DE69928213T2

DE69928213T2 - Methode zur bestimmung humaner thymidylat-synthase und kit dafür

Info

Publication number: DE69928213T2
Application number: DE69928213T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Hoshino; Takeshi Matsuya; Masakazu Hanno-shi FUKUSHIMA; Hiroyuki Iruma-shi OKABE
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc; Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd; LSI Medience Corp
Priority date: 1998-09-01
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-09-01
Also published as: EP1030179B1; EP1030179A1; EP1030179A4; WO2000013023A1; ATE309539T1; DE69928213D1; US6569634B1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine immunologische Methode zum Bestimmen von menschlicher Thymidylat-Synthase, und einen Kit dafür.
Stand der Technik
Thymidylat-Synthase (EC2.1.1.45, nachfolgend als "TS" bezeichnet), ein Enzym, das die Reaktion, in der Thymidylsäure aus Deoxyuridylsäure gebildet wird, katalysiert, spielt eine Rolle bei der Bereitstellung von Thymin, das eine für DNAs spezifische Base ist, und ist eines der Geschwindigkeits-begrenzenden Hauptenzyme für einen DNA-Vorläufer-Versorgungsweg. Es ist bekannt, dass seine Aktivität in normalen oder Tumorgeweben, wo das Zellwachstum aktiv ist, höher wird.
Andererseits wirken Fluorpyrimidin-Antitumormittel, wie z.B. 5-Fluoruracil und 5-Fluordeoxyuridin, gegen TS als Zielenzym, und 5-Fluordeoxyuridin geht beisepielsweise in vivo in Fluordeoxyuridylsäure über und inhibiert TS. Es ist insbesondere bekannt, dass Fluorpyrimidin-Antitumormittel eine hohe Verabreichungswirkung und eine markante, die Lebensdauer verlängernde Wirkung für Patienten mit einer geringen Menge an TS in Tumorzellen zeigen, aber einen geringen Verabreichungseffekt bei Patienten mit einer großen Menge an TS ["Gan to Kagaku Ryoho (Cancers and Chemotherapy)", 24(6), 705–712 (1997)]. Die Bedeutung von TS ist deshalb hoch, und eine Vorausbestimmung der Menge an TS in einem bei der Behandlung eines Tumorpatienten entfernten Tumors gibt Hinweise zur Bestimmung einer Behandlungsmethode und zur Auswahl eines Antitumormittels.
Als konventionelle Methoden zur Bestimmung von TS werden hauptsächlich Methoden durchgeführt, die eine biochemische Messung seiner Enzymaktivität beinhalten, einschließlich von z.B. einer Methode, in der die Bildung von Dihydrofolsäure als Reaktionsprodukt durch Messung des spektralen Absorptionsmaßes bei einer spezifischen Wellenlänge bestimmt wird, und eine Methode, in der die Menge an radiomarkierter Fluordeoxyuridylsäure (FdUMP) (z.B. [3H]FdUMP), die an TS bindet, bestimmt wird.
Andererseits wurden auch immunologische Bestimmungsmethoden, die Anti-TS-Antikörper verwenden, beschrieben. Bekannte Methoden umfassen z.B. eine Methode, bei der TS unter Verwendung von anti-TS-monoklonalen Antikörpern M-TS-4 und M-TS-9 bestimmt wird [Malgorzata M. Jastreboff et al., Biochemistry, 1985(24), 587–592]; und eine Methode, bei der TS unter Verwendung der anti-TS-monoklonalen Antikörper TS 102, TS 105, TS 106, TS 109, TS 110, TS 11A und TS 11B bestimmt wird [Japanese Language Laid-Open Publication (PCT) No. HEI 6-507314]. Bekannt ist auch eine Blotting-Methode, bei der verschiedene homogenisierte Tumorzellen einer Elektrophorese und danach einem Transfer unterworfen werden, wobei ein Anti-TS-IgG-Antikörper und markiertes Anti-IgG als primärer Antikörper bzw. sekundärer Antikörper verwendet werden ["Gan to Kagaku Ryoho (Cancers and Chemotherapy", 24(6), 705–712 (1997)]; eine Methode, in der Vertiefungen mit einem Standard-TS-Antigen beschichtet werden, und eine TS enthaltende Testprobe und ein Anti-TS-Antikörper dann zugegeben werden, um eine Konkurrenz-Situation zu verursachen; und eine Methode, bei der Vertiefungen mit einer TS enthaltenden Testprobe beschichtet werden, und ein Anti-TS-Antikörper zugegeben und gebunden wird, und dann markiertes Anti-Maus-IgG zur Reaktion gebracht wird.
Die vorstehend beschriebenen Methoden, die die Enzymaktivität von TS biochemisch messen, sind jedoch deshalb mit vielen Problemen behaftet, weil inter alia die Sensibilität zur Messung einer geringen Enzymaktivität unzureichend ist, die Verwendung frischer Proben erforderlich ist, die Testproben sorgfältig gehandhabt werden müssen, um einen enzymatischen Abbau zu vermeiden, Testproben in großen Mengen erforderlich sind, und spezielle Techniken und Vorraussetzungen erforderlich sind, wenn eine radioaktive Substanz verwendet wird.
Die konventionellen immunologischen Testmethoden werden außerdem im Hinblick auf die lästigen Verfahren und die Genauigkeit der Messungen als unbefriedigend angesehen. Spezifischer beschrieben ist z.B. die Methode, bei der eine Bestimmung durch eine Elektrophorese mit einem darauf folgenden Blotting durchgeführt wird, von dem Problem begleitet, dass sie quantitativ schlecht ist, obwohl ihre Verfahren sehr komplex sind, und die Methode, in der eine Testprobe und ein Antikörper auf Antigen-beschichteten Vertiefungen kompetitiv reagieren gelassen werden, mit dem Problem behaftet, dass sie eine schlechte Messempfindlichkeit aufweist, und sogar die Methode, in der eine verdünnte Lösung einer Testprobe, so wie sie ist, auf Vertiefungen aufgetragen wird, mit dem Problem behaftet, dass TS nicht notwendigerweise in ihrer Gesamtheit beschichtet werden kann, was zu einer schlechten Zuverlässigkeit führt. Es besteht deshalb gegenwärtig ein außergewöhnliches Bedürfnis nach einer einfachen und hoch genauen Methode zur Messung von TS.
