SE453614B - Forfarande for bestemning av kreatinkinas-mb-isoenzym formen av kreatinkinas samt diagnostestkit herfor - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 453 614 vid vilka provets homogenitet förblir bibehållen. Wreton och Pfleiderer- förfarandet kräver ett flertal bestämningar (minst fyra) för att komma fram till de värden som är erforderliga för bestämning av CK-isoenzymaktiviteterna.

Detta betyder fyra felkällor och ett lika stort antal tidskrävande förfaranden.

Vid ett förfarande beskrivet av Wursburg et al i J. Clin. Chem. Clin.

Biochem. _l_§, 131-137 (1977) använder man för differentiering av CK-iso- enzymerna enligt ett schema fällande antikroppar, vilka mätningar nödvändiggör fyra olika bestämningar. Denna bestämning kräver mätning av total-CK-aktivitet i testprovet och restaktiviteten efter tillsats av fällande anti-CK-BB- och fällande antí-CK-MM-antikroppar, varvid dessa fällande antikroppar tillsätts i olika reaktionskärl. Efter dessa förfaranden är provets homogenitet genom de fällande antikropparna inte säkerställd. Liksom vid Wreton-Pfleiderer-förfaran- det kräver detta förfarande ett flertal arbets- och tidskrävande bestämningar med motsvarande stora felkällor. .

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande och ett diagnostiskt testkit för kvantitativ bestämning av CK-MB-isoenzymet, en form av kreatinkinas, som förekommer i ett prov av en biologisk vätska i ett flertal isoenzymer innehållande M- eller B-underenheterna eller båda. I inom ramen för föreliggande uppfinning har man funnit att man snabbt, ekonomiskt och exakt kan bestämma halten av CK-MB t.o.m. i vätskor som innehåller CK-BB, om den biologiska vätskan bestäms enligt följande förfarande: (a) Inkubering i ett första reaktionskärl av ett första av två prov på en biologisk vätska med en första antikropp, som selektivt immunologiskt inhiberar de kreatinkinasisoenzymer, som innehåller M-underenhet, och då genom selektiv immuninhibering av M-underenheten i det första 'provet för inhibering av den enzymatiska aktiviteten av endast M-underenheten av kreatinkinas-isoenzymerna och därpå kvantitativ mätning av aktiviteten av B-underenheten i det första provet; (b) Inkubering i ett separat reaktionskärl av den andra portionen av det biologiska vätskeprovet med (1) en antikropp, som selektivt immunologiskt binder de kreatinkinas-isoenzymer som innehåller M-underenheten och (2) en fällande andra antikropp, som selektivt immunologiskt binder med den antikropp som binder de kreatinkinas-isoenzymer som innehåller M-underenhet och bildar en reaktionsprodukt av denna andra antikropp med den andra antikroppen och de kreatinkinas-isoenzymer som innehåller M-underenheten i form av ett precipitat i den andra portionen och därefter kvantitativ mätning av aktiviteten av B- isoenzymerna i överstoden iden andra portionen och (c) bestämning av CK-MB-aktiviteten i den biologiska vätskan ur mätningar- r, 10 15 20 25 30 35 453 614 na erhållna från den första och andra portionen.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning kräver inte någon mångfald bestärnningar och beräkningar, som skulle leda till tvivelaktiga och mindre noggranna resultat.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning är värdefullt vid diagnos av hjärtinfarkter.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för kvantitativ bestämning av CK-MB i någon godtycklig biologisk vätska. Enligt förfarandet vid föreliggan- de uppfinning kan CK-MB bestämmas med användning av två portioner av ett enda prov på en biologisk vätska, som ger två värden för aktiviteten på B-under- enheten i var och en av dessa portioner. Ur dessa aktiviteter kan aktiviteten för CK-MB bestämmas.

Enligt uppfinningsförfarandet är det möjligt att använda biologiska vätskor, såsom blod, plasma, serum, lymfvätska, gallvätska, urin, ryggmärgs- vätska, saliv, svett och liknande men även stolutsöndringar från människor eller djur. Det är emellertid också möjligt att använda vätskepreparat från mänsklig vävnad eller djurvävnad, såsom muskelvävnad, hjärtvävnad, njurvävnad, lungväv- nad, hjärnvävnad, ryggmärgsvävnad, hudvävnad och liknande. Den biologiska vätska som är att föredra för förfarandet enligt uppfinningen är dock humant serum. l de flesta fall behöver serumet för förfarandet enligt uppfinningen inte spädas, men kan spädas för att man skall uppnå bättre resultat om andelen CK är onödigt hög, vilket är fallet i sera från patienter, som lider av en akut hjärtinfarkt.

