FI60720B - Foerfarande och medel foer bestaemning av aktiviteten av kreatinkinas-mb - Google Patents
Foerfarande och medel foer bestaemning av aktiviteten av kreatinkinas-mb Download PDFInfo
- Publication number
- FI60720B FI60720B FI763127A FI763127A FI60720B FI 60720 B FI60720 B FI 60720B FI 763127 A FI763127 A FI 763127A FI 763127 A FI763127 A FI 763127A FI 60720 B FI60720 B FI 60720B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- activity
- antibodies
- creatine kinase
- subunit
- sample
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
RSrTI ΓβΙ mi kwulutusjulkaisu .nf70n «Ha LBJ (11) utlAggningsskrift 60 720 C (45) Patentti myönnetty 10 03 1982 Patent meddelat v (51) Ky.ik?/i«t.a.3 C 12 Q 1/50 SUOMI—FINLAND (M) Pumttlhak«mus — Pat«ntan*eknln| 763127 (22) HikwnlspMv» — Anaekiilnpdag 02.11.76 ^ ^ (23) Alkupllvt—Glltlfhatadif 02.11.76 (41) Tullut |ulklMkal — Blhrit offuntllg 0*+ . 05.77
Patentti- ia rekisterihallitus .... ............
_ ^ ^ ^ . (44) Nlhtivlkilpanon j* kuuL|utkal«ufl pvm. —
Patent- oeh registerstyrelsen ' 7 An*ek«n utbfd och utLikriftan puUkund 30.11.8l (32)(33)(31) Pyydetty Kuoikaut —Begird prloritct 03.11.75
Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 25U8963.8 " (71) Merck Patent GmbH, Frankfurter Strasse 250, 6l Darmstadt, Saksan Liitto- tas avalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Uwe Wurzburg, Darmstadt, Norbert Hennrich, Darmstadt, Hans-Dieter Orth, Darmstadt, Hermann Lang, Darmstadt, Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) (Jk) Oy Kolster Ab
(5*0 Menetelmä ja aine kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi -Förfarande och medel för bestämning av aktiviteten av kreatinkinas-MB
Keksinnön kohteena on menetelmä ja aine kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi ihmisen kehonnesteestä.
Kreatiinikinaasin (ATP: kreatiini-fosfotransferaasi, E.C. 2.7·3.2; lyhennys: CK) aktiivisuuden määritystä seerumissa pidetään herkimpänä laboratorio-menetelmänä luuranko- ja sydänlihaksiston sairauksien, erityisesti sydänlihasin-farktin diagnostiikassa. Luuranko- ja sydänlihaksiston vammautumisten erottaminen erityisesti sydänlihasinfarktin erotusdiagnoosissa on kuitenkin vaikeata. Määrittämällä CK-kokonaisaktiivisuus ei erottaminen voi tapahtua varmuudella. Sentähden on yritetty lisätä CK-aktiivisuuden määrittämisen erotusdiagnostista todistusvoimaa jättämällä seerumin muiden entsyymien aktiivuus pois ja korreloimalla mittaustuloksia keskenään, esim. muodostamalla osamäärä CK glutamaatti-oksaali-asetaatti-transaminaasi. Tämän tapaisia osamääriä ei kuitenkaan voida käyttää erotettaessa sydän- ja keuhkoinfraktia tai erotettaessa sydäninfraktia ja muista syistä johtuvia shokkiseurauksia.
2 60720 GK esiintyy kehossa kolmen iso entsyymin muodossa, nimittäin muodossa CK-MM, esim. lihaksessa, muodossa CK-BB, esim. aivoissa ja hybridinä CK-MB (joka koostuu alayksiköstä M ja alayksiköstä B), esim. sydänlihaksessa. Veressä (seerumissa) esiintyvä CK-aktiivisuus johtuu normaalisti isoentsyymistä CK-MM, koska CK-BB ei läpäise selkäydinneste/veri-rajaa ja CK-MB rajoittuu tiettyihin elimiin (esim. sydänlihakseen). Sydänlihaksen vammautumisissa (esim. sydäninfarktissa) vapautuu CK-MB kuitenkin vereen (seerumiin) ja se on siitä osoitettavissa.
Tämän isoentsyymin kvantitatiivista määrittämistä CK-MM:n ohella seerumissa pidetään herkimpänä ja erotusdiagnostisesti todistusvoimaisimpana laboratoriomenetelmänä sydäninfarktin osoittamiseksi. Sydänlihaksen ohella sisältävät tosin vielä eräät muutkin elimet CK-MB:tä (esim. haima, pallea, aortta, keuhkot ja kohtu), kuitenkin on aktiivisuus näissä elimissä huomattavasti vähäisempi (1/100) kuin sydänlihaksessa, niin että mahdollisesti näistä elimistä vapautuneet CK-MB-aktiivisuudet ovat osoitusrajan alapuolella.
Näihin asti tavalliset CK-MB:n aktiivisuusmääritykset ovat perustuneet pääasiallisesti kolmeen menetelmään: 1. Elektroforeesi eri kantajilla. Näin saadut tulokset ovat joskus ristiriitaisia; usein esiintyy enemmän nauhoja kuin isoentsyymejä on läsnä (keinotekoisia).
2. Kromatografia eri kolonniaineilla. Tämä menetelmä on pitkäaikainen (useampia tunteja tehokasta työaikaa) eikä sovi rutiinitutkimuksiin. Eri tutkijoiden tulokset ovat osittain ristiriitaisia.
3. Immunologinen määritys saostuvilla vasta-aineilla. Tämä menetelmä on kuvattu saksalaisissa patenttihakemuksissa DE 21 2(T 670 ja DE 22 58 822 ja antaa esimerkiksi aldolaasin ja alkaalisen fosfataasin isoentsyymien kvantitatiivisessa määrityksessä hyviä tuloksia. CK:n ja erityisesti CK-MB:n suhteellisen vähäisten aktiivisuuksien määritykseen ei menetelmän herkkyys kuitenkaan ole riittävä.
Julkaisussa Z, Klin. Chem. Clin Biochem 13_ (1975) PP> 85-88 on kuvattu menetelmä, jossa CK-MB:n määrittämiseksi seeruminäytteestä käytetään kahta saostavaa antiseerumia CK-MM:ää ja CK-BB:ä vastaan. Laskemalla ero näytteen kokonaisaktiivi-suuden ja CK-MM:n ja CK-BB:n aktiivisuuksien summan välillä saadaan CK-MB:n aktiivisuus. Tällä menetelmällä ei voida suoraan määrittää CK-MB:ä, vaan näytteen CK-kokonuisaktiivisuus on ensin määritettävä ennen antiseerumien lisäämistä.
Kaikki nämä menetelmät vaativat sitäpaitsi suoritukseen pidemmän ajan ja ne eivät saitähden sovi käytettäviksi sydäninfarktin pikadiagnoosissa.
Keksinnön tehtävänä oli sentähden kehittää yksinkertainen, toistettava ja nopeasti suoritettava menetelmä sekä aine CK-MBih aktiivisuuden määrittämiseksi kehonneotenäytteestä.
Keksinnön mukaisesti tämä tehtävä ratkaistaan siten, että käytetään tähän asti tuntematonta menetelmää, jossa työskennellään spesifisten vakta-aineiden kanssa, jotka täydellisesti estävät alayksikön M entsymaattis en aktiivisuuden CK-MM:ssa ja CK-MB :ssä, in aktivoimat ta mahdollisesti läsnäolevan CK-MB :n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta.
60720
Keksintö koskee menetelmää kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi kehonnestenäytteestä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että näytettä inkuboidaan kreatiinikinaasi-MM-vasta-aineiden kanssa, joiden molekyylipaino on 130000-210000, jotka vasta-aineet pystyvät täydellisesti estämään kreatiini-kinaasi-isoentsyymi-MM:n ja -MB:n alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan kreatiinikinaasi-MB:n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta ja määritetään kreatiinikinaasi-alayksikön B aktiivisuus tunnetulla tavalla fotometrisesti.