Beschreibung der Erfindung
Im Hinblick auf die vorstehenden Gegebenheiten haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung verschiedene Untersuchungen durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Verwendung eines anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers, der auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, sehr wirksam ist, um Spurenmengen von humaner TS spezifisch und effizient aus einer Testprobe, die eine große Anzahl an Komponenten (Verunreinigungen) enthält, einzufangen, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führte.
Mit der vorliegenden Erfindung wird deshalb eine Methode zur immunologischen Bestimmung humaner Thymidylat-Synthase mit einem anti-humane-TS-Antikörper bereitstellt, worin als Antikörper mindestens ein anti-humane-TS-polyklonaler Antikörper, der an einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, verwendet wird.
Mit der vorliegenden Erfindung wird auch eine Methode zur Bestimmung der Sensibilität von Krebszellen gegenüber einem Fluorpyrimidin-Antitumormittel bereitgestellt, die umfasst das Messen einer Menge der in einer Probe der Krebszellen enthaltenen humanen TS nach der oben beschriebenen Methode und Bestimmen der Sensibilität aus den Ergebnissen dieser Messung.
Mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Kit zum Bestimmen von humaner TS bereitgestellt, der einen unlöslichen Träger (Matrix) mit mindestens einem darauf immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper aufweist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das eine Standardkurve der TS-Konzentration gegen das spektrale Absorptionsmaß in einem immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper-Platten-Enyzm-markierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper-System zeigt. Die 2 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Substrat-bindenden Methode (Aktivierungsmethode) und der Bestimmungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beste erfindungsgemäßen Ausführungsformen
Um einen anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird humane TS als Immunogen verwendet. Als humane TS kann native humane TS, erhältlich aus dem lebenden Körper durch Extraktion und Reinigung (nachstehend als "nhTS" bezeichnet) verwendet werden, oder es kann, wenn es gewünscht ist, humane TS leichter in einer großen Menge zu erhalten, rekombinante humane TS (nachstehend als "rhTS" bezeichnet) ebenfalls verwendet werden. rhTS ist leicht erhältlich und besitzt den Vorteil, dass ihre Verwendung es möglich macht, einen Antikörper mit gleichmäßiger Reaktivität zu erhalten, und erleichtert auch den Aufbau eines Systems, dessen Messgenauigkeit immer konstant bleibt, in einem Bestimmungskit. rhTS ist deshalb bevorzugt.
nhTS kann z.B., wie nachstehend beschrieben, erhalten werden. nhTS kann mit hoher Reinheit erhalten werden, indem man inkubierte Zellen eines TS-exprimierenden humanen Gewebes oder Tumorstammes, abgeleitet aus einem humanen Tumor oder einem Homogenisat eines in eine nackte Maus oder nackte Ratte subkutan transplantierten Tumors, auf eine Säule aufträgt, wobei Ethyl-10-formyl-5,8-dideazafolat als Ligand verwendet wird, und dann die Elution mit einem dUMP-enthaltenden Puffer durchführt.
Als Alternative kann rhTS z.B. auch wie folgt beschrieben erhalten werden. Zuerst wird ein Plasmid, das ein Glutathion-S-Transferase(GST)-TS-fusioniertes Protein durch Isopropyl-1-thio-β-D-glactosid (IPTG) ableiten kann, hergestellt, indem man die DNA-Sequenz humaner TS bestimmt und dann eine Translationsregion in ein Plasmid insertiert, das zur Bildung des GST-TS-Fusionsproteins ausgestaltet ist. Ein Escherichia coli-Stamm, der mit dem Plasmid transfektiert wurde, wird in Gegenwart von IPTG Massen-inkubiert, und das Inkubationsmedium auf eine Glutathion-Agarose-Säule aufgebracht. Das so adsorbierte GST-TS-Fusionsprotein wird mit einem geeigneten Puffer eluiert und dann in Gegenwart von Thrombin und Calciumchlorid erhitzt, um humane TS und GST von einander zu spalten. Die resultierende Mischung wird auf eine GST-Agarose-Säule aufgebracht, wobei rhTS höherer Reinheit erhalten werden kann.
Der anti-humane-TS-polyklonale Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung kann auf eine an sich bekannte Weise erhalten werden, indem man eine solche humane TS (z.B. rhTS) einem geeigneten Säuger, wie z.B. einer Maus, Ratte, einem Kaninchen oder einem Schaf, verabreicht. Aufgrund der Verwendung des anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers in einer an einem unlöslichen Träger immobilisierten Form wurden erfindungsgemäß gegenüber den Problemen der konventionellen immunologischen Bestimmungsmethoden, d.h., der lästigen Verfahren und der geringen Genauigkeit der Bestimmung, Fortschritte erzielt, und es kann eine extrem hohe Empfindlichkeit erzielt werden.
Die erfindungsgemäße Methode zur Bestimmung von humaner TS kann auf irgendein Messsystem angewendet werden, solange es einen auf einem unlöslichen Träger immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper verwendet, oder, wenn erforderlich, den Antikörper und eine verschiedene Art des Anti-humane-TS-Antikörpers in Kombination. Spezifischer ausgedrückt ist die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode, z.B. für eine Latex-Agglutination, Immunochromatographie, die Sandwich-Methode, einen kompetitiven Radioimmunoassay, Enzym-Immunoassay usw., und insbesondere eine Sandwich-Methode und Latex-Agglutination, geeignet.
