CN112710858A - 试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种试剂盒及其制备方法和应用，涉及药物检测技术领域，所述试剂盒用于检测β人绒毛膜促性腺激素的含量，包括：R1试剂，包括包被有链霉亲和素的磁珠以及pH值为7.2～7.6的第一缓冲液；R2试剂，包括酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH值为6.3～6.7的第二缓冲液；以及，R3试剂，包括生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH值为7.2～7.6的第三缓冲液。本发明提出的试剂盒，在检测β人绒毛膜促性腺激素的含量时，灵敏度高、稳定性和重复性好。

Description

试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种试剂盒及其制备方法和应 用。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白 激素，HCG从胎盘滋养层通过血循环进入卵巢，刺激黄体分泌孕酮维持黄体 功能，使子宫内膜保持适合胚胎着床发育的状态。血清β-HCG在受精后6～7 天可检测出，是女性妊娠激素中最早分泌的激素之一，妊娠正常孕妇的血清 β-HCG在随孕周的增加而成倍递增，是早孕检测的可靠指标，同时也是判定 妊娠是否正常的重要指标。不同的妊娠个体血清β-HCG水平存在差异，停经 时间、滋养细胞数量和质量、受精卵着床部位等是主要影响因素，其差异高 达20倍。有研究证明宫外孕患者血清β-HCG增长速度慢于正常宫内妊娠孕 妇，这对于宫外孕的早期诊断具有极高的指导意义。足量的血清β-HCG是胚 囊正常发育的保证，可使妊娠黄体不断退化。宫内妊娠血清β-HCG不足往往 提示妊娠黄体发育不良，从而影响到绒毛的发育和胎盘形成，容易导致流产。 除此之外血清β-HCG还可以作为是临床诊断葡萄胎和滋养细胞肿瘤等疾病及 治疗后随访的重要指标。

目前用于检测β-HCG的方法主要有胶体金试纸检测法、荧光免疫层析法、 酶联免疫法、化学发光等非均相免疫分析法。胶体金试纸检测法与荧光免疫 层析法均属层析法，两者都有方便快捷，试剂稳定等特点，但胶体金试纸检 测法目前无法实现定量测试，荧光免疫层析法可通过用两条测试线的比值或 测试线与控制线的比值来确定被检测物的量，但二者均有灵敏度低，线性范 围窄的缺点。酶联免疫法操作繁琐，定量检测效果不佳，线性范围窄，测试 结果易受人为因素影响；也有使用均相化学发光免疫分析定量测试β-HCG，但其灵敏度与重复性较非均相化学发光免疫分析来说还是较差的。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种试剂盒及其制备方法和应用，旨在提供一 种灵敏度高、稳定性和重复性好的用于检测β人绒毛膜促性腺激素的含量的 试剂盒。

为实现上述目的，本发明提出一种试剂盒，用于检测β人绒毛膜促性腺 激素的含量，所述试剂盒包括：

R1试剂，包括包被有链霉亲和素的磁珠以及pH值为7.2～7.6的第一缓冲 液；

R2试剂，包括酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH值为 6.3～6.7的第二缓冲液；以及，

R3试剂，包括生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH 值为7.2～7.6的第三缓冲液。

可选地，所述第一缓冲液的pH值为7.4；和/或，

所述第二缓冲液的pH值为6.5；和/或，

所述第三缓冲液的pH值为7.4。

可选地，所述第一缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)；和/或，

所述第二缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300 (v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)；和/或，

所述第三缓冲液包括：50mM Tris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、 0.1％吐温-20(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)。

可选地，所述R1试剂中所述包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.05％～ 0.1％(w/v)；和/或，

所述R2试剂的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中，酶包括碱 性磷酸酶。

可选地，所述R2试剂的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中， 所述β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与酶的质量之比为5：(6～10)。

可选地，所述R3试剂的生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 中，所述β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：(6～10)。

可选地，所述试剂盒还包括β人绒毛膜促性腺激素校准品，所述β人绒 毛膜促性腺激素校准品包括浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、800mIU/mL、 1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺激素溶液。

可选地，所述的试剂盒还包括发光底物液，所述发光底物液包括AMPPD。

本发明进一步提出一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

将包被有链霉亲和素的磁珠加入到第一缓冲液中混合均匀，得到R1试 剂；

将活化后的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与酶溶液混合反应制得酶 标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将酶标记的β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体加入到第二缓冲液中混合均匀，得到R2试剂；