Keksintö koskee lisäksi ainetta kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi kehonnestenäytteestä, jolle aineelle on tunnusomaista, että se kreatiinikinaasiaktiivisuuden entsymaattisessa määrityksessä käytettävän tunne-" tun reagenssikoostumuksen lisäksi sisältää kreatiinikinaasi-MM-vasta-aineita, joiden molekyylipaino on 130000-210000, jotka vasta-aineet pystyvät täydellisesti estämään alayksikön M aktiivisuuden kreatiinikinaasi-MM:ssä ja -MB:ssä, näytteen kreatiinikinaasi-kokonaisaktiivisuuden ollessa enintään h2 ^okat/l, inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan kreatiinikinaasi-MB:n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta.
Kehonnesteeksi keksinnön menetelmää varten sopii ensikädessä ihmisseerumi. Määritys voidaan suorittaa myös muista ihmisen kehonnesteistä, kuten kokoverestä, plasmasta, virtsasta, ysköksistä ja hiestä, samoin myös vastaavista eläinalku-perää olevista näytteistä, CK-BB häiritsee keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamista eikä sitä sentähden saa olla läsnä tutkittavissa kehonnesteissä.
Keksinnön mukaista menetelmää varten tarvittavia vasta-aineita saadaan istuttamalla eläimiin CK-MM-antigeenejä. Antigeeneiksi otetaan edullisesti ihmisen CK-MM. On kuitenkin myös mahdollista käyttää eläimistä saatavaa CK-MM, jos tällä valmistetut vastaseerumit täydellisesti pystyvät estämään alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden ihmis-CK-MM:ssä ja -CK-MB:ssä, mahdollisesti myös CK-substraattien läsnäollessa, inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan CK-MB:n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta. CK-MM-antigeenien antajiksi soveltuvat ensisijaisesti eri apinalajit, edullisesti reesusapinat ja simpanssit, edelleen kotieläimet, kuten sika, hevonen, nauta, kaniinit, marsut ja muut eläimet, kuten rotat, hiiret,ja linnut, kuten hanhet, ankat ja kanat.
Vasta-aineiden valmistukseen käytettävän CK-MM-antigeenin tulee olla vapaa CK-MB- ja CK-BB-aktiivisuuksista. Herkkä kriteerio tälle puhtausvaati- 11 60720 mukselle on immunologinen analyysi, joka edullisesti suoritetaan diffuusio-tai elektroforeesi-tekniikalla, Näiden ohella ovat esim. analyyttinen levy-elektroforeesi- ja polyakryyliamidi-geeli-elektroforeesimenetelmä käyttökelpoisia. Käytettäessä näitä menetelmiä on puhtauden osoittamisella CK-MB:n ja CK-BB:n suhteen etusija, Sensijaan on absoluuttinen puhtaus muiden proteiinien suhteen, joka voidaan määrittää esim. kummallakin viimemainitulla menetelmällä, vähemmän tärkeä. CK-isoentsyymityyppien mikroheterogeenisuudella, joka voi ilmetä esim. aminohappokoostumuksen pieninä eroina yksittäisissä isoentsyymeissä, ei yleensä ole merkitystä puhtauskriteeriona.
Immunointia varten otetaan sellaisia eläimiä, jotka aktivoidulla CK-MM:llä suoritetun rokotuksen jälkeen muodostavat vasta-aineita, jotka pystyvät täydellisesti estämään alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden kreatiinikinaaseissa MM ja MB, inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan CK-MB alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta. Erityisen sopivia tähän tarkoitukseen ovat vuohet. Vasta-aineen antajina tulevat kuitenkin kysymykseen myös muut eläimet, erityisesti selkärankaiset, esim. apinalajit, hevonen, nauta ja naudan sukuiset eläimet, lammas, koira, sika, kaniinit, linnut, kuten kanat, kalkkunat, hanhet ja ankat, edelleen rotat, hiiret ja marsut. Vuohia käytetään erityisesti sellaisten vasta-aineiden tuottamiseen, jotka myös CK-substraattien läsnäollessa pystyvät täydellisesti estämään M-alayksikön CK-MM:ssä ja CK-MB:ssä.
Koe-eläinten immunointi suoritetaan keksinnön mukaisesti aktivoidulla ihmisen tai eläimen CK-MM;llä. CK-MM:n aktivointi voi tapahtua tunnetuilla SH-ryhmiä stabiloivilla ja aktivoivilla reagensseilla ja/tai kaksiarvoisilla metalli-ioneilla, edullisesti yhdistämällä nämä reagenssit ja metalli-ionit. SH-ryhmiä stabiloivina ja aktivoivina reagensseina voidaan edullisesti käyttää esim. N-asetyylikysteiiniä, merkaptoetanolia ja ditioerytritolia, lisäksi glutationia, kysteiiniä, ditiotreitolia, S-(2-aminoetyyli)-isotiouroniumbromi-di-hydrobromidia (AET), ja/tai tioglykolihappoa. Kaksiarvoiset metalli-ionit ovat peräisin vastaavista vesiliukoisista suoloista (esim. klorideista tai asetaateista) edullisesti magnesiumin, edelleen mangaanin, kalsiumin ja/tai koboltin suoloista. Tällaiset aktivoimiset ovat sinänsä tunnettuja.
Immunoinnin suorittaminen ja jälkikäsittely vastaseerumien tai vasta-aineiden saamiseksi tapahtuu tunnetulla tavalla. Myös vastaseerumien tai vasta-aineiden jalostus ja säilytys tapahtuu immunologiassa tunnetuin menetelmin.
Keksinnön mukaista menetelmää varten käytettävät vasta-aineet on edullisesti luettava kuuluviksi IgG-luokkaan (kaksiarvoiset vasta-aineet).
Niiden raolekyylipaino on väliltä n. 130000-210000, edullisesti n. 160000; 5 60720 niiden likimääräinen sedimentoitumisvakio on väliltä 6 S - 8 S, edullisesti n. 7 S; niiden hiilihydraattiosa käsittää n. 3 % niiden kokonaispainosta. IgG-vasta-aineiden ohella voidaan käyttää myös yksiarvoisia IgG-osasia (=F sekä IgM-vasta-aineita keksinnön mukaisesti.
Keksinnön mukaisesti käytettävien vasta-aineiden tulee täydellisesti estää kreatiinikinaasien M-alayksikön entsyymiaktiivisuus, "Täydellisellä estämisellä" ymmärretään tässä estämistä, jolloin aineeseen jää korkeintaan 83 nkat/1, edullisesti vähemmän kuin 5 nkat/1 alayksikön M entsyymiaktiivisuutta CK-MM- ja CK-MB-näytteessä.
Vasta-aineet eivät liioin saa vaikuttaa CK-MB:n B-alayksikön entsymaatti-seen aktiivisuuteen. Tällä ymmärretään tässä, että korkeintaan 167 nkat/1, edullisesti vähemmän kuin 83 nkat/l CK-MB:n alayksikön B entsyymiaktiivisuudesta näytteessä estyy.
Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suoritusmuodon, joka perustuu siihen, että kehonnesteen määritettävää näytettä ja vasta-aineita inkuboidaan CK-substraattien läsnäollessa, toteuttamiseksi tulee vasta-aineilla edelleen olla se ominaisuus, että ne pystyvät kehittämään täydellisesti estävän vaikutuksensa alayksikön M entsymaattista aktiivisuutta vastaan CK-MM:ssä ja CK-MB:ssä myös CK-substraattien läsnäollessa, vaikuttamatta mahdollisesti läsnäolevan CK-MB:n alayksikön B entsymaattiseen aktiivisuuteen, Tällainen ominaisuus on esim. vasta-aineilla, jotka saadaan vuohista immunisoimalla täysin aktivoidulla CK-MM:llä, edellä esitettyjen tunnusomaisten ominaisuuksien lisäksi. Mainittua ominaisuutta ei välttämättä tarvita toteutettaessa keksinnön mukainen menetelmä normaalilla tavalla, jolloin inkuboidaan ensin vasta-aineen kanssa ja lisätään vasta sen jälkeen CK-substraattia ja suoritetaan fotometrinen mittaus.