Speciellt avser förfarandet enligt föreliggande uppfinning bestämning av den enzymatiska aktiviteten av CK-MB-isoenzymet i ett prov från en biologisk vätska, som kan innehålla CZK-MB, CK-MM och CK-BB. Förfarandet utförs genom (a) inkubering av en första av två portioner av ett prov på den biologiska vätskan i ett första reaktionskärl med en första antikropp, som selektivt immunologiskt binder med de kreatinkinas-isoenzymer, som innehåller M-underenheten, och då genom selektiv immunoinhibering av M-underenheten i den första portionen för inhibering av den enzymatiska aktiviteten av endast M-underenheten av kreatinkinas-isoenzymerna och därefter genom kvantitativ mätning av aktivi- teten av B-underenheten i denna första portion av provet på den biologiska vätskan, (b) inkubering av den andra portionen av provet på denna biologiska vätska i ett separat, andra reaktionskärl med (1) en antikropp, som selektivt binder med kreatinkinas-isoenzymerna som innehåller M-underenheten och (2) en fällande andra antikropp, som immunologiskt binder med den antikropp, som innehåller kreatinkinas-isoenzymerna innehållande M-underenheterna och bildar 453 614 l0 15 20 25 30 35 en reaktionsprodukt mellan nämnda andra antikropp och antikroppen och kreatinkinas-isoenzymerna som innehåller M-underenheten som fällning i denna andra portion och därefter kvantitativ mätning av aktiviteten av B-isoenzymet i överstoden i denna andra portion och (c) bestämning av CK-MB-aktiviteten i provet på den biologiska vätskan ur mätningarna på den första och andra portionen. _ Förfarandet enligt föreliggande uppfinning utnyttjar två immunologiska reaktioner, som utförs i olika reaktionskärl. Man får från var och en av dessa två reaktioner en mätning av den enzymatiska aktiviteten hos vätskan i reak- tionskärlet. Varje reaktion kan utföras samtidigt, men bestämningarna kan även ske vid olika tidpunkter. Det är dock fördelaktigt om reaktionerna utförs samtidigt. Det är inte nödvändigt, att reaktionskärlen innehåller lika stora portioner av provet, men lika stora portioner är att föredra för enkel bestämning.

För bestämning och särskiljning av den enzymatiska aktiviteten av CK-MB i vätskeprovet behöver man endast kvantifiera värdena på den enzyrnatiska aktiviteten från de båda separata reaktionerna med en inom fackvärlden känd och inom fackvärlden accepterad metod. För det fall att reaktionskärlen innehåller lika stora portioner av prov, behöver man endast subtrahera den enzymatiska aktivitet som man fått i det andra reaktionskärlet från den enzyma- tiska aktivitet som man fått i det första reaktionskärlet. Om olika stora portioner används, måste man först korrigera skillnaden i enzymkoncentration med någon sedvanlig metod, innan man subtraherar de från de båda reaktions- kärlen erhållna värdena från varandra.

Det enligt förfarandet enligt uppfinningen använda reaktionskärlet kan vara något godtyckligt känt reaktionskärl inom tekniken, som är lämpat för att utföra immunologiska bestämníngar. Till användbara reaktionskärl för att utföra förfarandet enligt uppfinningen hör provrör av glas, plast eller metall. Ett lämpligt reaktionskärl är ett provrör av glas.

Uppfimingm avser även ett diagnoskit för kvantitativ bestämning av närvaro av CK-MG-isoenzymet av kreatinkinas, som förekommer i en biologisk vätska i ett flertal isoenzymformer som innehåller underenheten M, B eller båda.

Beståndsdelarnai testkitet är: (a) en första behållare innehållande en antikropp, som har förmåga att selektivt immunologiskt binda med de kreatinkinas- isoenzymer som innehåller M-underenheten och då genom selektiv immuninhibe- ring av M-underenheten, (b) en andra behållare innehållande en fällande andra antikropp, som har förmåga att selektivt immunologiskt reagera med antikroppen enligt den första behållaren och (c) ett reagens av enzym-coenzym och substrat, som har förmåga att bestämma den enzymatiska aktiviteten av B-underenheten. 10 15 20 25 30 35 453 614 Om alla komponenter i diagnostestkitet används i överensstämmelse med förfarandet enligt föreliggande uppfinning, är fackmannen i stånd att bestämrna den enzymatiska aktiviteten av CK-MB i ett prov från en biologisk vätska som innehåller CK-MB, CK-MM och CK-BB. Testkitet är lämpat för kliniker, sjukhus, laboratorier, och enskilda läkare, som har behov av att bestämma och särskilja CK-MB i vätskor.

Enligt föreliggande uppfinning kan man som första antikropp använda varje antikropp som selektivt immuninhiberar M-underenheten av CK utan att signifikant immuninhibera B-underenheten. Dessa antikroppar kan framställas på sedvanligt sätt genom att man injicerar ett renat CK-MM-antigen i ett djur och genom uttagning av blod utvinner serumet innehållande antikroppen. Varje känd metod på området kan användas för rening av CK-MM-antigenet, och man kan använda varje känd teknik för att injicera detta antigen i djur för att få motsvarande antikroppar. Till de antikroppar som kan- användas enligt föreliggan- de uppfinning hör de enligt US-PS I; 237 04:14, som i ett djur framkallas av CK- MM-antigen som före injektionen aktiverats med en aktivator, såsom merkapto- etanol, men även sådana som framkallas av ett CK-MM-antigen som inte aktiverats före injektionen, såsom sådana som används vid den tidigare nämnda immuninhiberingsbestämningen enligt Wreton och Pfleiderer. Även om tíllsatsen av den första antikroppen vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan bilda fällning, så sedimenterar inte denna fällning utan förblir homogen under hela förfarandet.

