DE3115115C2 - Immunologisches Verfahren - Google Patents

Immunologisches Verfahren

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Abstract

Es wird ein Enzymimmunverfahren nach dem sogenannten "Sandwich-Prinzip" beschrieben. Charakteristisch für das neue Verfahren ist, daß nicht zwei Inkubationen durchgeführt werden, sondern daß die zu bestimmende Substanz gleichzeitig mit beiden immunologisch aktiven Reaktionspartnern während einer einzigen Inkubation zur Umsetzung gebracht wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Enzymimmunverfahren nach dem sogenannten "Sandwich-Prinzip". Nach diesem Prinzip wird die zu bestimmende Substanz, die ein Antigen, ein Antikörper oder ein Hapten sein kann, mit zwei immunologisch aktiven Reaktionspartnern zur Umsetzung gebracht. In der Regel ist einer dieser immunologisch aktiven Reaktionspartner an einen wasserunlöslichen Träger gebunden, während der andere mit einem geeigneten Enzym versehen ist. In der Praxis wird die zu bestimmende Substanz zuerst mit dem an einen Träger gebundenen Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht, worauf nach Phasentrennung und Waschen die inzwischen an den Träger immunologisch gebundene Substanz mit dem zweiten, enzymmarkierten Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht wird. Nach erneuter Phasentrennung erfolgt die enzymatische Reaktion zum quantitativen Nachweis der zu bestimmenden Substanz entweder in der festen oder flüssigen Phase.
  • In der DE-OS 27 44 836 wird ein immunochemisches Meßverfahren beschrieben, das eine Kombination aus der Sandwich-Methode und der konkurrierenden Methode darstellt und welches dadurch gekennzeichnet ist, daß nach der Umsetzung zwischen dem zu messenden Antigen und dem insolubilisierten Antikörper zu dem Antigen der Antigen/Antikörper-Komplex ohne Abtrennung von der Reaktionsmischung zur kontinuierlichen Umsetzung mit dem markierten Antikörper gebracht wird.
  • In der DE-OS 29 25 565 wird ein Einschritt-Sandwich-Verfahren beschrieben, das durch ein Radioimmun-Verfahren unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern exemplifiziert wird. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern bzw. die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und eines polyklonalen Antikörpers sowie die Verwendung eines Enzymimmunverfahrens wird in dieser Druckschrift in keiner Weise nahegelegt.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschend gefunden, daß man entgegen der bisherigen Meinung dieses "Eintopf-Verfahren", bei dem die zu bestimmende Substanz gleichzeitig mit beiden immunologisch aktiven Reaktionspartnern während einer einzigen Inkubation zur Umsetzung gebracht wird, auch dann durchführen kann, wenn man als immunologische Reaktionspartner zwei verschiedene monoklonale Antikörper oder einen monoklonalen Antikörper und einen Antikörper aus einer unterschiedlichen Tierspezies einsetzt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein immunologisches Verfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen einer Substanz mit einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der mit einem Enzym versehen ist, sowie einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist oder wird, durch Inkubieren der zu bestimmenden Substanz mit den immunologisch aktiven Reaktionspartnern, anschließende Trennung von fester und flüssiger Phase und Messen des Ausmaßes der Enzymmarkierung entweder in der festen oder in der flüssigen Phase als Ausmaß für die Menge der zu bestimmenden Substanz, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als immunologisch aktive Reaktionspartner zwei verschiedene monoklonale Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper und ein Antikörper aus einer unterschiedlichen Tierspezies eingesetzt werden, die mit der zu bestimmenden Substanz von Anfang an gemeinsam inkubiert werden.
  • Als zu bestimmende Substanz können all jene Bestandteile in physiologischen Flüssigkeiten, Zell- oder Gewebeextrakten genannt werden, für die immunologische Reaktionspartner vorhanden sind oder gebildet werden können, und die zwei oder mehrere immunologisch aktive Stellen besitzen. Dazu gehören Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Enzyme, Hormone, Polysaccharide, Alkaloide. Bevorzugte immunologisch aktive Substanzen sind die natürlichen Antigene, wie Hormone, Enzyme, organspezifische Antigene, Bindegewebekomponenten, Blutzellenantigene, Plasmaproteine, pathologische Globuline. Besonders bevorzugte Substanzen sind das carcinoembryonale Antigen (CEA) sowie das menschliche Choriongonadotropin (HGG).