CK-substraatteina voidaan käyttää kaikkia tavanomaisia substraatteja. Ensisijaisesti tulevat kysymykseen kreatiini, kreatiinifosfaatti, adenosiinidi-fosfaatti, adenosiinitrifosfaatti ja magnesiumionit.
CK:n ja sen isoentsyymien aktiivisuuden tai jäämäaktiivisuuden määritys voidaan periaatteessa suorittaa kaikilla menetelmillä, jotka ovat nopeita ja tarkkoja. Sopivia ovat esim. tunnetut menetelmät, jotka tekevät mahdolliseksi mitata CK-aktiivisuus CK-substräattien lisäämisen jälkeen apureaktioihin liittyvän fotometrisen määrityksen avulla. Tätä varten voidaan käyttää kolori-metrisiä menetelmiä, jollaisia on kuvattu esim. teoksessa "Methoden der enzymatischen Analyse", julkaissut H.U, Bergmeyer, 3, painos (197I+), nide 1, sivut Ί. Edullisia ovat kuitenkin kineettiset menetelmät, joissa entsyymi-aktiivisuus ilmaistaan mittaamalla ultravioletti-spektri esim. 33*+, 3*+0 tai 6 60720 366 nm:ssa. Käytetään erityisesti esim. standardimenetelmää, jonka mukaisesti CK määritetään käyttäen kreatiinifosfaattia ja adenosiinidifosfaattia (Z KLin.Chem.Klin.Biochem,, nide 8, sivut 658- (1970) ja nide 10, sivu 182 (1972). Testipakkauksia CK-aktiivisuuden määrittämiseksi tämän menetelmän mukaisesti on kaupallisesti saatavissa.
Erään toisen tunnetun määritysmenetelmän mukaisesti voidaan CK määrittää myös fluorometrisesti, CK:n vaikutuksesta vapautuu kreatiinifosfaatista kreatiinia, joka R.B. Conn'in (Clin.Chem., nide 6, sivu 537 (i960)) kehittämän menetelmän mukaisesti voidaan reaktiolla ninhydriinin kanssa voimakkaasti alkalisessa liuoksessa mitata fluorometrisesti (vrt, Sax et ai, Clin.Chem., nide 11, sivu 951 (1965)).
Keksinnön mukaisen menetelmän eräs tyypillinen suoritusmuoto esitetään seuraavassa: Määritettävä kehonnestetäyte, edullisesti ihmisseerumi sekoitetaan sellaisen määrän kanssa CK-MM-vasta-aineita, joka on riittävä estämään alayksikkö M CK-MM:ssä ja CK-MB:ssä, näytteen CK-kokonais aktiivisuuden ollessa enintään ä2yikat/l, edullisesti n. 17 ^okat/1. Kehonnesteissä, joilla on korkeammat kokonais-CK-aktiivisuudet, suoritetaan ennen varsinaista määritystä tarkoituksenmukaisesti esilaimentaminen 17 ^tkat/1:ksi. Tämä esilaimennus on laskettaessa otettava huomioon. Sekoitetaan ja inkuboidaan n. 1-30, edullisesti n. 5 minuutin ajan lämpötilassa +10 - +U0°C, edullisesti huoneen lämpötilassa, erityisesti 25 tai 30°C:ssa. Sen jälkeen määritetään reaktioseoksen jäämäentsyymiaktiivisuus jonkin tunnetun menetelmän avulla, esimerkiksi edellä kuvatulla UV-menetelmällä. Seerumi/vasta-aine-seos lisätään tunnettuun entsyymi-koentsyymi-substraatti-seokseen, joka sisältää kaikki menetelmän toteuttamiseen tarvittavat entsyymit, koentsyymit ja substraatit ja lisätään lopuksi riittävä määrä puskuriliuosta (pH n. 7). Tavalliset kaupalliset valmisteet sisältävät esim. entsyymi/koentsyymi-seoksena heksokinaasia, glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasia, adenosiinidifosfaat-tia ja nikotiiniami di-adeniini-dinukleotidifosfaattia sekä substraatteina kreatiinifosfaattia ja glukoosia.
On myös mahdollista lisätä seerumi/vasta-aine-seos koentsyymin ja entsyymin seokseen (tai päinvastoin) ja sen jälkeen lisätä puskuri-substraattiseos.
Sopivia puskureita ovat neutraalit puskurit, kuten esimerkiksi edullisesti trietanoliamiini- tai imidiatsdLiasetaattipuskuri, edelleen mm. morfoliinipropaani-sulfonihappo- ja morfoliinietaanisulfonihappo-puskuri. Sekoitetaan, inkuboidaan n, 1-10, edullisesti 5 minuuttia, 15-^0, edullisesti 25-30°C:ssa ja määritetään sen jälkeen n. huoneen lämpötilassa ekstinktiomuutos, Siitä lasketaan sen jälkeen alayksikön B aktiivisuus CK-MB:ssa.
Eräässä edullisessa suoritusmuodossa voidaan tätä menetelmää sikäli muuttaa, että analysoitavan kehonnesteen näytettä inkuboidaan vasta-aineiden 7 60720 ja CE-substraattien kansaa puskurin ja osoltusreaktiota varten tarvittavien aineiden kanssa yhdessä (ilman näytteen esi-inkubointia vasta-aineiden kanssa). Tätä suoritusmuotoa varten on edellytyksenä eräs vasta-aineiden lisäominaisuus: niiden täytyy täydellisesti estää CK-MM:n ja -MB:n alayksikön M entsymaattinen aktiivisuus myös CE-substraattien läsnäollessa. Tämä ominaisuus on esim. vasta-aineilla, jotka saadaan täysin aktivoidun CK-MMin avulla vuohista. Ne tekevät mahdolliseksi tämän keksinnön menetelmän toteuttamisen yksinkertaisella ja nopealla tavalla:
Niinpä esimerkiksi voidaan vasta-aineet, jotka sitä ennen on tunnetmn, osoitusreaktioon käytetyn koentsyymi-entsyymi-substraatti-seoksen kanssa saatettu lyofiloituun muotoon, liuottaa määrätyssä määrässä puskuriliuokseen, lisätä määritettävä kehoneste (esim. seerumi) ja suorittaa CE-MB:n B-osan aktiiviteetiin määritys. Tämän menetelmän eräässä muunnelmassa voidaan vasta-aineet, myös seoksen kanssa, joka koostuu pelkästään koentsyymeistä ja entsyymeistä, sekoittaa lyofilaattiin ja lisätä substraatit puskuriliuokseen.
Edelleen erään edullisen suoritusmuodon mukaan voidaan suorittaa CE-kokonaisaktiivisuuden ja CE-MB-aktiivisuuden samanaikaismääritys käyttäen avuksi niinikään kuvattua, edullista keksinnön menetelmää yhdessä ainoassa annoksessa. Voidaan menetellä esim. niin, että ensin määritetään näytteen CE-kokonaieaktiivisuus tunnetulla fotometrisellä menetelmällä} ja sen jälkeen lisätään samaan annokseen veteen liuotettua lyofilaattia, joka koostuu CK-MM-vasta-aineista. Sitten inkuboidaan n. 1 - 10, edullisesti 5 minuuttia ja määritetään näytteen jäämäaktiivisuus fotometrisesti. Myös tämän suoritusmuodon edellytyksenä on, että vasta-aineet CE-MM:ää vastaan pystyvät täydellisesti estämään CK-MM:n ja -MB:n alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden myös CE-substraattien läsnäollessa.
Antiseerumien vasta-ainekapasiteetti voidaan näissä keksinnön aukaisen menetelmän edullisissa suoritusmuodoissa asettaa niin, että se pystyy täydellisesti it2 ^iKat/l asti, edullisesti n. i:f jjKat/i :aan estämään CK-MMsn ja CE-MB:n alayksikön M. Mikäli määritettävien näytteiden CE-kokonaisaktiivi-suudet ovat liian korkeita näille vasta-aineiden estokapasiteeteille, täytyy myös tässä suorittaa esilaimennuksia, esim. alayksikön M CE-MMissa ja -MB:saa aktiivisuuksiin n. 17 ^Kat/1.
