CN112730853A - 抑制素b检测试剂盒和抑制素b的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抑制素B检测试剂盒和抑制素B的检测方法。其中,所述抑制素B检测试剂盒包括:第一试剂,所述第一试剂为抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂;和第二试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。本发明的技术方案具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单,检测时间短,不易出现交叉反应,并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域,特别涉及一种抑制素B检测试剂盒和抑制素B的检测方法。
背景技术
抑制素(INH)属于转化生长因子β多肽家族,成熟的INH是一种32kDa的二聚体糖蛋白激素。INH由α亚基和两种β亚基(βA和βB)之一通过二硫键连接而成,即抑制素A(α-βA)和抑制素B(α-βB)。只有二聚体形式的INH才有生物学活性。抑制素B是由生殖系统细胞分泌的糖蛋白激素。血清抑制素B可以直接反映睾丸的生精功能状况,是判断男性生育率更有效的指标。成年男性体内血铅抑制素水平与FSH成显著负相关,对FSH起负反馈作用。抑制素B可指导男性不育症分析、辅助生殖技术、检测放化疗对男性生精功能损伤、诊断性早熟、青春期延迟等。女性INHB由卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞分泌,抑制素B可指导卵巢储备功能评估,辅助诊断多囊卵巢综合征(PCOS);辅助诊断子宫内膜异位症;诊断监测卵巢颗粒细胞癌;指导选择辅助生殖技术方案等。
目前测定抑制素B的方法有放射免疫分析法、酶联免疫法、时间分辨荧光分析法、胶体金法等,其中,放射免疫分析法有放射性核素污染、组织样品处理不够迅速,操作复杂,测试结果不稳定,易出现交叉反应。酶联免疫法大多采用96微孔板检测,步骤繁琐耗时。时间分辨荧光分析法存在稀有金属污染的风险。胶体金法在目前的技术条件很难设计为定量实验,且灵敏度较低。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种抑制素B检测试剂盒和抑制素B的检测方法,旨在克服目前检测抑制素B方法中存在的缺陷。
为实现上述目的,本发明提出的抑制素B检测试剂盒,包括:第一试剂,所述第一试剂为抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂;和第二试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
可选的实施例中,所述第一试剂为用由50mmol/LHEPES、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300、0.9%NaCl以及1.2%BSA组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的甲苯磺酰基磁颗粒固相试剂;和/或,所述第二试剂为用由50mM HEPES、1.2%BSA、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300及0.9%氯化钠组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
可选的实施例中,所述抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒中,所述抑制素B多克隆抗体与所述甲苯磺酰基化的磁微粒的质量比范围为1:50至1:100。
可选的实施例中,所述甲基磺酰基化的磁微粒的粒径范围为1.0μm至3.0μm。
可选的实施例中,所述酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体中,所述抑制素B单克隆抗体与所述酶标记物的质量比范围为5:6至5:10。
可选的实施例中,所述酶标记物为碱性磷酸酶。
可选的实施例中,所述抑制素B检测试剂盒还包括样本处理液,所述样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸与次氯酸钠的混合溶液。
可选的实施例中,所述样本处理液的pH值为10.0,其中,按体积份计,所述次氯酸钠的含量为0.5%。
可选的实施例中,所述抑制素B检测试剂盒还包括化学发光底物液,所述化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物;和/或,所述抑制素B检测试剂盒还包括抑制素B校准品,其浓度分别为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、1300.0pg/mL的抑制素B溶液。
本发明还提出了一种抑制素B的检测方法,包括以下步骤:
混合待测样本、样本处理液、第一试剂及第二试剂,反应后进行磁分离清洗,之后加入化学发光底物液;
检测化学底物发光液的相对发光强度,并根据检测到的相对发光强度,计算抑制素B的浓度;
其中,所述第一试剂抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液,所述样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸与次氯酸钠的混合溶液,所述化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物。
