CN111569844A - 一种预活化的亲水磁性微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种预活化的亲水磁性微球的制备方法，磁性微球表面含有甲苯磺酰基团，无需再经过EDC或戊二醛活化处理，通过甲苯磺酰基团可直接与含有氨基的生物分子共价偶联结合，包括以下步骤：通过对含羟基的亲水聚合物进行甲苯磺酰基化改性；将甲苯磺酰基化亲水聚合物与氨基磁珠混合反应，得到预活化的甲苯磺酰基磁性微球。本发明提供的磁性微球具有预活化的特点，预活化磁性微球表面的甲苯磺酰基是通过氨基与磁性微球偶联的，其间隔臂长度比一般的官能团修饰的磁性微球的空间臂更长，同时由于亲水聚合物结构的存在使得所述磁性微球表面亲水，在应用过程中具有更低的非特异性吸附。本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。

Description

一种预活化的亲水磁性微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及材料领域的表面预活化磁性微球的制备方法，具体地说是一种预活化的亲水磁性微球的制备方法。
背景技术
近年来，随着核酸诊断、化学发光免疫分诊断的快速发展，作为技术平台重要原材料之一，磁性微球已被广泛应用，它是一种新型的功能化固体载体，具有固体载体和磁性材料等特点，在外磁场的作用下可以定向移动和集中，当撤去外磁场后，稍加振荡或抽吸又可均匀分散于液体中，从而使固液相的分离变的十分快捷方便，通过简单的洗脱可以得到纯度很高的靶向物质；磁性微球表面修饰有各种官能团如氨基、羧基、环氧基、醛基和巯基等基团，利用磁性微球表面的这些基团通过共价结合与目标生物分子如蛋白、酶、核酸等进行偶联，最终经过未结合位点的封闭处理，便可应用于蛋白纯化、核酸提取、分子诊断、免疫诊断试剂等领域。
其中，羧基、氨基是常用来修饰磁性微球的官能基团，在一定条件下，它们可以与生物配基进行偶联得到免疫磁珠。对于羧基，其原理是利用磁性微球表面的羧基进行活化处理，通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行基团活化，生成的活性基团与含有氨基生物分子进行共价结合反应；氨基磁性微球通过加入戊二醛与氨基生物分子进行还原胺化反应，将含有氨基的生物分子偶联到磁性微球表面；醛基和环氧基也是目前市场上用来修饰磁性微球的基团，它们无需加入活化物质，在一定缓冲液条件下可直接与含有氨基生物分子进行共价结合，偶联到磁性微球上。
但这些磁性微球均存在一定的不足和缺陷，羧基、氨基等官能团修饰磁性微球反应需加入活化物质，操作稍显繁琐，不易控制批间差，活性基团本身易水解，活化时间长短和活化物质加入量的多少等活化步骤操作不当容易造成实验失败；而环氧基和醛基虽然不需要添加活化物质，可直接与氨基生物分子进行共价偶联，但是环氧基和醛基不易长期保存，保存条件苛刻，间隔臂较短。因此开发一种预活化、间隔臂长、含有高密度甲苯磺酰基的磁性微球极为重要，该磁性微球无需活化，可直接与氨基生物分子共价结合偶联，且甲苯磺酰基性能稳定，易保存，解决了上述基团存在的不足问题，给实际应用过程中带来极大的好处。
发明内容
针对现有技术存在不足，本发明提供了一种亲水性预活化甲苯磺酰基修饰的磁性微球的制备方法，该制备方法简单，原料易得，成本低。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种预活化亲水性磁性微球，磁性微球的表面修饰有甲苯磺酰基团聚合物，该制备方法包括以下步骤：