Keksinnön menetelmällä on tekniikan tasoon verrattuna merkittäviä etuja. Näihin lukeutuvat tulosten suuri tarkkuus sekä toteuttamisen nopeus ja yksinkertaisuus.
Keksinnön menetelmän tarkkuus perustuu siihen, että käytetyt vasta-aineet spesifisesti vaikuttavat CK-MMsn ja CK-MB:n M-alayksikköön ja tekevät sentähden mahdolliseksi määrittää CK-MB-aktiivisuus kehonesteissä, kuten ihmisseerumissa, yhtenä suorana määrityksenä.
60720
Sitävastoin liittyy saksalaisissa patenttihakemuksissa DE 21 28 6f0 ja DE 22 58 822 kuvattuihin immunologisiin menetelmiin isoentsyymien kvantitatiiviseksi määrittämiseksi haittoja. Näiden menetelmien mukaisesti saostetaan CK:n isoentsyymit isoentsyymeille spesifisillä, seostavilla vasta-aineilla ja määritetään vastaavat jäämäaktiivisuudet. Huolimatta tämän menetelmän kalleudesta, joka yleensä tekee useampien spesifisten vastaseerumien valmistuksen tarpeelliseksi, täytyy kaikissa tapauksissa suorittaa vähintään kaksi eri testisarjaa, nimittäin CK-kokonaisaktiivisuuden määritys ja CK-jäämäaktiivisuuden määritys saostamisen jälkeen. CK-MB-aktiivisuus voidaan siis määrittää vasta erotus-mittauksen jälkeen, Tulosta rasittaa sentähden virhelaskennan sääntöjen mukaan kummankin mittauksen epävarmuus. Keksinnön mukaisella menetelmällä vältetään sensijaan virheenkasvu ja suoritetaan suora mittaus.
Eräs saostusmenetelmän epäkohta on myös, että immuuni-saostaminen sekun-däärireaktiona vaatii suhteellisen paljon aikaa. (n. 60 minuutista useampaan tuntiin), joten menetelmä ei sovi pikatestiksi.
Teoksessa Clin.Chim.Acta, nide 58, sivut 223-232 (1975) on kuvattu estäviä vasta-aineita CK-isoentsyymejä vastaan. Nämä vasta-aineet saavat CK-MM:n 100 %:sen estämisen ohella aikaan CK-MB:n 80 /»:sen estämisen. Verrattuna CK-MB:sta lähtöisin olevaan M-alayksikköön estävät käytetyt vasta-aineet oleellisen osan B-alayksi-köstä (molempien alayksikköjen M ja B CK-MB:ssä aktiviteettien suhde tämän isoentsyymin kokonaisaktiivisuuteen on n, 50:100). Jopa silloinkin kun näillä vasta-aineilla löydetty jäämäaktiivisuus on n. 20 #:sti toistettavissa, niin olisivat saadut arvot vielä CK-MB:n tarkkaa mittausta varten liian alhaisia, koska CK-kokonaisaktiivisuus seerumissa sinänsä jo on alhainen. Tässä kirjallisuusviitteessä kuvattuja estäviä vasta-aineita ei vastaavasti käytetty myöskään CK-isoentsyymin määrittämiseen estoperiaatteen mukaan. Keksinnön menetelmän mukaisesti jää sitä vastoin vielä n. 50 % CK-MB-aktiivisuudesta, so. suunnilleen alayksikön B koko aktiivisuus, käytettäväksi mittausta varten. Tämä merkitsee huomattavaa parannusta määritysmenetelmään,
Nopea suoritettavuus on keksinnön mukaisen menetelmän erityinen etu.
Tämä pätee erityisesti edullista suoritusmuotoa varten, jonka mukaisesti CK-MM:n ja CK-MB:n M-osan estäminen sekä myös jäämäaktiivisuuden määritys suoritetaan samanaikaisesti. Tämän suoritusmuodon mukaan voidaan lyhyimmässä ajassa, esim.
5-3Ο minuutissa, edullisesti 5~15 minuutissa, saada käyttöön täsmällinen testitulos taudin määritystä varten.
Keksinnön menetelmän eräs huomionarvoinen etu on myös sen yksinkertainen toteutettavuus, Testimenetelmä voidaan toteuttaa suuremmissa laitoksissa tai klinikoilla (esim. tavallisten mekanisoitujen laitteiden avulla entsyymiaktii- 9 60720 visuuksien määrittämiseksi), mutta se on toteutettavissa myös pienemmissä laitoksissa tai lääkärilaboratoriossa fotometrin avulla,
Yksittäismäärityksiin sopivat testipakkaukset, jotka sisältävät kaikkia keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseen tarvittavia reagensseja, kuten esim. tavallista koentsyymin, entsyymin ja substraatin seosta, keksinnön mukaisia CK-MM-vasta-aineita ja puskuriliuoksen. Tällainen tai samankaltainen testi-pakkaus tekee CK-MB:n määrittämisen mahdolliseksi pienimmän mahdollisin kustannuksin.
Tekniikan tason mukaisesti ei ollut odotettavissa, että CK-MB-määritys-ongelma on ratkaistavissa näin yksinkertaisen ja nopeatoimisen menetelmän avulla kuin keksinnön mukaisella menetelmällä, Niinpä ei ollut ennalta odotettavissa, että voidaan valmistaa spesifisiä vastaseerumeita, jotka estävät CK-MM:n ja -MB:n alayksikön entsymaattisen aktiivisuuden täydellisesti, mutta eivät vaikuta CK-MB:n alayksikön B entsymaattiseen aktiivisuuteen. Vasta näiden ennestään tuntemattomia ominaisuuksia omaavien vasta-aineiden käyttö tekee mahdolliseksi keksinnön mukaisen reaktion,
Yllättävää on myös, että keksinnön mukaisesti käytettävät vasta-aineet myös substraattien läsnäollessa säilyttävät täyden estovoimansa. Tämä ei ole itsestään selvää. Niinpä on kirjallisuudessa (Ann.N.Y.Acad.Sci., nide 103, sivut 858-889 (1963)) kuvattu vasta-aineita, jotka eivät CK-substraattien läsnäollessa enää inaktivoi CK-MM 100 %:iin asti. Vasta-aineet, joilla olisi tällaiset ominaisuudet, olisivat keksinnön mukaisen menetelmän edullisiin suoritusmuotoihin, joiden mukaisesti vasta-aineiden estäminen ja CK-substraattien lisääminen tapahtuvat samanaikaisesti, täysin käyttökelvottomia. M-aktiivisuuksien estämättömät osat korottaisivat CK-MB:n mittausarvoa virheellisesti, antaisivat väärän kuvan CK-MB-aktiivisuuksista, joita ei ollenkaan ole läsnä, ja siten vääriä laboratorio-arvoja taudinmääritystä varten.
Keksinnön mukaisesti käytettävien vasta-aineiden yllättävä ominaisuus, kykenevyys täydellisesti estämään CK-MM:n ja -MB:n alayksikön M entsymaattinen aktiivisuus vaikuttamatta silti CK-MB:n alayksikön B entsymaattiseen aktiivisuuteen myös substraattien läsnäollessa, tekevät mahdolliseksi tähän asti immunologisin menetelmin saavuttamattoman CK-MB-aktiivisuusmäärityksen nopeuden ja tarkkuuden. Tämän ansiosta avautuu käytäntöä varten mahdollisuus määrittää CK-MB-aktiivisuus pikatestillä.
Laboratoriokokein havaitusta potilaan CK-aktiivisuuden noususta voidaan päätellä onko kysymyksessä luuranko- tai sydänlihaksiston sairaus tai vammautuminen. Täten saadaan tärkeitä lisätietoja sydäninfarktin (esim. keuhkoinfarktin 10 60720 ja/tai shokkiseurausten) ja muiden sydämen sairauksien tai vahingoittumisten erotusdiagnoosia varten.