将活化后的生物素与β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体混合反应制得生 物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将所述生物素标记的β人绒 毛膜促性腺激素单克隆抗体加入到第三缓冲液中混合均匀，得到R3试剂。

本发明进一步提出一种β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法，采用 如上所述的试剂盒，所述β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法包括以下 步骤：

将待测样本与R2试剂混合均匀，孵育4～6min，再依次加入R3试剂和 R1试剂，继续孵育4～6min后，得到混合液体；

将所述混合液体磁分离得含磁珠物，将含磁珠物清洗后，加入发光底物 液，混合均匀，得到待测液；

检测所述待测液的发光强度；

根据发光强度计算β人绒毛膜促性腺激素的含量。

本发明提供的技术方案中，采用酶促化学发光法，选用包被有链霉亲和 素的磁珠、酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和生物素标记的β人 绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，一方面，链霉亲和素偶联时不存在位阻效应， 可均匀连接至磁珠表面，同时链霉亲和素与生物素结合，消除抗体与磁珠的 位阻效应，使得抗体可均匀连接至磁珠表面，易于控制试剂批间差，此外， 亲和素与生物素间的结合呈高度特异性，在具有多层次放大作用提高灵敏度 的同时，并不会增加特异性干扰；另一方面，在检测待测样本的过程中，抗原与抗体结合，样本的β人绒毛膜促性腺激素夹在酶标记的β人绒毛膜促性 腺激素单克隆抗体和生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体之间， 形成“双抗体夹心”结构，只需加入发光底物液并检测发光强度，发光强度 与待测抗原含量呈正比，使用相应的计算方法即可计算出样本中待测抗原的 浓度。本发明通过酶促化学发光法，具有很高的检测灵敏度、检测结果稳定、 重复性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1试剂盒的线性范围检测图；

图2为本发明实施例1试剂盒的临床样本测试比对图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域 普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现 时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前用于检测β-HCG的方法主要有胶体金试纸检测法、荧光免疫层析法、 酶联免疫法、化学发光等非均相免疫分析法。胶体金试纸检测法与荧光免疫 层析法均属层析法，两者都有方便快捷，试剂稳定等特点，但胶体金试纸检 测法目前无法实现定量测试，荧光免疫层析法可通过用两条测试线的比值或 测试线与控制线的比值来确定被检测物的量，但二者均有灵敏度低，线性范 围窄的缺点。酶联免疫法操作繁琐，定量检测效果不佳，线性范围窄，测试 结果易受人为因素影响；也有使用均相化学发光免疫分析定量测试β-HCG，但其灵敏度与重复性较非均相化学发光免疫分析来说还是较差的。

鉴于此，本发明提出一种试剂盒及其制备方法和应用，旨在提供一种灵 敏度高、稳定性和重复性好的用于检测β人绒毛膜促性腺激素的含量的试剂 盒。

在本发明提供的试剂盒的一实施例中，所述试剂盒，用于检测β人绒毛 膜促性腺激素的含量，所述试剂盒包括：R1试剂、R2试剂、R3试剂及发光 底物液，其中，R1试剂包括包被有链霉亲和素的磁珠以及pH值为7.2～7.6的 第一缓冲液；R2试剂包括酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH 值为6.3～6.7的第二缓冲液；R3试剂包括生物素标记的β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体以及pH值为7.2～7.6的第三缓冲液。

本发明提供的技术方案中，采用酶促化学发光法，选用包被有链霉亲和 素的磁珠、酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和生物素标记的β人 绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，一方面，链霉亲和素为小分子物质，偶联时 不存在位阻效应，可均匀连接至磁珠表面，同时链霉亲和素与生物素结合， 消除抗体与磁珠的位阻效应，使得抗体可均匀连接至磁珠表面，易于控制试 剂批间差，此外，亲和素与生物素间的结合呈高度特异性，在具有多层次放 大作用提高灵敏度的同时，并不会增加特异性干扰，而且其结合特性不会因 反应试剂的高度稀释而受影响，以此很好的避免了易出现的HOOK效应；另 一方面，在检测待测样本的过程中，抗原与抗体结合，样本的β人绒毛膜促 性腺激素夹在酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和生物素标记的β 人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体之间，形成“双抗体夹心”结构，只需加入 发光底物液并检测发光强度，发光强度与待测抗原含量呈正比，使用相应的 计算方法即可计算出样本中待测抗原的浓度。本发明通过酶促化学发光法，具有很高的检测灵敏度、检测结果稳定、重复性好、检测线性范围宽。