  • Bei der erfindungsgemäßen Methode dient der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einem Enzym versehen ist, als Indikator der immunologischen Reaktion. Bevorzugte Enzyme sind die alkalische Phosphatase, die Malat-Dehydrogenase, die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, die Glucose-Oxidase, die Glucoamylase, die Galaktosidase und die Acetylcholinesterase. Eine besonders bevorzugte Enzym-Markierung ist jene mit Peroxidase aus Meerrettich.
  • Das Enzym als Indikator der immunologischen Reaktion wird in der flüssigen, vorzugsweise aber in der festen Phase nach bekannten Methoden gemessen und ist ein Ausmaß für die Menge der zu bestimmenden Substanz. Bei der Peroxidase aus Meerrettich als Markierung wird vorzugsweise die Enzymmenge auf Grund der vorhandenen katalytischen Aktivität gemessen, die mit Hilfe von H&sub2;O&sub2; und o-Phenylendiamin als Redoxindikator bestimmt wird. Dabei wird nach einer 30minütigen katalytischen Reaktion die Farbintensität des oxidierten Redoxindikators photometrisch gemessen.
  • Der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner dient der Abtrennung der zu bestimmenden Substanz aus der Analysenprobe. Für diesen Trennschritt kann der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner von Anfang an an einen wasserlöslichen Träger gebunden sein oder dann während oder nach der immunologischen Reaktion an einen entsprechenden Träger gebunden werden.
  • Als wasserunlösliche Träger für den zweiten immunologisch aktiven Reaktionspartner sind geeignet: organische und anorganische Polymere (Amylase, Dextrane, native oder modifizierte Cellulose, Polyacrylamid, Agarose, Magnetit, poröses Glaspulver, Polyvinylidenfluorid und Latex), die Innenwand von Testgefäßen (Teströhrchen, Titrierplatten oder Küvetten aus Glas oder Kunststoff) sowie die Oberfläche von festen Körpern (Glas- und Kunststoffstab, Stab mit endständiger Verdickung, Stab mit endständigen Flügeln oder Lamellen). Besonders geeignete Träger für die erfindungsgemäße Methode sind Glas- und Kunststoffkugeln.
  • Der zweite immunologisch aktive Reaktionspartner kann an den wasserunlöslichen Träger physikalisch (adsorptiv) oder chemisch gebunden sein oder mit Hilfe eines weiteren Reaktionspartners, der seinerseits an einen Träger gebunden ist, während oder nach der Reaktion gebunden werden.
  • Wesentlich für die erfindungsgemäße Methode ist, daß die zu bestimmende Substanz mindestens zwei immunologisch aktive Stellen (Epitope) besitzt, die von den beiden immunologisch aktiven Reaktionspartnern, dem an einen Träger gebundenen und dem mit einem Enzym versehenen Reaktionspartner, erkannt und zur Reaktion gebracht werden können. Als immunologisch aktive Reaktionspartner werden zwei verschiedene monoklonale Antikörper bzw. ein monoklonaler Antikörper und ein Antikörper aus einer unterschiedlichen Tierspezies benützt, wobei die beiden Kombinationen beide mit der zu bestimmenden Substanz reagieren, aber je auf verschiedene immunologisch aktive Stellen gerichtet sind. Zur Bestimmung von Antigenen ist die Kombination von Antikörpern von verschiedenen Klons oder von monoklonalen Antikörpern und Antikörpern aus einer unterschiedlichen Tierspezies besonders geeignet.
  • Für die immunologische Reaktion kann die Probe mit der zu bestimmenden Substanz direkt oder vorverdünnt oder in einer geeigneten Weise vorbehandelt eingesetzt werden. Zur Vorbehandlung kann die zu bestimmende Substanz isoliert, angereichert oder von störenden Bestandteilen befreit werden.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu bestimmende Substanz gleichzeitig mit dem Enzym-markierten sowie dem Träger-gebundenen immunologisch aktiven Reaktionspartner zur Umsetzung gebracht. Die Reihenfolge der Reagenzienzugabe richtet sich nach der Art des gewählten Trägersystems. Beim Arbeiten mit einer sensibilisierten Plastikkugel werden vorerst in einem geeigneten Teströhrchen der Enzym-markierte Reaktionspartner mit der zu bestimmenden Substanz zusammengegeben und anschließend die mit dem anderen Reaktionspartner sensibilisierte Kugel zugesetzt.