Määrittämällä spesifisesti ja tarkasti CK-MB:n aktiivisuus saadaan näyttöä sydänlihaksen osuudesta tai vammautumisesta muissa sydämen ulkopuolisissa sairaustapauksissa (esim, myrkytyksissä tai tapaturmissa), terapeuttisissa käsittelytoimenpiteissä (esim, elvytyksessä) tai diagnostisissa käsittelytoimenpiteissä (esim, sydänkatetroinneissa ja verisuonten kuvauksissa).
Seuraavissa esimerkeissä tarkoittavat "M" (tai "mM") väkevyyksiä mooleissa (tai millimooleissa) litraa kohti.
Lähtöaineiden valmistus Esimerkki A CK-MM:n valmistus a) 1,2 kg syväjäädytettyä ihmisen luurankolihasta sulatetaan huoneen lämpötilassa ja hienonnetaan koneellisesti. Kudos suspendoidaan 2,5 l:aan kylmää 0,05 M tris/HCl-puskuria, Ph 8,0 /tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani-HCl-puskuri7, joka sisältää 0,01 M KC1, 1 mM EDTA /etyleenidiamiini-tetraetikka-happoa7 ja 1 ml·! ditioerytritolia, ja homogenoidaan sekoittimella. Homogenoitua seosta sekoitetaan U5 minuuttia jäillä jäähdyttäen ja lingotaan sen jälkeen 60 minuuttia 12000 g:ssa. Sakan päällä oleva kirkas neste (2,680 1) saatetaan ammoniumsulfaatti-fraktiointiin pH 8,0;ssa tO-75 %:n kyllästysrajoissa. 0,75 s-sakka kootaan 0,0¾ M tris/HCl-puskuriin, pH 8,0 ja dialysoidaan samaa puskuria vastaan. Myoglobiinin ja happamien sivuproteiinien adsorboimiseksi lisätään 500 g kosteata emäksistä silloitettuun dekstraaniin pohjautuvaa ioninvaihto-hartsia, joka on tasapainoitettu samaa puskuria vastaan. 30 minuutin kuluttua imusuodatetaan ioninvaihtohartsi ja pestään kahdesti kulloinkin !+00 ml:11a 0,0¾ M tris/HCl-puskuria, pH 8,0, joka sisältää 0,02 M NaCl. Suodos ja pesuvedet yhdistetään ja saatetaan ammoniumsulfaatilla 0,75 s:ään. Sakka lingotaan erilleen, liuotetaan 100 ml:aan 0,0¾ M tris/HCl-puskuria, pH 8,0, ja dialysoidaan samaa puskuria vastaan, kunnes ammoniumsulfaattia ei enää ole osoitettavissa. Kirkas dialysaatti tasapainoitetaan pylväässä, jossa on emäksistä ioninvaihto-hartsia, joka pohjautuu silloitettuun dekstraaniin (6 x 60 cm) ja joka on tasapainoitettu samalla puskurilla. Pylvästä pestään lähtöpuskurilla niin kauan, kunnes eluaatti on proteiinivapaa. Sen jälkeen entsyymi eluoidaan pylväästä 0,0¾ M tris/HCl-puskurilla, pH 8,0j joka sisältää 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA ja 1 mM ditioerytritolia, Jakeet, joiden entsyymipitoisuus on vähintään 20 U/ml, yhdistetään, kyllästetään 80 %;iin ammoniumsulfaatilla ja lingotaan saostunut entsyymi erilleen, Loppupuhdistusta varten se saatetaan vielä kerran kromatogra-foltavaksi samassa systeemissä, käyttäen kuitenkin pienempää pylvästilavuutta.
" 60720
Yhdistetyistä aktiivisista jakeista saostetaan entsyymi 0,8 s ammoniumsulfaatilla, liuotetaan väkevöitynä 50 ml:aan 0,0^ M tris/HCl-puskuria, pH 8,0, joka sisältää 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA ja 1 mM ditioerytritolia, steriilisuodatetaan ja saatetaan uudelleen kyllästyspitoisuuteen 0,8 s ammoniumsulfaatilla. Näin saadaan U°C:ssa CK-MM:n pysyvä entsyymisuspensio, jonka spesifinen aktiivisuus on ^33-500 nkat/mg proteiinia, mitattuna kreatiini substraattina 25°C:ssa.
Tilavuus; 86 ml; aktiivisuus; 5267 nkat/ml; proteiini 11,8 mg/ml.
Saalis: n. 30 % (laskettuna elinuutteesta).
b) Samalla tavalla kuin esimerkissä Aa) eristetään CK-MM seuraavien eläinten lihaskudoksesta: reesus-apina, sika ja nauta.
Esimerkki B
Anti-CK-MM:n valmistus a) Ihmislihaksesta saatua CK-MM dialysoidaan 0,07 M trietanoliamiinilla puskuroitua fysiologista NaCl-liuosta, pH 7,0, vastaan, joka sisältää 10 mM merkaptoetanolia ja 10 mM MgCl^. Entsyymiliuos vapautetaan ultrasentrifugilla kasaumista ja säädetään proteiinipitoisuus mainitulla dialyysipuskurilla 2 mg/ml:ksi. 1 ml tätä liuosta emulgoidaan 1 ml:n kanssa täydellistä Freund'in Adjuvans'ia (vesi-mineraaliöljysuspensio, joka lisäksi sisältää vielä 2 mg tapettuja M-tuberkuloosibasilleja), Tätä emulsiota ruiskutetaan vuoheen lihaksensisäisesti, Kolmen samanlaisen ruiskeen jälkeen kolmen viikon välein ja vielä kolmen lisäruiskeen jälkeen 16 viikon välein otetaan eläimestä verta 21 päivän kuluttua viimeisestä ruiskeesta. Tunnetuilla tavoilla talteenotettu seerumi säädetään pH 8,H;ään seoksella, joka sisältää 3 % lammasseerumialbumiinia ja 0,1 % natriumatsidia 0,1 M boraattipuskurissa, ja steriilisuodatetaan. Saatua liuosta, joka sisältää anti-ihmislihas-CK-MM, täytetään 0,5 ml:n annoksina ruskeisiin lasipulloihin ja pakastekuivataan. Vasta-aineiden molekyylipaino on n. I6OOOO - 180000.
b) Esimerkin Aa) mukaisesti ihmislihaksesta saatua CK-MM dialysoidaan 0,1 M imidiatsolilla puskuroitua, fysiologista NaCl-liuosta pH 6,8, vastaan, joka sisältää 7,5 mM N-asetyylikysteiiniä ja 25 mM magnesiumasetaattia. Sen-jälkeen vapautetaan entsyymiliuos ultrasentrifugissa linkoamalla kasaumista ja säädetään proteiinipitoisuus mainitulla dialyysipuskurilla 0,2 mg/ml:ksi.
1 ml tätä liuosta emulgoidaan 1 ml:n kanssa täydellistä "Freund'in Adjuvans'ia". Tätä emulsiota annetaan ihonsisäisesti ruiskeena kuohitulle pässille. 3 ja 6 viikon kuluttua seuraavat kaksi lihaksensisäistä ruisketta ja kolme lisäruisketta, kukin it viikon välein. 19 päivän kuluttua viimeisestä ruiskeesta otetaan verta. Jalostaminen tapahtuu samalla tavalla kuin esimerkissä Ba). Saadaan anti-ihmis-lihas-CK-MM pakastekuivatussa muodossa. Vasta-aineen molekyylipaino on n. 160OOO-180000.
12 60720 c) Reesusapinan lihaksesta saatua CK-MM dialysoidaan perusteellisesti 0,15 M imidiatsolilla puskuroitua, fysiologista NaCl-'liuosta, pH 6,8, vastaan, joka sisältää 25 mmoolia ditioerytritolia ja 15 mM mangaani (II)-kloridia.
