺栓塞等情况引起。呼吸困难患者急诊就诊时的BNP水平以及治疗后的变化也可以反映其出院时风险。

经过质谱分析表明，在心衰患者血液中，具有1-32个氨基酸完整序列的BNP分子只占极少数部分，同时发现了大量的BNP碎片，其分布区域在3-32，4-32，5-32，2-31，3-27，3-39，4-27，4-30，4-31，5-31和6-32。这些BNP碎片的形成，主要是在人体血液中含有一些蛋白酶，它们可以特异性识别相关位点并裂解BNP。其中，二肽基肽酶IV和中性肽链内切酶主要裂解BNP的N末端，生成BNP 3-32和BNP 5-32。中性肽链内切酶还会裂解BNP环状结构上的位点Arg17-Ile18。胰岛素降解酶则会降解BNP C末端：Leu29-Arg30和Arg30-Arg31。

目前，大多数的BNP检测试剂盒采用的是两株单克隆抗体的双抗体夹心法检测，但是由于BNP分子易被血液中蛋白酶裂解成片段，则会导致该双抗体夹心法对BNP的检测准确度较差。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种BNP检测试剂盒和BNP的检测方法，旨在解决因BNP分子易被裂解而导致其检测准确度较差的问题。

为实现上述目的，本发明提出的BNP检测试剂盒，包括磁微粒混悬液和酶结合物缓冲液，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液。

可选地，所述酶标记的BNP抗体酶标工作液为碱性磷酸酶标记的BNP抗体酶标工作液。

可选地，所述酶结合物缓冲液包括酶标抗体和酶结合物稀释液，所述酶标抗体和酶结合物稀释液的稀释比为0.01％-0.1％(w/v)。

可选地，所述酶结合物稀释液包括基础液和稳定剂，所述基础液包括Tris、NaCl、BSA、Proclin 300、镁离子及锌离子，所述稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

可选地，所述酶结合物稀释液包括50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、1.5g/L牛血清蛋白、1g/L Proclin 300、1mmol/L MgCl₂、5mmol/L ZnCl₂、50g/L甘油、20g/L甘氨酸及20g/L海藻糖。

可选地，所述磁微粒混悬液的浓度为0.1μg/T-1.0μg/T；和/或，所述磁微粒混悬液中，所述磁微粒的粒径范围为1.0μm-3.0μm。

可选地，所述包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液中，BNP包被抗体为BNP多克隆抗体；和/或，所述酶标记的BNP抗体酶标工作液中，酶标记的BNP抗体为一株或多株鼠单克隆抗体的混合物。

可选地，所述BNP检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括BNP抗原和校准品稀释液，所述校准品的浓度为0pg/mL、15pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL及5000pg/mL。

所述校准品稀释液包括50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、1.2％BSA及1g/LProclin 300。

本发明还提出了一种BNP的检测方法，包括以下步骤：

混合待测样本、磁微粒混悬液及酶结合物缓冲液，孵育反应后进行磁分离清洗，之后加入化学发光底物液；

检测化学底物发光液的相对发光强度，并根据检测到的相对发光强度，计算BNP的浓度；

其中，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液，所述化学发光底物液为1，2-二氧环已烷衍生物。

本发明的技术方案，采用双抗夹心法原理对BNP进行定量检测，通过磁微粒上包被的抗体与抗原结合，再与酶标抗体结合，形成“抗体-抗原-抗体-酶”的复合物，在该复合物中的酶催化底物发光，通过仪器的光电收集装置进行计数，收集的光子数与样本中BNP的含量成正比，检测准确度较高。可以理解的，本发明BNP检测是一种混抗的检测模式，它可以通过多个抗体进行表位互补，从而解决上面提到因蛋白酶裂解而导致BNP检测准确度差的问题。并且，这里磁微粒被甲苯磺酰基化，因而磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合BNP抗体的特异性。同时，甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下与BNP抗体偶联成偶联抗体，简化了操作步骤。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为实施例2的线性范围检测结果图；

图2为实施例5临床样本符合性测试结构图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本发明提出一种BNP检测试剂盒，用于人血浆样本中BNP的检测。

本发明BNP检测试剂盒包括磁微粒混悬液和酶结合物缓冲液，磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液。

本发明采用双抗夹心法原理对BNP进行定量检测，通过磁微粒上包被的抗体与抗原结合，再与酶标抗体结合，形成“抗体-抗原-抗体-酶”的复合物，在该复合物中的酶催化底物发光，通过仪器的光电收集装置进行计数，收集的光子数与样本中BNP的含量成正比，检测准确度较高。可以理解的，本发明BNP检测是一种混抗的检测模式，它可以通过多个抗体进行表位互补，从而解决上面提到因蛋白酶裂解而导致BNP检测准确度差的问题。并且，这里磁微粒被甲苯磺酰基化，因而磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖，提高了磁微粒结合BNP抗体的特异性。同时，甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上，使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下与BNP抗体偶联成偶联抗体，简化了操作步骤。