  • Die immunologische Reaktion wird zur Einhaltung eines optimalen pH-Wertes, der zwischen 4 und 9 liegen kann, in einem geeigneten Puffersystem durchgeführt. Bevorzugte Puffer sind beispielsweise Acetatpuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Triäthanolaminpuffer, Boratpuffer oder Glycinpuffer. Es können auch Puffermischungen eingesetzt werden.
  • Die immunologische Reaktion erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 0 bis 55°C. Normalerweise nimmt die immunologische Reaktionsgeschwindigkeit mit höheren Temperaturen zu, wodurch unter sonst gleichen Testbedingungen das Gleichgewicht schneller erreicht wird.
  • Die Inkubation der zu bestimmenden Substanz mit dem Enzym-markierten Reaktionspartner und dem Träger-gebundenen Reaktionspartner kann bis zum Erreichen des Gleichgewichtes erfolgen. Die immunologische Reaktion kann aber auch zu einem früheren Zeitpunkt abgestoppt werden, indem nach einer bestimmten Inkubationsdauer die feste und die flüssige Phase getrennt und das Ausmaß der Enzymmarkierung entweder in der flüssigen oder in der festen Phase bestimmt wird.
  • Bei der immunologischen Reaktion können Maßnahmen zur Stabilisierung der immunologischen Aktivität der Reaktionspartner und der zu bestimmenden Substanz sowie des Enzyms getroffen werden. Weiter können der Inkubationslösung Bestandteile, wie Proteine und Detergenzien, zur Ausschaltung unspezifischer Reaktionen, zur Verminderung von hemmenden Einflüssen oder zur Aktivierung zugegeben werden.
  • Die neue Methode gemäß vorliegender Erfindung ist außerordentlich empfindlich und zeichnet sich durch ihre Einfachheit in der Handhabung aus.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
    • Beispiel 1 Quantitative Bestimmung von CEA in Patientenplasmen mit einem monoklonalen CEA-Antikörper und einem gebräuchlichen CEA-Antikörper (Ziegen)
  • In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10×75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,2 mol/l NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, pH 6,5 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, 20% normales Ziegenserum und 0,2 µg/ml Ziegen-Anti-CEA-Peroxidase-Konjugat) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der CEA-Standards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA und 20 ng/ml CEA) und des CEA-Kontrollserums (5,0 ng/ml CEA±1,0 ng/ml) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus Anti-CEA-sensibilisierte Polystyrolkugel*) (∅=6,5 mm) zugefügt und bei 37°C während 16 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/l Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/l H&sub2;O&sub2; und 20 mmol/l o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml 1N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle I sind die Werte einer CEA-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit dem Radioimmunoassay von ROCHE erhalten wurden.
  • *) Die Herstellung des monoklonalen Maus Anti-CEA erfolgt in Analogie zu der in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, beschriebenen Methode, wobei als Ausgangszellinie für die Fusion die Myelomlinie Sp 2/01-AG verwendet wird, welche unter der Nr. CRL 8006 bei ATCC hinterlegt ist. Die Fusion erfolgt mit Milzzellen von Mäusen, die mit CEA immunisiert wurden. Die Immunisierung der Mäuse erfolgte in Analogie zu Tabelle 1 der erwähnten Publikation, wobei die ersten beiden Immunisierungen mit je 50 µg CEA erfolgten, die Immunisierungen 3 und 4 weggelassen wurden, Immunisierung 5 mit 50 µg CEA und die Immunisierungen 6-8 mit je 200 µg CEA erfolgten. Tabelle I &udf53;vz33&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Werte unter 2,5 ng/ml CEA liegen im Normalbereich, während Werte über 2,5 ng/ml im pathologischen Bereich liegen.