酶促化学发光法相对于其他类型发光来说，反应速度快，在很短时间内 提供正确可靠的结果，有利于信号的检测，提供了试剂盒的灵敏度和特异性 性能。本发明的试剂盒结构简单，成本低廉，大大降低了生产成本。且其操 作简单，更能提高检测效率。此外，亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原- 抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性； 而且酸、碱、变性剂、蛋白水解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，在 此应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。

进一步地，为了提升试剂盒的灵敏度，优选地，第一缓冲液的pH值为 7.4；第二缓冲液的pH值为6.5；第三缓冲液的pH值为7.4。可以理解的是， 上述三个pH值可以只满足其中一个，也可以同时满足，而作为本发明的优选 实施例，上述三个pH值同时满足，得到的试剂盒的灵敏度最高。

优选地，第一缓冲液包括：50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.1％吐 温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)； 其中，BSA为牛血清蛋白。

第二缓冲液包括：50mM MES(2-吗啉乙磺酸)、0.1％吐温-20(v/v)、 0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)。

第三缓冲液包括：50mM Tris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、 0.1％吐温-20(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)。

对于R1试剂中所述包被有链霉亲和素的磁珠的浓度，本发明不做限制， 优选地，R1试剂中所述包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.05％～0.1％ (w/v)，其中，包被有链霉亲和素的磁珠的质量的单位取mg，R1试剂的体 积的单位取ml，也就是说，每100ml的R1试剂中中含有链霉亲和素的磁珠 的质量为0.05～0.1mg。

此外，优选地，R2试剂的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中， 酶包括碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的 羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称 为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶 的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团 加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中 的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。

在R2试剂中，本发明对于酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中 两者的质量比，也不做限制，优选地，所述β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗 体与酶的质量之比为5：(6～10)。

类似地，在R3试剂中，生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 中，两者的质量比，本发明也不做限制，优选地，所述β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：(6～10)。

进一步地，本发明实施例提出的试剂盒还包括β人绒毛膜促性腺激素校 准品，β人绒毛膜促性腺激素校准品包括浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、 800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺 激素溶液。

此外，本发明实施例提出的试剂盒还包括发光底物液，所述发光底物液 包括AMPPD。AMPPD为1，2-二氧环已烷衍生物，它是一种生物化学领域 中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提 供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和 金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持 着整个分子结构的稳定。在通常情况下，这种化合物很稳定。

本发明进一步提出一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

S10、将包被有链霉亲和素的磁珠加入到第一缓冲液中混合均匀，得到 R1试剂。

本步骤用以制备R1试剂，以下给出本步骤的一具体实施方式：

取50mM Tris、0.1％吐温-20、0.1％Proclin300、0.9％NaCl、1.2％BSA混 合，得到pH值为7.4的第一缓冲液，用第一缓冲液将链霉亲和素磁珠稀释得 到0.05％～0.1％的包被有链霉亲和素的磁珠溶液，即为R1试剂。

S20、将活化后的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与酶溶液混合反应制 得酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将酶标记的β人绒毛膜促性 腺激素单克隆抗体加入到第二缓冲液中混合均匀，得到R2试剂。

具体地，在本发明实施例中，酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗 体的制备方法如下：

向β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中依次加入PBS缓冲液和EDC水溶 液，活化后加入酶溶液并混匀，避光静置后，在封闭条件下加入Tris缓冲液 进行反应，再加入磷酸二乙脂继续反应，得混合液，将所述混合液除盐纯化 后，加入甘油，得到酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

其中，磷酸二乙脂作为封闭剂，作用是终止反应。

以下给出本步骤的一具体实施方式：

取100ul的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，加入250ul浓度为0.1M， pH值为7.0的PBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液，混匀，加入20ul新配置的 10.0mg/ml EDC水溶液，活化30min，然后加入200ul浓度为5mg/ml的碱性 磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用含1％BSA的0.1M，pH值 为7.4的Tris缓冲液室温封闭反应30min，再加入0.5％磷酸二乙脂于室温下 继续反应30min，用30KD的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20℃，得到酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