本发明的技术方案至少能够取得以下有益效果:本发明抑制素B检测试剂盒以免疫磁微粒为固相,以碱性磷酸酶标记的抗体偶联磁性微球,作为通用的分离试剂,不仅使免疫反应更容易混匀和分离,而且大大提高了反应速度,具有灵敏度高,检测时间短,操作简便的优点。同时使用的是甲苯磺酰基化磁微粒,工艺成熟,不会出现磁珠团聚等问题。本发明的抑制素B检测试剂盒用于测定抑制素B,具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单,检测时间短,不易出现交叉反应,并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例二的线性范围检测结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
另外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种抑制素B检测试剂盒,用于检测抑制素B,所述抑制素B检测试剂盒包括:第一试剂,第一试剂为抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂;和第二试剂,第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
本发明检测试剂盒中,第一试剂为固相试剂,主要包括抑制素B多克隆抗体和甲苯磺酰基化的磁微粒,二者偶联。磁微粒被甲苯磺酰基化,因而磁微粒的表面被亲水聚合物覆盖,提高了磁微粒结合抑制素B多克隆抗体的特异性。同时,甲苯基基团作为活性基团结合在磁微粒的表面上,使得磁微粒可以在不使用偶联剂的情况下与抑制素B多克隆抗体偶联成偶联抗体,简化了操作步骤。第二试剂为液相试剂,主要包括酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液,这里酶标记物可选为碱性磷酸酶。
可以理解的,本发明抑制素B检测试剂盒以免疫磁微粒为固相,以碱性磷酸酶标记的抗体偶联磁性微球,作为通用的分离试剂,不仅使免疫反应更容易混匀和分离,而且大大提高了反应速度,具有灵敏度高,检测时间短,操作简便的优点。同时使用的是甲苯磺酰基化磁微粒,工艺成熟,不会出现磁珠团聚等问题。本发明的抑制素B检测试剂盒用于测定抑制素B,具有灵敏度高、准确定量、无放射性风险及其操作简单,检测时间短,不易出现交叉反应,并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测的优点。
可选的实施例中,第一试剂为用由50mmol/LHEPES、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300、0.9%NaCl以及1.2%BSA组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的甲苯磺酰基磁颗粒固相试剂。
可选的实施例中,第二试剂为用由50mM HEPES、1.2%BSA、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300及0.9%氯化钠组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
可选的实施例中,抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒中,抑制素B多克隆抗体与甲苯磺酰基化的磁微粒的质量比范围为1:50至1:100。比如抑制素B多克隆抗体与甲苯磺酰基化的磁微粒的质量比为1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
可选的实施例中,甲基磺酰基化的磁微粒的粒径范围为1.0μm至3.0μm。比如,甲基磺酰基化的磁微粒的粒径为1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm或3.0μm。
可选的实施例中,酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体中,抑制素B单克隆抗体与酶标记物的质量比范围为5:6至5:10,比如抑制素B单克隆抗体与酶标记物的质量比为5:6、5:7、5:8、5:9或5:10。
进一步地,抑制素B检测试剂盒还包括样本处理液,样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)与次氯酸钠的混合溶液。
可选的实施例中,样本处理液的pH值为10.0,其中,按体积份计,所述次氯酸钠的含量为0.5%。
进一步地,抑制素B检测试剂盒还包括化学发光底物液,化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物。
进一步地,抑制素B检测试剂盒还包括抑制素B校准品,其浓度分别为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、1300.0pg/mL的抑制素B溶液。
本发明抑制素B检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
(1)第一试剂的制备:
