DE3205301C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Creatinkinase-MB-Isoenzym-Form von Creatinkinase gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.

Creatinkinase (CK) kommt in tierischen Körperflüssigkeiten und Gewebe in der Form von drei bekannten Isoenzymen vor, welche CK-BB, CK-MM und CK-MB bezeichnet werden. Jedes dieser drei Isoenzyme, nämlich CK-BB, CK-MM und CK-MB unterscheidet sich von den andern durch eine unterschiedliche Kombination der Untereinheiten, welche als M oder B bezeichnet werden. CK-BB hat zwei B-Untereinheiten, CK-MM hat zwei M-Untereinheiten und CK-MB hat eine M- und eine B-Untereinheit. Die Bestimmung der Anwesenheit von CK-MB in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere im Serum eines Patienten, hat sich bei der Diagnose von Herzinfarkt als sehr wertvoll erwiesen (Galen, RS., Human Path. 6. No. 2, 145-147, April 1975).

Gängige immunologischen Methoden zur Bestimmung der Gegenwart von CK-MB sowie die Nachteile dieser Methoden wurden kürzlich beschrieben (Current Problems in Cardiology, Vol. III, No. 12, März 1979, p. 7-28). Diese Methoden waren nicht sehr befriedigend im Lösen der Schwierigkeit von störender CK-MM und CK-BB in der Unterscheidung und Bestimmung von CK-MB gegenüber CK-MM und CK-BB.

Ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung der CK-MB-Aktivität in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit wurde in den US-Patenten Nos. 40 67 775 und 42 37 044 beschrieben. Nach dem Verfahren dieser Patente wird ein Antikörper verwendet, welcher durch ein aktiviertes CK-MM-Antigen hergestellt wurde. Bei diesem Verfahren ist es notwendig, daß die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe kein CK-BB-Isoenzym enthält. Im speziellen wird im US-Patent No. 40 67 775 in Kolonne 3, Zeilen 38-40 erwähnt, daß CK-BB das Verfahren der vorliegenden Erfindung störe und deshalb in der zu testenden biologischen Flüssigkeit nicht enthalten sein dürfte. Da biologische Flüssigkeiten CK-BB enthalten, könnte die Bestimmung gemäß diesen Patenten zeitaufwendige und schwierige Verfahren notwendig machen, um erst alles CK-BB aus der Flüssigkeit zu entfernen. Für den Fall, daß CK-BB in der flüssigen Probe vorhanden ist, würden bei Verwendung dieser Bestimmungsmethode falsch positive Ergebnisse resultieren. Das heißt also, daß dieses Verfahren zur Bestimmung von CK-MB in Flüssigkeiten, die CK-BB enthalten, nicht verwendet werden kann.

Wreton und Pfleiderer, Clinica Chimica Acta 58, 223-232 (1975) beschreiben ein System für einen Immunoassay, bei dem CK-MM und CK-BB durch Imunoinhibition und Immuntitration bestimmt werden. Diese Bestimmungen erfordern die Quantifizierungen von Werten, die durch Vergleich der erhaltenen Restisoenzymaktivität mit der Gesamtisoenzymaktivität der Probe erhalten wurden. Eine Immunihibitionsbestimmung für die CK-Isoenzyme ist eine solche, bei der die enzymatischen Aktivitäten der CK-Isoenzyme in der Testflüssigkeit unterschiedlich inhibiert oder inaktiviert werden und zwar durch immunologische Inhibierung oder durch inaktivierende Antikörper, bei denen die Homogenität der Probe erhalten bleibt. Das Wreton und Pfleiderer-Verfahren erfordert eine Vielzahl von Bestimmungen (mindestens vier) um zu den Werten zu gelangen, die zur Bestimmung der CK-Isoenzymaktivitäten erforderlich sind.

Dies bedeutet vier Fehlerquellen und eine gleiche Anzahl von zeitaufwendigen Verfahren.

Bei einem von Wursburg et al. in J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15, 131-137 (1977) beschriebenen Verfahren werden zur Differenzierung der CK-Isoenzyme nach einem Schema fällende Antikörper verwendet, welche Messungen von vier verschiedenen Bestimmungen notwendig machen. Diese Bestimmung erfordert die Messung der Gesamt-CK-Aktivität in der Testprobe und der Restaktivität nach Zugabe von fällenden Anti-CK-BB und fällenden Anti-CK-MM-Antikörper, wobei diese fällenden Antikörper in verschiedenen Reaktionsgefäßen zugegeben werden. Nach diesen Verfahren ist die Homogenität der Probe durch die fällenden Antikörper nicht gewährleistet. Wie beim Wreton-Pfleiderer-Verfahren erfordert dieses Verfahren arbeits- und zeitaufwendige Mehrfachbestimmungen mit entsprechend hohen Fehlerquellen.

Ferner wird in der DAS 21 28 670 erwähnt, daß man auch schon versucht hat, nicht präzipitierbare Isoenzym-Antikörperkomplexe zu fällen, indem man das Antiserum im Überschuß mit dem Isoenzym vereinte und den gebildeten Komplex samt anderen γ-Globulinen mit Anti-γ-Globulinseren präzipitierte. Dazu war aber eine weitere quantitative Vorbestimmung des Titers an γ-Globulinen erforderlich. Die Reaktion mit dem Anti-γ-Globulin benötigt außerdem längere Zeiten, z. B. 12 Stunden, und eignet sich deshalb für die Routinediagnostik weniger.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein entsprechendes Mittel anzugeben, mit dem man schnell, ökonomisch und präzis den Gehalt an CK-MB sogar in Flüssigkeiten enthaltend CK-BB bestimmen kann.

Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren bzw. durch das im Anspruch 8 gekennzeichnete Mittel gelöst.

Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erfordert keine Vielzahl von Bestimmungen und Berechnungen, welche zu zweifelhaften und weniger genauen Ergebnissen führen würde.

Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist wertvoll bei der Diagnose von Herzinfarkten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von CK-MB in jeder biologischen Flüssigkeit. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann CK-MB unter Verwendung von zwei Portionen einer einzigen Probe einer biologischen Flüssigkeit bestimmt werden, welche zwei Werte für die Aktivität der B-Untereinheit in jeder dieser Portionen liefert. Von diesen Aktivitäten kann die Aktivität der CK-MB bestimmt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich biologische Flüssigkeiten, wie Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, Rückenmarkflüssigkeit, Speichel, Schweiß und dergleichen oder aber auch Stuhlausscheidungen von Menschen oder Tieren zu verwenden. Es ist aber auch möglich, Flüssigpräparate von menschlichem oder tierischen Gewebe, wie Muskelgewebe, Herzgewebe, Nierengewebe, Lungengewebe, Hirngewebe, Rückenmarksgewebe, Hautgewebe und dergleichen zu verwenden. Die bevorzugte biologische Flüssigkeit für das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch menschliches Serum. In den meisten Fällen muß das Serum für das erfindungsgemäße Verfahren nicht verdünnt werden, kann jedoch zur Erzielung besserer Resultate verdünnt werden, wenn der Anteil an CK unüblicherweise hoch ist, wie dies in Seren von Patienten der Fall ist, die an einem akuten Herzinfarkt leiden.

In speziellen betrifft das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des CK-MB-Isoenzyms in einer Probe in einer biologischen Flüssigkeit, welche CK-MB, CK-MM und CK-BB enthalten kann. Das Verfahren wird durchgeführt durch (a) Inkubation einer ersten von zwei Portionen der Probe der biologischen Flüssigkeit in einem ersten Reaktionsgefäß mit einem ersten Antikörper, welcher selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen bindet, welche die M-Untereinheit enthalten, und zwar durch selektive Immunoinhibition der M-Untereinheit in der ersten Portion zur Inhibition der enzymatischen Aktivität von nur der M-Untereinheit der Creatinkinase-Isoenzyme und hernach durch quantitative Messung der Aktivität der B-Untereinheit in dieser ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit, (b) Inkubation der zweiten Portion der Probe dieser biologischen Flüssigkeit in einem separaten zweiten Reaktionsgefäß mit (a) einem Antikörper, welcher selektiv mit dem Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit bindet und (2) einem fällenden zweiten Antikörper, welcher immunologisch mit dem Antikörper bindet, der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheiten enthält und ein Reaktionsprodukt bildet zwischen dem zweiten Antikörper und dem Antikörper und den Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit als Niederschlag in dieser zweiten Portion und hernach quantitativ die Aktivität des B-Isoenzyms im Überstand dieser zweiten Portion mißt und (c) die CK-MB-Aktivität in der Probe der biologischen Flüssigkeit aus den Messungen der ersten und zweiten Portion bestimmt.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zwei immunologische Reaktionen, welche in verschiedenen Reaktionsgefäßen durchgeführt werden. Man erhält von jeder dieser zwei Reaktionen eine Messung der enzymatischen Aktivität der Flüssigkeit im Reaktionsgefäß. Jede Reaktion kann gleichzeitig durchgeführt werden, doch können die Bestimmungen auch zu verschiedenen Zeiten erfolgen. Es ist jedoch von Vorteil, wenn die Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden. Es ist nicht notwendig, daß die Reaktionsgefäße gleiche Portionen der Probe enthalten, doch sind gleich Portionen für eine einfache Bestimmung bevorzugt. Zur Bestimmung und Unterscheidung der enzymatischen Aktivität von CK-MB in der flüssigen Probe muß man nur durch eine in der Fachwelt bekannte und von der Fachwelt akzeptierte Methode die Werte der enzymatischen Aktivität von den beiden separaten Reaktionen quantifizieren. Für den Fall, daß die Reaktionsgefäße gleiche Portionen an Probe enthalten, muß man nur die enzymatische Aktivität die man im zweiten Reaktionsgefäß erhalten hat, von der enzymatischen Aktivität die man im ersten Reaktionsgefäß erhalten hat, subtrahieren. Sofern ungleiche Portionen verwendet werden, muß man zuerst durch eine herkömmliche Methode die Differenz in der Enzymkonzentration korrigieren, bevor man die durch die zwei Reaktionsgefäße erhaltenen Werte voneinander subtrahiert.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reaktionsgefäß kann jedes in der Art bekannte Reaktionsgefäß sein, daß für die Durchführung immunologischer Bestimmungen geeignet ist. Zu den verwendbaren Reaktionsgefäßen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gehören Teströhrchen aus Glas, Plastik oder Metall. Das geeignete Reaktionsgefäß ist ein Teströhrchen aus Glas.

Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Die Bestandteile des Mittels sind: (a) ein erster Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen zu binden, die die M-Untereinheit enthalten und zwar durch selektive Immuninhibition der M-Untereinheit, (b) ein fällender zweiter Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit dem ersten Antikörper zu reagieren und (c) ein Reagens von Enzym-Coenzym und Substrat, welches fähig ist, die enzymatische Aktivität der B-Untereinheit zu bestimmen.

Wenn alle Komponenten des Mittels in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist der Fachmann in der Lage, die enzymatische Aktivität von CK-MB in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit enthaltend CK-MB, CK-MM und CK-BB zu bestimmen. Das Testkit ist geeignet für Kliniken, Spitäler, Laboratorien und einzelne Ärzte, welche eine Notwendigkeit zur Bestimmung und Unterscheidung von CK-MB in Flüssigkeiten haben.