取制备的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，用第二缓冲液按 酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与第二缓冲液的体积比为1:500 混合后，即得R2试剂。

S30、将活化后的生物素与β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体混合反应制 得生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将所述生物素标记的β 人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体加入到第三缓冲液中混合均匀，得到R3试 剂。

具体地，在本发明实施例中，生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克 隆抗体的制备方法如下：

向活化生物素中依次加入PBS缓冲液和β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗 体水溶液，混合均匀后，静置后离心纯化，得液体，向所述液体中加入甘油， 得到生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

以下给出本步骤的一具体实施方式：

取100μL浓度为5.0mg/ml的活化生物素，加入200μL浓度为0.1M，pH 值为8.5的PBS缓冲液，混匀，加入10μL新配置的5.0mg/ml总β人绒毛膜 促性腺激素单克隆抗体水溶液，室温避光反应2小时后取出，脱盐柱离心纯 化，收集离心得到的液体，加一半甘油，保存于-20℃，得到生物素标记的β 人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

取制备的生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，用第三缓冲 液按生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与第三缓冲液的体积比 为1:1000混合后，即得R3试剂。

可以理解的是，上述R1试剂、R2试剂及R3试剂的制备步骤不分先后顺 序，也即本发明对于步骤S10、S20及S30的先后顺序不做限制。

本发明进一步提出一种β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法，采用 如上所述的试剂盒，所述β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法包括以下 步骤：

S100、将待测样本与R2试剂混合均匀，孵育4～6min，再依次加入R3 试剂和R1试剂，继续孵育4～6min后，得到混合液体；

S200、将所述混合液体磁分离得含磁珠物，将含磁珠物清洗后，加入发 光底物液，混合均匀，得到待测液；

S300、检测所述待测液的发光强度；

S400、根据发光强度计算β人绒毛膜促性腺激素的含量。

本发明提出的上述β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法，在外加磁 场作用下，通过生物素-亲和素系统，并结合酶标记的β人绒毛膜促性腺激素 单克隆抗体，与人绒毛膜促性腺激素形成“双抗体夹心”结构，将免疫反应 形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗磁微粒复合物，加入 发光底物液，通过发光仪检测反应的发光强度，发光强度与待测抗原含量呈 正比，使用相应的计算方法即可计算出样本中待测抗原的浓度。通过这种酶 促化学发光法，提供一种具有很高的检测灵敏度，检测结果稳定、重复性好、检测线性范围宽的检测方法。

以下给出β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法的一实施例：

取血清为待测样本，以全自动化学发光仪(CL-2000)为检测工具，加入 20μL的待测样本与100μL R2试剂孵育5min、再加入50μL R3试剂及50 μL R1试剂孵育5min，进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入底物300μ L后，将反应杯移到光电模块中采集光电强度，仪器自动转换为浓度，显示测 试结果。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应 当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1试剂盒

R1试剂：包被有链霉亲和素的磁珠、第一缓冲液[50mM Tris、0.1％吐温 -20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)]， 其中，第一缓冲液的pH值为7.4，包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.05％ mg/ml；

R2试剂：酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体、第二缓冲液[50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及 1.2％BSA(w/v)]，其中，第二缓冲液的pH值为6.5，β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体与酶的质量之比为5：6；

R3试剂：生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，第三缓冲液 [50mMTris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、0.1％吐温-20(v/v)、 0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)]，其中，第三缓冲液的pH值为 7.4，β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：6；

发光底物液：AMPPD；

β人绒毛膜促性腺激素校准品：浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、 800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺 激素溶液。

实施例2试剂盒

R1试剂：包被有链霉亲和素的磁珠、第一缓冲液[50mM Tris、0.1％吐温 -20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)]， 其中，第一缓冲液的pH值为7.4，包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.1％ mg/ml；

R2试剂：酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体、第二缓冲液[50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及 1.2％BSA(w/v)]，其中，第二缓冲液的pH值为6.5，β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体与酶的质量之比为5：10；

R3试剂：生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，第三缓冲液 [50mMTris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、0.1％吐温-20(v/v)、 0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)]，其中，第三缓冲液的pH值为7.4，β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：10；