可选地，酶标记的BNP抗体酶标工作液为碱性磷酸酶标记的BNP抗体酶标工作液。

可选的实施例中，酶结合物缓冲液包括酶标抗体和酶结合物稀释液，所述酶标抗体和酶结合物稀释液的稀释比为0.01％-0.1％(w/v)。

酶结合物缓冲液是采用酶结合稀释液将酶标抗抗体稀释的工作液，其中，二者按照0.01％-0.1％(w/v)的稀释比进行稀释。

其中，酶结合物稀释液包括基础液和稳定剂，基础液包括Tris、NaCl、BSA、Proclin300、镁离子及锌离子，稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

在酶结合物稀释液中加入稳定剂，稳定剂选用甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。在酶结合物稀释液稀释酶标抗体时，可以有效地保护酶标抗体，从而延长了酶结合物工作液的有效期。

其中，甘氨酸是一种含有氨基和羧基的两性离子，具有很强的缓冲性，可以与基础液形成一个缓冲系统，维持缓冲液在一个相对稳定的pH范围内，从而使得酶标抗体始终处于一个稳定的pH范围内，从而保持酶标抗体的生物活性。

海藻糖是由两个葡萄糖分子组成的非还原性双糖，对热和酸碱具有很好的稳定性，能有效的保护生物分子结构不被破坏。同时，海藻糖作为一种多元醇化合物，既可以通过氢键与酶蛋白表面分子相结合，也可以通过氢键与外部的水分子连接，从而影响酶蛋白的水合作用来稳定和激活蛋白，并能阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变形。

甘油，又称丙三醇，是一种液态饱和多元醇化合物，常作为酶、抗体、蛋白等的保护剂；也可作为细菌等的保护剂，添加终浓度为10-20％甘油，细菌可以在-20℃保存数月之久并保持生物活性。甘油对蛋白具有较明显的保护作用，且是一种非特异性保护。甘油不仅可以提高蛋白质的热稳定性还可以提高蛋白质在含有变性剂环境中的稳定性。

Tris是一种缓冲液，其中文名称为三(羟甲基)氨基甲烷，其在pH为7-9时具有很强的缓冲能力，对很多酶的反应是惰性的，能够很好的维持反应体系的相对稳定且不影响抗体及酶的活性。

需要说明的是，稳定剂中的甘氨酸是可以与Tris形成一个缓冲系统，维持缓冲液在一个相对稳定的pH范围内，从而使得酶标抗体始终处于一个稳定的pH范围内，进而保持其生物活性。

NaCl是一种中性盐，一方面，在水溶液中可以增加蛋白质表面的电荷，增加蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大；另一方面，氯化钠因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。

BSA是一种惰性蛋白，加入BSA可以增加缓冲液中蛋白浓度，对缓冲液中含量相对较少的酶标抗体与酶复合物起到一个保护作用。同时，BSA也可以防止抗体与酶的分解和非特异性吸附，保证检测结果的准确性；另外，BSA还可以有效地减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。

Proclin 300是一种高效的体外诊断抑菌剂，具有广泛的抑制微生物(细菌、真菌)生长的效果。它可替代传统的防腐剂，如硫柳汞(含汞有机物)、叠氮钠(易燃易爆剧毒品)、庆大霉素(抗生素)等，在推荐浓度下使用无危害，废弃物安全。

镁离子是碱性磷酸酶位点的特异性效应分子，它与酶中有关基团配位，稳定了酶活性部位的构像。锌离子是碱性磷酸酶活性中心成份。

在本发明的一实施例中，酶结合物稀释液包括50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、1.5g/L牛血清蛋白、1g/L Proclin 300、1mmol/L MgCl₂、5mmol/L ZnCl₂、50g/L甘油、20g/L甘氨酸及20g/L海藻糖。

可选地，磁微粒混悬液的浓度为0.1μg/T-1.0μg/T，磁微粒混悬液中，所述磁微粒的粒径范围为1.0μm-3.0μm。

磁微粒混悬液主要通过以下步骤配制得到：选择粒径范围为1.0μm-3.0μm的磁微粒原液，分别将BNP包被抗体按照0.1μg/T-1.0μg/T的浓度包被到磁微粒表面，便可配制得到BNP混悬液。