Nach der vorliegenden Erfindung kann als erster Antikörper jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv die M-Untereinheit von CK immunihibiert, ohne die B-Untereinheit signifikant zu immuninhibieren. Diese Antikörper können in herkömmlicher Weise hergestellt werden, indem man einem Tier gereinigtes CK-MM-Antigen injiziert und durch Blutentnahme das Serum enthaltend den Antikörper gewinnt. Jede in der Art bekannte Methode kann zur Reinigung des CK-MM-Antigens verwendet werden, und es kann jede bekannte Art zur Injektion dieses Antigens in Tiere verwendet werden, um entsprechende Antikörper zu erhalten. Zu den Antikörpern die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, zählen die gemäß US-Patent No. 42 37 044, welche in einem Tier durch CK-MM-Antigen erzeugt werden, welches vor der Injektion durch einen Aktivator, wie Mercaptoäthanol, aktiviert wurde, aber auch solche, welche durch ein CK-MM-Antigen erzeugt werden, welches vor der Injektion nicht aktiviert wurde, wie diejenigen, die bei der vorerwähnten Immunoinhibitionsbestimmung von Wreton und Pfleiderer verwendet werden. Obwohl durch die Zugabe des ersten Antikörpers beim Verfahren der vorliegenden Erfindung Fällung entstehen kann, sedimentiert diese Fällung nicht, sondern bleibt während des ganzen Verfahrens homogen.

Der erste Antikörper kann in jeder Tierspezies erzeugt werden. Die Tierspezies umfaßt insbesondere Wirbeltiere, wie Schwein, Rindvieh, Hund, Esel, Pferd, Ziege, Kaninchen, Ratte und dergleichen. Unter diesen Tieren sind Säugetiere wie Esel, Schaf und Ziege bevorzugt. Das bevorzugteste Tier ist die Ziege.

Nach einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird der erste Antikörper durch Immunisieren von Ziegen, einer ersten Tierspezies, mit einem gereinigten CK-MM-Antigen erzeugt, wobei man durch herkömmliche immunologische Techniken Ziegen-Anti-CK-MM-Antikörper enthält. Zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren muß der erste Antikörper in der Lage sein, die M-Untereinheit von CK selektiv zu inhibieren und zwar durch Immuninhibition. Unter Immuninhibition wird verstanden, daß der erste Antikörper die M-Untereinheit immunologisch inhibiert ohne die B-Untereinheit signifikant zu inhibieren und daß diese Inhibition der M-Untereinheit in der Probenportion unter Erhaltung der Homogenität der Probe erfolgt.

Der erste Antikörper wird mit der ersten und zweiten Portion, vorzugsweise gleichen Portionen der Testprobe, im Reaktionsgefäß inkubiert und vorzugsweise gemischt.

Als Ergebnis bindet der erste Antikörper immunologisch an jedes CK-MB und CK-MM jeder Portion der Probe und liefert Immuninhibition von CK-MB und CK-MM ohne die B-Untereinheit signifikant zu beeinträchtigen. Es ist zu beachten, daß der wesentliche Punkt des ersten Antikörpers für die zweite Portion lediglich darin besteht, die CK-MB und CK-MM immunologisch zu binden ohne signifikant CK-BB zu binden. Es ist nicht wesentlich oder notwendig, daß der erste Antikörper Immuninhibition in der zweiten Portion der Probe bewirkt. Daraus resultiert, daß der erste Antikörper in der zweiten Portion der Probe durch einen unterschiedlichen Antikörper ersetzt werden kann, der in einem anderen Tier als demjenigen zur Erzeugung des ersten Antikörpers unter Verwendung von gereinigten CK-MM-Antigen produziert wurde. Tatsächlich kann als erster Antikörper in der zweiten Portion der Probe jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv die Creatinkinase enthaltend die M-Untereinheit bindet ohne wesentlich die B-Untereinheit zu inhibieren.

Die Temperatur und Zeit der Inkubation jeder Portion der Testprobe nach der Zugabe des Antikörpers ist nicht kritisch und kann bei jeder Temperatur und während jeder Zeit durchgeführt werden, die bei Enzymimmunverfahren üblich und geeignet sind. Vorzugsweise werden die Inkubationen bei Raumtemperatur und während 5 bis 60 Minuten durchgeführt.

Nach der vorliegenden Erfindung wird die Messung der ersten Portion auf enzymatischen Aktivität nach der Inkubation dieser ersten Probe mit dem ersten Antikörper durchgeführt während die Homogenität der Probe erhalten bleibt. Nach dieser Art der Messung kann die B-Untereinheit von CK-MB und CK-BB bestimmt werden.

Die Menge an erstem Antikörper in der zweiten Portion der Probe muß genügend sein, um praktisch alle CK-MB und CK-MM-Isoenzyme dieser Portion zu binden. Um beste Ergebnisse zu erzielen wird der erste Antikörper zu jeder Portion der Probe in einer Menge zugegeben, die im Überschuß zu derjenigen Menge ist, die normalerweise benötigt wird, um alle CK-MB und CK-MM zu binden. Die Bestimmung der Menge an erstem Antikörper, welche für jede Probe notwendig ist, kann nach herkömmlichen Methoden erfolgen.