Den första antikroppen kan framkallas i varje djurart. Djurarterna omfattar särskilt ryggradsdjur, såsom svin, nötboskap, hund, åsna, häst, get, kanin, råtta och liknande. Bland dessa djur är däggdjur såsom åsna, får och get att föredra. Det mest föredragna djuret är geten.

Enligt en föredragen aspekt av uppfinningen framkallas den första antikroppen genom immunisering av getter, en första djurart, med ett renat CK- MM-antigen varvid man genom sedvanliga immunologiska tekniker får get-anti- CK-MM-antikroppar. För användning vid förfarandet enligt uppfinningen måste den första antikroppen vara i stånd att selektivt inhibera M-underenheten av CK och då genom immuninhibering. Med immuninhibering förstås, att den första antikroppen immunologiskt inhiberar M-underenheten utan att signifikant inhibe- ra B-underenheten, och att denna inhibering av M-underenheten i provportionen sker under bibehållande av provets homogenitet.

Den första antikroppen inkuberas och blandas företrädesvis med den första och andra portionen, företrädesvis lika stora portioner av testprovet, i reaktionskärlet. 10 15 20 25 30 35 453 614 Som resultat binder den första antikroppen immunologiskt till varje CK- MB och CK-MM i varje portion av provet och ger immuninhibering av CK-MB och CK-MM utan att signifikant påverka B-underenheten. Det bör beaktas, att den väsentliga punkten för den första antikroppen för den andra portionen endast består i att immunologiskt binda CK-MB och CK-MM utan att signifikant binda CK-BB. Det är inte väsentligt eller nödvändigt, att den första antikroppen åstadkommer immuninhibering i-den andra portionen av provet. Därav resulterar, att den första antikroppen i den andra portionen av provet kan ersättas med en olikartad antikropp, som producerats i ett annat djur än det för alstringen av den första antikroppen med användning av renat CK-MM-antigen. I själva verket kan man som första antikropp i den andra portionen av provet använda varje antikropp, som selektivt binder det kreatinkinas som innehåller M-underenheten utan att i väsentlig utsträckning inhibera B-underenheten.

Temperaturen och tiden för inkubationen av varje portion av testprovet efter tillsatsen av antikroppen är inte 'kritisk och kan utföras vid varje temperatur och under varje tid som är sedvanlig och lämplig vid enzymimmun- förfaranden. Företrädesvis utförs inkubationen vid rumstemperatur och under 5 till 60 minuter. " Enligt föreliggande uppfinning utförs mätningen på den första portionen med avseende pâ enzymatisk aktivitet efter inkubationen av detta första prov med den första antikroppen under bibehållande av provets homogenitet. Enligt denna teknik för mätningen kan B-underenheten i CK-MB och CK-BB bestämmas.

Mängden av den första antikroppen i den andra portionen av provet mäste vara tillräcklig för att binda praktiskt taget alla CK-MB- och CK-MM- isoenzymer i denna portion. För att man skall uppnå bästa resultat tillsätter man den första antikroppen till varje portion av provet i en mängd som är i överskott till den mängd som normalt krävs för att binda allt CK-MB och CK-MM. Den bestämning av mängden av den första antikroppen, som är nödvändig för varje prov, kan ske enligt sedvanliga metoder.

Den andra portionen av testprovet i det andra reaktionskärlet försätts efter tillsats av en andra antikropp, nämligen antingen den första eller en ersättningsantikropp, med en fällande andra antikropp. Tiden för tillsatsen av denna andra antikropp efter tillsatsen av den första antikroppen är inte kritisk, varvid dock cirka fem minuter är att föredra. Om så önskas kan längre tidsintervall användas. Enligt föreliggande uppfinning kan man som andra fällande antikropp använda varje antikropp som selektivt binder till den första antikroppen och fäller denna och som är praktiskt taget fri från immunologisk aktivitet mot B-underenheten av kreatinkinas. 10 15 20 25 30 35 453 614 Den andra antikroppen kan framkallas enligt någon sedvanlig teknik i en djurart, som är skild från den där den första antikroppen bildades. Typiskt sett produceras den andra antikroppen enligt konventionella immunologiska tekniker genom immunisering av åsnor med getgammaglobulin (IgG) och utvinning av àsne-antiget-IgG. Denna andra antikropp som erhållits på detta sätt har förmåga att binda varje get-IgG, alltså även get-anti-CK-MM, den föredragna första antikroppen. Den andra antikroppen binds företrädesvis till en fast bärare. Den fasta bärare som innehåller den andra antikroppen inkuberas med den andra portionen av testprovet i det andra reaktionskärlet, företrädesvis efter blandning under ungefär fem minuter vid rumstemperatur. Som resultat binder nu den andra antikroppen immunologiskt till den andra antikroppen i den första portionen av provet. Detta ger ett immunprecipitat som innehåller CK-MB-första antikroppl- andra antikropp, CK-MM-första antikropp/andra antikropp och första antikroppl- andra antikropp. Mängden av den andra antikroppen motsvarar den mängd som är tillräcklig för att binda alla första antikroppar. Enligt en särskilt föredragen aspekt av föreliggande uppfinning tillförs den andra antíkroppen vanligtvis i en mängd som ligger över den som är nödvändig för att binda alla första antikroppar.