    • Beispiel 2 Quantitative Bestimmung von CEA in Patientenplasmen mit mit monoklonalen CEA-Antikörpern von zwei verschiedenen Clons
  • In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10×75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,2 mol/l NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, pH 6,5 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, 20% normales Ziegenserum und 0,15 µg/ml monoklonales Maus-Anti-CEA-Peroxidase-Konjugat*) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der CEA-Standards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA und 20 ng/ml CEA) und des CEA-Kontrollserums (5,0 ng/ml CEA±1,0 ng/ml) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus Anti-CEA-sensibilisierte*) Polystyrolkugel (∅=6,5 mm) zugefügt und bei 37°C während 16 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/l Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/l H&sub2;O&sub2; und 20 mmol/l o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (22°C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml 1N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle III sind die Werte einer CEA-Bestimmung aufgeführt und mit den Werten verglichen, wie sie mit dem Radioimmunoassay von ROCHE erhalten wurden.
  • *) Die Herstellung des monoklonalen Maus Anti-CEA erfolgt in Analogie zu der in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, beschriebenen Methode, wobei als Ausgangszellinie für die Fusion die Myelomlinie Sp 2/01-AG verwendet wird, welche unter der Nr. CRL 8006 bei ATCC hinterlegt ist. Die Fusion erfolgt mit Milzzellen von Mäusen, die mit CEA immunisiert wurden. Die Immunisierung der Mäuse erfolgte in Analogie zu Tabelle 1 der erwähnten Publikation, wobei die ersten beiden Immunisierungen mit je 50 µg CEA erfolgten, die Immunisierungen 3 und 4 weggelassen wurden, Immunisierung 5 mit 50 µg CEA und die Immunisierungen 6-8 mit je 200 µg CEA erfolgten. Es werden zwei verschiedene, geeignete monoklonale Antikörper verwendet, die gegen unterschiedliche Epitope des CEA Antigens gerichtet sind. Tabelle II &udf53;vz28&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Werte unter 2,5 ng/ml CEA liegen im Normalbereich, während Werte über 2,5 ng/ml im pathologischen Bereich liegen.
    • Beispiel 3 Quantitative Bestimmung von HCG in Serum/Plasma/Urin
  • In die erforderliche Teströhrchen (10×75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,1 mol/l NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, und 1,0 µg/ml monoklonales Maus-Anti-HCG-Peroxidase-Konjugat*) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der HCG-Standards (0, 25, 50, 100 und 250 mIU/ml HCG) zugemischt, je eine mit Kaninchen-Anti-HCG-sensibilisierte Polystryrolkugel (∅=6,5 mm) zugefügt und bei Raumtemperatur während 16 Stunden in wassergesättigter Atmosphäre inkubiert. Anschließend werden die Polystryrolkugeln dreimal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/l Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/l H&sub2;O&sub2; und 20 mmol/l o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (16-30°C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 2,0 ml 1N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte einer HCG-Bestimmung in Serum und in Urin aufgeführt.
  • *) Die Herstellung des monoklonalen Anti-HCG kann nach einer der in Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297-304 beschriebenen Methode erfolgen. HCG Bestimmung in Serum und in Urin 1. Standardkurven &udf53;vz10&udf54; &udf53;vu10&udf54; 2. Patientenproben &udf53;vz22&udf54; &udf53;vu10&udf54;
    • Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von HCG in Serum mit monoklonalen HCG-Antikörpern von zwei verschiedenen Klons
  • In die erforderliche Anzahl Teströhrchen (10×75 mm) werden je 0,2 ml Testlösung (0,1 mol/l NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,0 mit 2 g/l Rinderserumalbumin, und 1,0 µg/ml monoklonales Maus-Anti-HCG-Peroxidase-Konjugat*) pipettiert, 0,050 ml der zu analysierenden Patientenplasmen resp. der HCG-Standards (0, 25, 50, 100 und 200 mIU/ml HCG) zugemischt, je eine mit monoklonalem Maus-Anti-HCG-sensibilisierte Polystyrolkugel*) (∅=6,5 mm) zugefügt und z. B. bei 37°C während 2 Stunden inkubiert. Anschließend werden die Polystyrolkugeln dreimal mit je 2-5 ml dest. Wasser gewaschen, in je 0,5 ml Substratpuffer für die Aktivitätsbestimmung der Peroxidase (0,1 mol/l Kaliumcitratpuffer vom pH 5,0 mit 6 mmol/l H&sub2;O&sub2; und 20 mmol/l o-Phenylendiamin) transferiert und während 30 Minuten bei Raumtemperatur (16-30°C) inkubiert. Zum Abstoppen der peroxidatischen Aktivität sowie zur Intensivierung der Farbintensität werden 1,0 ml 2N HCl zugemischt und innerhalb von 30 Minuten die Extinktion bei der Wellenlänge 492 nm photometrisch gemessen. In der Tabelle sind die Werte von HCG-Bestimmungen in Serum aufgeführt.