Die zweite Portion der Testprobe im zweiten Reaktionsgefäß wird nach Zugabe eines anderen Antikörpers, nämlich entweder des ersten oder eines Ersatzantikörpers mit einem fällenden zweiten Antikörper versetzt. Die Zeit für die Zugabe dieses zweiten Antikörpers nach der Zugabe des ersten Antikörpers ist nicht kritisch, wobei jedoch etwa 5 Minuten bevorzugt sind. Falls erwünscht, können längere Zeitintervalle verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann als zweiter fällender Antikörper jeder Antikörper verwendet werden, welcher selektiv an den ersten Antikörper bindet und diesen fällt und welcher praktisch frei von immunologischer Aktivität gegen die B-Untereinheit von Creatinkinase ist.

Der zweite Antikörper kann nach einer herkömmlichen Technik in einer Tierspezies erzeugt werden, welche unterschiedlich ist zu derjenigen in der der erste Antikörper gebildet wurde. Typischerweise wird der zweite Antikörper nach konventionellen immunologischen Techniken durch Immunisieren von Eseln mit Ziegengammaglobulin (IgG) und Gewinnung des Eselantiziegen-IgG produziert. Der zweite Antikörper, der in dieser Weise erhalten wurde, ist fähig, jedes Ziegen-IgG zu binden, also auch Ziegen-anti-CK-MM, den bevorzugten ersten Antikörper. Der zweite Antikörper wird vorzugsweise an einem festen Träger gebunden. Der feste Träger enthaltend den zweiten Antikörper wird mit der zweiten Portion der Testprobe im zweiten Reaktionsgefäß, vorzugsweise nach Mischen während ungefähr 5 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert. Als Ergebnis bindet nun der zweite Antikörper immunologisch zum anderen Antikörper in der zweiten Portion der Probe. Dies gibt ein Immunpräzipitat enthaltend CK-MB-ersten Antikörper/zweiten Antikörper, CK-MM-ersten Antikörper/zweiten Antikörper und ersten Antikörper/zweiten Antikörper. Die Menge an zweiten Antikörper entspricht der Menge die genügend ist, um alle ersten Antikörper zu binden. Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der zweite Antikörper gewöhnlich in einer Menge zugeführt, welche über derjenigen liegt, die notwendig ist, um alle ersten Antikörper zu binden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Präzipitat, welches nach Zugabe des zweiten Antikörpers entsteht, von der zweiten Portion der Probe nach einer herkömmlichen Technik getrennt. Der erhaltene Überstand wird auf enzymatische Aktivität gemessen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es der Überstand, welcher auf enzymatische Aktivität gemessen wird.

Zu den herkömmlichen Methoden zur Abtrennung des Präzipitates von dieser zweiten Portion gehören herkömmliche Filtrationen und Chromatographiemethoden. Die am meisten bevorzugten Methode zur Abtrennung des Präzipitates aus dieser zweiten Portion ist die Zentrifugation gefolgt durch Dekantierung des Überstandes und Messen der dekantierten Flüssigkeit.

Der Überstand dieser zweiten Portion wird dann in herkömmlicher Weise gemessen um die Aktivität des CK-BB-Isoenzyms in diesem Überstand zu bestimmen.

Die Messung oder Bestimmung der Aktivität von CK-MB und/oder CK-BB in jeder Reaktionsportion der Testprobe kann nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden. Diese Methoden umfassen kolorimetrische Methoden, z. B. diejenige gemäß Methoden der enzymatischen Analyse herausgegeben durch H. U. Bergmeyer, 3. Edition 1974, Vol. 1, Seiten 145 und folgende. Ebenfalls umfaßt ist die fluorimetrische Bestimmung von CK-BB. Creatin wird aus Creatinphosphat durch CK befreit und dieses Creatin kann durch Reaktion mit Ninhydrin in streng alkalischer Lösung fluorimetrisch gemessen werden (R. B. Conn, Clin. Chem., Vol. 6, Seite 537 und folgende 1960).

Für diesen Zweck bevorzugt sind kinetische Methoden, nach denen die enzymatische Aktivität durch Messen im UV, z. B. bei 334, 340 oder 366 nm bestimmt wird. Bevorzugt ist eine Standardmethode, bei der CK unter Verwendung von Creatinphosphat und Adenosinphosphat bestimmt wird: Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., Vol. 8, Seiten 658 und folgende (1970) und Vol. 10, Seite 182 (1972). Testgarnituren zur Bestimmung der CK-Aktivität nach dieser Methode sind käuflich erhältlich.

Nach der bevorzugten Methode wird die enzymatische Aktivität der CK-MB und/oder CK-BB nach Zugabe geeigneter Enzyme, Coenzyme und Substrate gemessen, wobei CK-BB den reversiblen Übergang einer Phosphatgruppe von Creatinphosphat zu Adenosindiphosphat katalysiert und wobei die Rate des resultierenden Adenosintriphosphates unter Verwendung gekuppelter und von Hexokinase und Glucose-6-phosphat-dehydrogenate katalysierten Reaktionen gemessen wird. Die Aktivität dieses letzten Enzyms in der Reduktion von Nikotinamid-adenin-dinucleotid wird spektrophotometrisch verfolgt durch die Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm, wobei die Rate in der Änderung der Absorptionszunahme direkt proportional zur Aktivität des CK-MB und/oder CK-BB in jeder gegebenen Portion der Testprobe ist.

Das Isoenzym CK-MM, das als Antigen zur Erzeugung des ersten Antikörpers verwendet wird, kann aus jeder geeigneten biologischen Flüssigkeit wie Blut, Serum oder aus biologischen Organen oder Geweben, wie Herzmuskulatur, Skelettmuskulatur, Knochenmark oder irgendeinem geeigneten Organgewebe erhalten werden, von welchem bekannt ist, daß es dieses Isoenzym enthält. Die bevorzugte Quelle für dieses Isoenzym ist tierische Skelettmuskulatur.