Um die erfindungsgemäße Methode bei der Latex-Agglutination anzuwenden, werden z.B. Latex-Teilchen mit dem anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper beschichtet, die so sensibilisierten Antikörper-beschichteten Latex-Teilchen mit einer humane TS enthaltenden Testprobe reagieren gelassen, und dann wird eine Veränderung im spektralen Absorptionsmaß aufgrund der resultierenden Agglutination gemessen, wobei humane TS quantifiziert werden kann.
Um die erfindungsgemäße Methode bei einem kompetitiven Assay anzuwenden, werden z.B. ein Matrix-immobilisierter anti-humane-TS-polyklonaler Antikörper, eine Testprobe, die humane TS enthält und markierte humane TS kompetitiv reagieren gelassen, und die Markierungsaktivität der an die Matrix gebundenen humanen TS dann gemessen, wobei humane TS quantifiziert werden kann.
Um die erfindungsgemäße Methode auf die Sandwich-Methode anzuwenden, werden z.B. ein Matrix-immobilisierter anti-humane-TS-polyklonaler Antikörper und eine humane TS enthaltende Testprobe umgesetzt, um einen Komplex zu bilden, das Reaktionsmedium wird entfernt und dann wird ein markierter Anti-humane-TS-Antikörper umgesetzt unter Bildung eines sandwichartigen Reaktionsproduktes des Matrix-immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers und des markierten Anti-humane-TS-Antikörpers, und ein überschüssiger Anteil des markierten Antikörpers wird durch Waschen entfernt und dann die Menge der auf der Matrix immobilisierten Markierung gemessen, wobei humane TS quantifiziert werden kann.
Spezifische Beispiele für in der Sandwich-Methode verwendete Materialien können als Matrix umfassen ein Glasrohr oder -platte oder Glasvertiefungen oder Perlen, ein Kunststoffrohr oder -platte oder Kunststoffvertiefungen oder -perlen, oder Ferrit-Teilchen. Der anti-humane-TS- polyklonale Antikörper wird mittels einer bekannten physikalischen Adsorption oder chemischen Bindung an die Matrix binden gelassen, und wird als Matrix-immobilisierter Antikörper verwendet.
Zur Markierung kann ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Substanz oder dergleichen verwendet werden. Von diesen wird ein Enzym bevorzugt. Als Enzym können geeigneterweise solche verwendet werden, die eine hervorragende Stabilität aufweisen und eine leichte Bestimmung der Enzymaktivitäten ermöglichen, wie z.B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase und Galactosidase. Beispiele einer Methode, um ein solches Enzym an den Antikörper zu binden, können umfassen Bindungsreaktionen zwischen Aminogruppen des Enzyms und Antikörpers mit Glutaraldehyd, und Bindungsreaktionen, die ein Vernetzungsmittel verwenden, das eine Succinimidogruppe, eine Maleimidogruppe oder dergleichen enthält. Aufgrund ihrer guten Ausbeute und der einfachen Verfahren wird auch eine Methode bevorzugt, in der die Zuckerkette von Peroxidase mit Periodsäure oxidiert und mit einer Aminogruppe eines Antikörpers binden gelassen wird.
Als Substrat zur Messung der Enzymaktivität kann ein solches, das gegenüber dem Enzym spezifisch ist, verwendet werden. Humane TS kann quantifiziert werden, indem eine Färbung, Fluoreszenz, Lichtemission oder dergleichen verursacht und dann ihr Signal mittels eines Messinstruments bestimmt wird. Wenn eine Peroxidase als Enzym verwendet wird, verursacht die Verwendung einer Kombination von Wasserstoffperoxid und Orthophenylendiamin eine Farbstoff-bildende Reaktion im Verhältnis zur Menge des Enzyms, und die Verwendung einer Kombination von Wasserstoffperoxid und Luminol verursacht das Auftreten einer lichtemittierenden Reaktion. Ein der Menge des Enzyms entsprechendes Signal kann erhalten werden, indem man im Falle der den Farbstoff bildenden Reaktion eine Messung mit einem Spektrophotometer und im Falle der Licht-emittierenden Reaktion mit einem Luminometer durchführt.
Um die erfindungsgemäße Methode bei der Immunochromatographie anzuwenden, wird ein bekanntes Material, das dazu fähig ist, eine Flüssigkeit zu entwickeln, wie z.B. Papier oder ein dünner Cellulosefilm, als unlösliche Matrix verwendet. Durch Entwickeln einer flüssigen Probe, die humane TS enthält, wird der anti-humane-TS-polyklonale Antikörper an einer Bestimmungsposition immobilisiert. Zur Immobilisierung können bekannte Methoden verwendet werden, wobei insbesondere eine Methode bevorzugt ist, die auf chemischen Bindungen beruht. Ein markierter Anti-humane-TS-Antikörper ist in einer Position enthalten, auf die die flüssige Probe aufgetropft wird oder an einem dazwischen liegenden Punkt auf einem Weg, entlang dem die aufgetropfte flüssige Probe entwickelt wird. Da eine irreversible Absorption des markierten Anti-humane-TS-Antikörpers auf der unlöslichen Matrix nicht bevorzugt ist, ist es bevorzugt, den markierten Anti-humane-TS-Antikörper an einem dünnen Film zu verfestigen, indem man eine hochmolekulare Substanz (Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol oder ein hochmolekulares Saccharid, wie z.B. Dextran) verwendet. Geeignete Beispiele für die Markierungssubstanz können zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Enzymen umfassen Metallkolloide, wie z.B. kolloides Gold und Platin; mit Farbstoff gefärbte Latex-Teilchen (sogenannte Farblatices); ver schiedene Fluoreszenz-Reagentien, wie z.B. Fluorescein und Europiumchelat; und Lumineszenz-Reagentien, wie z.B. Acridinium-Derivate. Bevorzugt werden Metallkolloide oder Farblatices verwendet, weil sie keine zusätzliche Sensibilisierungsreaktion erfordern und eine visuelle Beobachtung ermöglichen.