可选地，包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液中，BNP包被抗体为BNP多克隆抗体。

这里BNP包被抗体为用完整BNP分子免疫得到的多克隆抗体，包括但不限于兔多抗、羊多抗、驴多抗、鸡多抗中的一种。

可选地，酶标记的BNP抗体酶标工作液中，酶标记的BNP抗体为一株或多株鼠单克隆抗体的混合物。

可以理解的，本发明采用多抗和混抗结合而成的“双抗体夹心技术”对BNP进行检测，可以有效地避免因血液样本中BNP分子容易降解而导致检测结果不准确的问题。

进一步地，BNP检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括BNP抗原和校准品稀释液，所述校准品的浓度为0pg/mL、15pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL及5000pg/mL。

校准品为含有定量的BNP蛋白的重组蛋白，通过将BNP抗原按照一定的浓度溶解在校准品稀释液中，配制成浓度分别为0pg/mL、15pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL及5000pg/mL的校准品溶液。

其中，校准品稀释液包括50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、1.2％BSA及1g/LProclin 300。

进一步地，BNP检测试剂盒还包括化学发光底物液，化学发光底物液为1，2-二氧环已烷衍生物。

本发明BNP检测试剂盒主要通过以下步骤制备得到：

(1)配制校准品

校准品稀释液是由50mM pH 7.4的Tris缓冲液配制而成，其中含有：50mM Tris，100mM NaCl，1.2％BSA，1g/L Proclin 300。按照设定的BNP校准品浓度将相应的BNP纯品加入上述缓冲液中，制备成系列浓度的5个校准品；5个校准品的浓度分别为0pg/mL、15pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL。

(2)制备磁微粒混悬液

a.取甲苯磺酰基磁珠10mg重悬于0.1M，pH 9.5的硼酸缓冲液中，放置于磁力架上静止1分钟，除去上清液；

b.添加900μL的0.1M，pH 9.5的硼酸缓冲液，涡旋混匀；

c.加入相应量的BNP包被抗体至反应终浓度400μg/ml，涡旋混匀；

d.加入450μL的3M硫酸铵/0.1M，pH9.5的硼酸缓冲液，涡旋混匀；

e.37℃旋转混匀18h；

f.加入10ul 10％BSA，涡旋混匀，并在37℃旋转混匀6h；

g.反应结束后，将其置于磁力架上静止1分钟，除去上清液，用清洗缓冲液(25mMTris pH 7.2、150mM NaCl、0.1％Tween20)重悬；重复3次；

h.最后重悬于50mM Tris、100mM NaCl、1.5g/L牛血清蛋白、1g/L Proclin 300，制得0.2mg/mL的磁微粒混悬液。

(3)制备酶结合物缓冲液：

取BNP标记抗体，加入浓度为0.1M，pH值为7.0的PBS缓冲液，混匀，加入新配置的10.0mg/ml EDC水溶液，活化30分钟，然后加入浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用30KD的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20度备用。

酶结合物稀释液配方如下：50mM Tris、100mM NaCl、1.5g/L牛血清蛋白、1g/LProclin 300、1mM MgCL2、5mM ZnCL2、50g/L甘油、20g/L甘氨酸，20g/L海藻糖，其pH为6.5。

将酶标抗体用酶结合物稀释液按照0.01％～0.1％(w/v)的比例进行稀释配制成酶结合物缓冲液。

本发明还提出了一种BNP的检测方法，包括以下步骤：

混合待测样本、磁微粒混悬液及酶结合物缓冲液，孵育反应后进行磁分离清洗，之后加入化学发光底物液；

检测化学底物发光液的相对发光强度，并根据检测到的相对发光强度，计算BNP的浓度；

其中，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液，所述化学发光底物液为1，2-二氧环已烷衍生物。

具体地，BNP的检测方法所用仪器为全自动化学发光免疫仪(CL-2000)，免疫学检测方法为双抗体夹心法，即仪器依次加入50μL的BNP抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液、50μL的BNP样本及100μL碱性磷酸酶标记的BNP抗体酶标记物，37℃孵育反应5min后，进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入底物300μL后，将反应杯移到光电采集模块中采集光信号值，仪器自动转换为浓度，显示测试结果。

本发明采用双抗夹心法原理对BNP进行定量检测，通过磁微粒上包被的抗体与抗原结合，再与酶标抗体结合，形成“抗体-抗原-抗体-酶”的复合物，在该复合物中的酶催化底物发光，通过仪器的光电收集装置进行计数，收集的光子数与样本中BNP的含量成正比，检测准确度较高。这里是一种混抗的检测模式，它可以通过多个抗体进行表位互补，从而解决上面提到因蛋白酶裂解而导致BNP检测准确度差的问题。