Die Reinigung des vorerwähnten Isoenzyms zu einem sehr hohen Grad von Reinheit bevor es zur Erzeugung von Antikörpers verwendet wird ist sehr zu empfehlen um die Gegenwart nicht-spezifischer Antikörper zu vermindern. Das Isoenzym kann nach jeder herkömmlichen Reinigungsmethode gereinigt werden. Die bevorzugten Reinigungsmethoden sind ebenfalls herkömmlicher Art, nämlich Alkoholfraktionierung und Anionenaustauschchromatographie.

Der Reinheitsgrad des Isoenzyms sowie die Spezifität der erzeugten Antikörper können nach herkömmlichen Methoden bestimmt werden, wie durch Immundiffusion oder durch elektrophoretische Techniken. Die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Reinheit des Isoenzyms ist die Acrylamidgelelektrophorese.

Der zweite Antikörper kann durch Anbringen an ein unlösliches Trägermaterial insolubilisiert werden. Geeignete feste Trägermaterialien umfassen wasserunlösliche organische Polymere, wie Cellulose oder andere Polysaccharide, ein Vinyladditions- oder Kondentionspolymer oder eine wasserunlösliche anorganische Substanz mit Polymercharakter, wie Glas oder Silikongummi. Auf der anderen Seite kann der zweite Antikörper auf der Oberfläche eines festen Trägers, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyfluoräthylen oder Polyvinylidenfluorid absorbiert werden. Die Methode des Anheftens des zweiten Antikörpers an den festen Träger ist nicht kritisch und kann umfassen (1) kovalentes Kuppeln des löslichen zweiten Antikörpers an ein unlösliches Polymer, wie z. B. durch Reaktion mit einem Insolubilisierungsmittel, (2) physikalisches Einwickeln der Partikel des zweiten Antikörpers in die Poren eines Gelpolymers, wie eines quervernetzten Polyacrylamides, oder (3) physikalische Adsorption an eine unlösliche polymere Substanz. Sofern ein fester Träger verwendet wird, ist die bevorzugte Weise die, daß der zweite Antikörper durch Adsorption an aktiviertes Polyvinylidenfluorid (Kynar) angeheftet wird, wobei dem Fachmann bekannte Methoden verwendet werden, wie z. B. diejenige, die im US-Patent No. 38 43 443 beschrieben ist.

Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung weiter.

Beispiel 1 CK-MM-Reinigung I. Homogenat

Ungefähr 1000 g menschliche Skelettmuskulatur oder Herzgewebe wird bei 4°C aufgetaut. Überschüssiges Fett wird vom Gewebe abgetrennt, welches nachher in kleine Stücke (1 cm) geschnitten wird. Die Gewebestücke werden dann in einem Mischer mit 1000-1500 ml kaltem (4°C) 0,05 M (Hydroxymethyl) Aminomethan [Tris-Puffer] enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol vom pH 7,4 homogenisiert. Das erhaltene Homogenat wird dann bei 50 000 xg während 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert und liefert als Niederschlag ein Kügelchen. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch einen gesinterten Glastrichter filtriert und zurückbehalten. Das Kügelchen wird wieder in den Mischer gegeben und mit 500-700 ml Tris-Puffer erneut homogenisiert, bei 50 000 xg zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit mit der ersten überstehenden Flüssigkeit nach Filtrieren zusammengegeben werden. Die zusammengegebenen Überstände werden in Teil II verwendet.

II. Äthanolfällung

Kaltes (4°C) absolutes Äthanol wird zu den vereinigten Überständen gemäß Teil I gegeben bis eine Endkonzentration von 50% (V/V) erreicht wird, worauf man während 30 Minuten bei 4°C rührt. Das erhaltene Gemisch wird dann während 15 Minuten bei 4°C und 70 000 xg zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird zurückbehalten und das ausgefallene Kügelchen wird verworfen. Kaltes (4°C) absolutes Äthanol wird langsam zum Überstand gegeben bis die Äthanolkonzentration 70% ist. Die erhaltene Mischung wird während 30 Minuten bei 4°C gerührt und dann erneut während 15 Minuten bei 7000 xg und 4°C zentrifugiert. Das erhaltene Kügelchen wird resuspendiert in 500-700 ml von 0,05 M Trispuffer vom pH 7,4 enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol und 0,05 M Natriumchlorid.

III. Ionenaustauschchromatographie ("Batch"-Methode)

Diäthylaminoäthyldextran-Anionenaustauschharz (DEAE Sephadex A-50) äquilibriert mit 0,05 M Tris vom pH 7,4 enthaltend 0,05 M NaCl und 1 mM Mercaptoäthanol wird zum resuspendierten Kügelchen gemäß Teil II gegeben, worauf man während 30 Minuten bei 4°C rührt. Die Suspension wird durch Whatman Nr. 1 Filterpapier filtriert und mit Portionen von 0,05 M Trispuffer vom pH 7,4 enthaltend 1 mM Mercaptoäthanol gewaschen, bis das Filtrat nur noch vernachlässigbare CK-Aktivität aufweist. Das Filtrat wird dann bei 4°C unter Druck auf 300-500 ml unter Verwendung einer PM-10-Filtermembran konzentriert.