Der markierte Anti-humane-TS-Antikörper wird dann eingefangen und an der Position des immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers konzentrieren gelassen, und der Grad der Färbung oder dergleichen, die von der Markierung an der Position verursacht wird, wird visuell oder unter Verwendung einer optischen Vorrichtung bestimmt, wodurch die humane TS bestimmt werden kann.
Wenn zusätzlich zum immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper ein von dem erstgenannten Antikörper verschiedener markierter Antikörper in Kombination verwendet wird, können für einen solchen Antikörper genannt werden anti-humane-TS-polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper.
Wenn ein anti-humane-TS-monoklonaler Antikörper verwendet wird, kann der anti-humane-TS-monoklonale Antikörper z.B. erhalten werden, indem man ein Hybridom (z.B. Mäuse-Hybridom), das den monoklonalen Antikörper bilden kann, in einem geeigneten Medium oder innerhalb der Peritonealhöhle eines Säugers (z.B. einer Maus) inkubiert.
Im allgemeinen kann dieses Hybridom z.B. erhalten werden, indem man Milzzellen eines rhTS- oder nhTS-immunisierten Säugers oder Vogels (z.B. einer Maus) und Myelomzellen eines Säugers (z.B. einer Maus) einer Zellfusion gemäß der ursprünglich von Kohler und Milstein [siehe Nature, 256, 495 (1975)] skizzierten Methode einer Zellfusion unterwirft. Ein für die Inkubation des Hybridoms geeignetes Medium ist ein Medium, das fetales Rinderserum, L-Glutamin, L-Brenztraubensäure und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) in Dulbecco-modifiziertem Eagle's-minimum-essential-Medium enthält. Die Inkubation des Hybridoms wird z.B. bei 5% CO₂-Konzentration und 37°C während 3 Tagen durchgeführt, wenn sie in einem Inkubationsmedium durchgeführt wird, oder z.B. 14 Tage lang, wenn sie innerhalb der Peritonealhöhle einer Maus durchgeführt wird. Aus dem vorstehend beschriebenen Inkubationsmedium oder Säuger-Ascites-Fluid kann der anti-humane-TS-monoklonale Antikörper abgetrennt und nach einer Methode gereinigt werden, die üblicherweise zur Isolierung und/oder Reinigung von Proteinen verwendet wird. Beispiele für eine solche Methode können umfassen das Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionen-Austausch-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Ionen-Austausch-Cellulose, Molekularsieb-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Molekularsieb-Gels, Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung von mit Protein A komplexiertem Polysaccharid, Dialyse und Lyophilisierung.
Beispielhaft für den wie vorstehend beschrieben erhältlichen anti-humane-TS-monoklonalen Antikörper sind solche, die durch die Mäuse-Hybridome RTSMA1 (FERM BP-6404), RTSMA2 (FERM BP-6402), NTSMA1 (FERM BP-6401) und NTSMA2 (FERM BP-6403) gebildet werden, wie dies in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird. Diese Hybridome wurden gemäß dem Budapester Vertrag im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agen cy of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-0046, JAPAN) hinterlegt (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 30. Juni 1998). Die Verwendung eines auf einer unlöslichen Matrix immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers in Kombination mit einem solchen monoklonalen Antikörper oder polyklonalen Antikörper in der vorliegenden Erfindung macht es möglich, humane TS mit guter Genauigkeit zu bestimmen.
Unter Verwendung eines Matrix-immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers und unter Auswahl eines markierten Antikörpers, eines Substrats und eines Messinstruments entsprechend jedem Assay-System wird die Bestimmung von humaner TS leicht ausführbar. Außerdem kann ein humane TS-Messkit, der für die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode geeignet ist, aufgebaut werden unter Verwendung einer unlöslichen Matrix mit mindestens einer Art eines darauf immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers und ebenfalls durch die geeignete Auswahl anderer Elemente, entsprechend jedem Assay-System.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele werden zur näheren Beschreibung der vorliegenden Erfindung angegeben, es ist aber darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Bezugsbeispiel 1
A. Herstellung von rhTS
Ein Escherichia coli-Stamm NM522, in den ein mit durch darin eingebauten Restriktions-Endonuclease-Erkennungssequenzen MunI bis HindIII von humaner TS-cDNA hergestelltes Plasmid zur Expression eines Fusionsproteins von Glutathion S-Transferase (GST) und humane TS eingeführt wurde, wurde danach bei 37°C unter Schütteln in LB-Medium (200 ml) (Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in Gegenwart von Ampicillin (50 μg/ml) inkubiert. Das Inkubationsmedium wurde in 100 ml-Anteilen in zwei Erlenmeyerkolben, die Ampicillin-enthaltendes LB-Medium (1 Liter/Kolben) enthielten, eingegossen. Sie wurden bei 25°C während 3 Stunden unter Schütteln inkubiert, 0,6 ml-Anteile Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG, 40 mg/ml) zugegeben und dann einer weiteren Inkubation bei 25°C während 20 Stunden unterworfen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und dann in einem Zerstörungs-Puffer (100 ml; 50 mM Tris, pH 7,5, 