实施例1、灵敏度的检测

参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案对5份浓度近似检出限的低值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合低于生产企业提供的空白限数值(空白限为10pg/mL)的检测结果的数量应小于或等于3个，即可认为生产企业提供的空白限和检出限的设置基本合理，求得灵敏度为15pg/mL。由此可知晓，本发明BNP的检测方法具有较高的灵敏度。

表1灵敏度检测数据表

序号	S1	S2	S3	S4	S5
						1	11.65	12.41	12.86	12.90	14.69
2	10.53	12.27	13.63	13.00	14.84
						3	11.47	11.55	12.92	13.06	14.16
4	11.69	12.96	12.49	13.80	14.39
						5	10.59	11.88	12.37	12.95	14.08

实施例2、线性的检测

对浓度为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、5000.0pg/mL的校准品进行线性分析(参照表2)，计算线性相关系数r＝0.9998，该试剂盒的线性范围为15pg/ml～5000pg/ml。具体地，图1中横坐标为样本浓度值(pg/mL)，纵坐标为相对发光值(RLU)，线性方程为y＝1609.2x+19607。

表2线性范围检测结果

实施例3、准确度测试

取浓度为100pg/mL及1000pg/mL两个BNP样品，每个样本浓度各做3个平行测试，用本试剂盒进行检测，计算相对偏差，其测量结果的相对偏差应在±10％范围内，说明本发明BNP的检测方法具有较高的准确度。

表3准确度检测分析结果

实施例4、抗干扰实验

取待检测样品分别加入血红蛋白、甘油三酯、胆红素三种干扰物，用本发明提供的BNP化学发光检测试剂盒检测待测样本干扰物加入前后BNP的含量，根据NCCLS的文件标准，计算二者的偏差，以±10％为接受范围。结果表明，相对偏差均在±10％以内，说明在存在干扰物的情况下，采用本发明提供的BNP化学发光检测试剂盒检测准确度仍然较高。

表4抗干扰实验数据

干扰物质	添加前	添加后	相对偏差
				血红蛋白500mg/dL	100	101	1％
甘油三酯2500mg/dL	100	105	5％
				胆红素12mg/dL	100	103	3％

实施例5、临床样本符合性测试

采集本市一医疗机构提供的200例样本(涵盖整个线性范围)，用本发明BNP试剂盒以及雅培BNP测试试剂盒分别进行测试，参照图2，计算试验结果相关性为：R²＝0.9946，K值为0.9753，与雅培BNP测试试剂盒的相关性非常好，能满足实际应用的需求，能准确测定样本中BNP浓度。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种BNP检测试剂盒，用于BNP的检测，其特征在于，所述BNP检测试剂盒包括磁微粒混悬液和酶结合物缓冲液，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液。

2.如权利要求1所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的BNP抗体酶标工作液为碱性磷酸酶标记的BNP抗体酶标工作液。

3.如权利要求2所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物缓冲液包括酶标抗体和酶结合物稀释液，所述酶标抗体和酶结合物稀释液的稀释比为0.01％-0.1％(w/v)。

4.如权利要求3所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物稀释液包括基础液和稳定剂，所述基础液包括Tris、NaCl、BSA、Proclin300、镁离子及锌离子，所述稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

5.如权利要求4所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物稀释液包括50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、1.5g/L牛血清蛋白、1g/L Proclin 300、1mmol/L MgCl₂、5mmol/LZnCl₂、50g/L甘油、20g/L甘氨酸及20g/L海藻糖。

6.如权利要求1所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒混悬液的浓度为0.1μg/T-1.0μg/T；和/或，

所述磁微粒混悬液中，所述磁微粒的粒径范围为1.0μm-3.0μm。

7.如权利要求1所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液中，BNP包被抗体为BNP多克隆抗体；和/或，

所述酶标记的BNP抗体酶标工作液中，酶标记的BNP抗体为一株或多株鼠单克隆抗体的混合物。

8.如权利要求1至7中任一项所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述BNP检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括BNP抗原和校准品稀释液，所述校准品的浓度为0pg/mL、15pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL及5000pg/mL。

9.如权利要求8所述的BNP检测试剂盒，其特征在于，所述校准品稀释液包括50mmol/LTris、100mmol/L NaCl、1.2％BSA及1g/L Proclin 300。

10.一种BNP的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

混合待测样本、磁微粒混悬液及酶结合物缓冲液，孵育反应后进行磁分离清洗，之后加入化学发光底物液；

检测化学底物发光液的相对发光强度，并根据检测到的相对发光强度，计算BNP的浓度；

其中，所述磁微粒混悬液为包被有BNP抗体的甲苯磺酰基化的磁微粒工作液，所述酶结合物缓冲液为酶标记的BNP抗体酶标工作液，所述化学发光底物液为1，2-二氧环已烷衍生物。

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