IV. Zweite Äthanolfällung

Kaltes absolutes Äthanol wird langsam zum konzentrierten Filtrat gemäß Teil III gegeben, bis eine 50%ige Konzentration erreicht ist. Das erhaltene Gemisch wird während 30 Minuten bei 4°C gerührt und dann bei 7000 xg zentrifugiert, wobei sich ein Kügelchen bildet. Der Überstand wird zurückbehalten und das Kügelchen wird verworfen. Kaltes absolutes Äthanol wird langsam zum Überstand gegeben, bis eine 70%ige Konzentration erreicht ist. Die erhaltene Mischung wird während 15 Minuten wieder bei 7000 xg zentrifugiert, worauf das erhaltene Kügelchen in einem minimalen Volumen von 0,05 M Tris vom pH 7,4 (z. B. 50-70 ml) gelöst wird. Das erhaltene Gemisch wird gegen 2000 ml 0,05 M Tris vom pH 7,4 bei 4°C dialysiert wobei der Puffer zweimal gewechselt wird. Ein leichter Niederschlag der sich bei der Dialyse in der Mischung gebildet hat wird nach Zentrifugation entfernt und verworfen. Der Überstand wird in Teil V unten verwendet.

V. Ionenaustauschchromatographie (Kolonne)

DEAE Sephadex A-50 wird mit 0,05 M Tris vom pH 7,4 äquilibriert und eine 2,6 × 60 cm Kolonne wird vorbereitet und extensiv mit diesem Puffer gewaschen. Der letzte Überstand gemäß Teil IV wird auf diese Kolonne gegeben und bei 4°C und einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Stunde eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt. Fraktionen werden auf CK-Aktivität und Proteingehalt analysiert. Die vereinigten Fraktionen enthaltend die Mehrheit des CK-MM-Isoenzyms gegen 0,05 M Tris vom pH 7,4 enthaltend 10 mM Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) dialysiert. Die dialysierten Fraktionen werden bei 4°C unter Druck und unter Verwendung einer PM-10-Filtermembran zu einem geeigneten Konzentrat (z. B. 8-40 mg Protein/ml) konzentriert und bei 4°C in 0,05 M Trispuffer vom pH 7,5 enthaltend 10 mM EDTA gelagert. Ein leichter Niederschlag, welcher sich beim Stehenlassen bildet, wird durch Zentrifugation entfernt. Die Reinheit des CK-MM in dem gelagerten Material ist bezeichnenderweise 90-100%, wie dies durch Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wurde. Elektrophorese an Agarosegel wird verwendet um zu zeigen, daß MB und BB-Isoenzym im gelagerten Material nicht vorhanden sind. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist die endgültig gereinigte Probe von CK-MM.

Beispiel 2 Ziegen-anti-CK-MM-Serum

Zur Herstellung des Immunogens zur Immunisierung der Ziegen wird das gereinigte CK-MM, welches gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, mit 0,02 M Trispuffer vom pH 7,5 auf 4 mg/ml verdünnt und mit einem gleichen Volumen an Freund's kompletten Adjuvans (eine Mineralölsuspension enthaltend getötete M-Tuberculosis Bazillen). Das erhaltene Gemisch wird zu einer Wasser/Öl-Emulsion emulgiert. Ziegen wird wöchentlich eine Injektion von 1 ml dieses Immunogens subkutan in die Achselgegend an zwei Stellen injiziert, wobei bei jeder Seite 0,5 ml Immunogen verwendet wird. Den Ziegen wird alle zwei Wochen Blut entnommen, um das Ziegen-anti-CK-MM-Serum zu erhalten.

Beispiel 3 Aktivierung von Polyvinylidenfluorid

Um die Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG-Serum an Polyvinylidenfluorid (PVF) zu kuppeln, wird das PVF vorgängig nach dem nachfolgenden Verfahren aktiviert:

• 1. 15 l Tris-azid-Puffer wird durch Lösen von 36,3 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Trizma-Base) und 15 g Natriumazid in ungefähr 14,000 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst, wobei der pH mit 5 N Salzsäure auf 7,5 ±0,1 gestellt wird. Die 5 N Salzsäure erhält man durch Verdünnen von 50 ml 38%iger Salzsäure mit 70 ml deionisiertem Wasser. Das Volumen der erhaltenen Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf 15,000 ml eingestellt und bei Raumtemperatur gelagert.
• 2. 100 g Polyvinylidenfluoridpulver wird in einem geeigneten Gefäß mit 600 ml 2-Propanol gemischt. Die erhaltene Suspension wird in einem Homogenisator während 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit homogenisiert, die ausreicht, um eine feine Dispersion herzustellen, und liefert ein Gemisch, welches in einen geeichten 4-l-Zylinder übergeführt wird. Das Gemisch wird während 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 3400 ml Salzwasser, welches durch Lösen von 28,9 g Natriumchlorid in 3400 ml deionisiertem Wasser erhalten wurde, werden zum Gemisch gegeben. Nach der Zugabe des Salzwassers wird das erhaltene Gemisch gut gemischt, worauf man es sich während 1 Stunde absetzen läßt oder solange, bis sich das Polyvinylidenfluorid auf ungefähr 1/5 des Gesamtvolumens abgesetzt hat. Der Überstand wird durch Absaugen entfernt und das Volumen wird mit deionisiertem Wasser wieder auf 4000 ml erhöht. Nach Absetzen des Polyvinylidenfluorids wird der Überstand erneut abgesaugt. Hierauf wird das Volumen erneut auf 4000 ml gebracht und das Polyvinylidenfluorid wird weitere drei Male in dieser Weise mit deionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wird das Polyvinylidenfluorid noch zweimal in dieser Weise mit Tris-azid-Puffer von Stufe 1 gewaschen. Nach der letzten Waschung wird das Volumen des Polyvinylidenfluorids auf 2000 ml gebracht, worauf die Suspension bei Raumtemperatur gelagert wird, bis sie für die Kupplung des Esel-anti-Ziege-IgG-Serums verwendet wird.

