DK151399B - Immunologisk fremgangsmaade til paavisning af et stof ved omsaetning med immunologisk aktive reaktionsdeltagere - Google Patents
Immunologisk fremgangsmaade til paavisning af et stof ved omsaetning med immunologisk aktive reaktionsdeltagere Download PDFInfo
- Publication number
- DK151399B DK151399B DK155881AA DK155881A DK151399B DK 151399 B DK151399 B DK 151399B DK 155881A A DK155881A A DK 155881AA DK 155881 A DK155881 A DK 155881A DK 151399 B DK151399 B DK 151399B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cea
- substance
- immunologically active
- determined
- hcg
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i 151399
Den foreliggende opfindelse angår en enzymimmunfremgangsmåde ifølge det såkaldte "sandwich-princip". Ifølge dette princip omsættes det stof, der skal bestemmes, og som kan være et antigen, et antistof eller en hapten, med to immunologisk aktive reaktionsdeltagere. I 5 regelen er den ene af disse immunologisk aktive reaktionsdeltagere bundet til et vanduopløseligt bærestof, medens den anden er forsynet med et egnet enzym. I praksis omsættes det stof, der skal bestemmes, først med den på et bærestof bundne reaktionsdeltager, og efter faseadskillelse og vask omsættes det i mellemtiden på bærestoffet 10 immunologisk bundne stof med den anden, enzymmærkede reaktionsdeltager. Efter fornyet faseadskillelse foregår den enzymatiske reaktion til kvantitativ påvisning af det stof, der skal bestemmes, enten i fast eller i flydende fase.
I DE-OS 27 44 836 beskrives en immunokemisk målemetode, som er en 15 kombination af sandwich-metoden og den konkurrende metode, og som er ejendommelig ved, at efter omsætning mellem det antigen, der skal måles, og det insolubiliserede antistof til antigenet omsættes antige-net/antistof-complexet uden isolering fra reaktionsblandingen kontinuerligt med det markerede antistof.
20 I DE-OS 29 25 565 beskrives en et-trins sandwich-metode, som eksemplificeres ved en radioimmuno-fremgangsmåde under anvendelse af polyklonale antistoffer. Anvendelsen af monoklonale antistoffer eller anvendelse af et monoklonalt antistof og et polyklonalt antistof samt anvendelsen af en enzymimmunofremgangsmåde gøres på ingen måde 25 nærliggende i dette offentliggørelsesskrift.
Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse har det overraskende nok nu vist sig, at man i modsætning til den tidligere opfattelse også kan arbejde med en "étkars-teknik", ved hvilken det stof, der skal bestemmes, omsættes samtidig med begge de immunologisk 30 aktive reaktionsdeltagere i en enkelt inkubering, når der som monologisk reaktionsdeltagere anvendes to forskellige monoklonale antistoffer eller et monoklonalt antistof og et antistof fra en anden dyreart.
2 151399
Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse og angår således en immunologisk fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af et stof med en immunologisk aktiv reaktionsdeltager, som er forsynet med et enzym, samt med en immunologisk aktiv reaktionsdeltager, 5 som er bundet eller bindes til et vanduopløseligt bærestof, ved inku-bering af det stof, der skal bestemmes, med de immunologisk aktive reaktionsdeltagere, påfølgende adskillelse af fast og flydende fase og måling af enzymmærknrngens omfang, enten i den faste eller i den flydende fase, som et mål for mængden af det stof, der skal bestem-10 mes, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som immunologisk aktive reaktionsdeltagere anvendes to forskellige monoklonale antistoffer eller et monoklonalt antistof og et antistof fra en anden dyreart, som inkuberes fra starten sammen med det stof, der skal bestemmes.
15 Som stof, der skal bestemmes, kan nævnes alle bestanddele i fysiologiske væsker, celle- eller vævsekstrakter, til hvilke der forekommer eller kan dannes immunologiske reaktionsdeltagere, og som har to eller flere immunologisk aktive positioner. Dertil hører peptider, proteiner, lipoproteiner, glycoproteiner, steroler, steroider, lipoider, nucleinsy-20 rer, enzymer, hormoner, polysaccharider og alkaloider. Foretrukne immunologisk aktive stoffer er de naturlige antigener såsom hormoner, enzymer, organspecifikke antigener, bindevævskomponenter, blodcelle-antigener, plasmaproteiner og patologiske globuliner. Særlig foretrukne stoffer er det carcinoembryoniske antigen (CEA) samt humant 25 choriongonadotropin (HCG).