首先取10mg甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液,磁分离上清,用1-2ml的0.1M,pH值为9.0的硼酸盐缓冲液清洗1次后,加入1ml0.1M,pH值为9.0的硼酸盐缓冲液重悬;然后加入0.5ml-0.75ml硫酸铵溶液后加入0.2mg-0.4mg的抑制素B多克隆抗体,37℃下混悬反应12h-24h,反应完成后,磁分离去上清,用1-2ml的50mM Tris、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300、0.9%氯化钠、1.2%BSA pH值为7.4的溶液清洗1次,加入1ml Tris缓冲液重悬,37℃下混悬反应1h,反应完成后,重复步骤31次,重悬于1mlTris缓冲液得到10mg/ml的包被有抑制素B多克隆抗体的磁微粒。最后,取包被有抑制素B多克隆抗体的磁微粒,用50mM HEPES、1.2%BSA、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300及0.9%氯化钠pH值为7.4的溶液将磁微粒稀释到0.2mg/ml的浓度,即为第一试剂。
(2)第二试剂的制备:
首先,取抑制素B单克隆抗体,加入浓度为0.1M,pH值为7.0的PBS缓冲液,混匀,加入新配置的10.0mg/ml EDC水溶液,活化30分钟,然后加入浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀,室温避光保存2小时后取出,用30KD的超滤柱除盐纯化,收集的剩余体积溶液加一半甘油,保存于-20度备用。之后,取碱性磷酸酶标记的抑制素B酶标记物,用50mM HEPES、1.2%BSA、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300及0.9%氯化钠pH值为7.4的溶液按1:600倍稀释,即为第二试剂。
(3)样本处理液的制备:配制pH值为10.0的CAPSO溶液,加入0.5%次氯酸钠,即为样本处理液。
(4)抑制素B校准品的制备:用校准品缓冲液将抑制素B配置成浓度为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、1300.0pg/mL每瓶0.5mL分装,4度保存备用。其中校准品缓冲液包括:0.05M(pH 7.4)Tris、1.5%BSA、0.1%TW-20、0.9%NaCl及0.1%Proclin300。
本发明还提出了一种抑制素B的检测方法,包括以下步骤:
混合待测样本、样本处理液、第一试剂及第二试剂,反应后进行磁分离清洗,之后加入化学发光底物液;
检测化学底物发光液的相对发光强度,并根据检测到的相对发光强度,计算抑制素B的浓度;
其中,所述第一试剂抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液,所述样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸与次氯酸钠的混合溶液,所述化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物。
具体地,采用全自动化学发光仪作为检测工具,方法学模式为双抗体夹心法,即仪器依次加入50μL待测样本、50μL样本处理液、50μL第一试剂及50μL第二试剂,反应10min后进行磁分离清洗,清洗完之后仪器自动加入300μL化学发光底物液,之后将反应杯移到光电模块中采集光电值,仪器自动转换为浓度,显示测试结果。
本发明抑制素B的检测方法采用的是酶促化学发光法,其相较于酶联免疫法来说,免去了使用酶标板标记的麻烦,减少了批内差异。且其灵敏度与线性范围都较广。且样本孵育时间为10min,比很多同类型的试剂盒反应时间短。本发明抑制素B的检测方法具有灵敏度高,检测时间短,操作简便的优点。
实施例1灵敏度的检测
参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案对5份浓度近似检出限的低值样本进行检测,每份样本检测5次,对检测结果按照大小进行排序,符合低于生产企业提供的空白限数值(空白限为10pg/mL)的检测结果的数量应小于或等于3个,即可认为生产企业提供的空白限和检出限的设置基本合理,求得灵敏度为15pg/mL,由此可知晓,本发明抑制素B的检测方法具有较高的灵敏度。
表1灵敏度检测数据表
序号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 |
1 | 8.372 | 11.532 | 12.390 | 13.544 | 14.030 |
2 | 8.916 | 11.362 | 12.968 | 13.163 | 14.977 |
3 | 8.767 | 11.741 | 13.071 | 13.035 | 14.636 |
4 | 8.018 | 11.995 | 12.420 | 13.848 | 14.337 |
5 | 8.078 | 11.087 | 12.680 | 13.457 | 14.337 |
实施例2线性的检测
对浓度为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、1300.0pg/mL定标品做线性分析,计算线性相关系数r=0.9989,该试剂盒的线性范围为15pg/ml~1300pg/ml。具体地,图1中横坐标为样本浓度值(pg/mL),纵坐标为相对发光值(RLU),线性方程为y=535.41x+735.01。