A：亲水聚合物在有机溶剂环境中进行甲苯磺酰基化反应，使得亲水聚合物的伯羟基变为甲苯磺酰基，形成两端可与氨基反应的修饰有活性基团的亲水聚合物；其中，有机溶剂为常用溶剂，如N,N二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜、乙腈的一种或多种溶剂的混合溶剂；
B：将A中甲苯磺酰基修饰的亲水聚合物与氨基磁性微球混合，在缓冲液中混合反应后得到所述甲苯磺酰基修饰的磁性微球；缓冲液为常用缓冲液，如pbs缓冲液、Mes缓冲液、CB缓冲液或Hepes缓冲液等。
优选地，亲水聚合物为常用聚合物，如PEG、HEMA、葡聚糖等含羟基的亲水聚合物，聚合物分子量为800-20000。
优选地，甲苯磺酰基修饰亲水聚合物为至少含有两个或两个以上甲苯磺酰基团，其中一个基团与氨基磁性微球结合，其它所有活性基团暴露在磁性微球表面。
优选的，A步骤中所述亲水聚合物在有机溶剂环境中进行甲苯磺酰基化反应，使得亲水聚合物羟基变为甲苯磺酰基，包括如下步骤：
A-1将亲水聚合物加入到有机溶剂中，常温搅拌溶解，配制成聚合物液体，所述亲水聚合物、有机溶剂加入质量比为1：(2-10)；
A-2当亲水聚合物完全溶解于有机溶剂中，加入甲苯磺酰氯和有机碱，常温条件下反应6个小时，其中亲水聚合物、甲苯磺酰氯、三乙胺：加入质量比为1：(0.02-0.08)：(0.01-0.05)；
A-3通过超滤管超滤纯化，用纯化水对上述反应液进行稀释，防止有机溶剂破坏超滤管半透膜，将稀释后的反应液装入超滤管中，离心超滤，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10结束，所述超滤管选择截留分子量为300-2000，所述稀释比例为纯化水：B中反应液＝(1：0.2-1)。
优选地，B步骤中氨基磁性微球包括聚苯乙烯磁性微球、二氧化硅磁性微球、葡聚糖磁性微球等，均可在市场上购得。
优选地，B步骤中甲苯磺酰基修饰磁性微球的反应过程如下：
B-1：将A-3所述制得的改性聚合物加入到缓冲液中，搅拌溶解，待PEG完全溶解，将磁珠加入溶液中，常温反应18-72小时。
氨基磁性微球、所述亲水聚合物、甲苯磺酰基化亲水聚合物、硫酸铵质量比为1：(0.05-0.5)：(0.2-2)，此操作为了使亲水聚合物与氨基磁性微球发生最大程度偶联反应。
缓冲液为pH 6-8的常用缓冲液，如pbs缓冲液、Mes缓冲液、CB缓冲液、Hepes等常用缓冲溶液。
B-2反应结束，利用磁铁磁分离反复清洗磁性微球，直到清洗完全，去除所有未反应结合的改性聚合物和缓冲液中的无机盐。
本发明的最终清洗需要使用电导率仪进行分析测定，符合判断标准即可。判断标准为电导率仪测定结果＜10us/cm。
本发明制备甲苯磺酰基修饰的亲水聚合物，通过使亲水聚合物的羟基被甲苯磺酰取代，制得甲苯磺酰基化聚合物，间隔臂长，亲水性强。效果更加优于直接在纳米磁性粒子表面进行甲苯磺酰基修饰得到的磁性微球。
优选地，甲苯磺酰基化亲水聚合物为含有羟基基团的亲水聚合物通过修饰改性使得羟基变为甲苯磺酰基。
优选地，氨基磁性微球包括氨基修饰的二氧化硅磁性微球或有机聚合物磁性微球，有机聚合物磁性微球包括聚苯乙烯磁性微球、聚苯乙烯与氨基单体共聚磁性微球、葡聚糖磁性微球、琼脂糖磁性微球等。
本发明的相对于现有技术相比具有显著优点为：
1本发明提供了一种预活化亲水磁性微球，由于磁性微球上的甲苯磺酰基无需活化，可直接与氨基生物分子偶联，避免了活化过程产生的标记批间差；
2由于磁性微球表面的亲水聚合物的存在，使得磁性微球表面亲水好，非特异性吸附少；
3.本发明的甲苯磺酰基磁性微球表面的基团间隔臂长，因此更容易结合游离的生物分子；
4.本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，具有很强的实用性。
附图说明
图1为预活化亲水磁性微球的制备流程示意图.