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tjener den immunologisk aktive reaktionsdeltager, som er forsynet med et enzym, som indikator for den immunologiske reaktion. Foretrukne enzymer er den alkaliske phosphatase, malat-dehydrogenasen, glucose-6-phosphat-dehydrogena-30 sen, glucose-oxidasen, glucoamylasen, galactosidasen og acetylcholin-esterasen. En særlig foretrukken enzym-label er peroxidase fra peberrod.
Enzymet som indikator for den immunologiske reaktion måles i den flydende, men fortrinsvis i den faste fase ved kendte metoder og er 3 151399 et mål for mængden af det stof, der skal bestemmes. Ved peroxidase fra perberrod som label måles enzymmængden fortrinsvis på grundlag af den iboende katalytiske aktivitet, som bestemmes ved hjælp af og o-phenylendiamin som redoxindikator. Efter 30 minutters katalytisk 5 reaktion måles farveintensiteten i den oxiderede redoxindikator fotometrisk.
Den anden immunologisk aktive reaktionsdeltager tjener til fraskillelse af det stof, der skal bestemmes, fra analyseprøven. Til dette adskillelsestrin kan den anden immunologisk aktive reaktionsdeltager fra 10 starten være bundet til et vanduopløseligt bærestof, eller det kan bindes til et relevant bærestof under eller efter den immunologiske reaktion.
Som vanduopløselige bærestoffer for den anden immunologisk aktive reaktionsdeltager kan f.eks. nævnes: organiske og uorganiske polyme-15 rer (amylase, dextraner, nativ eller modificeret cellulose, polyacryl-amid, agarose, magnetit, porøst glaspulver, polyvinylidenfluorid og latex), indervæggen i testbeholdere (reagensglas, titrerplader eller kuvetter af glas eller kunststof) samt overfladen af faste stoffer (glas- og kunststofstave, stave med fortykkelse for enden og stave 20 med vinger eller lameller for enden). Særlig egnede bærestoffer til fremgangsmåden ifølge opfindelsen er glas- og kunststofkugler.
Den anden immunologisk aktive reaktionsdeltager kan være fysisk (adsorptivt) eller kemisk bundet til det vanduopløselige bærestof, eller det kan ved hjælp af en yderligere reaktionsdeltager, der på sin 25 side er bundet til et bærestof, bindes under eller efter reaktionen.
Det er væsentligt for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at det stof, der skal bestemmes, har mindst to immunologisk aktive positioner (epitoper), som kan erkendes af de to immunologisk aktive reaktionsdeltagere, den til et bærestof bundne og den med et enzym forsynede 30 reaktionsdeltager, og kan omsættes. Som immunologisk aktive reaktionsdeltagere benyttes to forskellige monoklonale antistoffer eller et monoklonalt antistof og et antistof fra en anden dyreart, som ganske vist begge reagerer med det stof, der skal bestemmes, men som hver 4 151399 er rettet mod forskellige immunologisk aktive positioner. Til bestemmelse af antigener er det særlig velegnet med en kombination af antistoffer fra forskellige kloner eller af monoklonale antistoffer og antistoffer fra en anden dyreart.
5 Til den immunologiske reaktion kan prøven med det stof, der skal bestemmes, anvendes direkte eller fortyndet eller forbehandlet på egnet måde. Til forbehandling kan det stof, der skal bestemmes, isoleres, beriges eller befries for forstyrrende bestanddele.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen omsættes det stof, der skal 10 bestemmes, samtidig med den enzymmærkede og den bærerbundne immunologisk aktive reaktionsdeltager. Rækkefølgen af tilsætningen af reagenserne retter sig efter arten af det valgte bærestof sy stem. Ved arbejde med en sensibiliseret plastkugle sammenhældes først den enzymmærkede reaktionsdeltager og det stof, der skal bestemmes, i et 15 egnet reagensglas, hvorefter den med den anden reaktionsdeltager sensibiliserede kugle tilsættes.