Enligt föreliggande uppfinning separeras det precipitat, som bildas efter tillsats av den andra antikroppen, från den andra portionen av provet enligt någon sedvanlig teknik. Den erhållna överstoden mäts med avseende på enzymatisk aktivitet. Enligt föreliggande uppfinning är det överstoden som mäts med avseende på. enzymatisk aktivitet.

Till de sedvanliga metoderna för separation av precipitatet från derma andra portion hör sedvanliga filtreringar och kromatografimetoder. Den mest föredragna metoden för att separera precipitatet från denna andra portion är centrifugering följt av dekantering av överstoden och mätning på den dekan- terade vätskan. överstoden i denna andra portion mäts sedan på sedvanligt sätt för bestämning av aktiviteten av CK-BB-isoenzymet i denna överstod.

Mätningen eller bestämningen av aktiviteten av CK-MB och/eller CK-BB i varje reaktionsportion av testprovet kan utföras enligt i och för sig kända metoder. Dessa metoder omfattar kolorimetriska metoder, t.ex. sådana enligt "Methoden der enzymatischen Analyse", utgiven av i-LU. Bergmeyer, 3 uppl. 1974, vol. l, sid 145 och följande. Även fluorimetrisk bestämning av CK-BB omfattas. Kreatin befrias från kreatinfosfat genom CK, och detta kreatin kan mätas fluorimetriskt genom reaktion med ninhydrin i kraftigt alkalisk lösning (R.B. Conn, Clin. Chem., Vol. 6, sid 537 och följande, 1960). 453 614 10 15 20 25 30 35 För detta ändamål är kinetiska metoder föredragna, enligt vilka den enzymatiska aktiviteten bestäms genom mätning l UV, t.ex. vid 334, 340 eller 366 nm. Att föredra är en standardmetod, vid vilken CK bestäms med användning av kreatinfosfat och adenosinfosfat: Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., Vol. 8, sid 658 och följande (1970) och Vol. 10, sid 182 (1972). Testsatser för bestämning av CK-aktiviteten enligt denna metod finns kommersiellt tillgängliga.

Enligt en föredragen metod mäts den enzymatiska aktiviteten av CK-MB ochleller CK-BB efter tillsats av lämpliga enzymer, coenzymer och substrat, varvid CK-BB katalyserar den reversibla övergången av en fosfatgrupp i kreatinfosfat till adenosindifosfat, och varvid raten för det resulterande adenosintrifosfatet mäts med användning av kopplade och av hexokinas och glukos-ó-fosfat-dehydrogenat katalyserade reaktioner. Aktiviteten för detta sistnämnda enzym vid reduktion av nikotinamid-adenin-dinukleotid följs spektro- fotometriskt genom mätning av absorptionsökningen vid 340 nm, varvid raten vid ändringen av absorptionsökningen är direkt proportionell mot aktiviteten av CK- MB och/eller CK-BB i varje given portion av testprovet.

Det isoenzym CK-MM, som används som antigen för framkallning av den första antikroppen kan erhållas från varje lämplig biologisk vätska, såsom blod, serum eller frän biologiska organ eller vävnader, såsom hjärtmuskulatur, skelettmuskulatur, benmärg eller godtyckliga lämpliga organvävnader, som man vet innehåller detta ísoenzym. Den föredragna källan för detta enzym är djurisk skelettmuskulatur.

Reningen av det ovannämnda isoenzymet till en mycket hög renhetsgrad innan det används för att framkalla antikroppar är i hög grad att rekommendera för att minska närvaron av icke-specifika antikroppar. Isoenzymet kan renas enligt någon godtycklig sedvanlig reningsmetod. De reníngsmetoder som är att föredra är likaså känd teknik, nämligen alkoholfraktionering och anjonbytes- kromatografi. isoenzymets renhetsgrad liksom specificiteten för de framkallade anti- kropparna kan bestämmas enligt sedvanliga metoder, såsom genom immun- diffusion eller genom elektroforetiska tekniker. En föredragen metod för bestämning av isoenzymets renhet är akrylamidgelelektrofores.

Den andra antikroppen kan insolubiliseras genom anbringning på ett olösligt bärarmaterial. Lämpliga fasta bärarmaterial omfattar vattenolösliga organiska polymerer, såsom cellulosa eller andra polysackarider, en vinyl- additions- eller kondensationspolymer eller en vattenolöslig oorganisk substans med polymerkaraktär, såsom glas eller silikongummi. Å andra sidan kan den andra antikroppen adsorberas på ytan av en fast bärare, såsom polystyren, 10 15 20 25 30 35 455 614 polypropen, polyfluoreten eller polyvinylidenfluorid. Metoden för vidhäftning av den andra antikroppen vid den fasta bäraren är inte kritisk och kan omfatta (l) kovalent koppling av den lösliga andra antikroppen till en olöslig polymer, som t.ex. genom reaktion med ett insolubiliseringsmedel, (2) fysikalisk inveckling av partikeln av den andra antikroppen i porerna hos en gelpolymer, såsom en tvärbunden polyakrylamid, eller (3) fysikalisk adsorption på en olöslig polymer substans. Om en fast bärare används, är det sätt som är att föredra, att den andra antikroppen genom adsorption fixeras vid aktiverad polyvinylidenfluorid ("Kynar"), varvid kända metoder för fackmannen används, som t.ex. de som beskrivs i US-PS 3 843 443.