Kasaumien poistamisen jälkeen ultrasentrifugilla säädetään proteiinipitoisuus mainitulla dialyysipuskurilla 5 mg/ml:ksi, 1 ml tätä liuosta emulgoidaan 1 ml:n kanssa täydellistä Freund3in Adjuvans’ia. Ruiskeen antaminen, veren otto ja jalostaminen tapahtuvat samalla tavalla kuin esimerkissä Ba). Saadaan arrti-reesusapinalihas-CK-MM pakastekuivatussa muodossa. Vasta-aineen sedimentoitumis-vakio on n. 7 S.
d) Sian lihaksesta saatua CK-MM aktivoidaan samalla tavalla kuin esimerkissä Bb) ja annetaan antigeeni-emulsiota täydellisen Freund'in Adjuvans'in kanssa ruiskeena kaniineille, Kolmen viikon kuluttua tapahtuu vielä antigeeni-ruiskeen antaminen ihonalaisesti. Ruiskeen anto toistetaan edelleen kolmen viikon kuluttua, ja 19 päivää tämän jälkeen otetaan verta. Jalostaminen tapahtuu samalla tavalla kuin esimerkissä Ba), Saadaan anti-sianlihas-CK-MM pakastekuivatussa muodossa. Vasta-aineiden molekyylipaino on n. 16OOOO-I8OOOO.
Täysin samalla tavalla saadaan naudan lihaksesta anti-naudanlihas-CK-MM talteen (molekyylipaino n. 16ΟΟΟΟ-18ΟΟΟΟ).
Esimerkki 1 CK-MM:n CK-MB:n ja CK-BB:n estäminen ihmisen anti-CK-MM:llä.
CK-oma-aktiivisuutensa suhteen inaktivoituun ihmisseerumiin lisätään puhdasta CK-MM, CK-MB tai CK-BB ja määritetään yksittäisten näytteiden CK-aktii-visuudet. Tämän jälkeen sekoitetaan 0,1 ml näytettä 0,1 ml:n kanssa anti-CK-MM-liuosta (saatu esimerkin Ba) mukaan), sekoitetaan mekaanisesti ja inkuboidaan 5 minuuttia 25°C:ssa. Sen jälkeen seuraa CK-jäämäaktiivisuuden määritys tunnetulla tavalla. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon: CK-isoentsyymien jäämäaktiivisuudet inkuboinnin jälkeen ihmisen vasta-CK-MM:llä (keskiarvot - 1 s kulloinkin viidestä määrityksestä) (s = normaali-poikkeama)
Taulukko
Lisätyn isoentsyymin Jäämäaktiivisuus inkuboinnin
Isoentsyymi aktiivisuus (nkat/l) jälkeen anti-CK-MM:llä _ (nkat/l)_ CK-MM 1633+32 5 ± 35 17383 + 366 8 + 1*2 CK-MB 1717 + 33 883 ± 28 6833 + 130 31*33 + 103 CK-BB 3283 +63 3317+68
Mittaustarkkuuden puitteissa estyy CK-MM:n aktiivisuus 100 #:sti CK-BB:n 0 %:zti ja CK-MB:n (vastaten 50 %:sta. M-alayksiköiden osuutta) 50 J5:sti. Tulokset ovat muuttumattomia laajalla lisättyjen isoentsyymiaktiivisuuksien aktiivisuus-alueella.
13 60720
Eelaerkkl 2
Testi I CK-MBrn aktiivisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi keho-nesteissä a) Testipakkauksen kokoonpano
Testipakkaus riittää 10:een aktiivisuusmääritykseen. Pakkaus sisältää yhden pullon puskuria 10 määritystä varten, 10 pulloa koentsyymientsyymi-substraatti-seosta ja yhden pullon anti-CK-MM (saatu esimerkin Ba mukaisesti).
Pullo koentsyyai-entsyyai-substraatti-seosta sisältää:
Kreatiinifosfaatti-dinatriumsuolaa, heksahydraattia 27,24 ag glutationia, pelkistettyä 6,4 ag (tai N-asetyyli-kysteiiniä 3,4 mg) adenosiinidifosfaatti-dinatriumsuolaa, heksahydraattia 1,25 ag nikotiiniaaidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaattia, di- 1,7 ag natriumeuolaa adenosiini-aonofosfaattia, dinatriuasuolaa 8,47 £ heksokinaasia 5 ^
glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasia 3 U
glukoosia 8,32 ag magnesiuaasetaattia 4,52 ag
Pullo puskuriliuosta sisältää:
trietanoliaaiini-asetaattia (vedessä) 105 aM
Lyofilöidut vasta-aineet liuotetaan 2 ai:11a tislattua vettä. Syntynyt vaeta-aineliuos on säädetty niin, että kreatiinikinaasi-MM estyy täysin I7^kat/l:aan asti. Kun on kysymyksessä seerumeita, joilla on erityisen korkeat kokonaiskreatiinikinaasi-aktiivisuudet, täytyy seerumi sentähden esilaimentaa n. 17 ^ikat/liaan. Vasta-aine liuos on +4°C:ssa pysyvä vähintäin 7 päivää.
b) CK-MB:n aktiivisuueaäärityksen suoritus bl) Suoritus
Reaktioastiaan pipetoidaan 0,1 ml seerumia ja 0,1 ml vasta-aineliuosta, sekoitetaan hyvin ja inkuboidaan 5 minuuttia 25°C:sea. SenJälkeen lisätään 0,1 ml tätä reaktioseosta sekä 2,0 ai puskuriliuosta pulloon, jossa on koentsyyai, entsyymi ja substraatti.
Sekoitetaan, inkuboidaan 5 minuuttia 25°0:sea, kaadetaan senjälkeen kyvettiin, mitataan ekstlnktio 25°C:ssa ja määritetään senjälkeen ekatinktiomuutos minuutissa. Aallonpituudet: 334» 340 tai 366 naf kerrospaksuus: 1 ca.
60720
1U
b2) Laskeminen Määritetty näytteen CK-aktiivisuus täytyy kertoa a) laimennuskerioimella 2 ja b) CK-MB-hybridikertoimella 2 (testissä mitataan ainoastaan CK-MBsn B-alayksiköt).
Ekstinktioeroieta minuuttia kohti (ΔΕ/min.) muodostetaan keskiarvo ja sijoitetaan vastaavaan laskentakaavaan? mittaus 334 nnussai tilavuusaktiivisuus-CK-MB -ΔΕ/min. x 4 x 58 yikat/1 mittaus 340 nm:ssä: tilavuusaktiivisuus-CK-MB « ΔΕ/min. x 4 x 56 ^ikat/1 mittaus 336 nmissä? tilavuusaktiivisuus-CK-MB -ΔΕ/min. x 4 x 106 ^ikat/l.
Esimerkki 3
Testi II CK-MB-aktiivisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi kehonnea- teissä a) Testipakkauksen koostumus
Testipakkaus riittää 30 aktiivisuusmääritykseen. Perkaus sisältää yhden pullon puskuriliuosta 30 määritystä varten ja 30 pulloa lyofiloitua seosta, jossa on koentsyymiä, entsyymiä, substraattia ja esimerkin. Ba) mukaisesti valmistettua anti-CK-MM.
Puskuriliuospullon sisältämä määrä trietanoliamiinlasetaattia vastaa esimerkissä 2a) annettua määrää. Yksittäiset pullot, jotka sisältävät koent-syymin, entsyymin, substraatin ja esimerkin Ba) mukaisen anti-CK-MM?n, vastaavat kolmen ensinmainitun komponentin suhteen samoin esimerkissä 2a) annettua koostumusta ja sisältävät lisäksi anti-CK-MM, joka estää CK-MMtää kokonaan 17 ^ika-t/ltaan asti.
b) CK-MB:n aktiivisuuden määritys bl) Suoritus
Koentsyymi/entsyymi/eubetraatti/ anti -CK-MM-seospullon sisältöön pipe-toldaan 2,0 ml puskuriliuosta ja 0,1 ml seerumia. Sekoitetaan, inkuboidaan 3 minuuttia 25°C?eea, kaadetaan sitten kydettiin ja mitataan 3 minuutin aikana ekstinktiot 23°C:ssa. Aallonpituudet? 334, 340 tai 366 nm; kerrospaksuus? 1 cm.
b2) Laskeminen
Ekstinktioeroieta minuuttia kohti (ΔΕ/min.) muodostetaan keskiarvo ja sijoitetaan vastaavaan laskentakaavaan?