Den immunologiske reaktion udføres i et egnet puffersystem for at opretholde en optimal pH-værdi, der kan ligge mellem 4 og 9. Foretrukne puffere er f.eks. acetatpuffer, citratpuffer, phosphatpuffer, 20 tris-puffer, triethanolaminpuffer, boratpuffer og glycinpuffer. Der kan også anvendes pufferblandinger.
Den immunologiske reaktion foretages fortrinsvis ved en temperatur på mellem 0 og 55°C. Normalt tiltager den immunologiske reaktionshastighed med højere temperaturer, hvorved ligevægten hurtigere nås under 25 ellers samme testbetingelser.
Inkuberingen af det stof, der skal bestemmes, med den enzymmærkede reaktionsdeltager og den bærerbundne reaktionsdeltager kan foretages, indtil ligevægten er nået. Den immunologiske reaktion kan dog også afbrydes på et tidligere tidspunkt, idet den faste og den fly-30 dende fase adskilles efter en bestemt inkubationstid, og enzymmærkningens omfang bestemmes enten i den flydende eller i den faste fase.
5 151399
Ved den immunologiske reaktion kan der træffes foranstaltninger til stabilisering af den immunologiske aktivitet af reaktionsdeltagerne og af det stof, der skal bestemmes, samt af enzymet. Endvidere kan der til inkubationsopløsningen sættes bestanddele, f.eks. proteiner og 5 detergenter, for at udelukke uspecifikke reaktioner, til formindskelse af hæmmende indflydelser eller til aktivering.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er overordentlig følsom og udmærker sig ved at være enkel at håndtere.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående 10 eksempler:
Eksempel 1.
Kvantitativ bestemmelse af CEA i patientplasma med et monoklonalt CEA-antistof og et anvendeligt CEA-antistof (ged).
I hvert af det nødvendige antal reagensglas (10 x 75 mm) afpipetteres 15 0,2 ml testopløsning (0,2 mol/liter Ν3Η2ΡΟ^/Ν82ΗΡΟ^, pH-værdi 6,5, med 2 g/liter kvægserumalbumin, 20%'s normalt gedeserum og 0,2 vg/ml gede-anti-CEA-peroxidase-konjugat), 0,050 ml af det patientplasma, der skal analyseres, henholdsvis CEA-standarder (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA og 20 ng/ml CEA) og CEA-kon-20 trolserum (5,0 ng/ml CEA ± 1,0 ng/ml) tilsættes, og til hvert glas sættes en med monoklonalt muse-anti-CEA sensibiliseret polystyrenkugle* (ø = 6,5 mm), og der inkuberes i 16 timer ved 37°C. Derefter vaskes polystyren kuglerne tre gange med hver gang 2 - 5 ml destilleret vand, hver overføres til 0,5 ml substratpuffer til aktivitetsbestem-25 melse af peroxidasen (0,1 mol/liter kaliumcitratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 mmol/liter og 20 mmol/liter o-phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (22°C). Til afbrydelse af den peroxidatiske aktivitet samt til intensivering af fa rvei nten siteten tilsættes 2,0 ml IN HCI, og inden for 30 minutter måles ekstinktionen 30 fotometrisk ved en bølgelængde på 492 nm. I tabel I er værdierne for en CEA-bestemmelse anført og sammenlignet med de værdier, der er opnået med Roche's radioimmunoassay.
6 151399 * Fremstillingen af monoklonalt muse-anti-CEA foretages i analogi med den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beskrevne metode, idet der som udgangscellelinje til fusionen anvendes myelom-linjen Sp 2/01-AG, der er deponeret i ATCC under nr. CRL 8006.
5 Fusionen foretages med miltceller fra mus, som er blevet immuniseret med CEA. Immuniseringen af musene blev foretaget i analogi med tabel 1 i den nævnte publikation, idet de første to immuniseringer hver blev foretaget med 50 ug CEA, immunisering 3 og 4 blev udeladt, immunisering 5 blev foretaget med 50 ug CEA og immunisering 6-8 10 hver med 200 ug CEA.