De efterföljande exemplen belyser uppfinningen ytterligare, men är inte avsedda att inskränka uppfinningens omfattning eller grundtanke.

Exempel l CK-MM-rening l. Homogenat Ungefär 1000 g mänsklig skelettmuskulatur eller hjärtvävnad tinas vid WC. överskott av fett avskiljs från vävnaden som därefter skärs i små stycken (l cm). Vävnadsstyckena homogenlseras sedan i en blandare med 1000-1500 ml kall (4°C) 0,05M tris-(hydroximetyl)-aminometan (tris-buffert] innehållande l mM merkaptoetanol med pl-l 7,14. Det erhållna homogenatet centrifugeras sedan vid 50 000 xg under 20 minuter vid 4°C och ger en liten kula som fällning. Den erhållna överstàende vätskan filtreras genom en sintrad glastratt och behålls.

Kulan âterinförs i blandaren och homogeniseras på nytt med 500-700 ml tris- buffert och centrifugeras vid 50 000 xg, varpå den överstående vätskan slås samman med den första överstående-vätskan efter filtrering. De sammanslagna överstoderna används i del ll. ll. Etanolutfällning Kall (4°C) absolut etanol sätts till de sammanslagna överstoderna enligt del l, tills en slutkoncentration på 50 96 (voL/vol.) uppnås, varpå man rör om i 30 minuter vid l+°C. Den erhållna blandningen centrífugeras sedan under 15 minuter vid lø°C och 70 000 xg. Den erhållna överstoden behålls, och den utfallna lilla kulan kastas. Kall (lfoC) absolut etanol sätts långsamt till överstoden, tills etanolkoncentrationen är 70 96¿ Den erhållna blandningen rörs om under 30 minuter vid ll°C och centrifugeras sedan på nytt under 15 minuter vid 7 D00 xg och lloC. Den erhållna lilla kulan omsuspenderas i 500-700 ml 0,05 M trisbuffert med pH 7,4 innehållande l mM merkaptoetanol och 0,05 M natriumklorid. lll. Jonbyteskromatografi ("Batch"-metod) Dietylaminoetyldextran-anjonbytesharts (DEAE-Sephadeß A-50)' ekvi- 10 15 20 25 30 35 453 614 10 librerat med 0,05 M tris med pH 7,4 innehållande 0,05 M NaCl och l mM merkaptoetanol sätts till den omsuspenderade lilla kulan enligt del Il, varpå man rör om under 30 minuter vid 4°C. Suspensionen filtreras genom "Whatman" nr l filterpapper och tvättas med portioner om 0,05 M trisbufiert med pH 7,4 innehållande l mM merkaptoetanol tills filtratet endast uppvisar försumbar CK- aktivitet. Filtratet koncentreras sedan vid I+°C under tryck till 300-500 ml med användning av ett PM-IO-filtermembran.

IV. Andra etanolutfällning Kall absolut etanol sätts långsamt till det koncentrerade filtratet enligt del lll, tillsen5096-ig koncentration uppnås. Den erhållna blandningen rörs om under 30 minuter vid 4°C och centrifugeras sedan vid 7 000 xg, varvid en liten kula bildas. Överstoden behålls, och den lilla kulan kastas. Kall absolut etanol sätts långsamt till överstoden, tills en 7096-ig koncentration uppnås. Den erhållna blandningen centrifugeras under l5 minuter åter vid 7 000 xg, varpå den erhållna lilla kulan löses i en minimal volym 0,05 M tris med pH 7,14 (t.ex. 50-75 ml). Den erhållna blandningen dialyseras mot 2 000 ml 0,05 M tris med pH 7,14 vid lloC, varvid bufferten byts två gånger. En lätt fällning, som bildats i blandningen vid dialysen, avlägsnas efter centrifugering och kastas. Återstoden används i del V nedan.

V. Jonbyteskromatografi (kolonn) DEAE-Sephadeag A-SO ekvilibreras med 0,05 M tris med pH 7,4 och en 2,6 x 60 cm kolonn görs i ordning och tvättas grundligt med denna buffert. Den sista överstoden enligt del lV påförs på denna kolonn och elueras vid 4°C och en strömningshastighet på 30 ml/timme. Fraktioner om 10 ml uppsamlas. Frak- tionerna analyseras med avseende på CK-aktivitet och proteinhalt. De samman- slagna fraktionerna som innehåller merparten av CK-MM-isoenzymet dialyseras mot 0,05 M tris med pH 7,4 innehållande l0 mM etylendiamin-tetraättlksyra (EDTA). De dialyserade fraktionerna koncentreras vid ll0°C under tryck och med användning av ett PM-IO-filtermembran till ett lämpligt koncentrat (t.ex. 8-40 mg protein/ml) och lagras vid 4°C i 0,05 M trisbuffert med pH 7,5 innehållande 10 mM EDTA. En lätt fällning, som bildas då det hela får stå, avlägsnas genom centrifugering. Renheten för CK-MM i det lagrade materialet är betecknande nog 90-10096, vilket bestämdes genom polyakrylamidgelelektrofores. Elektrofores på agarosgel används för att visa, att MB- och BB-isoenzym inte är närvarande i det lagrade materialet. Den på detta sätt erhållna produkten är det slutgiltigt renade provet av CK-MM. 0.: q' l0 15 20 25 30 35 453 614 ll ExemEl 2 Get-anti-CK-MM-serumz- För att framställa immunogenen för immunisering av getterna späds det renade CK-MM, som erhölls enligt Exempel l, med 0,02 M trisbuffert med pH 7,5 till 4 mg/ml och blandas med en lika stor volym av Freunds kompletta adjuvans (en mineraloljesuspension innehållande avdödade M-tuberkulos-baciller). Den erhållna blandningen emulgeras till en vatten/olja-emulsion. Getter injiceras subkutant på tvâ ställen i skulderområdet varje vecka med en injektion av l ml av denna immunogen, varvid man på varje sida använder 0,5 ml immunogen.