  • *) Die Herstellung der monoklonalen Maus HCG-Antikörper erfolgt nach der in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, beschriebenen Methode. Es werden zwei verschiedene, geeignete monoklonale Antikörper verwendet, die gegen unterschiedliche Epitope des HCG-Antigens gerichtet sind. HCG Bestimmung in Humanserum (Mittelwerte aus Doppelbestimmungen) 1. Standardkurven &udf53;vz11&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Die HCG Werte der unten angeführten Beispiele von Patientenseren wurden aus der Standardkurve 1) abgelesen. Die Standardkurven 2), 3) und 4) wurden an einem andern Tag mit neuen HCG Standards ermittelt. 2. Patientenseren &udf53;vz15&udf54; &udf53;vu10&udf54;

Claims (11)

1. Immunologisches Verfahren zum Nachweisen bzw. Bestimmen einer Substanz mit einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der mit einem Enzym versehen ist, sowie einem immunologisch aktiven Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist oder wird, durch Inkubieren der zu bestimmenden Substanz mit den immunologisch aktiven Reaktionspartnern, anschließende Trennung von fester und flüssiger Phase und Messen des Ausmaßes der Enzymmarkierung entweder in der festen oder in der flüssigen Phase als Ausmaß für die Menge der zu bestimmenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktive Reaktionspartner zwei verschiedene monoklonale Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper und ein Antikörper aus einer unterschiedlichen Tierspezies eingesetzt werden, die mit der zu bestimmenden Substanz von Anfang an gemeinsam inkubiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz ein Antigen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Substanz carcinoembryonales Antigen (CEA) ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist, monoklonales Maus-anti-CEA ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes, anderes monoklonales Maus-anti-CEA ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes Ziegen-anti-CEA ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit Peroxidase markiertes Anti-CEA eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen HCG ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Reaktionspartner, der an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist, Kaninchen-anti-HCG ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der immunologisch aktive Reaktionspartner, der mit einer Markierung versehen ist, ein enzymmarkiertes, monoklonales Maus-anti-HCG ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mit Peroxidase markiertes Maus-anti-HCG eingesetzt wird.
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Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH320980A CH642458A5 (en) 1980-04-25 1980-04-25 Immunological method
CH589880A CH651396A5 (en) 1980-08-04 1980-08-04 Immunological method for detecting and determining carcinoembryonic antigen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3115115A1 DE3115115A1 (de) 1982-02-04
DE3115115C2 true DE3115115C2 (de) 1987-02-12

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AT (1) AT373398B (de)
AU (1) AU542563B2 (de)
CA (1) CA1160566A (de)
DE (1) DE3115115C2 (de)
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FR (1) FR2481318A1 (de)
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IT (1) IT1137344B (de)
NL (1) NL187545B (de)
NO (1) NO159620C (de)
SE (1) SE460930B (de)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0111762B1 (de) * 1980-06-20 1987-11-19 Unilever Plc Verfahren und Gerät zur Durchführung spezifischer Bindungsbestimmungen
US6406920B1 (en) 1980-06-20 2002-06-18 Inverness Medical Switzerland Gmbh Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
WO1982000364A1 (en) * 1980-07-16 1982-02-04 Jefferis R Methods of immuno-analysis using monoclonal antibodies
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4879219A (en) * 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
DE3174064D1 (en) * 1980-10-15 1986-04-17 Takeda Chemical Industries Ltd Method for immunochemical assay and kit therefor
US4837167A (en) * 1981-01-30 1989-06-06 Centocor, Inc. Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity
GB2118300B (en) * 1982-02-12 1985-06-19 Corning Glass Works Method of immunoassay
DK76983A (da) * 1982-03-05 1983-09-06 Takeda Chemical Industries Ltd Fremgangsmaade og reagens til immunkemisk bestemmelse af humant choriogonadotropin