Mittaus 334 nm?ssä? tilavuusaktiivisuus CK-MB -ΔΕ/min. x 117^ikat/l 60720
Mittaus 340 nmissä: tilavuusaktiivisuus CK-MB · ΔΕ/min. x 113^ikat/l
Mittaus 366 nmissä: tilavuusaktiivisuus CK-MB * AE/min. x 212^ikat/l.
Esinerkki 4 CK-kokonaisaktiivisuuden ja CK-MB-aktiivisuuden samanaikaismääritys a) Testipakkauksen koostumus
Testipakkauksen sisältö on sama kuin esimerkissä 2a).
b) CK-MB:n CK-kokonaisaktiivisuuden ja CK-MB-aktiivisuuden määritys bl) Suoritus
Koentsyymi-entsyymi-substraatti-seosta sisältävään pulloon pipetoi-daan 2,0 ml puskuriliuosta ja 0,1 ml seerumia tai laimennettua seerumia. Sekoitetaan, inkuboidaan 5 minuuttia 25°Cissa, kaadetaan senjälkeen kyvet-tiin ja mitataan ekstinktiomuutos (ΔΕ1) 2 minuutin aikana 25°C:esa. Senjälkeen lisätään 0,1 ml vasta-aineliuosta, sekoitetaan heti ja 3 minuutin kuluttua määritetään uudelleen ekstinktiomuutos (ΔΕ2) 25°Cissa. Aallonpituudet! 334· 34Ο tai 366 nm; kerrospaksuus! 1 cm. b2) Laskeminen CK-kokonaisaktiivisuue lasketaan seuraavasti!
Mittaus 334 nm:ssä! tilavuusaktiivisuus CK-yhteensä -AEl/min. x 58 ^ikat/l
Mittaus 340 nmissä: tilavuusaktiivisuus CK-yhteensä -ΔΕΐ/min. x 56 ^ikat/l
Mittaus 366 nmissä! tilavuusaktiivisuus CK-yhteensä -ΔΕΐ/min. x 106 yokat/1, SK-MB-aktiivisuus saadaan seuraavien laskentakaavojen mukaani Mittaus 334 nmissä: tilavuusaktiivisuus CK-MB -AE2/min. x 123 yakat/1
Mittaus 340 nmissä tilavuusaktiivisuus CK-MB -ΔΕ2/η1η. x 1l8yukat/l
Mittaus 366 nmissä: tilavuusaktiivisuus CK-MB -AE2/min. x 223 yukat/l.
Esimerkki 5 CK-MB-aktiivisuuksien määritys potilailla, joilla on tai ei ole sydäninfarktia esimerkin 3 mukaisella testipakkauksella a) Eri potilasryhmien CK-aktilvisuudet 16 60720
Tapausten Keskiarvot
lukumäärä Kokona! s-CK CK-MB
(nkat/l) (nkat/l)
Potilaat, joilla on kasvaneet CK-aktiivisuudet ilman sydän- 48 8000 <28 infarktia
Sydäninfarkti-potilaat 5 8500 733
Taulukko osoittaa» että keksinnön mukaisen määritysmenetelmän avulla nopeasti ja yksiselitteisesti voidaan saada osoitus sydäninfarktista.
b) CK-MB-aktiivisuuden muuttuminen ajan funktiona sydäninfarkti-potilaalla
CK-MB
Tunteja infarktin alkamisesta nkat/l_ 3.5 *83 4.5 <83 5.5 100 7.5 367 8.5 383 9.5 ^3 10.5 833 11.5 767 15.5 933 15.5 917 17.5 1067 21.5 1033 25.5 833 29.5 700 53.5 M 7 43.5 300 53.5 <83 61.5 <83
Lukuarvot osoittavat keksinnön mukaisella menetelmällä määritetyn CK-MB-aktlivisuuden nousun ja takaisinlaskeutumisen sydäninfarkti-potilailla.
Claims (3)
1. Menetelmä kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi kehon-nestenäytteestä, tunnettu siitä, että näytettä inkuboidaan kreatiini-kinaasi-MM-vasta-aineiden kanssa, joiden molekyylipaino on 130000-210000, jotka vasta-aineet pystyvät täydellisesti estämään kreatiinikinaasi-isoentsyymi-MM:n ja -MB:n alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan kreatiinikinaasi-MB:n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta, ja määritetään kreatiinikinaasi-alayksikön B aktiivisuus tunnetulla tavalla fotometrisesti.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennen näytteen inkubointia vasta-aineiden kanssa samasta näytteestä lisäksi määritetään kreatiinikinaasi-kokonaisaktiivisuus.
3. Aine kreatiinikinaasi-MB:n aktiivisuuden määrittämiseksi kehonneste-näytteestä, tunnettu siitä, että se kreatiinikinaasiaktiivisuuden entsymaattisessa määrityksessä käytettävän tunnetun reagenssikoostumuksen lisäksi sisältää kreatiinikinaasi-MM-vasta-aineita, joiden molekyylipaino on 130000-210000, jotka vasta-aineet pystyvät täydellisesti estämään alayksikön M entsymaattisen aktiivisuuden kreatiinikinaasi-MM:ssä ja -MB:ssä, näytteen kreatiini-kinaasi-kokonaisaktiivisuuden ollessa enintään k2 pkat/1, inaktivoimatta mahdollisesti läsnäolevan kreatiinikinaasi-MB:n alayksikön B entsymaattista aktiivisuutta. h. Patenttivaatimuksen 3 mukainen aine, tunnettu siitä, että se sisältää kreatiinikinaasi-MM:llä immunoiduista vuohista saatuja vasta-aineita.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2548963A DE2548963C3 (de) | 1975-11-03 | 1975-11-03 | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB |
| DE2548963 | 1975-11-03 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI763127A FI763127A (fi) | 1977-05-04 |
| FI60720B true FI60720B (fi) | 1981-11-30 |
| FI60720C FI60720C (fi) | 1982-03-10 |
Family
ID=5960613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI763127A FI60720C (fi) | 1975-11-03 | 1976-11-02 | Foerfarande och medel foer bestaemning av aktiviteten av kreatinkinas-mb |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4067775A (fi) |
| JP (1) | JPS5257887A (fi) |
| AT (1) | AT359205B (fi) |
| BE (1) | BE847905A (fi) |
| BR (1) | BR7607257A (fi) |
| CH (1) | CH628144A5 (fi) |
| CS (1) | CS200196B2 (fi) |
| DD (1) | DD127243A5 (fi) |
| DE (1) | DE2548963C3 (fi) |
| DK (1) | DK151920C (fi) |
| ES (1) | ES452916A1 (fi) |
| FI (1) | FI60720C (fi) |
| FR (1) | FR2330010A1 (fi) |
| GB (1) | GB1512328A (fi) |
| HU (1) | HU176133B (fi) |
| IE (1) | IE44183B1 (fi) |
| IL (1) | IL50803A (fi) |
| IT (1) | IT1109402B (fi) |
| LU (1) | LU76112A1 (fi) |
| NL (1) | NL190171C (fi) |
| NO (1) | NO148457C (fi) |
| SE (1) | SE439380B (fi) |
| ZA (1) | ZA766526B (fi) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2548962C2 (de) * | 1975-11-03 | 1985-11-21 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatinkinase-Isoenzymen |
| US4237219A (en) * | 1977-10-27 | 1980-12-02 | Washington University | Radioimmunoassay assay and reagents for MB isoenzyme of CK |
| DE2828658C3 (de) * | 1978-06-29 | 1981-10-22 | Lkb-Produkter Ab, Stockholm | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
| US4260678A (en) * | 1979-02-23 | 1981-04-07 | Corning Glass Works | Determining creatine kinase isoenzmes via immobilized antibody-isoenzyme complexes |
| DE2908053C2 (de) * | 1979-03-02 | 1982-08-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
| US4353982A (en) * | 1980-04-10 | 1982-10-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
| EP0040964A1 (en) * | 1980-05-23 | 1981-12-02 | Michael Howard Burnam | Protein enzyme derivative |
| US5009996A (en) * | 1980-06-30 | 1991-04-23 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Two site cross-reaction immunometric sandwich assay method |
| US5009997A (en) * | 1980-06-30 | 1991-04-23 | Shah Vipin D | Two site cross-reaction immunometric sandwich assay method |
| US4360413A (en) * | 1980-12-29 | 1982-11-23 | Beckman Instruments, Inc. | Creatine kinase isoenzyme electrophoretic technique and improved creatine kinase isoenzyme reagent for use therein |
| US4387160A (en) * | 1981-02-17 | 1983-06-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
| ES511156A0 (es) * | 1981-04-13 | 1983-08-01 | Hoechst Co American | Un metodo de determinar la presencia de un antigeno en un medio liquido sospechoso de contenerlo. |
| JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
| JPS60125565A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | エノラ−ゼサブユニット量の分別定量法 |