Beispiel 4 Herstellung der Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG-Serum

Die Globulinfraktion von Esel-anti-Ziege-IgG-Serum für die Kupplung an den aktivierten PVF gemäß Beispiel 3 wird unter Verwendung der folgenden Materialien und Verfahren erhalten:

Verfahren

• 1. 100 ml Esel-anti-Ziegen-IgG-Serum (Punkt a) werden bei bei 4°C in ein geeignetes Gefäß mit Magnetrührer gegeben. Darauf werden unter schwachem Rühren 60 ml gesättigtes Ammoniumsulfat (Punkt b) zugegeben um den Gefäßinhalt zu einer 37,5%igen Sättigung zu bringen. Man rührt während 1 Stunde bei 4°C, worauf der ausgefallene Antikörper als Kügelchen durch Zentrifugation während 30 Minuten bei 4°C und 12,000 xg gesammelt wird. Das Kügelchen wird in ungefähr 70 ml Tris-azid-Puffer (Punkt c) gelöst, worauf das Volumen auf das Originalvolumen von 100 ml mit demselben Puffer gebracht wird. Hierauf werden unter leichtem Rühren bei 4°C 50 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung (Punkt b) gegeben um das erhaltene Gemisch auf eine 33%ige Sättigung zu bringen. Das Gemisch wird während 1 Stunde bei 4°C gerührt. Der ausgefallene Antikörper wird nach 30minütiger Zentrifugation bei 12,000 xg und 4°C als Kügelchen erhalten. Das Kügelchen wird in ungefähr 40 ml Tris-azid-Puffer (Punkt c) gelöst und in eines Dialyseschlauch übergeführt. Man dialysiert gegen Tris-azid-Puffer bei 4°C. Der Puffer wird dreimal gewechselt (2 l pro Wechsel) nach einem Minium von 4 Stunden Dialyse jedes Mal. Die Gegenwart von Sulfationen wird durch Zugabe von 1 ml Dialysat zu 1 ml gesättigter Bariumchloridlösung festgestellt, wobei nach Rühren ein weißer Niederschlag die Gegenwart von Sulfat anzeigt. Falls irgendwelches Präzipitat beobachtet wird, wird das Dialysat mit frischem Puffer gewechselt und es wird solange dialysiert, bis der Sulfattest negativ ist. Das Volumen des Dialysates wird mit 100 ml Tris-azid-Puffer auf 100 ml gebracht und während 10 Minuten bei 2000 xg und 4°C zentrifugiert, worauf der Überstand gesammelt wird. Der Überstand enthaltend das hergestellte Esel-anti-Ziegen-IgG und wird bei 4°C gelagert, bis er zur Kupplung an den aktivierten Polyvinylidenfluorid gemäß Beispiel 3 gekuppelt wird.

Beispiel 5 Kupplung der Globulinfraktion von Esel-anti-Ziegen-IgG an aktiviertes Polyvinylidenfluorid

Die Kupplung der Globulinfraktion des Esel-anti-Ziegen-IgG-Serums hergestellt nach dem Verfahren von Beispiel 4 zu einer Suspension des aktivierten PVF hergestellt nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3 wird unter Verwendung der nachfolgenden Reagenzien und Verfahren bewerkstelligt:

Verfahren

• 1. 10 ml Tris-EDTA-Puffer werden wie folgt hergestellt: 24,2 g Trizma-Base (Punkt c), 10,0 g Natriumazid und 147,4 g EDTA (Punkt d) werden bei Raumtemperatur in ungefähr 9000 ml deionisiertem Wasser gelöst. Um eine komplette Lösung zu erreichen, kann es notwendig sein, während 30-60 Minuten zu rühren. Das pH der Lösung wird mit 10 N. NaDH auf 7,5 ±0,1 gestellt, und die Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf ein Volumen von 10,000 ml gebracht. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gelagert.
• 2. 2000 ml einer Suspension enthaltend aktiviertes Polyvinylidenfluorid (Punkt a) wird in ein geeignetes Gefäß gegeben und leicht gerührt. 100 ml Esel-anti-Ziegen-Serum (Punkt b) wird zur Suspension gegeben, worauf man während 6 Stunden bei Raumtemperatur und über Nacht (12-18 Stunden) bei 4°C rührt. Man erhält Esel-anti-Ziegen-IgG-Antikörper gebunden an Polyvinylidenfluorid.
• 3. Der an das Polyvinylidenfluorid gekuppelte Antikörper gemäß Stufe 2 wird durch Zentrifugation bei 1500 xg während 10 Minuten als Kügelchen gesammelt. Der Überstand wird weggegossen, und das Kügelchen wird in einem Totalvolumen von 2000 ml Tris-EDTA-Puffer (wie in Stufe 1 hergestellt) resuspendiert.
• 4. Stufe 3 wird ingesamt dreimal wiederholt.
• 5. Das Kügelchen bzw. die Kügelchen, die nach Stufe 4 erhalten werden, werden bis zu einem Volumen von 500 ml im Tris-EDTA-Puffer (Stufe 1) resuspendiert, worauf in dieser Suspension 2,5 g Rinderserumalbumin durch leichtes Rühren während 30 Minuten gelöst werden. Diese Suspension wird dann in einem Homogenisator während 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit homogenisiert, die eine feine Dispersion liefert und so als Produkt unlösliches Anti-Ziegen-IgG liefert.
• 6. Das unlösliche Anti-Ziegen-IgG-Produkt wird bei 4°C in der folgenden endgültigen Konzentration gelagert:
  • 20% (W/V) Polyvinylidenfluorid
  • 0,02 g M Tris pH 7,5
  • 0,1% (W/V) Natriumazid
  • 0,5% (W/V) BSA
  • 39,6 nM EDTA