图2为氨基磁性微球的SEM图。
图3为修饰有亲水聚合物的磁性微球的SEM图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步解释本专利，所举的实施例仅是对本发明制备方法作概括性例示，有助于更好的理解本专利，但不会限制本发明范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从市场途径购得。
本发明用于偶联含氨基生物分子的磁性微球，磁性微球表面含有甲苯磺酰基，其与磁性微球表面氨基偶联结合。由于该基团无需活化可直接与磁性微球表面氨基反应，减少由于活化步骤带来的一系列问题，使效率更高。
本发明用于偶联含氨基生物分子的磁性微球的制备方法，首先对亲水聚合物的羟基进行甲苯磺酰基修饰，然后将修饰的亲水聚合物与氨基磁性微球反应，形成磁性微球本体-亲水聚合物-甲苯磺酰基结构的预活化亲水磁性微球。
实施例1
(1)准备机械搅拌器和水浴锅，对100ml三口烧瓶进行安装，加入20ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌的情况下加入10g聚乙二醇(分子量为800)，搅拌30min左右完全溶解，称取0.8g甲苯磺酰氯加入反应液中，同时再向反应液中滴加0.2ml三乙胺，反应6小时。
(2)反应结束，准备若干超滤管，用40ml纯化水稀释反应液，将稀释后的反应液装入超滤管中，选择截留分子量300的超滤管，置于离心机中离心，离心机设置为4000转/分钟，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
(3)透析结束，将透析袋液体全部吸出倒入准备好的圆底烧瓶，通过旋转蒸发仪旋蒸除去所有水分，将液体旋干直至变为粉末。
(4)准备机械搅拌器和水浴锅，对200ml三口烧瓶进行安装，向瓶中倒入120ml pbs缓冲液，加入10g氨基磁性微球(粒径大小为1um)，磁性微球加入体积根据固含量进行换算，再加入1g甲苯磺酰基化聚乙二醇粉末和500mg硫酸铵，机械搅拌反应60小时。
(5)反应结束，将制得的磁性微球倒入烧杯中，磁分离清洗去除缓冲液，纯化水将磁性微球重新悬浮，这样重复清洗悬浮，直至电导率仪测定溶液电导率＜10，用质量分数为0.01％的叠氮钠水溶液将磁性微球定容至10％固含量，制得所述预活化磁性微球。
实施例2
(1)准备机械搅拌器和水浴锅，对100ml三口烧瓶进行安装，加入30ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌的情况下加入6g聚甲基丙烯酸羟乙酯(分子量为2500)，搅拌30min左右完全溶解，称取0.3g甲苯磺酰氯加入反应液中，同时再向反应液中滴加0.1ml三乙胺，反应6小时。
(2)反应结束，准备若干超滤管，用80ml纯化水稀释反应液，将反应液装入超滤管中，选择截留分子量500的超滤管，置于离心机中离心，离心机设置为4000转/分钟，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
(3)透析结束，将透析袋液体全部吸出倒入准备好的圆底烧瓶，通过旋转蒸发仪旋蒸除去所有水分，将液体旋干直至变为粉末。
(4)准备机械搅拌器和水浴锅，对200ml三口烧瓶进行安装，向瓶中倒入120ml MES缓冲液，加入6g氨基磁性微球(粒径大小为1um)，磁性微球加入体积根据固含量进行换算，再加入0.8g甲苯磺酰基化聚乙二醇粉末和800mg硫酸铵，机械搅拌反应36小时。
(5)反应结束，将制得的磁性微球倒入烧杯中，磁分离清洗去除缓冲液，纯化水将磁性微球重新悬浮，这样重复清洗悬浮，直至电导率仪测定溶液电导率＜10，用质量分数为0.01％的叠氮钠水溶液将磁性微球定容至10％固含量，制得所述预活化磁性微球。
实施例3
(1)准备机械搅拌器和水浴锅，对100ml三口烧瓶进行安装，加入70ml N,N-二甲基甲酰胺，搅拌的情况下加入7g聚乙二醇(分子量为3000)，搅拌30min左右完全溶解，称取0.35g甲苯磺酰氯加入反应液中，同时再向反应液中滴加0.2ml吡啶，反应6小时。