Varannan vecka uttar man blod från getterna för att få get-anti-CK-MM- serumet.

Exempel 3 Aktivering av polyvinylidenfluorid För att koppla globulinfraktionen av åsne-anti-get-lgG-serum till poly- vinylidenfluoríd (PVF) aktiveras PVF i förväg enligt följande förfarande: l. 15 l tris-azid-buffert löses genom upplösning av'36,3 g tris-(hydroximetyly aminometan (trizma-bas) och 15 g natriumazid i ungefär lll 000 ml avioniserat vatten vid rumstemperatur, varvid pH justeras till 7,5 I 0,1 med 5 N saltsyra. 5 N saltsyra får man genom spädning av 50 ml 3896-ig saltsyra med 70 ml avjoniserat vatten. Volymen av den erhållna lösningen reglerar man med av- joniserat vatten till 15 000 ml och lagrar den vid rumstemperatur. 2. 100 g polyvinylidenfluoridpulver blandas i ett lämpligt kärl med 600 ml 2- propanol. Den erhållna suspensionen homogeniseras i en homogenisator under 30 sekunder vid en hastighet, som är tillräcklig för att framställa en fin dispersion, och ger en blandning, som överförs i en kalibrerad 4 l-cylinden Blandningen får stå i 10 minuter vid rumstemperatur. 3 400 ml saltvatten, som erhållits genom upplösning av 28,9 g natriumklorid i 3 400 ml avjoniserat vatten, sätts till blandningen. Efter tillsatsen av saltvattnet blandas den erhållna blandningen väl, varefter man låter den sätta sig under en timme eller ända tills polyvinyliden- fluoriden avsatt sig till ungefär 1/5 av totalvolymen. Överstoden avlägsnas genom avsugning, och volymen ökas åter till 4 000 ml med avjoniserat vatten.

Efter avsättning av polyvinylidenfluoriden avsugs överstoden på nytt. Därefter bringas volymen på nytt till ll 000 ml och polyvinylidenfluoriden tvättas ytterligare tre gånger på detta sätt med avjoniserat vatten. Polyvinylidenfluorid- en tvättas sedan ytterligare två gånger på detta sätt med tris-azid-btlffert från steg l. Efter den sista tvättningen bringas volymen av polyvinylidenfluorlden till 2 000 ml, varefter suspensionen lagras vid rumstemperatur, tills den används för kopplingen av åsne-anti-get-igG-serumet. f. 453 614 10 15 20 25 30 35 12 Exemæl 14 Framställning av globulinfraktionen av åsne-anti-get-lgG-serum Globulinfraktionen av àsne-anti-get-IgG-serum för kopplingen till det aktiverade PVF enligt exempel 3 erhålls med användning av följande material och förfaranden: flr_1k_t Material Mängd a) kommersiellt tillgängligt åsne-anti-get- lgG-serum 100 ml b) mättad ammoniumsulfatlösning erhâllen genom tillsats av 500 g fast ammoniumsul- fat (granulat) till 500 ml avjoniserat vatten och en timmes häftig omrörning vid rumstemperatur, lagring vid 4°C och avsättning av kristallerna. ll0 ml c) 0,02 M tris-azid-buffert pH 7,5 ungefär 6 l d) mättad bariumkloridlösning framställd genom tillsats av 50 g bariumklorid-ZHZO (granulat) till 100 ml avjoniserat vatten och l timmes omrörning vid rumstemperatur, varvid man låter bildade kristaller avsätta sig. Man lagrar vid rumstemperatur. ungefär l ml Förfarande: l. 100 ml åsne-anti-get-lgG-serum (punkt a) införs vid 4°C i ett lämpligt kärl med magnetomrörare. Därefter tillsätter man under försiktig omrörning 60 ml mättat ammoniumsulfat (punkt b) för att bringa kärlinnehàllet till 37,5 96-ig mättning. Man rör om under l timme vid l4°C, varefter den utfallna antikroppen uppsamlas som en liten kula genom centrifugering under 30 minuter vid 4°C och 12 000 xg. Den lilla kulan löses i ungefär 70 ml tris-azid-buffert (punkt c), varpå volymen bringas till ursprungsvolymen på 100 ml med samma buffert. Därefter tillsätter man under lätt omrörning vid 4°C 50 ml mättad ammoniumsulfatlösning (punkt b) för att bringa den erhållna blandningen till 3396-ig mättning. Blandningen rörs om under l timme vid lioC. Den utfällda antikroppen erhålls som en liten kula efter 30 minuters centrifugering vid 12 000 xg och #°C. Den lilla kulan löses i ungefär #0 ml tris-azid-buffert (punkt c) och överförs i en dialysslang. Man dialyserar mot tris-azid-buffert vid 4°C. Bufferten byts tre gånger (2 l per byte) efter ett minimum pâ 4 timmars dialys per gång.