25% Sucrose) suspendiert. Es wurden "10% Nonidet P-40" (5 ml; oberflächenaktives Mittel, Produkt von NACALAI TESQUE INC.) und 1 M Magnesiumchlorid (0,5 ml) zugegeben. Die Zellen wurden mittels eines Sonikators zerstört, und dann eine Zentrifugierung bei 10.000 UpM während 15 Minuten angeschlossen. Der Überstand wurde durch eine mit Glutathion(GSH)-Agarose (14 ml; Produkt von Sigma Chemical Co.) beschickte Säule hindurch laufen gelassen (20 ml/h). Nach Waschen der Säule mit einem Waschpuffer (100 ml, 20 mM Tris, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT) wurde die Säule mit einem Elutionspuffer (50 ml, 50 mM Tris, pH 9,6, 5 mM GSH) so eluiert, dass das Eluat in 5 ml-Anteilen in Röhrchen empfangen wurde. Durch Bestätigung der Protein-Fraktionen gemäß der Bradford-Methode wurden Peak-Fraktionen (9 ml, Proteinkonzentration: 7 mg/ml) erhalten. Sie wurden sofort gegen den vorstehend beschriebenen Waschpuffer (1 Liter) dialysiert, um ihren pH-Wert auf ca. 7,5 zu erniedrigen, und Thrombin (600 Einheiten) wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C 2 Stunden lang in Gegenwart von 1 ml Calciumchlorid behandelt, wodurch das GST-TS-Fusionsprotein an den Bindungsstellen gespalten wurde. Die resultierende Mischung von GST und TS wurde wieder durch eine GSH-Agarose-Säule (20 ml/h) hindurch laufen gelassen, die Säule mit einem Waschpuffer eluiert und Protein-Fraktionen mittels der Bradford-Methode bestimmt, wodurch eine rhTS-Lösung (9 ml) erhalten wurde. 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mg/ml BSA-Lösungen (100 μl) wurden zu 5 ml-Anteilen der Bradford-Lösung zugegeben und ihre spektralen Absorptionsmaße bei 595 nm bestimmt, um eine Standardkurve auszubilden. Eine rhTS-Lösung (100 μl), die auf das 5-fache mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, wurde zu der Bradford-Lösung (5 ml) zugegeben, und das spektrale Absorptionsmaß bei 595 nm gemessen. Als Ergebnis wurde eine Protein-Konzentration der rhTS-Lösung von 3,5 mg/ml festgestellt.
B. Herstellung von nhTS
Die Reinigung von nhTS wurde auf der Basis der von Rode et al. [Rode et al., Biochemical Pharmacology, 29, 723 (1980)] basierenden Methode durchgeführt. Menschlicher Lungenkrebs-Stamm Lu-99, der subkutan in Dorsalregionen von 50 männlichen BALB/c-nu/nu-Mäusen transplantiert worden war, wurde entfernt, um Tumore zu erhalten (50 g). Diese Tumore wurden mit 10 mM Phosphatpuffer (100 ml, pH 7,5, 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM 2-Mercaptoethanol) versetzt und dann homogenisiert. Das Homogenisat wurde bei 4°C und 10.000 UpM 1 Stunde lang zentrifugiert, und aus dem Überstand mit Ammoniumsulfat bei 30 bis 70%iger Sättigung ein Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 0,1% Triton X-100, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 20 μM dUMP) gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf eine Affinitätssäule aufgetragen, wobei Ethyl-10-formyl-5,8-dideazafolat als Ligand verwendet wurde. Nach Waschen der Säule mit 200 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 0,1% Triton X-100, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 20 μM dUMP) wurden nhTS-Proteine mit 200 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 0,1% Triton X-100, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 20 μM dUMP) eluiert und gesammelt (4 ml). 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 mg/ml BSA-Lösungen (100 μl) wurden zu 5 ml-Anteilen der Bradford-Lösung zugegeben und ihre spektralen Absorptionsmaße bei 595 nm gemessen, um eine Standardkurve auszubilden. Eine nhTS-Lösung (100 μl) wurde zu der Bradford-Lösung (5 ml) zugegeben, und das spektrale Absorptionsmaß bei 595 nm gemessen. Als Ergebnis wurde eine Protein-Konzentration der nhTS-Lösung von 0,3 mg/ml festgestellt.
Bezugsbeispiel 2
Herstellung eines polyklonalen Antikörpers unter Verwendung von rhTS als Immunogen
Einem Kaninchen (New Zealand White, weiblich, 12 Wochen alt) wurde die in Bezugsbeispiel 1A erhaltene rhTS subkutan mit einer Dosis von 100 μg/Kaninchen in seine Dorsalregion verabreicht. Die rhTS wurde in Form einer vorher in einem Freund'schen vollständigen Adjuvans ausgebildeten Emulsion verwendet. Dem Kaninchen wurde die vorher in einem Freund'schen unvollständigen Adjuvans emulgierte rhTS subkutan bei einer Dosis von 100 μg/Kaninchen viermal hintereinander in Intervallen von 14 Tagen an seiner Dorsalregion subkutan injiziert. 7 Tage nach der letzten Immunisierung wurde dem Kaninchen eine Blutprobe entnommen und dann durch Zentrifugieren Serum erhalten. Das Serum wurde dann durch eine "Protein G Sepharose 4FF"-Säule (Produkt von Pharmacia AB) hindurch gelassen. Nach Waschen der Säule mit einem Waschpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,0) wurde der Antikörper mit einem Elutionspuffer (0,1 M Glycin, pH 2,7) eluiert und sofort gegen den vorstehend beschriebenen Waschpuffer dialysiert, wobei der Antikörper als IgG gereinigt wurde. Die Probe der IgG-Fraktion wurde auf eine rhTS-gebundene Sepharose-4B-Säule aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit einem Waschpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,0) wurde der Antikörper mit dem Elutionspuffer (0,1 M Glycin, pH 2,7) eluiert und sofort gegen einen Waschpuffer dialysiert.