(2)反应结束，准备若干超滤管，用70ml纯化水稀释反应液，将反应液装入超滤管中，选择截留分子量800的超滤管，置于离心机中离心，离心机设置为4000转/分钟，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
(3)透析结束，将透析袋液体全部吸出倒入准备好的圆底烧瓶，通过旋转蒸发仪旋蒸除去所有水分，将液体旋干直至变为粉末。
(4)准备机械搅拌器和水浴锅，对200ml三口烧瓶进行安装，向瓶中倒入120ml pbs缓冲液，加入12g氨基磁性微球(粒径大小为1um)，磁性微球加入体积根据固含量进行换算，再加入0.9g甲苯磺酰基化聚乙二醇粉末和500mg硫酸铵，机械搅拌反应18小时。
(5)反应结束，将制得的磁性微球倒入烧杯中，磁分离清洗去除缓冲液，纯化水将磁性微球重新悬浮，这样重复清洗悬浮，直至电导率仪测定溶液电导率＜10，用质量分数为0.01％的叠氮钠水溶液将磁性微球定容至10％固含量，制得所述预活化磁性微球。
实施例4
(1)准备机械搅拌器和水浴锅，对100ml三口烧瓶进行安装，加入20ml二甲基亚砜，搅拌的情况下加入3g葡聚糖(分子量为8000)，搅拌50min左右完全溶解，称取0.1g甲苯磺酰氯加入反应液中，同时再向反应液中滴加0.1ml三乙胺，反应6小时。
(2)反应结束，准备若干超滤管，用20ml纯化水稀释反应液，将反应液装入超滤管中，选择截留分子量1000的超滤管，置于离心机中离心，离心机设置为4000转/分钟，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
(3)透析结束，将透析袋液体全部吸出倒入准备好的圆底烧瓶，通过旋转蒸发仪旋蒸除去所有水分，将液体旋干直至变为粉末。
(4)准备机械搅拌器和水浴锅，对200ml三口烧瓶进行安装，向瓶中倒入120ml pbs缓冲液，加入5g氨基磁性微球(粒径大小为1um)，磁性微球加入体积根据固含量进行换算，再加入0.6g甲苯磺酰基化聚乙二醇粉末和400mg硫酸铵，机械搅拌反应24小时。
(5)反应结束，将制得的磁性微球倒入烧杯中，磁分离清洗去除缓冲液，纯化水将磁性微球重新悬浮，这样重复清洗悬浮，直至电导率仪测定溶液电导率＜10，用质量分数为0.01％的叠氮钠水溶液将磁性微球定容至10％固含量，制得所述预活化磁性微球。
实施例5
(1)准备机械搅拌器和水浴锅，对100ml三口烧瓶进行安装，加入10ml二甲基亚砜，搅拌的情况下加入4g葡聚糖(分子量为15000)，搅拌50min左右完全溶解，称取0.1g甲苯磺酰氯加入反应液中，同时再向反应液中滴加0.05ml吡啶，反应6个小时。
(2)反应结束，准备若干超滤管，用20ml纯化水稀释反应液，将反应液装入超滤管中，选择截留分子量2000的超滤管，置于离心机中离心，离心机设置为4000转/分钟，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
(3)透析结束，将透析袋液体全部吸出倒入准备好的圆底烧瓶，通过旋转蒸发仪旋蒸除去所有水分，将液体旋干直至变为粉末。
(4)准备机械搅拌器和水浴锅，对200ml三口烧瓶进行安装，向瓶中倒入120ml pbs缓冲液，加入5g氨基磁性微球(粒径大小为1um)，磁性微球加入体积根据固含量进行换算，再加入0.5g甲苯磺酰基化聚乙二醇粉末和400mg硫酸铵，机械搅拌反应72小时。
(5)反应结束，将制得的磁性微球倒入烧杯中，磁分离清洗去除缓冲液，纯化水将磁性微球重新悬浮，这样重复清洗悬浮，直至电导率仪测定溶液电导率＜10，用质量分数为0.01％的叠氮钠水溶液将磁性微球定容至10％固含量，制得所述预活化磁性微球。
量取上述实施例1-5中的预活化的亲水磁性微球10mg，加入0.5mg SA(链霉亲和素),混合均匀在室温下孵育18小时，用Tris缓冲液(含0.05％吐温20)磁分离清洗磁性微球，得到SA磁性微球，并与市场商品化SA磁性微球作为对照在化学发光仪器上进行发光值检测。