Närvaron av sulfatjoner konstateras genom tillsats av l ml dialysat till 1 ml mättad bariumkloridlösning, varvid efter omrörning en vit fällning påvisar // 10 15 20 25 30 35 453 614 13 närvaro av sulfat. Om något som helst precipitat observeras, utbyts dialysatet mot färsk buffert, och man dialyserar ända tills sulfattestet är negativt.

Dialysatets volym bringas till 100 ml med 100 ml tris-azid-buffert och man centrifugerar under 10 minuter vid 2 000 xg och lioC, varefter överstoden uppsamlas. Överstoden innehållande det framställda åsne-anti-get-lgG lagras vid UOC, tills det används för koppling till den aktiverade polyvinylidenfluoriden enligt exempel 3.

ExemEl 5 Koppling av globulinfraktionen av âsne-anti- get-lgG till aktiverad polyvinyl- idenfluorid Koppling av globulinfraktionen av âsne-anti-get-IgG-serum framställt enligt förfarandet i Exempel 14 till en suspension av det aktiverade PVF framställt enligt förfarandet enligt Exempel 3 utförs med användning av följande reagens och förfarande: lgnlg Reagens Kvantitet a) Aktíverad polyvinylidenfluorid (Exempel 3) 2 000 ml b) Globulinfraktion av ásne-anti-get-lgG-serum (Exempel 4) ' 100 ml c) Tris-(hydroximetyD-aminometan (trizma- bas) 24,2 g d) Dinatriumsalt av etylendiamintetraättiksyra (EDTA) 147,44 g e) 10 N natriumhydroxid 1 vatten ungefär 20 ml F örfarande: 1. 10 l trís-EDTA-buffert framställs på följande sätt; 214,2 g trizma-bas (punkt c), 10,0 g natriumazid och 147,1: g EDTA (punkt d) löses vid rumstemperatur i ungefär 9 000 ml avjoniserat vatten. För att man skall uppnå fullständig upplösning, kan det vara nödvändigt att röra om under 30-60 minuter. Lösningens pH justeras till 7,5 2 0,1 med 10 N NaOH, och lösningen bríngas till en volym pä 10 000 ml med avjoniserat vatten. Lösningen lagras vid rumstemperatur. 2. (punkt a) införs i ett lämpligt kärl och omrörs försiktigt. 100 ml âsne-anti-get- serum (punkt b) sätts till suspensionen, varefter man rör om under 6 timmar vid rumstemperatur och över natten (12-18 timmar) vid li°C. Man får àsne-antí-get- lgG-antikroppar bundna till polyvinylidenfluorid. 3. Den till polyvinylidenfluorid kopplade antikroppen enligt steg 2 upp- samlas som en liten kula genom centrifugering vid 1 500 xg under 10 minuter. 2 000 ml av en suspension innehållande aktiverad polyvinylidenfluorid 10 l5 20 25 30 35 453 614 lll- Överstoden hälls bort, och den lilla kulan omsuspenderas i en totalvolym på 2 000 ml tris-EDTA-buffert (framställd som i steg 1). 4. Steg 3 upprepas totalt tre gånger. 5. Den lilla kula resp. de små kulor som erhålls efter steg li omsuspenderas till en volym på 500 ml i tris-EDTA-biiffert (steg l), varefter man i denna suspension löser 2,5 g nötserumalbumin genom lätt omrörning under 30 minuter.

Denna suspension homogeniseras sedan i en homogenisator under 30 sekunder vid en hastighet, som ger en fin dispersion och sålunda som produkt olösligt anti-get- IgG. 6. Den olösliga anti-get-lgG-produkten lagras vid li°C i följande slutgiltiga koncentration: 2096 (vikt/vol.) polyvinylídenfluorid 0,02 g M tris pH 7,5 0,196 (vikt/vol.) natriumazid 0,596 (vikt/vor) ßsA 39,6 mM EDTA Exempel 6 En bestämning av CK-MB-aktívitet i en biologisk vätska utförs genom följande förfarande, som kräver tvâ provrör; l. Till provrör l sätter man: 200 ul patientserum och 250 ul get-anti-CK- MM-serum (framställt som i Exempel 2), varvid blandningen omrörs försiktigt och sedan får stå 20 minuter vid rumstemperatur, varvid man får den blandning som skall användas i steg 3. 2. Till provrör 2 sätter man: 200 ul patientserum och 50 ul get-anti-CK- MM-serum (framställt som i Exempel 2), varvid man rör om försiktigt och sedan låter det hela stå 5 minuter vid rumstemperatur. Därefter tillsätter man 200 ul lagrat olösligt anti-get-lgG (framställt som i Exempel 5), varvid man rör om försiktigt och låter reaktionsblandningen stå under 5 minuter vid rumstempera- tur. Provröret centrifugeras sedan under 5 minuter vid l 000 xg, och den erhållna överstoden används i steg 3. 3. l00 ul av den resulterande blandningen från steg l och 200 ul av över- stoden från steg 2 sätts till den första och andra portionen av 1,0 ml enzymatiskt CK-reagens (exempel 7) för mätning av CK-enzymaktíviteten. Därefter blandas varje portion grundligt och inkuberas sedan under 5 minuter vid 37°C. Absorp- tionen registreras för varje portion vid 340 nm under en totaltid på 5 minuter med periodiska intervall i en spektrofotometer vid 37°C med användning av en kyvett med 1 cm skikttjocklek. De registrerade absorptionerna omvandlas till absorptionsändring per minut, och l.E./liter av CK-aktivitet för varje portion C) Û. 10 15 453 614 15 erhålls. Därefter subtraheras värdet på CK-aktiviteten för den andra portíonen från värdet på CK-aktíviteten för den första portionen.