7 151399
Tabel I
Prøvemateriale iE492 nn,/RT/30 Bin- CEA-Standard O ng/ml CEA 0,103 2,5 ng/ml CEA 0,330 10.0 ng/ml CEA 0,978 20.0 ng/ml CEA 1,850 CEA- kontrolserum 5,0 ng/ml CEA 0,540
Patientplasma ROCHE-RIA-Test Fremgangsmåden ifølge opfindelsen_
Nr. 7212 0,6 ng/ml 1,2 ng/ml
Nr. 7188 2,2 ng/ml 1,0 ng/ml
Nr. 7220 1,2 ng/ml 1,4 ng/ml I Nr. 7218 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml ; Nr. 7234 2,5 ng/ml 2,7 ng/ml i Nr. 7249 2,4 ng/ml 2,0 ng/ml
Nr. 7203 2,3 ng/ml 2,0 ng/ml
Nr. 7223 3,0 ng/ml 3,3 ng/ml
Nr. 7247 3,1 ng/ml 2,8 ng/ml
Nr. 7258 4,6 ng/ml 4,3 ng/ml
Nr. 7215 4,9 ng/ml 5,5 ng/ml
Nr. 7219 5,0 ng/ml 5,9 ng/ml
Nr. 8180 8,6 ng/ml 8,5 ng/ml
Nr. 7248 11,2 ng/ml 10,7 ng/ml
Nr. 7262 14,2 ng/ml 14,3 ng/ml
Nr. 7201 15,6 ng/ml 15,3 ng/ml Værdier på under 2,5 ng/ml CEA ligger i normalområdet, medens værdier på over 2,5 ng/ml ligger i det patologiske område.
8 151399
Eksempel 2.
Kvantitativ bestemmelse af CEA i patientplasma med monoklonale CEA-antistoffer fra to forskellige kloner.
I hvert af det nødvendige antal reagensglas (10 x 75 mm) afpipetteres 5 0,2 ml testopløsning (0,2 mol/liter Naf^PO^/ts^HPO^, pH-værdi 6,5, med 2 g/liter kvaegserumalbumin, 20%'s normalt gedeserum og 0,15 μg/ml monoklonalt muse-anti-CEA-peroxidase-konjugat0), 0,050 ml af det patientplasma, der skal analyseres, henholdsvis CEA-standarder (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA og 20 ng/ml CEA) og 10 CEA-kontrolserum (5,0 ng/ml CEA ±1,0 ng/ml) tilsættes, og til hvert glas sættes en med monoklonalt muse-anti-CEA sensibiliseret polystyrenkugle1 (ø = 6,5 mm), og der inkuberes i 16 timer ved 37°C. Derefter vaskes polystyren kuglerne tre gange med hver gang 2 - 5 ml destilleret vand, hver overføres til 0,5 ml substratpuffer til aktivi-15 tetsbestemmelse af peroxidasen (0,1 mol/liter kaliumcitratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 mmol/liter og 20 mmol/liter o-phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (22°C). Til afbrydelse af den peroxidatiske aktivitet samt til intensivering af farveintensite-ten tilsættes 2,0 ml 1N HCI, og inden for 30 minutter måles ekstinktio-20 nen fotometrisk ved en bølgelængde på 492 nm. I tabel III er værdierne for en CEA-bestemmelse anført og sammenlignet med de værdier, der er opnået med Roche's radioimmunoassay.
Fremstillingen af monoklonalt muse-anti-CEA foretages i analogi med den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beskrevne 25 metode, idet der som udgangscellelinje til fusionen anvendes myelom-linjen Sp 2/01-AG, der er deponeret i ATCC under nr. CRL 8006.
Fusionen foretages med miltceller fra mus, som er blevet immuniseret med CEA. Immuniseringen af musene blev foretaget i analogi med tabel 1 i den nævnte publikation, idet de første to immuniseringer hver 30 blev foretaget med 50 μg CEA, immunisering 3 og 4 blev udeladt, immunisering 5 blev foretaget med 50 μg CEA og immunisering 6-8 hver med 200 μg CEA. Der anvendes to forskellige, egnede monoklonale antistoffer, som er rettet mod forskellige epitoper i CEA-antige-net.
9 151399
Tabel Ij ΔΕ
Prøvemateriale 492 nm/RT/30 min.