表2线性范围检测结果
实施例3、准确度测试
取浓度为100pg/mL及500pg/mL两个抑制素B样品,每个样本浓度各做3个平行测试,用本试剂盒进行检测,计算相对偏差,其测量结果的相对偏差应在±10%范围内,说明本发明抑制素B的检测方法具有较高的准确度。
表3准确度检测分析结果
测定样本的浓度(pg/mL) | 测试结果(IU/L) | 相对偏差(%) |
100 | 99.57 | -0.43 |
500 | 488.62 | -2.28 |
实施例4、抗干扰实验
取待检测样品分别加入血红蛋白、甘油三酯、胆红素三种干扰物,用本发明提供的抑制素B化学发光检测试剂盒检测待测样本干扰物加入前后抑制素B的含量,根据NCCLS的文件标准,计算二者的偏差,以±10%为接受范围。由表4结果表明,相对偏差均在±10%以内,说明在存在干扰物的情况下,采用本发明提供的抑制素B化学发光检测试剂盒检测准确度仍然较高。
表4抗干扰实验数据
干扰物质 | 添加前 | 添加后 | 相对偏差 |
血红蛋白500mg/dL | 100 | 105 | 5% |
甘油三酯2500mg/dL | 100 | 103 | 3% |
胆红素12mg/dL | 100 | 107 | 7% |
以上所述仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书内容所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种抑制素B检测试剂盒,用于检测抑制素B,其特征在于,所述抑制素B检测试剂盒包括:
第一试剂,所述第一试剂为抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂;和
第二试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
2.如权利要求1所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述第一试剂为用由50mmol/LHEPES、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300、0.9%NaCl以及1.2%BSA组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的甲苯磺酰基磁颗粒固相试剂;和/或,
所述第二试剂为用由50mM HEPES、1.2%BSA、0.1%吐温-20、0.1%Proclin300及0.9%氯化钠组成的pH值为7.4的缓冲液稀释的酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液。
3.如权利要求1所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒中,所述抑制素B多克隆抗体与所述甲苯磺酰基化的磁微粒的质量比范围为1:50至1:100。
4.如权利要求3所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述甲基磺酰基化的磁微粒的粒径范围为1.0μm至3.0μm。
5.如权利要求1所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体中,所述抑制素B单克隆抗体与所述酶标记物的质量比范围为5:6至5:10。
6.如权利要求5所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述酶标记物为碱性磷酸酶。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述抑制素B检测试剂盒还包括样本处理液,所述样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸与次氯酸钠的混合溶液。
8.如权利要求7所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述样本处理液的pH值为10.0,其中,按体积份计,所述次氯酸钠的含量为0.5%。
9.如权利要求1至6中任一项所述的抑制素B检测试剂盒,其特征在于,所述抑制素B检测试剂盒还包括化学发光底物液,所述化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物;和/或,
所述抑制素B检测试剂盒还包括抑制素B校准品,其浓度分别为0.0pg/mL、15.0pg/mL、100.0pg/mL、500.0pg/mL、1000.0pg/mL、1300.0pg/mL的抑制素B溶液。
10.一种抑制素B的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
混合待测样本、样本处理液、第一试剂及第二试剂,反应后进行磁分离清洗,之后加入化学发光底物液;
检测化学底物发光液的相对发光强度,并根据检测到的相对发光强度,计算抑制素B的浓度;
其中,所述第一试剂抑制素B多克隆抗体包被的甲苯磺酰基化的磁微粒固相试剂,所述第二试剂为酶标记物标记的抑制素B单克隆抗体溶液,所述样本处理液为3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸与次氯酸钠的混合溶液,所述化学发光底物液为1,2-二氧环已烷衍生物。
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