Bezugsbeispiel 3
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung von rhTS als Immunogen
Einer weiblichen BALB/c-Maus (8 Wochen alt) wurde das in Bezugsbeispiel 1A erhaltene rhTS intraperitoneal mit einer Dosis von 20 μg/Maus injiziert. Das TS-Protein wurde in einer vorher in einem Freund'schen unvollständigen Adjuvans emulgierten Form verwendet. Der Maus wurde das rhTS in Form einer vorher in Freund'schem unvollständigen Adjuvans ausgebildeten Emulsion zusätzlich und intraperitoneal in einer Dosis von 20 μg/Maus viermal hintereinander in Intervallen von 14 Tagen injiziert. 3 Tage vor der Fusion wurde das rhTS (100 μg) in Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (0,5 ml) durch eine kaudale Vene injiziert. Unter Verwendung von Milzzellen (1 × 10³) aus der immunisierten Maus, P3 × 63 Ag8-Variante 653-Myelomzellen (2 × 10⁷) und unter "50% (V/V) Polyethylenglykol 4000" (Produkt von Merck & Co., Inc.) als Fusionsreagens wurden diese Zellen gemäß der von Galfre und Milstein [Galfre et al., Nature 266, 550 (1977)] vorgeschlagenen Fusionsmethode einer Fusion unterworfen.
Nach der Fusion wurden die Zellen in HAT-Medium (RPMI1640-Medium, enthaltend 1 × 10^–4 M Hypoxanthin, 4 × 10^–7 M Aminopterin und 1,6 × 10^–5 M Thymidin), das 10% fetales Rinderserum enthielt, suspendiert, um eine Zellenkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml zu ergeben. Die resultierende Suspension wurde in 200 μl-Anteilen pro Vertiefung auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
Die Fusionszellen wurde in einem CO₂-Inkubator (5% CO₂, 37°C) inkubiert, während dessen ein Ersatz des Mediums unter Verwendung von HAT-Medium, das 10% fetales Rinderserumalbumin enthielt, so durchgeführt wurde, dass die Zellen sich vermehren konnten. Ein aus den Milz zellen und den Myelomzellen gebildetes Hybridom wurde gescreent und wurde dann in HT-Medium (RPMI1640-Medium, enthaltend 1 × 10^–4 Hyeoxanthin und 1,6 × 10^–5 M Thymidin), das 10% fetales Rinderserum enthielt, konditioniert.
Der Antikörper im Inkubationsüberstand des Hybridoms wurde mittels ELISA unter Verwendung einer rhTS-sensibilisierten Mikrotiterplatte bestimmt. Im Hinblick auf jede Vertiefung, die als positiv festgestellt wurde, wurde das Klonieren zweimal gemäß der begrenzenden Verdünnungsanalyse unter Verwendung von HT-Medium, das 10% fetales Rinderserum und 5% Bleiclone (Produkt von Dainippon Pharmaceuticals Co., Ltd.) enthielt, wiederholt. Daraus wurden zwei Arten von Klonen, die eine Reaktivität gegenüber dem rhTS zeigten, ausgewählt und mit "RTSMA1" (FERM BP-6404) und "RTSMA2" (FERM BP-6402) bezeichnet.
Ein durch jeden der Klone gebildeter monoklonaler Antikörper wurde wie nachstehend beschrieben erhalten. Pristane (0,5 ml; Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wurde einer nackten Maus intraperitoneal injiziert. 7 Tage später wurde weiteres Pristane (0,5 ml) intraperitoneal verabreicht, und das Hybridom (1 × 10⁷ Zellen) in die Peritonealhöhle transplantiert und sich vermehren gelassen. Nach 2 bis 3 Wochen wurde die Ascites-Flüssigkeit erhalten. Die Ascites-Flüssigkeit wurde durch eine "Protein G Sepharose 4FF"-Säule (Produkt von Pharmacia AB) hindurch laufen gelassen. Nach Waschen der Säule mit Waschpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,0) wurde der Antikörper mit dem Eluens (0,1 M Glycin, pH 2,7) eluiert und sofort gegen Waschpuffer dialysiert.
Bezugsbeispiel 4
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung von nhTS als Immunogen
Auf ähnliche Weise wie im Bezugsbeispiel 3 wurden, mit der Ausnahme, dass als Immunogen das im Bezugsbeispiel B1 erhaltene nhTS anstelle des rhTS verwendet wurde, zwei Arten von Klonen mit einer hohen Reaktivität gegenüber nhTS ausgewählt und mit "NTSMA1" (FERM BP-6401) und "NTSMA2" (FERM BP-6403) bezeichnet. Aus diesen Hybridomen wurden dann auf ähnliche Weise wie im Bezugsbeispiel 3 monoklonale Antikörper erhalten.
Bezugsbeispiel 5
Herstellung von Mess-Antikörpern
(1) Digestion von anti-TS-Kaninchen-spezifischem Antikörper mit Pepsin
Die Kaninchen-spezifischen Antikörper-IgG-Fraktionen, die vorstehend in Bezugsbeispiel 2 erhalten wurden, wurden gegen 50 mM Acetat-Puffer (pH 4,5) dialysiert. Das Dialysat wurde mit Pepsin in einer Menge von 2,5%, bezogen auf die Menge an IgG, versetzt, und eine Digestionsreaktion in einem bei 37°C eingestellten Inkubator 16 Stunden lang durchgeführt. Danach wurde die Digestion durch Erhöhung des pH-Wertes auf 8 mit Tris-Lösung beendet und mittels Gel-Filtration unter Verwendung einer "Sephacryl S-200"-Säule Fraktionen eines Antikörpers F(ab')₂ mit einem Molekulargewicht von 100.000 gepoolt.
(2) Herstellung von an Matrix immobilisiertem Antikörper
Die Fraktionen des Antikörpers F(ab')₂, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden mit 20 mM PBS (pH 7,0) auf 20 μg/ml eingestellt und wurden in 0,1 ml-Anteilen auf eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Die Platte wurde verschlossen und dann während 2 Stunden in einem auf 37°C eingestellten Inkubator einer Beschichtung unterworfen, wobei ein Matrix-immobilisierter Antikörper erhalten wurde. Zur Verwendung wurde die beschichtete Platte zweimal mit Salzlösung (Waschlösung), die 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen und dann in einer Reaktion verwendet.