CEA-Standard O ng/ml CEA 0,390 2,5 ng/ml CEA 0,440 10.0 ng/ml CEA 0,620 20.0 ng/ml CEA 0,860 . 1 1 CEA-kontrolserum 5,0 ng/ml CEA 0,510
Patientplasma ROCHE-RIA-Tes t Fremgangsmåden ifølge opfindelsen._
Nr. 7220 1,2 ng/ml 0,8 ng/ml
Nr. 7234 2,5 ng/ml 3,0 ng/ml
Nr. 7223 3,0 ng/ml 3,5 ng/ml
Nr. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml
Nr. 7258 4,6 ng/ml 4,4 ng/ml
Nr. 7215 4,9 ng/ml 5,0 ng/ml
Nr. 7219 5,0 ng/ml 5,4 ng/ml
Nr. 8180 8,6 ng/ml 8,6 ng/ml
Nr. 7248 11,2 ng/ml 11,0 ng/ml
Nr> 7262 14,2 ng/ml 14.0 ng/ml
Nr. 7201 15,6 ng/ml 16,0 ng/ml j i _____: Værdier på under 2,5 ng/ml CEA ligger i normalområdet, medens værdier på over 2,5 ng/ml ligger i det patologiske område.
151399 ίο
Eksempel 3.
Kvantitativ bestemmelse af HCG i serum/plasma/urin.
I hvert af det nødvendige antal reagensglas (10 x 75 mm) afpipetteres 0,2 ml testopløsning (0,1 mol/liter Nah^PO^/I^HRO^, pH-værdi 7,0, 5 med 2 g/liter kvaegserumalbumin og 1,0 yg/ml monoklonalt muse-anti-HCG-peroxidase-konjugat°), 0,050 ml af det patientplasma, der skal analyseres, henholdsvis HCG-standarder (0, 25, 50, 100 og 250 mlU/ml HCG) tilsættes, og til hvert glas sættes en med kanin-anti-HCG sensibiliseret polystyren kugle (ø = 6,5 mm), og der inkuberes i 16 10 timer ved stuetemperatur i vandmættet atmosfære. Derefter vaskes polystyrenkuglerne tre gange med hver gang 2 - 5 ml destilleret vand, hver overføres til 0,5 ml substratpuffer til aktivitetsbestemmelse af peroxidasen (0,1 mol/liter kaliumcitratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 mmol/liter og 20 mmol/liter o-phenylendiamin) og inkube- 15 res i 30 minutter ved stuetemperatur (16 - 30°C). Til afbrydelse af den peroxidatiske aktivitet samt til intensivering af fa rvei nten siteten tilsættes 2,0 ml IN HCI, og inden for 30 minutter måles ekstinktionen fotometrisk ved en bølgelængde på 492 nm. I tabellerne er værdierne fra en HCG-bestemmelse i serum og i urin anført. 1 * Fremstillingen af monoklonalt anti-HCG kan foretages efter en af de i Journal of Immunogical Methods 32 (1980) 297 - 304 beskrevne metoder.
11 151399 HCG-Bestemmelse i serum og i urin.
1. Standardkurver.
1 iE492 nm/3° min-/RT
mlU HCG/ml Serum__Urin 0 0,185 0,385 25 0,385 0,525 50 0,530 0,720 100 0,830 1,05 }_250 0,185 1,59 2. Patientprøver.
Prøve nr. ^E492 nn/3l~ min -/RT = HCG/ml prøve
Urin N-1032 E 0,375 0 " 58-418 0,575 (x 50) * 1500 " 58414 0,775 (x 100) * 5500 " 58416 0,810 (x 500) * 320.00
Serum 2559 0,155 0 " 2560 0,125 0 " 1543 0,195 1,5 " 2673 0,505 44 " 1167 1,085 181 " 1492 0,98 (x 10) * 1370 " 2793 0,77 (x 20) * 1740 " 924 0,69 (x 100) * 7300 * Fortynding af prøven
Omregning: 1 ng rent HCG svarer til ca. 10 mlU HCG.
12 151399
Eksempel 4.
Kvantitativ bestemmelse af HCG i serum med monoklonale HCG-anti-stoffer fra to forskellige kloner.