| US4624916A (en) * | 1984-04-06 | 1986-11-25 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Process and composition for the rapid quantitation of small levels of creative kinase-MB isoenzyme |
| US4703002A (en) * | 1985-05-01 | 1987-10-27 | Eastman Kodak Company | Method for preparing coating compositions containing an immunologically reactive species and elements containing same |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
| US4983513A (en) * | 1986-03-28 | 1991-01-08 | Beckman Instruments, Inc. | Sulfhydryl compounds for suppressing the inhibitory effects of NAD degradation products on LD-L activity |
| JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
| US4950592A (en) * | 1987-05-12 | 1990-08-21 | Eastman Kodak Company | Blend of monoclonal antibodies |
| JPH01503565A (ja) * | 1987-05-12 | 1989-11-30 | クールター・エレクトロニクス・インコーポレーテッド | 中和／免疫阻害アッセイ方法および試験キット |
| US5382515A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents |
| US4900662A (en) * | 1987-07-21 | 1990-02-13 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | CK-MM myocardial infarction immunoassay |
| US5382522A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunoassay for creatine kinase-MB and creatine kinase-BB isoforms and reagents |
| US5804394A (en) * | 1988-04-06 | 1998-09-08 | Unitika Ltd. | Reagent for measuring creatine kinase activity and measuring method thereof |
| JPH02181654A (ja) * | 1989-01-06 | 1990-07-16 | Green Cross Corp:The | 抗酵素抗体価の測定方法 |
| US5086001A (en) * | 1989-12-01 | 1992-02-04 | Baxter International, Inc. | Automated test method for evaluating the physical compatibility of intravenous drugs in solutions |
| US5512447A (en) * | 1990-09-07 | 1996-04-30 | The Regents Of The University Of California | Methods for the diagnosis and treatment of diabetes |
| DK0547164T3 (da) * | 1990-09-07 | 2004-10-25 | Univ California | Fremgangsmåder til diagnosticering og behandling af diabetes |
| JPH09304393A (ja) * | 1996-05-15 | 1997-11-28 | Ind Technol Res Inst | 急性心筋梗塞診断キット |
| US5998158A (en) * | 1997-05-14 | 1999-12-07 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Glucose free, stable dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme |
| JP3750955B2 (ja) * | 1997-04-18 | 2006-03-01 | 富士写真フイルム株式会社 | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 |
| EP0989190B1 (en) * | 1998-09-22 | 2002-11-27 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme |
| DE69809741T2 (de) * | 1998-09-22 | 2003-04-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | Trockenes analytisches Element zur quantitativen Analyse von Creatinkinase oder seinem MB-Isoenzym |
| EP1072889B1 (en) * | 1999-01-19 | 2008-08-13 | Sysmex Corporation | Method for assaying creatine kinase isozyme activity and assay reagent |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| US3994783A (en) * | 1975-09-26 | 1976-11-30 | Calbiochem | Differential assay of creatine phosphokinase isoenzymes |
-
1975
- 1975-11-03 DE DE2548963A patent/DE2548963C3/de not_active Expired
-
1976
- 1976-10-28 FR FR7632591A patent/FR2330010A1/fr active Granted
- 1976-10-29 BR BR7607257A patent/BR7607257A/pt unknown
- 1976-11-01 IL IL50803A patent/IL50803A/xx unknown
- 1976-11-01 IE IE2428/76A patent/IE44183B1/en not_active IP Right Cessation
- 1976-11-01 US US05/737,587 patent/US4067775A/en not_active Expired - Lifetime
- 1976-11-01 DD DD195542A patent/DD127243A5/xx unknown
- 1976-11-01 ZA ZA766526A patent/ZA766526B/xx unknown
- 1976-11-02 NO NO763722A patent/NO148457C/no unknown
- 1976-11-02 FI FI763127A patent/FI60720C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 CS CS767066A patent/CS200196B2/cs unknown
- 1976-11-02 SE SE7612175A patent/SE439380B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 JP JP51133145A patent/JPS5257887A/ja active Granted
- 1976-11-02 CH CH1380576A patent/CH628144A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 DK DK496476A patent/DK151920C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 AT AT809576A patent/AT359205B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-11-02 ES ES452916A patent/ES452916A1/es not_active Expired
- 1976-11-02 IT IT52004/78A patent/IT1109402B/it active
- 1976-11-03 LU LU76112A patent/LU76112A1/xx unknown
- 1976-11-03 GB GB45805/76A patent/GB1512328A/en not_active Expired
- 1976-11-03 HU HU76ME2027A patent/HU176133B/hu not_active IP Right Cessation
- 1976-11-03 BE BE172009A patent/BE847905A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-11-03 NL NLAANVRAGE7612182,A patent/NL190171C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI60720B (fi) | Foerfarande och medel foer bestaemning av aktiviteten av kreatinkinas-mb | |
| Löhr et al. | Glucose-6-phosphate Dehydrogenase:(Zwischenferment) | |
| Karl et al. | A microfluorometric enzymatic assay for the determination of alanine and pyruvate in plasma and tissues | |
| US3932221A (en) | Immunological isozyme determination method | |
| Goldstein et al. | Cystathionine synthase activity in human lymphocytes: induction by phytohemagglutinin | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| CA1211062A (en) | Sensitive tests for malignancies based on dna detection | |
| JPH0614045B2 (ja) | 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法 | |
| US4387160A (en) | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| Dunnette et al. | Inheritance of low immunoreactive human plasma dopamine-β-hydroxylase: Radioimmunoassay studies | |
| Rushmore et al. | Purification and characterization of P-52 (glutathione S-transferase-P or 7-7) from normal liver and putative preneoplastic liver nodules | |
| Reid et al. | Analysis of 2′, 5′-oligoadenylates in cells and tissues | |
| Cummings et al. | Atypical γ1A-globulin with the electrophoretic properties of an α2-globulin occurring in multiple myeloma | |
| US4330620A (en) | Method and reagent for the determination of creatine kinase MB | |
| CN104155456B (zh) | 一种稳定性强的肌钙蛋白检测试剂盒 | |
| CA1062609A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-mb | |
| Glazer et al. | Glutamate dehydrogenase activity related to histopathological grade of hepatocellular carcinoma in man | |
| FI77895B (fi) | Foerfarande foer bestaemning av deoxithymidinkinas-isoentsymaktivitet och dess anvaendning foer diagnosis av sjukdomar. | |
| US4409200A (en) | Reverse transcriptase from human milk, method for its purification, and its use in the detection of breast cancer | |
| Fishman et al. | Quantitation of potency of antisera to placental alkaline phosphatase by an automated immunoenzyme technique | |
| ES2325739T3 (es) | Medicion enzimatica de mesilato de imatinib. | |
| Morin | Creatine kinase isoenzyme--antibody reactions in immuno-inhibition and immunonephelometry. | |
| CS207669B2 (cs) | Prostředek ke stanovení účinnosti hybridního isoenzymu kreatinkinázy-MB | |
| JP2000180446A (ja) | 干渉作用を回避する方法及び試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MERCK PATENT GMBH |