(3) Herstellung von Peroxidase-markiertem Antikörper
Meerrettich-Peroxidase (2 mg; Produkt von Toyobo Co., Ltd.) wurde in destilliertem Wasser (0,5 ml) gelöst, und nach Zugabe von 0,2 M Natriummetaperiodat (0,1 ml) wurde bei Raumtemperatur während 20 Minuten unter Schütteln eine Reaktion durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine "Sephadex G-25"-Säule [1,5 cm Durchmesser × 12 cm, mit 1 mM Acetat-Puffer (pH 4,2) equilibriert] aufgebracht und mit dem Puffer eluierte braune Enzym-Fraktionen gepoolt. Hälften (1 mg) des gepoolten Enzyms wurden zur polyklonalen Antikörper-IgG-Fraktion (2 mg) bzw. der monoklonalen Antikörper-IgG-Fraktion (2 mg) in 50 mM Carbonat-Puffer (pH 9,5, 1 ml) zugegeben. Ferner wurden 0,1 ml-Anteile von 1 M Carbonat-Puffer zugegeben und die Reaktionen bei Raumtemperatur 2 Stunden lang unter Schütteln durchgeführt. 0,1 ml-Anteile von 4 mg/ml Natriumborhydrid wurden zugegeben, und die resultierenden Mischungen bei 4°C 1 Stunde lang stehen gelassen, wodurch die Reaktionen beendet wurden. Die Reaktionsmischungen wurden dann getrennt gegen Salzlösung dialysiert. Die inneren Dialysate wurden getrennt auf "Sephacryl S-200"-Säulen (2,5 cm Durchmesser × 70 cm, mit physiologischer Salzlösung equilibriert) aufgebracht, und fraktionierte anfängliche Peaks als Enzym-markierte Antikörper gepoolt.
Test 1 Vergleich von Antikörper-Kombinationen
Ein Vergleich der Messsensibilität wurde durchgeführt, indem man den anti-humane-TS-monoklonalen Antikörper, der aus dem Hybridom "RTSMA1" (FERM BP6404) in Bezugsbeispiel 3 erhalten wurde, mit dem in Bezugsbeispiel 5(1) hergestellten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörper kombinierte.
Der monoklonale Antikörper IgG (RTSMA1) und der polyklonale Antikörper IgG, die beide mit 50 mM Carbonat-Puffer (pH 9,5) auf 2 μg/ml eingestellt wurden, wurden in 0,1 ml-Anteilen auf ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen aufgebracht. Die Platten wurden verschlossen und dann während 2 Stunden in einem auf 37°C eingestellten Inkubator einer Beschichtung unterworfen, wodurch zwei Arten von an Matrix-immobilisierten Antikörpern erhalten wurden. Nach zweimaliger Waschung dieser Matrices mit einer Waschlösung wurden serielle Verdünnungen (0,1 ml) von gereinigtem rhTS, die mit 20 mM PBS-enthaltendem 0,5% Tween 20 (Verdünnungsmittel) hergestellt wurden, auf die Antikörper-immobilisierten Platten aufgebracht, und die Platten dann statisch bei 37°C 1 Stunde lang reagieren gelassen. Nach zweimaligem Waschen der Platten mit einer Waschlösung wurden die Enzym-markierten Antikörper (0,1 ml), die aus monoklonalem Antikörper und polyklonalem Antikörper, erhalten aus dem in Bezugsbeispiel 4 erhaltenen Hybridom "NTSMA1" (FERM BP-6401) hergestellt wurden, in die Vertiefungen gegeben und dann statisch 1 Stunde lang bei 37°C reagieren gelassen. Nach viermaligem Waschen der Vertiefungen mit einer Waschlösung wurden 0,1 ml-Anteile von 0,1 M-Acetat-Puffer (pH 5,5, farbbildende Lösung), die 3 mg/ml Orthophenylendiamin und 0,75 mM Wasserstoffperoxid enthielten, zugegeben, und die Enzym-Reaktionen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang an einem dunklen Ort weitergeführt. Schließlich wurden 0,1 ml-Anteile von 1 M Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktionen zu beenden, und die Messungen mit der auf 490 nm eingestellten Messwellenlänge mit einem ELISA-Platten-Lesegerät durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

1) RTSMA1
2) NTSMA1

Aus Tabelle 1 ist es ersichtlich, dass die Verwendung einer Platte mit immobilisiertem monoklonalem Antikörper eine schwache Reaktion gegenüber rhTS niedriger Konzentration zeigt und keine Bestimmungsmethode mit hoher Sensibilität bereitstellen kann, während die Verwendung eines immobilisierten polyklonalen Antikörpers unabhängig von der Art des markierten Antikörpers eine hohe Sensibilität ergibt und eine Spurenmenge von humaner TS bestimmen kann.
Beispiel 1 Bestimmung von humaner TS
(1) Bestimmung eines Standards und humaner TS in einer Probe
Die Proteinmenge des in Bezugsbeispiel 1A gereinigten rhTS wurde quantifiziert, und ihr Wert als nominaler Wert des Standards aufgezeichnet. Der Standard wurde in 20 mM PBS (Verdünnungslösung), die 0,05 Tween 20 enthielt, verdünnt, und der so verdünnte Standard für die Be stimmung bereitgestellt. Als Probe wurde ein Zentrifugenüberstand eines Krebsgewebe-Homogenisats in der Verdünnungslösung auf das 10-fache verdünnt, und der so verdünnte Überstand für die Bestimmung verwendet. 0,1 ml-Anteile des Standards oder der Probe wurden auf eine Platte mit immobilisiertem anti-humane-TS-polyklonalem Antikörper aufgebracht und statisch bei 37°C 1 Stunde lang reagieren gelassen. Nach zweimaligem Waschen der Vertiefungen mit einer Waschlösung wurden 0,1 ml-Anteile des Enzym-markierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers, die mit der Verdünnungslösung auf eine Antikörpermenge von 1 μg/ml eingestellt wurden, in die einzelnen Vertiefungen eingebracht, und bei 37°C 1 Stunde lang statisch reagieren gelassen. Nach viermaligem Waschen der Vertiefungen mit einer Waschlösung wurden 0,1 ml-Anteile von 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, farbentwickelnde Lösung), die 3 mg/ml Orthophenylendiamin und 0,75 mM Wasserstoffperoxid enthielt, zugegeben, und eine Enzym-Reaktion bei Raumtemperatur 30 Minuten lang an einem dunklen Platz ablaufen gelassen. Schließlich wurden 0,1 ml-Anteile von 1 M Schwefelsäure zur Beendigung der Reaktion zugegeben, und die Bestimmungen mit der Messwellenlänge eines auf 490 nm eingestellten ELISA-Platten-Lesegeräts durchgeführt.