I hvert af det nødvendige antal reagensglas (10 x 75 mm) afpipetteres 5 0,2 ml testopløsning (0,1 mol/liter Na^PO^/I^HPO^, pH-værdi 7,0, med 2 g/liter kvægserumalbumin og 1,0 ng/ml monoklonalt muse-an-ti-HCG-peroxidase-konjugat1), 0,050 ml af det patientplasma, der skal analyseres, henholdsvis HCG-standarder (0, 25, 50, 100 og 200 mlU/ml HCG) tilsættes, og til hvert glas sættes en med monoklonalt 10 muse-anti-HCG sensibiliseret polystyren kugle1 (ø = 6,5 mm), og der inkuberes f.eks. i 2 timer ved 37°C. Derefter vaskes polystyrenkuglerne tre gange med hver gang 2 - 5 ml destilleret vand, hver overføres til 0,5 ml substratpuffer til aktivitetsbestemmelse af peroxidasen (0,1 mol/liter kaliumcitratpuffer med pH-værdi 5,0 med 6 mmol/liter 15 P12^2 ^ mmol/liter o-phenylendiamin) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (16 - 30°C). Til afbrydelse af den peroxidatiske aktivitet samt til intensivering af farveintensiteten tilsættes 1,0 ml 2N HCI, og inden for 30 minutter måles ekstinktionen fotometrisk ved en bølgelængde på 492 nm. I tabellerne er værdierne fra HCG-bestemmel-20 ser i serum anført.
Fremstillingen af monoklonalt muse-HCG-antistof foretages efter den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beskrevne metode. Der anvendes to forskellige, egnede monoklonale antistoffer, som er rettet mod forskellige epitoper i HCG-antigenet.
13 151399 HCG-Bestemmelse i humant serum (middelværdier af dobbeltbestemmelser).
1. Standardkurver.
i [i ii —
ΔΕ 432 nm/30 min./RT
mu/ml HCG 1) Serum 2) Plasma 3) Urin 4) Puffer 0 0,038 0,054 0,158 0,180 25 0,226 - - - 50 0,475 0,544 0,557 0,716 100 0,905 0,955 0,970 1,40 200 1,75 1,55 1,90 2,44 i___- HCG-Værdierne i de nedenfor anførte eksempler på patientsera er 5 aflæst fra standardkurve 1). Standardkurverne 2), 3) og 4) er opstillet en anden dag med nye HCG-standarder.
2. Patientsera.
ΔΕ492/30 min./RT mIU/ml HCG Målt fra kurve l)
Pool 091080 0,041 0
Nr. 2801 0,025 0
Nr. 3881 0,450 47
Nr. 2673 1,13 127
Nr. 1167 2,12 (1:2) 470
Nr. 4891 0,975 (1:50) 5*450
Nr. 3240 1,06 (1:20) 2*280
Nr. 4418 1,475 ( 1:1000) 167Ό00
Claims (4)
1. Immunologisk fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af et stof med en immunologisk aktiv reaktionsdeltager, som er forsynet med et enzym, samt med en immunologisk aktiv reaktionsdeltager, der 5 er bundet eller bindes til et vanduopløseligt bærestof, ved inkubering af det stof, der skal bestemmes, med de immunologisk aktive reaktionsdeltagere, påfølgende adskillelse af fast og flydende fase og måling af omfanget af enzymmærkningen, enten i den faste eller i den flydende fase, som et mål for mængden af det stof, der skal bestemmes, 10 kendetegnet ved, at der som immunologisk aktive reaktionsdeltagere anvendes to forskellige monoklonale antistoffer eller et monoklonalt antistof og et antistof fra en anden dyreart, som inkuberes fra starten sammen med det stof, der skal bestemmes.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at det stof, der skal bestemmes, er et antigen.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg n et ved, at det stof, der skal bestemmes, er carcinoembryonisk antigen (CEA). 1
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den immunologisk aktive reaktions-deltager, der er bundet til et vanduopløseligt bærestof, er monoklonalt muse-anti-CEA.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH320980A CH642458A5 (en) | 1980-04-25 | 1980-04-25 | Immunological method |
| CH320980 | 1980-04-25 | ||
| CH589880A CH651396A5 (en) | 1980-08-04 | 1980-08-04 | Immunological method for detecting and determining carcinoembryonic antigen |
| CH589880 | 1980-08-04 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK155881A DK155881A (da) | 1981-10-26 |
| DK151399B true DK151399B (da) | 1987-11-30 |
| DK151399C DK151399C (da) | 1988-09-05 |
Family