Exemggl 7 Det enzymatiska CK-reagenset i Exempel 7 innehåller följande reagens: Reagens Koncentration i beredningen Kreatíníosfat 17 mM D-glukos 20 mM ADP 1,2 mM AMP 8 mM NAD (jäst) 2,3 mM MgClz 15 mM Hexokinas (jäst) z soo :Elmer vid ao°c Glukos-ó-fosfat-dehydro- genas (Leuconostoc) 2 500 lE/liter vid 30°C Dítioerytritol ' 60 mM Reagensen bereds i'piperazin-N,N-bis-(Z-etansulíonsyrà-buífert med pH 5,3 i 0,15 (so°c).

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 453 614 l6 Patentkrav

1. l. Förfarande för kvantitativ bestämning av närvaro av kreatinkinas-MB- isoenzym-formen av kreatinkinas, som förekommer i biologiska vätskor i ett flertal isoenzymformer, som innehåller underenheterna M eller B eller båda, kännetecknat av a. att man i ett första reaktionskärl inkuberar en första av två portioner av ett prov från en biologisk vätska med en första antikropp, som selektivt immunologiskt binder med de kreatínkinas-isoenzymer som innehåller M-under- enheten och då genom selektiv immuninhibering av M-underenheten i den första portionen av provet från den biologiska vätskan, och att man därefter kvantitativt mäter aktiviteten av B-isoenzymet i den första portionen av provet från den biologiska vätskan, b. att man i ett separat reaktionskärl inkuberar den andra portionen av provet från den biologiska vätskan med _ (l) en antikropp, som selektivt immunologiskt binder kreatinkinas- isoenzymerna som innehåller M-underenheten i den andra portionen av provet från den biologiska vätskan, (2) tillsätter en fällande andra antikropp, som selektivt immunologiskt binder med den antikropp, som binder kreatinkinas-isoenzymerna innehållande M- underenheten, för att få en reaktionsprodukt i form av en fällning i denna andra portion bestående av nämnda andra antikropp med den andra antikroppen och dessa kreatinkinas-isoenzymer innehållande M-underenheten och att man där- efter kvantitativt mäter aktiviteten av B-isoenzymet i överstoden i denna andra portion, och c. att man bestämmer CK-MB-aktiviteten i detta prov ur mâtresultaten erhållna från de första och andra portionerna.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t a v att provet från den biologiska vätskan är blodserum.

3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a t a v att den första antikroppen i steg a och den antikropp som binder de kreatinkinas-isoenzymer som innehåller M-underenheterna i steg b är get-anti-kreatinkinas-MM och att den andra antikroppen i steg b är åsne-anti- get-lgG.

4. Förfarande enligt patentkravet l, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t a v att den andra fällande antikroppen är bunden till en fast bärare. Jim 10 15 20 25 453 614 17

5. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t a v att den fasta bäraren är polyvinylidenfluorid.

6. Föríarande enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t a v att den enzymatiska aktiviteten av B-ísoenzymet bestäms genom en fotometrisk bestämning.

7. Förfarande enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t a v att den spektrofotometriska bestämningen omfattar en enzym-co-enzym- och substratblandning.

8. Diagnostestkít för kvantitativ bestämning av närvaron av kreatinkinas- MB-isoenzym-formen av det kreatinkinas, som förekommer i biologiska vätskor i ett flertal isoenzymíormer, som innehåller underenheten M eller B eller båda, k ä n n e t e c k n a t a v att det innehåller följande: (a) selektivt immunologiskt binda med kreatinkinas-isoenzymer som innehåller en första behållare innehållande en antikropp, som har förmåga att underenheten M, och dä genom selektiv immunoinhibering av M-underenheten, (b) en andra behållare innehållande en fällande andra antikropp, som är i stånd att selektivtlimmunologiskt reagera med den antikropp som ingår i den första behållaren, och (c) bestämma den enzymatiska aktiviteten för B-underenheten. ett reagens av enzym-coenzym och substrat, som har förmåga att

9. Testkit enligt patentkravet 8, k ä n n e t e c k n a t a v att den fällande andra antikroppen är bunden till en fast bärare.

10. k ä n n e t e c k n a t a v att den fasta bäraren är polyvinylidenfluorid. Testkit enligt patentkravet 9,