发光底物液：AMPPD。

实施例3试剂盒

R1试剂：包被有链霉亲和素的磁珠、第一缓冲液[50mM Tris、0.1％吐温 -20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)]， 其中，第一缓冲液的pH值为7.4，包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.075％ mg/ml；

R2试剂：酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体、第二缓冲液[50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及 1.2％BSA(w/v)]，其中，第二缓冲液的pH值为6.5，β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体与酶的质量之比为5：8；

R3试剂：生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，第三缓冲液 [50mMTris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、0.1％吐温-20(v/v)、 0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)]，其中，第三缓冲液的pH值为 7.4，β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：8；

发光底物液：AMPPD；

β人绒毛膜促性腺激素校准品：浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、 800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺 激素溶液。

实施例4试剂盒

R1试剂：包被有链霉亲和素的磁珠、第一缓冲液[50mM Tris、0.1％吐温 -20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)]， 其中，第一缓冲液的pH值为7.4，包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.08％；

R2试剂：酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体、第二缓冲液[50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及 1.2％BSA(w/v)]，其中，第二缓冲液的pH值为6.5，β人绒毛膜促性腺激 素单克隆抗体与酶的质量之比为5：9；

R3试剂：生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，第三缓冲液[50mMTris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、0.1％吐温-20(v/v)、 0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)]，其中，第三缓冲液的pH值为 7.4，β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：7；

发光底物液：AMPPD；

β人绒毛膜促性腺激素校准品：浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、 800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺 激素溶液。

实施例5试剂盒的制备

根据实施例1至4对应的各配比的物质制备试剂盒，包括以下步骤：

(1)R1试剂的制备：取Tris、吐温-20、Proclin300、NaCl、BSA混合， 得到pH值为7.4的第一缓冲液，用第一缓冲液将链霉亲和素磁珠稀释得到包 被有链霉亲和素的磁珠溶液，即为R1试剂。

(2)R2试剂的制备：取β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，加入pH值 为7.0的PBS(磷酸缓冲盐溶液)缓冲液，混匀，加入新配置的EDC水溶液， 活化，然后加入碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用含BSA 的pH值为7.4的Tris缓冲液室温封闭反应30min，再加入磷酸二乙脂于室温 下继续反应30min，用30KD的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半 甘油，保存于-20℃，得到酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。取制 备的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，用第二缓冲液按酶标记的 β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与第二缓冲液的体积比为1:500混合后，即 得R2试剂。

(3)R3试剂的制备：取活化生物素，加入pH值为8.5的PBS缓冲液， 混匀，加入β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体水溶液，室温避光反应2小时 后取出，脱盐柱离心纯化，收集离心得到的液体，加一半甘油，保存于-20℃， 得到生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。取制备的生物素标记 的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，用第三缓冲液按生物素标记的β人绒 毛膜促性腺激素单克隆抗体与第三缓冲液的体积比为1:1000混合后，即得R3 试剂。

实施例5β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测

取血清为待测样本，以全自动化学发光仪(CL-2000)为检测工具，加入 20μL的待测样本与100μL实施例1中的试剂盒的R2试剂孵育5min、再加 入50μL R3试剂及50μL R1试剂孵育5min，进行磁分离清洗，清洗完后仪 器自动向含磁珠物中加入发光底物液300μL后，将反应杯移到光电模块中采 集光电强度，仪器自动转换为浓度，显示测试结果，为31.37mIU/mL。

1、灵敏度的检测

参照CLSI EP17-A文件推荐的实验方案，计算实施例1的试剂盒的灵敏 度，得出试剂盒的灵敏度为1.2mIU/mL，灵敏度较高。

2、线性范围

对实施例1中试剂盒的β人绒毛膜促性腺激素校准品中浓度分别为 1.2mIU/mL、400mIU/mL、800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、 2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺激素溶液做线性分析，分别得表1和图1所 示。

表1实施例1试剂盒的线性范围检测结果

浓度(mIU/mL)	发光强度(RLU值)
		0	4581
400	691366
		800	1197846
1200	1832984
		1600	2578413
2000	3148743

计算得线性相关系数r＝0.9979，该试剂盒的线性范围为1.2-2000mIU/mL， 具体地，图1中横坐标为样本浓度值(mIU/mL)，纵坐标为相对发光强度 (RLU)，线性方程为y＝1572.6x+3006.3，线性良好。