ID=25692464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK155881A DK151399C (da) | 1980-04-25 | 1981-04-06 | Immunologisk fremgangsmaade til paavisning af et stof ved omsaetning med immunologisk aktive reaktionsdeltagere |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT373398B (da) |
| AU (1) | AU542563B2 (da) |
| CA (1) | CA1160566A (da) |
| DE (1) | DE3115115A1 (da) |
| DK (1) | DK151399C (da) |
| FR (1) | FR2481318A1 (da) |
| GB (1) | GB2074727B (da) |
| IT (1) | IT1137344B (da) |
| NL (1) | NL187545B (da) |
| NO (1) | NO159620C (da) |
| SE (1) | SE460930B (da) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6406920B1 (en) | 1980-06-20 | 2002-06-18 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| EP0146654A3 (en) * | 1980-06-20 | 1986-08-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| JPS57501147A (da) * | 1980-07-16 | 1982-07-01 | ||
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4879219A (en) * | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| EP0049898B2 (en) * | 1980-10-15 | 1991-08-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| US4837167A (en) * | 1981-01-30 | 1989-06-06 | Centocor, Inc. | Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity |
| GB2118300B (en) * | 1982-02-12 | 1985-06-19 | Corning Glass Works | Method of immunoassay |
| DK76983A (da) * | 1982-03-05 | 1983-09-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade og reagens til immunkemisk bestemmelse af humant choriogonadotropin |
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| IL73938A (en) * | 1984-01-02 | 1989-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| DE3638767A1 (de) * | 1986-11-13 | 1988-05-26 | Behringwerke Ag | Laktoferrin enthaltendes inkubationsmedium fuer festphasenimmunometrisches verfahren und seine verwendung |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
| US6881589B1 (en) | 1987-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions |
| DE3851050T2 (de) * | 1987-08-25 | 1995-03-16 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | Diagnostische methode für chronischen gelenkrheumatismus. |
| US5175084A (en) * | 1987-10-30 | 1992-12-29 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the diagnosis of hepatic carcinoma |
| DE3807440A1 (de) * | 1988-03-07 | 1989-09-21 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit |
| US5779976A (en) * | 1988-11-03 | 1998-07-14 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5962218A (en) * | 1988-11-03 | 1999-10-05 | Igen International Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US5798083A (en) * | 1988-11-03 | 1998-08-25 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection |
| US5746974A (en) * | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| AU624200B2 (en) * | 1988-12-12 | 1992-06-04 | Csl Limited | Solid phase immunoassay with lyophilised conjugate |
| US5176999A (en) * | 1989-12-07 | 1993-01-05 | Eastman Kodak Company | Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use |
| ZA92803B (en) | 1991-02-06 | 1992-11-25 | Igen Inc | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescene asay including plurality of magnets |
| US6201109B1 (en) | 1993-01-13 | 2001-03-13 | Dade Behring Marburg Gmbh | Assay for bone alkaline phosphatase |
| FR2710410B1 (fr) * | 1993-09-20 | 1995-10-20 | Bio Merieux | Procédé et dispositif pour la détermination d'un analyte dans un échantillon . |
| AU705059B2 (en) * | 1994-02-19 | 1999-05-13 | Seikagaku Corporation | Method and measurement kit for assay of normal aggrecan, and method for evaluation of information on the joint |
| US6569634B1 (en) | 1998-09-01 | 2003-05-27 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for assaying human thymidylate synthase and assay kit |
| WO2000062073A1 (en) | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for analyzing the amount of intraabdominal adipose tissue |