DE3225027A1 (de) * 1982-07-05 1984-01-05 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Immunchemisches messverfahren
IL73938A (en) * 1984-01-02 1989-09-28 Boehringer Mannheim Gmbh Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors
US4690890A (en) * 1984-04-04 1987-09-01 Cetus Corporation Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay
US5011771A (en) * 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4935339A (en) * 1985-05-07 1990-06-19 Nichols Institute Diagnostics Delayed solid phase immunologic assay
US5770459A (en) * 1986-04-30 1998-06-23 Igen International, Inc. Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection
DE3638767A1 (de) * 1986-11-13 1988-05-26 Behringwerke Ag Laktoferrin enthaltendes inkubationsmedium fuer festphasenimmunometrisches verfahren und seine verwendung
US6881589B1 (en) 1987-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions
US5935779A (en) * 1988-11-03 1999-08-10 Igen International Inc. Methods for improved particle electrochemiluminescence assay
WO1989002078A1 (en) * 1987-08-25 1989-03-09 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Method for diagnosing chronic articular rheumatism
WO1989003997A1 (en) * 1987-10-30 1989-05-05 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Method for diagnosis of liver cancer
DE3807440A1 (de) * 1988-03-07 1989-09-21 Progen Biotechnik Gmbh Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit
US5962218A (en) * 1988-11-03 1999-10-05 Igen International Inc. Methods and apparatus for improved luminescence assays
US5798083A (en) * 1988-11-03 1998-08-25 Igen International, Inc. Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection
US5705402A (en) * 1988-11-03 1998-01-06 Igen International, Inc. Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets
US5746974A (en) * 1988-11-03 1998-05-05 Igen International, Inc. Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection
US5779976A (en) * 1988-11-03 1998-07-14 Igen International, Inc. Apparatus for improved luminescence assays
ATE179798T1 (de) * 1988-12-12 1999-05-15 Csl Ltd Festphase-immuno-testverfahren mit etikettierten konjugaten
US5176999A (en) * 1989-12-07 1993-01-05 Eastman Kodak Company Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use
ZA92803B (en) 1991-02-06 1992-11-25 Igen Inc Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescene asay including plurality of magnets
US6201109B1 (en) 1993-01-13 2001-03-13 Dade Behring Marburg Gmbh Assay for bone alkaline phosphatase
FR2710410B1 (fr) * 1993-09-20 1995-10-20 Bio Merieux Procédé et dispositif pour la détermination d'un analyte dans un échantillon .
JP3694894B2 (ja) * 1994-02-19 2005-09-14 生化学工業株式会社 正常アグリカンの測定法および測定用キット
US6569634B1 (en) 1998-09-01 2003-05-27 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Method for assaying human thymidylate synthase and assay kit
DE60035267T2 (de) 1999-04-12 2008-02-21 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Verfahren zur analyse der menge an intraabdominalem fettgewebe
JP5590796B2 (ja) 2005-06-03 2014-09-17 ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・システム 電気化学および単一ファラデー電極による電気化学発光

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1572220A (en) * 1976-10-07 1980-07-30 Mochida Pharm Co Ltd Immunochemical process of measuring physiologically active substances
GB1549069A (en) * 1976-12-10 1979-08-01 Erba Farmitalia Enzyme linked immunoassay
US4244940A (en) * 1978-09-05 1981-01-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Single-incubation two-site immunoassay
WO1982000058A1 (en) * 1980-06-20 1982-01-07 Porter P Processes and apparatus for carrying out specific binding assays

Also Published As

Publication number Publication date
ATA186481A (de) 1983-05-15
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NO159620B (no) 1988-10-10
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IT1137344B (it) 1986-09-10
AT373398B (de) 1984-01-10
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IT8121122A0 (it) 1981-04-13
FR2481318B1 (de) 1984-10-19
NL8101860A (nl) 1981-11-16
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DK155881A (da) 1981-10-26
SE8102558L (sv) 1981-10-26
DK151399B (da) 1987-11-30
GB2074727A (en) 1981-11-04

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