3、临床样本测试比对

用实施例1的试剂盒与雅培公司试剂盒同时检测临床血清。其检测结果 见图2。以雅培试剂盒测得的β人绒毛膜促性腺激素的含量(雅培Total-βhCG 测值)为横坐标X，浓度为mIU/mL，以实施例1测定的测得的β人绒毛膜促 性腺激素的含量(本试剂盒Total-βhCG测值)为纵坐标y，浓度单位为mIU/mL，作回归方程，得图2，请参阅图2，两者的相关方程为： y＝1.0036x+0.2055，相关系数为0.9989，K值为1.0036，其相关性很好。

4、准确度测定

取实施例1的试剂盒测定浓度为31.09mIU/mL和1016.44mIU/mL的样本， 平行测定3次，取均值，测试结果如下表2，

表2实施例1的试剂盒的准确度测定

测定样品的浓度(mIU/mL)	测定结果均值(mIU/mL)	相对偏差(％)
			31.09	29.52	-5.05
1016.44	1023.71	0.72

由表2可以看出，实施例1的试剂盒相对偏差＜10％。

5、批间差测定

取三个批次的实施例1的试剂盒分别测试浓度为31.09mIU/mL和 1016.44mIU/mL的样本，各重复10次，计算其变异系数CV，得表3，可以看 出，两个的CV<15％，表明稳定性良好。

表3实施例1的试剂盒的批间差测定

综上所述，本发明提出的试剂盒，在检测β人绒毛膜促性腺激素的含量 时，灵敏度和准确度高、稳定性和重复性好，可广泛应用于β人绒毛膜促性 腺激素的含量的检测中。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于 本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神 和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专 利保护范围内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其特征在于，用于检测β人绒毛膜促性腺激素的含量，其特征在于，所述试剂盒包括：

R1试剂，包括包被有链霉亲和素的磁珠以及pH值为7.2～7.6的第一缓冲液；

R2试剂，包括酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH值为6.3～6.7的第二缓冲液；以及，

R3试剂，包括生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体以及pH值为7.2～7.6的第三缓冲液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液的pH值为7.4；和/或，

所述第二缓冲液的pH值为6.5；和/或，

所述第三缓冲液的pH值为7.4。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液包括：50mM Tris、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)；和/或，

所述第二缓冲液包括：50mM MES、0.1％吐温-20(v/v)、0.1％Proclin300(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及1.2％BSA(w/v)；和/或，

所述第三缓冲液包括：50mM Tris、1％B-环糊精(w/v)、1％BSA(w/v)、0.1％吐温-20(v/v)、0.9％NaCl(w/v)及0.05％Proclin300(v/v)。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中所述包被有链霉亲和素的磁珠的浓度为0.05％～0.1％(w/v)；和/或，

所述R2试剂的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中，酶包括碱性磷酸酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中，所述β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与酶的质量之比为5：(6～10)。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R3试剂的生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体中，所述β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与生物素的质量之比为5：(6～10)。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括β人绒毛膜促性腺激素校准品，所述β人绒毛膜促性腺激素校准品包括浓度分别为1.2mIU/mL、400mIU/mL、800mIU/mL、1200mIU/mL、1600mIU/mL、2000mIU/mL的β人绒毛膜促性腺激素溶液。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括发光底物液，所述发光底物液包括AMPPD。

9.一种如权利要求1-8任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将包被有链霉亲和素的磁珠加入到第一缓冲液中混合均匀，得到R1试剂；

将活化后的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体与酶溶液混合反应制得酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将酶标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体加入到第二缓冲液中混合均匀，得到R2试剂；

将活化后的生物素与β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体混合反应制得生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，将所述生物素标记的β人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体加入到第三缓冲液中混合均匀，得到R3试剂。

10.一种β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1至8任意一项所述的试剂盒，所述β人绒毛膜促性腺激素的含量的检测方法包括以下步骤：

将待测样本与R2试剂混合均匀，孵育4～6min，再依次加入R3试剂和R1试剂，继续孵育4～6min后，得到混合液体；

将所述混合液体磁分离得含磁珠物，将含磁珠物清洗后，加入发光底物液，混合均匀，得到待测液；

检测所述待测液的发光强度；

根据发光强度计算β人绒毛膜促性腺激素的含量。

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