| CA2609379C (en) | 2005-06-03 | 2016-11-29 | Allen J. Bard | Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| US4244940A (en) * | 1978-09-05 | 1981-01-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Single-incubation two-site immunoassay |
| JPH0235944B2 (ja) * | 1980-06-20 | 1990-08-14 | Unilever Nv | Tokuitekiketsugokenteiojitsushisuruhohooyobigaihohoojitsushisurutamenoshikenkitsuto |
-
1981
- 1981-03-23 CA CA000373607A patent/CA1160566A/en not_active Expired
- 1981-04-06 DK DK155881A patent/DK151399C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-04-13 IT IT21122/81A patent/IT1137344B/it active
- 1981-04-14 DE DE19813115115 patent/DE3115115A1/de active Granted
- 1981-04-15 NL NLAANVRAGE8101860,A patent/NL187545B/xx not_active Application Discontinuation
- 1981-04-22 SE SE8102558A patent/SE460930B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-04-23 FR FR8108105A patent/FR2481318A1/fr active Granted
- 1981-04-24 AT AT0186481A patent/AT373398B/de not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 NO NO811407A patent/NO159620C/no not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 AU AU69811/81A patent/AU542563B2/en not_active Expired
- 1981-04-24 GB GB8112730A patent/GB2074727B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6981181A (en) | 1981-10-29 |
| DK151399C (da) | 1988-09-05 |
| IT8121122A0 (it) | 1981-04-13 |
| GB2074727B (en) | 1983-11-30 |
| SE8102558L (sv) | 1981-10-26 |
| NO811407L (no) | 1981-10-26 |
| NO159620B (no) | 1988-10-10 |
| GB2074727A (en) | 1981-11-04 |
| DE3115115C2 (da) | 1987-02-12 |
| AT373398B (de) | 1984-01-10 |
| IT1137344B (it) | 1986-09-10 |
| FR2481318B1 (da) | 1984-10-19 |
| NL187545B (nl) | 1991-06-03 |
| AU542563B2 (en) | 1985-02-28 |
| DK155881A (da) | 1981-10-26 |
| ATA186481A (de) | 1983-05-15 |
| DE3115115A1 (de) | 1982-02-04 |
| FR2481318A1 (fr) | 1981-10-30 |
| SE460930B (sv) | 1989-12-04 |
| CA1160566A (en) | 1984-01-17 |
| NL8101860A (nl) | 1981-11-16 |
| NO159620C (no) | 1989-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK151399B (da) | Immunologisk fremgangsmaade til paavisning af et stof ved omsaetning med immunologisk aktive reaktionsdeltagere | |
| JPH0239747B2 (da) | ||
| US4292403A (en) | Detection and/or determination of IgM, IgA, IgD and IgE immunoglobulins | |
| US4228237A (en) | Methods for the detection and determination of ligands | |
| US4467031A (en) | Enzyme-immunoassay for carcinoembryonic antigen | |
| EP0315364A2 (en) | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies | |
| CA1256025A (en) | Immuno-chemical measurement process for haptens and proteins | |
| CA1180274A (en) | Immunoassay of proteins | |
| JP3363466B2 (ja) | 酵素結合体を安定化する方法 | |
| EP0062892B1 (en) | Single incubation immunochemical assay for creatin phosphokinase mb | |
| US5037764A (en) | Process for determination of an analyte and reagent therefor | |
| US4313927A (en) | Immunoassay method for detecting viral antibodies in whole blood samples | |
| US20050009116A1 (en) | Reagents, methods and kit for detecting feed enzymes | |
| EP0389301A2 (en) | Reagent complex for immunoassay | |
| EP0268465A2 (en) | Method for detecting the presence of a plant antigen in a plant | |
| US5061619A (en) | Immunoassay using antibody-antigen conjugates | |
| EP0529057B1 (en) | Denatured vehicular proteins to improve enzyme linked immunosorbent assays | |
| JPH0123062B2 (da) | ||
| Edevåg et al. | The development and standardization of an ELISA for ovalbumin determination in influenza vaccines | |
| US4778755A (en) | Immunoassay method | |
| JPH09189698A (ja) | 免疫学的測定方法 | |
| JPH08509064A (ja) | 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化 | |
| JPS61245060A (ja) | ヒト補体１ｑ定量用キツト及び定量法 | |
| WO1993022325A1 (en) | Immunoassay for 3', 5' cyclic adenosine monophosphate | |
| JPH07117535B2 (ja) | ヒトプロテインｓに免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed | ||
| PUP | Patent expired |