Beispiel 6

Eine Bestimmung von CK-MB-Aktivität in einer biologischen Flüssigkeit wird durch die folgenden Verfahren bewerkstelligt, welche zwei Teströhrchen benötigen:

• 1. Zu Teströhrchen 1 wird gegeben: 200 µl Patientenserum und 250 µl Ziegen-anti-CK-MM-Serum (wie in Beispiel 2 hergestellt), wobei das Gemisch leicht gerührt und dann während 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wird, wobei man die in Stufe 3 zu verwendende Mischung erhält.
• 2. Zu Teströhrchen 2 wird gegeben: 200 µl Patientenserum und 50 µl Ziegen-anti-CK-MM-Serum (wie in Beispiel 2 hergestellt), wobei man leicht rührt und dann während 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen läßt. Hierauf gibt man 200 µl gelagertes unlösliches anti-Ziegen-IgG (hergestellt wie in Beispiel 5), wobei man leicht mischt und das Reaktionsgemisch während 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen läßt. Das Röhrchen wird dann während 5 Minuten bei 1000 xg zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird in Stufe 3 verwendet.
• 3. 100 µl der resultierenden Mischung von Stufe 1 und 200 µl des Überstandes von Stufe 2 werden zu der ersten und zweiten Portion von 1,0 ml enzymatischem CK-Reagens (Beispiel 7) zur Messung der CK-Enzymaktivität gegeben. Nacher wird jede Portion gründlich gemischt und dann während 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Absorption wird für jede Portion bei 340 nm während einer Gesamtzeit von 5 Minuten in periodischen Intervallen in einem Spektrophotometer bei 37°C unter Verwendung von einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke aufgezeichnet. Die aufgezeichneten Absorptionen werden in Absorptionswechsel pro Minute umgewandelt und die I. E./Liter an CK-Aktivität für jede Portion wird erhalten. Hierauf wird der Wert der CK-Aktivität der zweiten Portion vom Wert der CK-Aktivität der ersten Portion substrahiert.

Beispiel 7

Das enzymatische CK-Reagenz von Beispiel 7 enthält die folgenden Reagenzien:

Reagenzien
Konzentration in der Formulierung
Creatinphosphot|17 mM
D-Glucose	20 mM
ADP	1,2 mM
AMP	8 mM
NAD (Hefe)	2,3 mM
MgCl₂	15 mM
Hexokinase (Hefe)	2500 IE/Liter bei 30°C
Glucose-6-phosphatdehydrogenase (Leuconostoc)	2500 IE/Liter bei 30°C
Dithioerythritol	60 mM

Die Reagenzien werden in Piperazin-N,N-bis (2-äthansulfonsäure)-puffer vom pH 5,8 ±0,15 (30°C) formuliert.

Claims (10)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Creatinkinase-MB-Isoenzym-Form von Creatinkinase, welche in biologischen Flüssigkeiten in einer Vielzahl von Isoenzymformen vorkommt, welche die Untereinheiten M oder B oder beide enthalten,
bei dem man a) in einem ersten Reaktionsgefäß eine erste einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einem ersten Antikörper inkubiert, welcher selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit bindet und zwar durch selektive Immuninhibition der M-Untereinheit in der ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit und daß man darauf die Aktivität des B-Isoenzyms in der ersten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit quantitativ mißt, dadurch gekennzeichnet,
daß man zusätzlich b) in einem separaten Reaktionsgefäß eine zweite Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit mit

• (1) einem Antikörper inkubiert, der selektiv immunologisch die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheit in der zweiten Portion der Probe der biologischen Flüssigkeit bindet,
• (2) einen fällenden zweiten Antikörper zugibt, welcher selektiv immunologisch mit dem Antikörper bindet, der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheit bindet, um ein Reaktionsprodukt in Form eines Niederschlages in dieser zweiten Portion zu erhalten bestehend aus diesem zweiten Antikörper mit diesem andern Antikörper und diesen Creatinkinase-Isoenzymen enthaltend die M-Untereinheit und daß man darauf die Aktivität des B-Isoenzyms im Überstand in dieser zweiten Portion quantitativ mißt und
  daß man c) die CK-MB-Aktivität in dieser Probe aus dem Meßergebnissen erhaltend von der ersten und der zweiten Portion bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe der biologischen Flüssigkeit Blutserum ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper von Stufe a und der Antikörper der die Creatinkinase-Isoenzyme enthaltend die M-Untereinheiten von Stufe b bindet, Ziegen-anti-Creatinkinase-MM ist und daß der zweite Antikörper von Stufe b Esel-anti-Ziegen-IgG ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite fällende Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger Polyvinylidenfluorid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Aktivität des B-Isoenzyms durch eine photometrische Bestimmung ermittelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die spektrophotometrische Bestimmung eines Enzym-Coenzym- und Substratmischung umfaßt.

8. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß er folgendes umfaßt

• (a) einen ersten Antikörper, welcher fähig ist, selektiv immunologisch mit den Creatinkinase-Isoenzymen zu binden, die die Untereinheit M enthalten, und zwar durch selektive Immunoinhibition der M-Untereinheit,
• (b) einen fällenden zweiten Antikörper, welcher in der Lage ist, selektiv immunologisch mit dem ersten Antikörper zu reagieren und
• (c) ein Reagens von Enzym-Coenzym und Substrat, welches fähig ist, die enzymatische Aktivität der B-Untereinheit zu bestimmen.

9. Mittel gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der fällende zweite Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.

10. Mittel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger Polyvinylidenfluorid ist.