(2) Herstellung einer Standardkurve
Durch Auftragen der Standard-TS-Konzentrationen auf der Abszisse und die Wertes des spezifischen Absorptionsmaßes, die in der vorstehenden Bestimmung (1) erhalten wurden, auf der Ordinate, wurde eine Kurve ausgebildet. Wie in 1 dargestellt, wurde eine Standardkurve erhalten, bei der sich das spektrale Absorptionsmaß mit der Konzentration des Standards erhöhte.
(3) Korrelation mit einer Substrat-Bindungsmethode
Eine Substrat-Bindungsmethode, die Tritium-markiertes FdUMP verwendete, wurde durchgeführt auf der Basis der von Spears et al. vorgeschlagenen Methode [Spears et al., Cancer Research, 42, 450 (1982)]. Ein Tumorgewebe wurde mit dem dreifachen seines Gewichtes an Homogenisierungspuffer (200 mM Tris, pH 7,4, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 15 mM Cytidin-5'-monophosphat, 100 mM Natriumfluorid) versetzt. Nach der Homogenisierung wurde die Mischung bei 105.000 × g 1 Stunde lang zur Herstellung eines Homogenisats zentrifugiert. Das Homogenisat (50 μl) wurde mit Puffer A (50 μl, 600 mM Ammoniumhydrogencarbonat, pH 8,0, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 100 mM Natriumfluorid, 15 mM Cytidin-5'-monophosphat), Puffer B (25 μl, Kaliumphosphat, pH 7,4, 20 mM 2-Mercaptoethanol, 15 mM Cytidin-5'-monophosphat, 100 mM Natriumfluorid, 2% BSA, 2 mM Tetrahydrofolsäure, 16 mM Natriumascorbat, 9 mM Formaldehyd) und 2 μCi/ml [³H]FdUMP (50 μl) versetzt. Die resultierende Mischung wurde bei 30°C 20 Minuten lang inkubiert, und die Radioaktivität einer in Säure unlöslichen Fraktion gemessen. Unter der Annahme, dass TS und [³H]FdUMP miteinander in einem Verhältnis von 1:1 gebunden waren, wurde die Menge an TS aus der spezifischen Aktivität von [³H]FdUMP berechnet.
Die nach der vorstehend unter (3) beschriebenen Substrat-Bindungsmethode erhaltenen Mengen an humaner TS in den Proben wurden auf der Abszisse aufgetragen, während die unter Verwendung der Standardkurve aus den Werten des spektralen Absorptionsmaßes der Proben, die durch ELISA in der vorstehenden Bestimmung (1) erhalten wurden, berechneten Konzentrationswerte auf der Ordinate aufgetragen wurden. Wie in 2 gezeigt, wurde eine gute Korrelation festgestellt.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie vorstehend beschrieben, wurde es durch die vorliegende Erfindung möglich, humane TS in einer Probe mit hoher Sensibilität mittels einer einfachen immunologischen Bestimmungsmethode aufgrund der Verwendung eines auf einer unlöslichen Matrix immobilisierten anti-humane-TS-polyklonalen Antikörpers zu bestimmen. Die Quantifizierung von menschlicher TS in einer Probe (z.B. einem Magengewebsextrakt) mittels der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode ermöglicht nicht nur die Feststellung der Gegenwart oder Abwesenheit von Krebs, die Bestätigung der therapeutischen Wirkung und dergleichen, sondern auch den Hinweis darauf, welche Behandlungsmethode gewählt werden sollte, und ob die Verabreichung eines Antitumormittels zulässig ist oder nicht.

Claims

Methode zur immunologischen Bestimmung humaner Thymidylat-Synthase mit einem Anti-humane Thymidylat-Synthase-Antikörper, worin als Antikörper mindestens ein Anti-humane Thymidylat-Synthase-polyklonaler Antikörper, der an einer unlöslichen Matrix immobilisiert ist, verwendet wird.
Methode nach Anspruch 1, worin als Anti-humane Thymidylat-Synthase-Antikörper ein Anti-humane Thymidylat-Synthase-polyklonaler Antikörper, der an einer unlöslichen Matrix immobilisiert ist, und ein markierter Anti-humane Thymidylat-Synthase-Antikörper in Kombination verwendet werden.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, worin der Anti-humane Thymidylat-Synthase-Antikörper unter Verwendung einer rekombinanten humanen Thymidylat-Synthase als Immunogen erhalten wurde.
Methode zur Bestimmung der Sensibilität von Krebszellen gegenüber einem Fluorpyrimidin-Antitumor-Mittel, die umfasst das Messen einer Menge der in einer Probe der Krebszellen enthaltenen humanen Thymidylat-Synthase nach einer in einem der Ansprüche 1 bis 3 definierten Methode und Bestimmen der Sensibilität aus den Ergebnissen dieser Messung.
Kit zum Bestimmen von humaner Thymidylat-Synthase, der eine unlösliche Matrix mit mindestens einem darauf immobilisierten Anti-humane Thymidylat-Synthase-polyklonalen Antikörper aufweist.