从表1数据可看出，本专利发明的预活化亲水磁性微球，除了无需活化，操作简单之外，在产品性能上有很大优势，在阴性标本检测发光值方面，实施例1-5结果均小于对照磁性微球，说明本发明磁性微球本底信号值低，对于中值和高值标本来说，实施例1-5结果大于对照磁性微球，低值标本无明显区别，说明本专利发明的磁性微球灵敏度高，且线性范围要大于商品化磁性微球。
表1
Figure BDA0002474257140000071

Claims (10)

1.一种预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：
A：合成制备甲苯磺酰基化亲水聚合物；
B：将甲苯磺酰基化亲水聚合物与氨基磁性微球混合反应，磁性微球表面共价结合上改性聚合物，制得所述预活化亲水聚合物磁性微球。
2.根据权利要求1所述的预活化亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤A中亲水聚合物的甲苯磺酰基化反应如下进行：
将亲水聚合物溶解在有机溶剂环境中，加入甲苯磺酰氯和有机碱进行甲苯磺酰基化反应6h，使得聚合物的伯羟基变为甲苯磺酰基，形成两端可与氨基反应的修饰有活性基团的亲水聚合物；所述的亲水聚合物、甲苯磺酰氯、有机碱、有机溶剂加入质量比为1：(0.02-0.08)：(0.01-0.05)：(2-10)。
3.根据权利要求2所述预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为常用溶剂，N,N二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜、乙腈的一种或多种溶剂的混合溶剂。
4.根据权利要求2所述的预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤A中亲水聚合物为葡聚糖、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇等聚合物，所述聚合物分子量为800-20000。
5.根据权利要求2所述的预活化亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤A中获得的甲苯磺酰基化亲水聚合物通过超滤管超滤纯化，用纯化水对上述反应液进行稀释，防止有机溶剂破坏超滤管半透膜，将稀释后的反应液装入超滤管中，离心超滤，超滤过程中需要电导率仪进行监控，超滤直至电导率＜10us/cm结束。
6.根据权利要求5所述预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：所述的超滤管选择截留分子量为300-2000；所述的稀释比例为纯化水：B中反应液的体积比为1：0.2-1。
7.根据权利要求1所述的预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤B中甲苯磺酰基修饰的亲水聚合物与氨基磁性微球在室温条件下在反应液中混合，添加硫酸铵作为催化剂进行反应，反应结束后清洗去除未反应聚合物，制得所述甲苯磺酰基化磁性微球。
8.根据权利要求7所述的预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：氨基磁性微球、甲苯磺酰基化亲水聚合物、硫酸铵的质量比为1：(0.05-0.5)：(0.2-2)。
9.根据权利要求7所述的预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：
反应液为常用缓冲液，pbs缓冲液、Mes缓冲液、CB缓冲液或Hepes。
10.根据权利要求7所述预活化的亲水磁性微球的制备方法，其特征在于：
所述的磁性微球与甲苯磺酰基化亲水聚合物在缓冲液中混合反应时间为18-72小时。
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